制备用于硫代磷酸酯杀虫剂免疫分析的半抗原的方法 【发明背景】
【发明领域】
本发明涉及一种制备用于硫代磷酸酯杀虫剂免疫分析的半抗原的方法，更具体地，涉及一种通过用酚类化合物与O-甲基(乙基)二氯硫代磷酸酯反应来获得O-甲基(乙基)O-芳基氯硫代磷酸酯，并将由此获得的O-甲基(乙基)O-芳基氯硫代磷酸酯与氨基羧酸反应，来制备用于有机磷硫代磷酸酯杀虫剂免疫分析的半抗原的方法。
现有技术的描述
自从20世纪30年代Schrader发现了一种具有杀虫活性的有机磷化合物以来，在本领域中已经发展了大量具有高度生物学活性的有机磷杀虫剂，以符合阻止使用有机氯化物杀虫剂的运动。现在，有机磷杀虫剂在当前的杀虫剂中占大多数。此外，值得注意的是其中大约100,000种已被鉴定具有杀虫活性，且它们中的超过100种可以市售获得。
有机磷杀虫剂被依据其磷原子周围的化学结构分为磷酸酯，硫代磷酸酯，硫醇磷酸酯，二硫代磷酸酯，膦酸酯，硫代膦酸酯，二硫代膦酸酯，phosphorothiolothinate，以及焦磷酰胺(参见：表1)。在它们之中，硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯被认为是农业中最重要的杀虫剂且已经成为分析残留杀虫剂的主要对象。
残留杀虫剂的分析主要借助于GC或HPLC来进行，其中两者都具有固有的缺点即预处理步骤费时，机器和工具昂贵，以及需要专门的技术且对GC而言，不可能来分析热不稳定的材料以及对HPLC而言，很难用于分析没有发色团的杀虫剂。为解决这些问题，人们从20世纪70年代开始进行了许多尝试来利用免疫分析方法分析残留杀虫剂其主要地被用来分析生物组分或临床诊断。残留杀虫剂免疫分析的下述各方面比传统的方法更为有利：高灵敏度；不需要进行预处理样品；且由于其允许同时迅速分析多重样品所以成本较低。
免疫分析基于抗体和抗原之间的具有高度亲合力的特异性结合。因此，应制备合适的抗原来产生用于分析材料的抗体。然而，低分子量材料，诸如杀虫剂，不能用作它们自己的抗原且因此，抗体不能被产生。在这种情况下，对应该合成半抗原来制备杀虫剂-特异性抗原的需求已经增加，其中所述的半抗原具有与杀虫剂相似的结构且能与蛋白质形成共价键的原子基团。同样，需要合成半抗原来用于制备用于竞争性-免疫分析方法的酶示踪剂和固定抗原、竞争剂。
表1：有机磷杀虫剂的分类
通常，用于硫代磷酸酯杀虫剂免疫分析的半抗原具有如下的化学结构：
其中，
R1是甲基或乙基；
R2是芳基；
R3是氢或烷基；和，
R4是亚烷基。
上述半抗原中，具有其中R3是氢且R4是两个或五个亚甲基结构的半抗原通过如下步骤的方法合成：(i)3-氨丙酸(1)与苄基氯甲酸酯反应来获得3-(苄氧基羰基氨基)丙酸(2)；(ii)由此获得的3-(苄氧基羰基氨基)丙酸与叔-丁醇在二环己基碳二亚胺(DCC)存在下反应来获得叔-丁基3-(苄氧基羰基氨基)丙酸酯(3)；(iii)通过利用催化剂氢化去除由此获得的叔-丁基3-(苄氧基羰基氨基)丙酸酯(3)的氨基保护基来获得叔-丁基3-氨基丙酸酯(4)；(iv)由此获得的叔-丁基3-氨基丙酸酯(4)与O-烷基-二氯硫代磷酸酯(5)反应来获得叔-丁基3-[氯代(甲氧基)-phosphorthioyl-氨基]-丙酸酯(6)；(v)由此获得的叔-丁基3-[氯代(甲氧基)-phosphorthioyl-氨基]-丙醇酯与苯酚(7)的钠盐反应来获得O-烷基O-芳基N-[[2-[叔-丁基氧]羰基]乙基]氨基硫代磷酸酯(8)；以及，(vi)用三氟乙酸(TFA)除去O-烷基O-芳基N-[[2-[叔-丁基氧]羰基]乙基]氨基硫代磷酸酯(8)的叔-丁基保护基来获得O-烷基O-芳基N-(2-羧基乙基)氨基硫代磷酸酯(9)。
已知通过上述方法合成的O-烷基O-芳基N-(2-羧乙基)氨基硫代磷酸酯是一种高度优选用于产生硫代磷酸酯杀虫剂抗体的半抗原。然而，所述方法暴露了缺点：非常复杂，耗时-和浪费成本以及低产率。
在此情况下，人们强烈的需要发展一种以更有效的方式制备用于硫代磷酸酯杀虫剂免疫分析的半抗原的方法。
发明概述
本发明人努力发展了一种有效制备用于硫代磷酸酯杀虫剂免疫分析的半抗原的方法；并发现具有O-甲基(乙基)O-芳基N-(羧基烷基)phophoramidothioate或O-甲基(乙基)O-芳基N-烷基N-(羧基烷基)硫代氨基磷酸酯结构的半抗原可通过包括下述步骤的方法来制备：用酚类化合物与O-甲基(乙基)氯硫代磷酸酯反应来获得O-甲基(乙基)O-芳基氯硫代磷酸酯；以及，将获得的O-甲基(乙基)O-芳基氯硫代磷酸酯与羧基不被保护的氨基羧酸反应。
因此，本发明的主要目的是提供一种制备用于有机磷硫代磷酸酯杀虫剂免疫分析的半抗原的方法。
发明详述
一种制备用于有机磷硫代磷酸酯杀虫剂的免疫分析的半抗原的方法，包括步骤：(i)4℃下用化合物(10)与酚类化合物(11)以及K2CO3在乙腈中反应30到90分钟来获得化合物(12)；以及，(ii)4℃下将化合物(12)与化合物(13)以及KOH在甲醇中反应3至5分钟来获得化合物(14)。所述硫代磷酸酯杀虫剂包含penthion，penitrothion，对硫磷，甲基对硫磷，bromofos-甲基，bromofos-乙基，chloropyrifos，chloropyrifos-甲基，chloropyrifos-乙基，二嗪农，pyridapenthion，triazofos，isofenfos以及pyrimifos。
其中，
R1是甲基或乙基；
R2是芳基；
R3是氢或烷基；和，
R4是亚烷基。
本发明在下文实施例中进行进一步的说明，其不应被理解为对本
发明范围的范围。
实施例1：用于硫代磷酸酯杀虫剂免疫分析的半抗原的制备
通过O-甲基(乙基)二氯硫代磷酸酯与酚反应获得的O-甲基(乙基)O-芳基氯硫代磷酸酯与氨基羧酸反应来产生用于硫代磷酸酯杀虫剂免疫分析的半抗原：
46.28mmol的O-甲基(乙基)二氯硫代磷酸酯(10)溶于30ml的乙腈中，加入45g的重质K2CO3和溶解在30mL乙腈中的42.07mmol的酚(11)并在室温下搅拌1小时。然后，反应混合物用cellite过滤，从滤液中蒸发溶剂，且残余物用于通过苯/己烷(1∶1，v/v)或己烷/丁酸(10∶1，v/v)平衡的硅胶柱层析，来获得O-甲基(乙基)O-芳基氯代硫酸酯(12)的油状化合物。
2.1mmol由此获得的O-甲基(乙基)O-芳基氯代硫酸酯(12)溶于甲醇，加入4℃冰水，并搅拌3到5分钟徐徐加入溶解在1.7mL甲醇中的5.2mmol(292mg)的KOH和2.6mmol的氨基羧酸(13)。为制备含有甲醇的溶液，在为氨基羧酸为氢氯化物的情况下，KOH加入量差不多是氨基羧酸的3倍。反应溶液被灌注到分液漏斗中并通过加入1N HCl和氯仿获得提取物，通过MgSO4脱水，蒸发残余的溶剂，且残余物被用于通过氯仿∶乙酸乙酯∶乙酸(65∶35∶1，v/v/v)平衡的硅胶柱层析，来获得用于硫代磷酸酯杀虫剂免疫分析的化合物(14)。在下面的化学反应式中，R1是甲基或乙基，R2是芳基，R3是氢或烷基，以及R4是亚烷基。
实施例2：用于硫代磷酸酯杀虫剂免疫分析的半抗原的合成
通过利用实施例1的方法，合成带有不同的R1，R2，R3和R4取代基的半抗原来用于硫代磷酸酯杀虫剂诸如甲基对硫磷，chloropyrifos和isofenfos的免疫分析。用于硫代磷酸酯杀虫剂免疫分析的半抗原的不同结构显示在下述表2中，其中Ph和Pyr分别表示苯环和吡啶基。
表2：用于硫代磷酸酯杀虫剂免疫分析的半抗原的不同结构 硫代磷酸酯杀虫 剂 R1 R2 R3 R4 A 甲基对硫磷 CH3 Ph-p-NO2 H -(CH2)3- B 甲基对硫磷 CH3 Ph-p-NO2 H -(CH2)5- C 甲基对硫磷 CH3 Ph-p-NO2 CH3 -(CH2)3- D Chloropyrifos CH3CH2 Pyr-(3，5，6)-三氯 H -(CH2)3- E Chloropyrifos CH3CH2 Pyr-(3，5，6)-三氯 H -(CH2)5- F Chloropyrifos CH3CH2 Pyr-(3，5，6)-三氯 CH3 -(CH2)3- G Isofenfos CH3CH2 Ph-O-CO2CH(CH3)2 H -CH(CH3)CH2-
1H NMR分析显示合成的半抗原具有与表2中显示的半抗原结构相同的光谱。在1H NMR光谱中，化学位移的值用ppm标记作为来自四甲基硅烷的位移并且耦合常数的值(J)用Hz和s，d，t，q，qn，sext，sp表示，且和m分别表示单重峰，双重峰，三重峰，四重峰，五重峰，六重峰，七重峰，和多重峰。
实施例2-1：半抗原A的合成
通过利用实施例1的方法，合成了半抗原A(R1＝甲基，R2＝芳基，R3＝氢且R4＝-(CH3)CH2-：3.00g的(21.6mmol)O-甲基二氯硫代磷酸酯溶于20mL的乙腈中，加入溶解于15mL乙腈中的20g重质K2CO3和3.00g(21.6mmol)4-硝基酚并在室温下搅拌1小时。然后，反应混合物用cellite过滤，蒸发滤液中的溶剂，且残留物用于通过苯/己烷(1∶1，v/v)平衡的硅胶柱层析，来获得O-甲基O-(4-硝基苯基)phorochloridothioate的油状化合物。化合物的产率为70％且其NMR数据如下：
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.28(2H，d，J＝6.1，ar)，7.42(2H，d，J＝7.2，ar)，4.03(3H，d，J＝16.5，CH3OP)
由此获得的500mg(1.87mmol)O-甲基O-(4-硝基苯基)phorochloridothioate溶于3ml的甲醇，倾入4℃冰水，并搅拌3到5分钟徐徐加入通过在1.7mL甲醇中溶解274mg(4.88mmol)KOH和229mg(2.2mmol)氨基丁酸获得的含有甲醇的溶液。反应溶液被灌注到分液漏斗中并通过加入1N HCl和氯仿获得提取物，通过MgSO4脱水，蒸发残余的溶剂，且残余物被用于通过氯仿∶乙酸乙酯∶乙酸(65∶35∶1，v/v/v)平衡的硅胶柱层析，来获得表2中的半抗原A。半抗原A产量为81％且其NMR数据如下：
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.24(2H，d，J＝8.9，ar)，7.38(2H，d，J＝8.3，ar)，3.81(3H，d，J＝14.1，CH3OP)，3.47(1H，qn，J＝7.4，NH)，3.17(2H，sext，J＝6.8，NCH2)，2.46(2H，t，J＝7.0，CH2CO2)，1.88(2H，qn，J＝7.0，CH2CH2CH2)
实施例2-2：半抗原B的合成
通过利用实施例1的方法，合成了半抗原B(R1＝甲基，R2＝芳基，R3＝氢且R4＝-(CH2)6-)：由此获得的500mg(1.87mmol)O-甲基O-(4-硝基苯基)phorochloridothioate溶于3ml的甲醇，倾入4℃冰水，并搅拌3到5分钟徐徐加入通过在1.7mL甲醇中溶解274mg(4.88mmol)KOH和291mg(2.2mmol)的6-氨基己酸获得的含甲醇溶液。然后，以类似于实施例2-1的方式合成半抗原B，其产率为88％且NMR数据如下：
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.24(2H，d，J＝8.9，ar)，7.37(2H，d，J＝9.2，ar)，3.81(3H，d，J＝14.2 CH3OP)，3.34(1H，qn，J＝7.3，NH)，3.09(2H，sext，J＝6.9，NCH2)，2.37(2H，t，J＝7.3，CH2CO)，1.68(2H，qn，J＝7.6，NHCH2CH2)，1.56(2H，m，CH2CH2CO)，1.40(2H，m，CH2CH2CH2)。
实施例2-3：半抗原C的合成
通过利用实施例1的方法，合成半抗原C(R1＝甲基，R2＝芳基，R3＝氢且R4＝-(CH2)3-)：由此获得的202mg(0.76mmol)O-甲基O-(4-硝基苯基)phorochloridothioate溶于1.5ml的甲醇，加入4℃冰水，并搅拌5分钟徐徐加入通过在1.5mL甲醇中溶解207mg(3.7mmol)KOH和154mg(1.0mmol)的4-(甲基氨基)丁酸获得的含甲醇溶液。然后，以类似于实施例2-1的方式合成半抗原C，其产率为70％且NMR数据如下：
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ8.23(2H，d，J＝9.0，ar)，7.31(2H，d，J＝9.0，ar)，3.76(3H，d，J＝14.1，CH3OP)，3.36(2H，m，NCH2)，2.86(3H，d，J＝11.0，CH3N)，2.40(2H，t，J＝7.5，CH2CO2)，1.89(2H，qn，J＝7.0，CH2CH2CH2)。
实施例2-4：半抗原D的合成
通过利用实施例1的方法，合成了半抗原D(R1＝乙基，R2＝芳基，R3＝氢且R4＝-(CH2)3-)：3.52g的(20mmol)的O-乙基二氯硫代磷酸酯溶于20mL的乙腈中，加入溶解于5mL乙腈中的10g重质K2CO3和3.00g(15mmol)3，5，6-三氯-2-吡啶酚并在室温下搅拌1小时。然后，反应混合物用cellite过滤，蒸发滤液中的溶剂，且残留物用于通过苯/己烷(1∶1，v/v)平衡的硅胶柱层析，来获得O-乙基O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)phorochloridothioate的油状化合物。所述化合物的产率为65％且其NMR数据如下：
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.91(1H，d，J＝1.3，ar)，4.52(2H，qxd，J＝11.0 & 7.1，CH2CH3)，1.51(3H，txd，J＝7.1&1.1，CH2CH3)。
由此获得的0.50g(1.47mol)O-乙基O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)phorochloridothioate溶于3ml的甲醇，加入4℃冰水，并搅拌3到5分钟徐徐加入通过在1.7mL甲醇中溶解0.205g(3.23mmol)KOH和0.166g(1.6mmol)氨基丁酸获得的含有甲醇的溶液。反应溶液灌注到分液漏斗中并通过加入1N HCl和氯仿获得提取物，通过MgSO4脱水，蒸发残余的溶剂，且残余物用于通过氯仿∶乙酸乙酯∶乙酸(65∶35∶1，v/v/v)平衡的硅胶柱层析，来获得表2中的半抗原D。半抗原D的产量为54％，且NMR数据如下：
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.85(1H，d，J＝0.9，ar)，4.34(2H，qxd，J＝9.5&7.1，CH2CH3)，3.54(1H，m，NH)，3.25(2H，m，NHCH2)，2.51(2H，t，J＝7.2，CH2CO2)，1.93(2H，qn，J＝6.9，CH2CH2CH2)，1.41(3H，t，J＝7.1，CH2CH2)。
实施例2-5：半抗原E的合成
通过利用实施例1的方法，合成半抗原E(R1＝乙基，R2＝芳基，R3＝氢且R4＝-(CH2)6-)：由此获得的0.50g(1.47mol)O-乙基O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)phorochloridothioate溶于3ml的甲醇，加入4℃冰水，并搅拌5分钟徐徐加入通过在1.7mL甲醇中溶解0.205g(3.23mmol)KOH和0.210g(1.6mmol)氨基己酸获得的含有甲醇的溶液。然后，以类似于实施例2-4的方式合成半抗原E，其产率为53％且NMR数据如下：
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.87(1H，d，J＝1.0，ar)，4.36(2H，qxd，J＝9.6&7.1，CH2CH3)，3.47(1H，m，NH)，3.19(2H，m，NHCH2)，2.40(2H，t，J＝7.3，CH2CO2)，1.50(6H，m，CH2(CH2)3CH2)，1.43(3H，t，J＝7.1，CH2CH3)。
实施例2-6：半抗原F的合成
通过利用实施例1的方法，合成半抗原F(R1＝乙基，R2＝芳基，R3＝氢且R4＝-(CH2)3-)：0.50g(1.47mol))由此获得的O-乙基O-(3，5，6-三氯-2-嘧啶基)phorochloridothioate溶于3ml的甲醇，加入4℃冰水，并搅拌5分钟徐徐加入通过在1.7mL甲醇中溶解0.205g(3.23mmol)KOH和0.166g(1.61mmol)的4-氨基丁酸获得的含有甲醇的溶液。然后，以类似于实施例2-4的方式合成半抗原F，其产率为54％且NMR数据如下：
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.82(1H，s，ar)，4.36(2H，qxd，J＝8.7&7.1，CH2CH3)，3.33(2H，m，NCH2)，2.87(3H，d，J＝12.3，CH3N)，2.46(2H，t，CH2CO2)，1.93(2H，qn，CH2CH2CH2)，1.43(3H，t，J＝7.1，CH2CH3)。
实施例2-7：半抗原G的合成
通过利用实施例1的方法，合成半抗原G(R1＝乙基，R2＝2-(异丙氧基羰基)苯基，R3＝氢且R4＝-CH2(CH3)CH2-)：2.96g(17mmol)的O-乙基二氯硫代磷酸酯溶于10ml的乙腈，加入溶于20ml乙腈的5g重质K2CO3和1.96g(11mmol)水杨酸异丙酯并在室温下搅拌40分钟。然后，反应混合物用cellite过滤，蒸发滤液中的溶剂，且残留物用于通过己烷/乙酸乙酯(10∶1，v/v)平衡的硅胶柱层析，来获得O-乙基O[(2-异丙氧基羰基)苯基]phorochloridothioate的油状化合物。所述化合物的产率为61％且其NMR数据如下：
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.93(1H，dxd，J＝7.7&1.2，ar)，7.55(1H，dxd，J＝8.5&1.5，ar)，7.48(1H，txt，J＝8.4&1.6，ar)，7.32(1H，txt，J＝7.5&1.5，ar)，5.25(1H，sp，J＝6.3，(CH3)2CH)，4.48(2H，q，J＝7.1，CH2CH3)，1.47(3H，t，J＝7.1，CH2CH3)，1.38(6H，d，J＝6.3，CH(CH3)2)。
67mg(0.21mmol)由此获得的O[(2-异丙氧基羰基)苯基]phorochloridothioate溶于0.2mL的甲醇，加入4℃冰水，并搅拌5分钟徐徐加入通过在0.26ml甲醇中溶解31mg(0.55mmol)KOH和26mg(0.25mmol)DL-氨基丁酸的含甲醇溶液。反应溶液被灌注到分液漏斗中并通过加入1N HCl和氯仿获得提取物，通过MgSO4脱水，蒸发残余的溶剂，且残余物被用于通过氯仿∶乙酸乙酯∶乙酸(29∶9∶1，v/v/v)平衡的硅胶柱层析，来获得表2中的半抗原G。获得的半抗原G的产率为66％且其NMR数据如下：
1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.81(1H，dxd，J＝8.9&1.2，ar)，7.60(1H，dxqn，J＝8.2&1.5，ar)，7.48(1H，txt，J＝7.9&1.8，ar)，7.21(1H，txt，J＝7.5&1.1，ar)，5.25(1H，sp，J＝6.2，(CH3)2CH)，4.29(1H，q，J＝9.5，NHCH)，4.20(2H，q，J＝7.1，CH2CH3)，3.97(1H，sp，J＝6.0，NHCH)，2.45(2H，t，J＝6.3，CH2CO2)，1.38(3H，t，J＝7.0，CH2CH3)，1.37(6H，d，J＝6.2，CH(CH3)2)，1.31(3H，CHCH3)。