可食用的纳米核-壳胶体及其制备方法 【技术领域】
本发明是一种可食用的纳米核-壳胶体及其制备方法，属高分子化学领域。
背景技术
酪蛋白是牛奶中的主要蛋白质，由4种成分组成：αs1-、αs2-、β-、κ-，其比例为4∶1∶4∶1。酪蛋白在水溶液中的溶解性与pH有关，在等电点附近溶解度最小。酪蛋白的等电点为pH4.6，α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白的等电点分别为pH4.2、pH4.7和pH5.3-5.8(FoodResearch International 33(2000)637-647)。一般认为酪蛋白有一定的二级结构，没有三级结构，其在水溶液中的行为与两亲性的嵌段聚合物相似，具有疏水和亲水相互作用(CurrentOpinion in Colloid and Interface Science 7(2002)456-461)。天然的酪蛋白在牛奶中形成胶体聚集体，粒径为20-600纳米，其结构相当复杂：由亲水和疏水基团组成小胶体粒子，κ-酪蛋白的酸性基团位于小胶体表面起稳定胶体的作用，然后，这些小的胶体粒子通过磷酸钙组装成大的胶体粒子(International Dairy Journal 9(1999)353-357)。因此，酪蛋白聚集体的尺寸，稳定性和聚集度受溶液的pH，钙离子浓度，离子强度和疏水溶剂的影响(InternationalDairy Journal 9(1999)183-188)。
微米尺寸和纳米尺寸的药物载体引起了科学界和工业界的广泛兴趣，这些载体可以是胶体、囊泡或者微球。它们可以装载活细胞、酶、香味油、药物、维生素、农用化学品、催化剂等，并且具有很多优势：液体可以包埋在固体里面，当作固体来使用；毒性物质可以安全地处理；不稳定的化合物可以被保护起来；气味和口感可以被有效地屏蔽；药物可以被控制和有选择地释放等(International Journal ofPharmaceutics 242(2002)163-166)。在食品、医药和化妆品工业中，天然大分子形成的药物/营养物载体由于具有生物利用性和生物降解性因而受到特别的青睐。到目前为止，有通过乳化、喷雾干燥地方法，将豆油装入酪蛋白微胶囊中(J.Agric.Food Chem.49(2001)1934-1938)；用两种不同的蛋白质或者蛋白-多糖混合物在溶液中共凝聚的方法制备药物微胶囊包埋体系(International Journal ofPharmaceutics 242(2002)163-166；Journal Microencapsulation 19(2002)549-558)；酪蛋白与含有还原性糖的碳水化合物进行Maillard反应后的产物用乳化、干燥的方法包裹对氧气敏感的油(US Patent Application 20030185960)；磷酸钙作为内核，将要装载的药物或者蛋白质与磷酸钙结合后用酪蛋白将表面包裹起来作为口服药物(United States Patent Application20020054914)。然而，这些由生物大分子形成的药物/营养物载体还存在以下不足之处：其粒径偏大，都在微米尺度，有的体系尚不稳定，需要加稳定剂，较多的体系制备不简便等。
生物大分子广泛地应用于食品加工中，酪蛋白-多糖混合体系在牛奶产品中有许多应用，因而被广泛地研究过。在混合体系中，随着酪蛋白，多糖的比例和浓度的变化，有可能出现相容或相分离过程，而后者是经常观察到的现象。除酪蛋白以外，其他的蛋白-多糖体系也有类似的现象(International Journal of Pharmaceutics 242(2002)319-324；International Dairy Journal 8(1998)179-193；Food Hydrocolloids 15(2001)555-563)。蛋白-多糖复合物在水合作用(溶解度、粘度)、结构(聚集、凝胶化)、表面(发泡、乳化)方面表现出比纯蛋白或者多糖更好的性能，可用于药物的微胶囊包埋体系(Critical Reviewsin Food Science and Nutrition 38(1998)689-753)。共价键连接的蛋白-多糖共聚物比非共价键连接的蛋白-多糖混合物有明显的优势：在比较宽的实验条件下可以保持分子的完整性和溶解性，在食品、医药和化妆品工业中有很好的应用。阿拉伯树胶是一个天然的蛋白-多糖共价聚合物，被广泛地用做商业乳化剂(Journal of Food Engineering 31(1997)347-363)。
制备蛋白-多糖共价聚合物有三种方法：1、使用化学交联剂(J.Agric.Food Chem.1996，44，2538-2543；US Patent 5516673；5342770)，这类方法由于加入了化学物质，其在食品和医药领域的应用受到了限制；2、电化学合成(Food Hydrocolloids 16(2002)215-224)，该方法还处于基础研究阶段，未见其应用的报道；3、Maillard反应(Food Science andTechnology Research 8(2002)193-199；US Patent Application 20030185960)，这是一个很温和的反应，广泛地出现在食品和生物体系中，将蛋白质-糖混合物加热反应即可以发生。许多单糖和多糖与蛋白质的Maillard反应都被研究过(J.Agric.Food Chem.47(1999)1183-1188；Int.Dairy Journal 8(1998)907-915；Nahrung/Food 45(2001)150-159)。酪蛋白与各种单糖的Maillard反应表明，酪蛋白上的赖氨酸残基和N端上的氨基与糖上的羟基反应，形成共价键(J.Agric.Food Chem.49(2001)4667-4675；50(2002)6725-6739；Bioorganicand Medicinal Chemistry 11(2003)843-852；International Dairy Journal 8(1998)907-915)。酪蛋白与麦芽糖糊精的Maillard反应表明，多糖的还原端羟基与蛋白的赖氨酸残基以及N端上的氨基反应，生成接枝共聚物(Food Hydrocolloids 14(2000)281-286)，酪蛋白在pH＜6时不溶于水溶液中，而酪蛋白-麦芽糖糊精接枝共聚物由于麦芽糖糊精的亲水性，在pH＜6时仍然溶解于水中，形成透明溶液。但是目前尚未见到有关利用Maillard反应制备纳米胶体的报道。
【发明内容】
本发明的目的是获得一种可食用的具有核-壳结构的多糖-酪蛋白接枝共聚物的纳米胶体。
本发明的目的是获得一种制备简便、成本不高、包裹效果好的可食用的纳米胶体。
本发明的目的是利用上述胶体包埋药物/营养物/蛋白质的方法。
本发明的目的是利用上述胶体包埋药物/营养物/蛋白质的应用。
本发明胶体，是由多糖-酪蛋白接枝共聚物获得，该共聚物通过Maillard反应获得，胶体的结构是酪蛋白主链为核、多糖支链为壳，具有很好的单分散性，粒径是40-300纳米，多糖的分子量在1000-200000范围。该类胶体具有包裹药物/营养物/蛋白质的良好效果，由于其可食用性，因此作为药物、营养物、蛋白质等的载体有其广阔的应用前景。
本发明通过Maillard反应将不带电荷的中性多糖共价连接到酪蛋白上，形成以酪蛋白为主链，多糖为支链的接枝共聚物。控制接枝度和多糖分子量可以调节接枝共聚物的亲水/疏水比值。本发明通过三种方法利用酪蛋白-多糖接枝共聚物形成纳米胶体：(1)调节溶液的pH值到酪蛋白的等电点，形成以酪蛋白为核，多糖为壳的单分散纳米胶体；(2)加入带正电荷的蛋白质或多糖到溶液中，酪蛋白与带相反电荷的生物大分子通过静电作用力形成核，而中性多糖位于胶体表面起稳定纳米胶体的作用；(3)加入水溶性的钙离子到溶液中，钙离子促使酪蛋白凝聚形成胶体，而多糖位于胶体的表面。
现有的Maillard反应条件即能实现本发明的共聚物，该现有技术无需多叙述，将获得的共聚物以上述三种中任何一种方法，即可得到本发明所述的目标产物。
根据本发明的目标产物性能，较优化的Maillard反应条件使制备成本降低，产物性能更好：反应温度在50-95℃范围，反应时间在2-120小时，反应pH为6-11，反应可以在固相进行，也可以在液相进行。上述反应条件温和易控，在效果更好的基础上未提高制备成本。一般而言，当反应在较高温度进行时，所需时间大大缩短；当反应在较低pH进行时，所需时间大大增加；在同样的Maillard反应条件下，不同的酪蛋白所需的反应时间不同。
多糖为含有还原性端羟基的中性多糖，例如葡聚糖，或者不带电荷的含有还原性端羟基的多糖衍生物，分子量为1000到200000。酪蛋白为α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白的混合物或者为单组分酪蛋白，即α-酪蛋白或者β-酪蛋白或者κ-酪蛋白，或者酪蛋白酸盐，或者磷酸酪蛋白，或者它们的混合物，或者脱脂奶粉。多糖/酪蛋白的摩尔比是1/20-30/1，对于低分子量的多糖，需要较高的多糖/酪蛋白摩尔比值；而对于分子量较高的多糖，多糖/酪蛋白摩尔比值可以维持在较低的数值，以保证接枝共聚物的疏水/亲水平衡。酪蛋白-多糖接枝共聚物的接枝度指的是酪蛋白上参与Maillard反应的官能团摩尔数与体系中总的官能团摩尔数的比值，官能团指的是酪蛋白上的赖氨酸残基和N端的氨基。控制接枝程度是通过控制多糖/酪蛋白的摩尔比值、Maillard反应的湿度、温度、时间和反应的pH值而达到的。在pH6-11的范围内，接枝共聚物的接枝度随着多糖/酪蛋白比值的增加、反应时间的增加、温度的增加、pH的增加而分别有所增加。接枝度越高，共聚物的亲水性越强。在同样的接枝度下，多糖的分子量越大，共聚物的亲水性越强。在酪蛋白的等电点(pH4.6)，酪蛋白-多糖接枝共聚物由于酪蛋白的疏水聚集而形成疏水核，而亲水的多糖位于疏水核的表面，形成纳米胶体。酪蛋白-多糖接枝共聚物可以和带有相反电荷的生物大分子，如带正电荷的蛋白质或者多糖进行组装，酪蛋白与带正电荷的生物大分子通过静电作用形成胶体的核，而中性多糖形成胶体的壳。酪蛋白-多糖接枝共聚物还可以通过钙离子进行组装，钙离子与酪蛋白上的磷酸基团作用，促进酪蛋白聚集形成核，而多糖在胶体表面起稳定作用。用动态光散射、透射电子显微镜和原子力显微镜表征纳米胶体近似为球形，具有很好的单分散性，其粒径随接枝度和多糖的分子量变化而变化，变化范围为40-300纳米。
本发明中多糖分子量在10000-100000范围较好，获得的胶体亲/疏水比值恰当，包埋效果良好。
在上述分子量范围内，多糖与酪蛋白的摩尔比以1/20-30/1效果较好。
本发明中各种酪蛋白的混合物同样适用作为共聚物的反应物，适合不必特意分离酪蛋白的场合，因为分离既使制备工艺增加，又提高了生产成本。如酪蛋白的混合物或者为单组分酪蛋白，即α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白，或者酪蛋白酸盐，或者磷酸酪蛋白及其混合物，或者脱脂奶粉。
本发明中多糖-酪蛋白接枝共聚反应物的多糖为含有还原性端羟基的中性多糖，或者不带电荷的含有还原性端羟基的多糖衍生物。
用稀酸，例如0.1mol/L的稀酸调节共聚物溶液至酪蛋白等电点，是获得目标产物的好方法。
也可在共聚物溶液中加入带正电荷的多糖或蛋白质或聚电解质获得目标产物，如卵清溶菌酶、壳聚糖等。
若加入水溶性钙离子，得到的目标产物经济实惠，可安全食用，如氯化钙、乳酸钙等。
形成胶体的同时加入欲包裹的药物/营养物/蛋白质，即可获得以目标产物为载体的食用胶囊。
也可以在胶体形成以后，通过扩散的方法得到以目标产物为载体的食用胶囊。胶体的形成以光散射为检测手段。
本发明的胶体十分适合运用包埋药物，作为药物纳米载体。本发明的胶体十分适合运用包埋营养物品，作为营养物纳米载体。本发明的胶体十分适合运用包埋蛋白质，作为蛋白质纳米载体。本发明的胶体十分适合运用包埋对环境敏感的物质。
本发明的纳米胶体在制备过程中，没有加入化学物质，全部采用天然大分子以及水溶性的钙盐，无毒、卫生，因此所制备的纳米胶体可以作为口服药物/营养物/蛋白质载体。通过酪蛋白-多糖接枝共聚物可以用多种方法制备纳米胶体，可以包埋多种药物/营养物/蛋白质。本发明的纳米胶体可以通过接枝度、多糖的分子量控制粒径，所制备的胶体尺寸在纳米数量级，一般在40-300纳米左右，不仅作为载体包埋效果好，食用吸收效果也良好。本发明方法可以得到1％或者浓度更高的纳米胶体水溶液。所制备的纳米胶体冷冻抽干后，可以再次分散到水中，且粒径基本不变。本发明的Maillard反应产物不需要分离，可以直接用来制备纳米胶体，制备方法简便，不需特殊设备。
【附图说明】
图1是不同葡聚糖分子量的β-酪蛋白-葡聚糖胶体的粒径分布。图上葡聚糖与β-酪蛋白的摩尔比为2∶1(Maillard反应在60℃、湿度79％、pH7.0进行24个小时；动态光散射测量在pH4.6，β-酪蛋白浓度0.5mg/mL)。
【具体实施方式】
例1.将酪蛋白加入到去离子水中，在磁力搅拌下配成2.0mg/mL溶液，以0.1mol/LNaOH调节溶液的pH为10.0。加入分子量为35000的葡聚糖到上述溶液中，使葡聚糖/酩蛋白的摩尔比值为1/4，磁力搅拌混合均匀，并保持溶液的pH值，冷冻抽干。将冷冻抽干的固体放在装有KBr饱和溶液的密闭容器中(相对湿度为79％)，置于60℃下进行Maillard反应4小时。聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳表明有一部分酪蛋白共价连接了葡聚糖。将Maillard反应产物用去离子水溶解，得到酪蛋白浓度为10.0mg/mL溶液，用0.1mol/L HCl调节上述溶液的pH值到4.6，即可以得到纳米胶体溶液。用动态激光光散射测量所得到的纳米胶体溶液：粒径为95.7纳米，多分散系数为0.127。
在反应混合物中，当葡聚糖的分子量为10000、葡聚糖的摩尔数小于酪蛋白的摩尔数时，在pH4.6时可能得到白色沉淀或者粒径大、分散性不好的胶体溶液。但是随着葡聚糖分子量的增加，葡聚糖/酪蛋白摩尔比值小于1时也可以得到粒径小于100纳米的胶体。
表1.不同分子量的葡聚糖和不同的葡聚糖/酪蛋白摩尔比值所得到的纳米胶体结果(Maillard反应在60℃、湿度79％、pH10.0进行3或者4个小时；动态光散射测量在pH4.6，酪蛋白浓度0.5mg/mL)
编号葡聚糖分子量 葡聚糖 / 酪蛋白 反应 时间 (小时) 粒径 (nm) 多分 散性 系数 1 62,000 1∶4 4 98.6 0.140 2 1∶2 4 87.6 0.195 3 35,000 1∶4 4 96.1 0.119 4 1∶2 4 80.9 0.212 5 10,000 1∶1 3 148.3 0.210 6 2∶1 3 86.3 0.225
例2.将β-酪蛋白加入到去离子水中，在磁力搅拌下配成2.0mg/mL溶液，以0.1mol/LNaOH调节溶液的pH为7.0。将上述溶液置于冰水浴中，加入分子量为35000的葡聚糖，使葡聚糖/β-酪蛋白的摩尔比值为2/1，磁力搅拌混合均匀，并保持溶液的pH值，冷冻抽干。将冷冻抽干的固体放在装有KBr饱和溶液的密闭容器中(相对湿度为79％)，置于60℃下进行Maillard反应24小时。聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳表明有一部分β-酪蛋白共价连接了葡聚糖。将Maillard反应产物用去离子水溶解，得到β-酪蛋白浓度为2.0mg/mL溶液，用0.1mol/L HCl调节上述溶液的pH值到4.6，即可以得到纳米胶体溶液。用动态激光光散射测量所得到的纳米胶体溶液：粒径为96.7纳米，多分散系数为0.116。
按上述合成方法，用不同分子量的葡聚糖和β-酪蛋白反应，可以得到不同的接枝产物。当葡聚糖的分子量小于6,000、葡聚糖与β-酪蛋白的摩尔比值小于8，Maillard反应在pH7进行24小时后，将产物水溶液的pH值调节到4.6附近时，溶液产生沉淀或者粒径大、分散性不好的胶体，说明接枝共聚物的亲水性不够。但是当葡聚糖的分子量分别为10000、35000和62000时，将产物的水溶液调节到等电点附近可以得到稳定的胶体。用分子量为35000以上的葡聚糖与β-酪蛋白进行Maillard反应时，如果葡聚糖的摩尔数大于β-酪蛋白的摩尔数，则反应产物在等电点附近可以得到近似透明的胶体溶液。
例3.将酪蛋白加入到去离子水中，在磁力搅拌下配成2.0mg/mL溶液，以0.1mol/LNaOH调节溶液的pH为7.0。加入分子量为10000的葡聚糖到上述溶液中，使葡聚糖/酪蛋白的摩尔比值为25/1，磁力搅拌混合均匀，并保持溶液的pH值，将混合溶液置于85℃下进行Maillard反应29小时。取反应产物的上清液进行聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳分析，表明有一部分酪蛋白共价连接了葡聚糖。Maillard反应产物的上清液用0.1mol/L HCl调节到pH4.6，即可以得到纳米胶体溶液。用动态激光光散射测量所得到的纳米胶体溶液：粒径为206.6纳米，多分散系数为0.365。
例4.将κ-酪蛋白加入到去离子水中，在磁力搅拌下配成2.0mg/mL溶液，以0.1mol/LNaOH调节溶液的pH为7.0。将上述溶液置于冰水浴中，加入分子量为10000的葡聚糖，使葡聚糖/κ-酪蛋白的摩尔比值为l/1，磁力搅拌混合均匀，并保持溶液的pH值，冷冻抽干。将冷冻抽干的固体放在装有KBr饱和溶液的密闭容器中(相对湿度为79％)，置于60℃下进行Maillard反应60小时。聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳表明有一部分κ-酪蛋白共价连接了葡聚糖。将Maillard反应产物用去离子水溶解，得到κ-酪蛋白浓度为2.0mg/mL溶液，用0.1mol/L HCl调节上述溶液的pH值到4.6，即可以得到纳米胶体溶液。用动态激光光散射测量所得到的纳米胶体溶液：粒径为148.4纳米，多分散系数为0.253。
例5.将酪蛋白加入到去离子水中，在磁力搅拌下配成10.0mg/mL溶液，以0.1mol/LNaOH调节溶液的pH为7.0，加入分子量为10000的葡聚糖，使葡聚糖/酪蛋白的摩尔比值为1/1，磁力搅拌混合均匀，并保持溶液的pH值，冷冻抽干。将冷冻抽干的固体放在装有KBr饱和溶液的密闭容器中(相对湿度为79％)，置于60℃下进行Maillard反应101小时。聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳表明有一部分酪蛋白共价连接了葡聚糖。将Maillard反应产物用去离子水溶解，得到酪蛋白浓度为10.0mg/mL溶液，用0.1mol/L HCl调节上述溶液的pH值到4.6，即可以得到纳米胶体溶液。用动态激光光散射测量所得到的纳米胶体溶液：粒径为119.8纳米，多分散系数为0.735。
例6.β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物与溶菌酶在中性溶液中形成纳米胶体：
将β-酪蛋白加入到去离子水中，在磁力搅拌下配成2.0mg/mL溶液，以0.1mol/LNaOH调节溶液的pH为7.0。将上述溶液置于冰水浴中，加入分子量为35000的葡聚糖，使葡聚糖/β-酪蛋白的摩尔比值为8/1，磁力搅拌混合均匀，并保持溶液的pH值，冷冻抽干。将冷冻抽干的固体放在装有KBr饱和溶液的密闭容器中(相对湿度为79％)，置于60℃下进行Maillard反应24小时。聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳表明有一部分β-酪蛋白共价连接了葡聚糖。将Maillard反应产物用去离子水溶解，在磁力搅拌下将一定体积的2.92mg/mL溶菌酶滴加到上述经过Maillard反应的接枝共聚物溶液中(pH7.0)，滴加完毕后，得到β-酪蛋白浓度为1.0mg/mL，溶菌酶浓度为0.0875mg/mL的溶液，继续搅拌1小时，即可以得到纳米胶体溶液。用动态激光光散射测量所得到的纳米胶体溶液：粒径为254纳米，多分散系数为0.24。
例7.β-酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物与CaCl2在中性溶液中形成纳米胶体：
将β-酪蛋白加入到去离子水中，在磁力搅拌下配成2.0mg/mL溶液，以0.1mol/LNaOH调节溶液的pH为7.0。将上述溶液置于冰水浴中，加入分子量为35000的葡聚糖，使葡聚糖/β-酪蛋白的摩尔比值为8/1，磁力搅拌混合均匀，并保持溶液的pH值，冷冻抽干。将冷冻抽干的固体放在装有KBr饱和溶液的密闭容器中(相对湿度为79％)，置于60℃下进行Maillard反应24小时。聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳表明有一部分β-酪蛋白共价连接了葡聚糖。将Maillard反应产物用去离子水溶解，在磁力搅拌下将一定体积的0.5mol/LCaCl2溶液滴加到上述经过Maillard反应的溶液中，滴加完毕后，得到β-酪蛋白浓度为1.0mg/mL，CaCl2浓度为0.083mol/L，继续搅拌过夜，即可以得到纳米胶体溶液。用动态激光光散射测量所得到的纳米胶体溶液：粒径为78.7纳米，多分散系数为0.748。
例8.酪蛋白-葡聚糖接枝共聚物与壳聚糖在中性溶液中形成纳米胶体：
将酪蛋白加入到去离子水中，在磁力搅拌下配成100.0mg/mL溶液，以0.1mol/L NaOH调节溶液的pH为7.0，加入分子量为35000的葡聚糖，使葡聚糖/酪蛋白的摩尔比值为1/1，磁力搅拌混合均匀，并保持溶液的pH值，冷冻抽干。将冷冻抽干的固体放在装有KBr饱和溶液的密闭容器中(相对湿度为79％)，置于60℃下进行Maillard反应24小时。聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳表明有一部分酪蛋白共价连接了葡聚糖。将Maillard反应产物用去离子水溶解，在磁力搅拌下将一定体积的2％壳聚糖(壳聚糖溶解于2％乙酸溶液中)滴加到上述经过Maillard反应的接枝共聚物溶液中。在滴加壳聚糖的过程中，自始至终保持溶液的pH在7.0左右(滴加0.1mol/LNaOH)。滴加完毕后，所得溶液的酪蛋白浓度为1.0mg/mL，壳聚糖浓度为0.02mg/mL的溶液，pH7.0。将溶液磁力搅拌过夜，用动态激光光散射测量所得到的纳米胶体溶液：粒径为142.3纳米，多分散系数为0.482。