对虾桃拉综合症病毒基因诊断试剂盒及检测方法.pdf

本发明提供一种对虾桃拉综合症病毒(TSV，Taura Syndrome Virus)的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒及检测方法是以根据桃拉综合症病毒保守区序列设计的一对引物为主体而设计的。本发明采用反转录—聚合酶链式反应(RT－PCR)技术，对桃拉综合症病毒的特异性RNA核酸片段进行定性检测，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于对虾各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。

1.  一种对虾桃拉综合症病毒的基因诊断试剂盒，其特征是该试剂盒包括下列部件：
1).RNA提取液A液，2管，内装Trizol液；
2).B液，1管，内装氯仿；
3).C液，1管，内装异丙醇；
4).D液，1管，内装70％乙醇；
5).E液，1管，内装DEPC水；
6).RT反应液F液，1管，内装RT反应液，包括5×Buffer、dNTP、DEPC-H₂O、随机引物、RNA酶抑制剂RNAsin RI、反转录酶M-MLV RT；
7).RT-PCR反应液G液，1管，内装RT-PCR反应液，包括含mg²⁺的10×Buffer、dNTP、正向引物F1、反向引物R1、ddH₂O和TaqE；F1为：5’-TCAATGAGAGCTTGGTCC，R1为：5’-TTCGCG CCG ACA GAT GAA；
8).阳性对照H液，1管，内装TSV阳性模板；
9).盒子；
10).一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。

2.  一种检测对虾桃拉综合症病毒的方法，其特征是使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行：
1).取新鲜待检样品加A液稀释10～20倍，于匀浆器中冰浴匀浆，室温静置3～5min；
2).在上述匀浆液中加入200μl B液，上下颠倒混匀，静置5～10min；
3).4℃，10000～12000r/min离心10～15min；
4).取400μl上清，加入到500μl C液中，轻轻晃动，静置10～15min；
5).4℃，10000～12000r/min离心10～15min；
6).弃上清，用1ml预冷的D液洗涤2次，4℃，7500～10000r/min离心5～10min；
7).空气干燥或在超净工作台上吹干，加50μl E液水溶解，得到RNA提取液；
8).RNA提取液在95℃预热5～10min；
9).取2μl预热的RNA提取液，加入到8μl F液中，37℃孵育1h；然后95℃水浴5～10min使失活，得到RT-PCR反应模板；
10).分别取2μl RT-PCR反应模板和阳性对照H液加入到48μl G液中，混匀后离心数秒，置于PCR仪上；
11).按下列条件扩增：
95℃ 10min预变性，→94℃ 40sec  35个循环→72℃ 7min→4℃保存
                    55℃ 40sec
                    72℃ 40sec
12).反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察；若在与阳性对照同一位置的231bp处出现明亮的反应条带，则为桃拉综合症病毒阳性，说明待测样品携带桃拉综合症病毒，否则为阴性。

对虾桃拉综合症病毒基因诊断试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及水生经济动物病害的诊断试剂盒及检测方法，主要是针对对虾桃拉综合症病毒(TSV，Taura Syndrome Virus)基因诊断的试剂盒及检测方法。
背景技术
90年代以来，亚洲许多国家和地区虾病爆发性流行，对虾养殖产量锐减，造成了重大的经济损失。虾病尤其是对虾病毒病严重阻碍了对虾养殖业的持续发展。在众多的对虾病毒中，对虾桃拉综合症病毒(TSV)的危害较为严重，是南美白对虾养殖业地头号杀手。关于TSV的研究也是近年来水产养殖病害研究的热点。目前对于对虾病毒病还未有特效的治疗方法，推行对虾的健康养殖是最有效的预防措施，而这主要依赖于早期的快速检测。目前对于对虾病毒的检测方法主要包括传统组织学方法、电子显微技术、生物指示法、生化检测法、免疫学方法(主要有荧光抗体技术、酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫电镜技术、细胞培养方法、分子生物学方法(主要有分子杂交方法、聚合酶链式反应(PCR))等。这些检测方法有些对技术条件要求高，检测时间长，有些所需要的材料制备麻烦，费用高，有些方法灵敏度不高，特异性不强，因此广大虾农掌握关键的技术难度很大，难以推广，限制了这些技术的应用和发展。
早期快速诊断对虾桃拉综合症病毒是目前对虾养殖的主要预防措施和减少对虾损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法是广大对虾养殖者急切盼望的。
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，简称PCR技术)，是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快被应用于实践中。
发明内容
本发明的目的是利用TSV基因保守区序列设计一对引物，建立TSV RT-PCR反应体系，在此基础上优化和设计，提供对虾桃拉综合症病毒的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒可批量生产，操作简单，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于对虾各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。
本发明的对虾桃拉综合症病毒的基因诊断试剂盒包括下列部件：
1).RNA提取液A液，2管，内装Trizol液；
2).B液，1管，内装氯仿；
3).C液，1管，内装异丙醇；
4).D液，1管，内装70％乙醇；
5).E液，1管，内装DEPC水；
6).RT反应液F液，1管，内装RT反应液，包括5×Buffer、dNTP、DEPC-H₂O、随机引物、RNA酶抑制剂RNAsin RI、反转录酶M-MLV RT；
7).RT-PCR反应液G液，1管，内装RT-PCR反应液，包括10×Buffer(含mg²⁺)、dNTP、正向引物F1、反向引物R1、ddH₂O和TaqE；
8).阳性对照H液，1管，内装TSV阳性模板；
9).盒子；
10).一块泡沫板，其大小与上述盒子的底面相同，装于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管数量的小孔，上述各小管分别对应放置于这些小孔中。
上述TSV基因诊断试剂盒中所述的一对引物F1和R1是根据TSV基因保守区序列设计的，其DNA序列分别如下：
F1：5’-TCA ATG AGA GCT TGG TCC
R1：5’-TTC GCG CCG ACA GAT GAA
用本发明上述试剂盒检测对虾桃拉综合症病毒的方法，按下列步骤进行：
1).取新鲜待检样品加A液稀释10～20倍，于匀浆器中冰浴匀浆，室温静置3～5min；待检样品可以是直接取自待检动物的任何部位组织，最好是内脏组织或肌肉组织；
2).在上述匀浆液中加入200μlB液，上下颠倒混匀，静置5～10min；
3).4℃，10000～12000r/min离心10～15mim；
4).取400μl上清，加入到500μl C液中，轻轻晃动，静置10～15min；
5).4℃，10000～12000r/min离心10～15min；
6).弃上清，用1ml预冷的D液洗涤2次，4℃，7500～10000r/min离心5～10min；
7).空气干燥或在超净工作台上吹干，加50μl E液水溶解(若不能完全溶解可于55～60℃放置10～15min)，得到RNA提取液(可于-20℃保存)；
8).RNA提取液在95℃预热5～10min；
9).取2μl预热的RNA提取液，加入到8μl F液中，37℃ 孵育1h；然后95℃水浴5～10min使失活，得到RT-PCR反应模板；
10).分别取2μl RT-PCR反应模板和阳性对照H液加入到48μl G液中，混匀后离心数秒(通常为500～1000r/min离心5～10秒)，置于PCR仪上；
11).按下列条件扩增：
95℃ 10min预变性，→94℃ 40sec  35个循环→72℃ 7min→4℃保存
                    55℃ 40sec
                    72℃ 40sec
12).反应结束后取5～10μl加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟后于紫外仪上观察。若在与阳性对照同一位置的231bp处出现明亮的反应条带，则为TSV阳性，说明待测样品携带桃拉综合症病毒，否则为阴性。
本发明的有益效果：
本发明的对虾桃拉综合症病毒的基因诊断试剂盒及检测方法，是以根据TSV基因保守区序列设计的一对引物为主体而设计的。利用该对引物，可以特异性地扩增携带TSV病毒的待测样品的有关基因片段，所建立优化的RT-PCR反应体系保证检测结果的快速性、准确性和稳定性。因此使用本发明的试剂盒及检测方法，可以简便、快速、灵敏而特异地检测感染TSV的对虾，大大高于传统和常规的生物学方法，可运用于对虾各时期养殖过程中的病毒跟踪检测，也可用于环境监测，避免病毒传播流行，提高科学管理效率，具有很高的实用价值。
附图说明
图1是感染对虾桃拉综合症病毒的对虾肝脏组织样品的PCR检测结果。其中M：DNA分子量标准；Lane1：TSV阴性对照；Lane2：TSV阳性对照；Lane3：检测样品。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：对虾桃拉综合症病毒的基因诊断试剂盒
该试剂盒由以下各部分构成(10样份)：
1.RNA提取液(A液)，2管，5ml/管，内装Trizol液。
2.B液，1管，内装氯仿(也可自备)，共2ml(200μl/份×10份)。
3.C液，1管，内装异丙醇(也可自备)，共5ml(500μl/份×10份)。
4.D液，1管，内装70％乙醇(也可自备)，共10ml(1ml/份×10份)。
5.E液，1管，0.5ml/管，内装DEPC水。
6.RT反应液(F液)，1管，0.1ml/管，内装RT反应液(10μl体系)，包括5×Buffer、dNTP、DEPC-H₂O、随机引物、RNA酶抑制剂RNAsin(RI)、反转录酶M-MLV(RT)。
7.RT-PCR反应液(G液)，1管，0.5ml/管，内装RT-PCR反应液(50μl体系)，包括10×Buffer(含mg²⁺)、dNTP、正向引物F1、反向引物R1、ddH₂O和TaqE。
8.阳性对照(H液)，1管，20ul/管，内装TSV阳性模板。
9.长方体盒子，8.5×5.8×6.2cm³。
10.一块泡沫板，其大小与长方体盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四个孔，孔径1.3cm，第二排五个孔，孔径1.0cm，第三、四排分别六个孔，孔径0.6cm。上述各小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于长方体盒子中。
该试剂盒中的内外一对引物的DNA序列如下：
F1：5’-TCA ATG AGA GCT TGG TCC
R1：5’-TTC GCG CCG ACA GAT GAA
RT反应液体系(10μl体系)如下：
5×Buffer                     2μl
dNTP                          1μl
DEPC-H₂O                     3.3μl
随机引物                         1μl
RNA酶抑制剂RNAsin(RI)            0.2μl
反转录酶M-MLV(RT)                0.5μl
RT-PCR反应液体系(50μl体系)如下：
10×Buffer(含mg²⁺)              10μl
dNTP                             1μl
正向引物F1                       1μl
反向引物R1                       1μl
ddH₂O                          34.7μl
TaqE                             0.3μl
实施例2：对虾桃拉综合症病毒的检测方法
使用实施例1的试剂盒，按下列步骤进行：
1.用无菌操作方法，取新鲜对虾肝脏组织0.1g加1ml A 液稀释，于匀浆器中冰浴匀浆，室温静置3～5min。
2.在上述匀浆液中加入200μl B 液，上下颠倒混匀，静置5min。
3.4℃下，12000r/min离心15min。
4.取400μl上清，加入到500μl C液中，轻轻晃动，静置10min。
5.4℃下，12000r/min离心15min。
6.弃上清，用1ml预冷的D液洗涤2次，4℃下7500r/min离心5min。
7.空气干燥或在超净工作台上吹干，加50μl E 液水溶解(若不能完全溶解可于55-60℃放置10min)。得到的RNA提取液可于-20℃保存。
8.将RNA提取液在95℃预热5min。
9.取2μl预热的RNA提取液，加入到8μl F 液中，37℃下孵育1h；然后95℃水浴5min使失活，得到RT-PCR反应模板。
10.分别取2μl RT-PCR反应模板和阳性对照H液加入到48μl G 液中，混匀后1000r/min离心10秒，置于PCR仪上。
11.按下列条件扩增：
95℃ 10min预变性，→94℃ 40sec  35个循环→72℃ 7min→4℃保存
                    55℃ 40sec
                    72℃ 40sec
12.反应结束后取5～10μl(扩增产物)加4μl溴酚蓝混匀，经0.8％琼脂糖凝胶电泳20～30分钟(5V/cm)后于紫外仪上观察。若在231bp处出现明亮的反应条带(与阳性对照在同一位置)，则为TSV阳性，说明待测样品携带桃拉综合症病毒，否则为阴性(见图1)。