琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物及其用于蛋白质硝酰化的使用方法.pdf

本发明涉及琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物及合成此类化合物的方法。本发明还涉及琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物用于制备硝酰化蛋白质，例如硝酰化血红素蛋白(例如，硝酰化血红蛋白和硝酰化肌红蛋白)的用途。所述硝酰化蛋白质还任选地与聚环氧烷(PA0)，例如与聚乙二醇(PEG)偶联。聚硝酰化血红素蛋白用作携氧治疗剂(0TA)。本发明进一步涉及所述硝酰化蛋白质的药物组合物和使用硝酰化蛋白质治疗各种病状的方法。

权利要求书
1.  一种式(I)的硝酰化剂：

其中：
R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；
X为氧、硫、氮、磷或硅；
Y为CH2；
n为0或1；并且
m为0或1。

2.  一种制备式(II)的硝酰化剂的方法

包括使具有式(III)的化合物

与N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)在有机碱的存在下反应；
其中R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；
X为氧、硫、氮、磷或硅；
Y为CH2；并且
m为0或1。

3.  一种制备式(IV)的硝酰化剂的方法

包括使具有式(V)的化合物

与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)的存在下反应；
其中
R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；
Y为CH2；并且
m为0或1。

4.  一种具有结构(VI)的硝酰化蛋白质：

其中
Z表示所述蛋白质；
R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；
X为氧、硫、氮、磷或硅；
Y为CH2；
m为0或1；
n为0或1；
p为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的平均数；并且
N为所述蛋白质的氮。

5.  一种制备硝酰化蛋白质的方法，包括使所述蛋白质与式(II)的硝酰化剂反应

其中
R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；
X为氧、硫、氮、磷或硅；
Y为CH2；并且
m为0或1。

6.  一种制备硝酰化蛋白质的方法，包括使所述蛋白质与式(IV)的硝酰化剂反应：

其中R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；
Y为CH2；并且
m为0或1。

7.  根据权利要求1-6中任一项所述的硝酰化剂、硝酰化蛋白质或方法，其中R1、R2、R3和R4的每一个均为-CH3。

8.  根据权利要求1或7所述的硝酰化剂，其中n为1。

9.  根据权利要求8所述的硝酰化剂，其中X为氧或硫。

10.  根据权利要求8所述的硝酰化剂，其中X为氧。

11.  根据权利要求8所述的硝酰化剂，其中X为氧并且R1、R2、R3和R4的每一个均为-CH3。

12.  根据权利要求1或7所述的硝酰化剂，其中n为0。

13.  根据权利要求1-12中任一项所述的硝酰化剂、硝酰化蛋白质或方法，其中m为0。

14.  根据权利要求1-12中任一项所述的硝酰化剂、硝酰化蛋白质或方法，其中m为1。

15.  根据权利要求1所述的硝酰化剂，其选自由以下组成的组：



16.  根据权利要求1所述的硝酰化剂，其中所述硝酰化剂为：


17.  根据权利要求2、7、13和14中任一项所述的方法，其中所述有机碱包括三乙胺(TEA)、N，N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、 吡啶、N-甲基哌啶或其组合。

18.  根据权利要求17所述的方法，其中所述有机碱包括三乙胺。

19.  根据权利要求18所述的方法，其中所述式(III)的化合物、所述N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和所述三乙胺按约1∶2∶3的比例存在。

20.  根据权利要求2、7、13、14和17-19中任一项所述的方法，其中所述反应在约2℃至约30℃温度下进行。

21.  根据权利要求20所述的方法，其中所述反应在约15℃至约25℃温度下进行。

22.  根据权利要求2、7、13、14和17-21中任一项所述的方法，其中所述反应在约4℃温度下进行。

23.  根据权利要求21所述的方法，其中所述反应在约20℃温度下进行。

24.  根据权利要求2、7、13、14和17-23中任一项所述的方法，其中使所述反应进行约3至约6小时。

25.  根据权利要求2、7、13、14和17-24中任一项所述的方法，其中所述反应在极性非质子溶剂中进行。

26.  根据权利要求25所述的方法，其中所述极性非质子溶剂包含乙腈(ACN)、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯(EtOAc)、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)或其组合。

27.  根据权利要求26所述的方法，其中所述极性非质子溶剂包含乙腈。

28.  根据权利要求3、7、13和14中任一项所述的方法，其中所述式(IV)的化合物、N-羟基琥珀酰亚胺和N，N’-二环己基碳二亚胺按 约1∶1.1∶1.1的摩尔比存在。

29.  根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中m为0。

30.  根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中m为1。

31.  根据权利要求3、7、13、14和28-30中任一项所述的方法，其中所述反应在约2℃至约30℃温度下进行。

32.  根据权利要求31所述的方法，其中所述反应在约15℃至约25℃温度下进行。

33.  根据权利要求31所述的方法，其中所述反应在约4℃温度下进行。

34.  根据权利要求31所述的方法，其中所述反应在约20℃温度下进行。

35.  根据权利要求3、7、13、14和28-34中任一项所述的方法，其中使所述反应进行约6至约24小时。

36.  根据权利要求3、7、13、14和28-35中任一项所述的方法，其中所述反应在约7.2至约7.6的pH下进行。

37.  根据权利要求3、7、13、14和28-36中任一项所述的方法，其中所述反应在约7.4的pH下进行。

38.  根据权利要求4、7、13、14、29和30中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述蛋白质的N端氨基经硝酰化。

39.  根据权利要求4、7、13、14、29和30中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中赖氨酸残基的至少一个E(ε)-氨基经硝酰化。

40.  根据权利要求4、7、13、14、29、30、38和39所述的硝酰化蛋白质，其中p为约1至约25。

41.  根据权利要求4、7、13、14、29、30、38和39所述的硝酰化蛋白质，其中p为至少约2。

42.  根据权利要求41所述的硝酰化蛋白质，其中p为至少约10。

43.  根据权利要求40所述的硝酰化蛋白质，其中p为约15至约20。

44.  根据权利要求4、7、13、14、29、30和38-43中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述蛋白质包含血红蛋白(Hb)α-亚基、血红蛋白β-亚基、血红蛋白四聚体、肌红蛋白或白蛋白。

45.  根据权利要求44所述的硝酰化蛋白质，其中所述蛋白质包含血清白蛋白。

46.  根据权利要求45所述的硝酰化蛋白质，其中所述血清白蛋白包括人血清白蛋白(HSA)。

47.  根据权利要求44所述的硝酰化蛋白质，其中所述蛋白质包含血红蛋白α-亚基或血红蛋白β-亚基或血红蛋白四聚体。

48.  根据权利要求44所述的硝酰化蛋白质，其中所述蛋白质包含人血红蛋白α-亚基、人血红蛋白β-亚基或包含人血红蛋白α-亚基和β-亚基的血红蛋白四聚体。

49.  根据权利要求44、47或48中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述血红蛋白四聚体包含交联αα二聚体或交联ββ二聚体。

50.  根据权利要求49所述的硝酰化蛋白质，其中所述硝酰化蛋白质包含人血红蛋白α-亚基。

51.  根据权利要求50所述的硝酰化蛋白质，其中所述人血红蛋白α-亚基在N端缬氨酸残基的α-氨基处经硝酰化。

52.  根据权利要求50或51所述的硝酰化蛋白质，其中所述人血红蛋白α-亚基在选自由赖氨酸-7、赖氨酸-11、赖氨酸-16、赖氨酸-40、赖氨酸-56、赖氨酸-60、赖氨酸-61、赖氨酸-90、赖氨酸-99、赖氨酸-127、赖氨酸-139及其组合组成的组的赖氨酸残基的ε-氨基处经硝酰化。

53.  根据权利要求50所述的硝酰化蛋白质，其中所述硝酰化蛋白质包含人血红蛋白β-亚基。

54.  根据权利要求53所述的硝酰化蛋白质，其中所述人血红蛋白β-亚基在N端缬氨酸残基的α-氨基处经硝酰化。

55.  根据权利要求53或54所述的硝酰化蛋白质，其中所述人血红蛋白β-亚基在选自由赖氨酸-8、赖氨酸-17、赖氨酸-59、赖氨酸-61、赖氨酸-65、赖氨酸-66、赖氨酸-82、赖氨酸-95、赖氨酸-120、赖氨酸-132、赖氨酸-144及其组合组成的组的赖氨酸残基的ε-氨基处经硝酰化。

56.  根据权利要求44-55中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述蛋白质包含血红蛋白四聚体并且所述血红蛋白四聚体包含约17个硝酰化氨基。

57.  根据权利要求4、7、13、14、29、30和38-56中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述硝酰化蛋白质与聚环氧烷(PAO)偶联。

58.  根据权利要求57所述的硝酰化蛋白质，其中所述PAO为聚乙二醇(PEG)。

59.  根据权利要求58所述的硝酰化蛋白质，其中所述PEG的平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿。

60.  根据权利要求58所述的硝酰化蛋白质，其中所述PEG的平均分子量为约3,000至约10,000道尔顿。

61.  根据权利要求58所述的硝酰化蛋白质，其中所述PEG的平均分子量为约4,000至约6,000道尔顿。

62.  根据权利要求61所述的硝酰化蛋白质，其中所述PEG的平均分子量为约5,000道尔顿。

63.  根据权利要求58-62中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述PEG为马来酰亚胺-PEG。

64.  根据权利要求63所述的硝酰化蛋白质，其中所述马来酰亚胺经由亚烃基或亚苯基接头与所述PEG连接。

65.  根据权利要求64所述的硝酰化蛋白质，其中所述亚烃基接头为乙烯接头。

66.  根据权利要求63-65中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述马来酰亚胺-PEG与选自由以下组成的组的蛋白质的硫醇部分偶联：所述蛋白质的半胱氨酸残基的固有硫醇部分、所述蛋白质的硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分及其组合。

67.  根据权利要求66所述的硝酰化蛋白质，其中与半胱氨酸残基的固有硫醇部分偶联或与硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分偶联的所述马来酰亚胺-PEG具有结构(VIII)

其中
Z表示所述蛋白质，
S为所述蛋白质的硫醇，
R3为亚烃基或亚苯基，
X为端基，
m为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的平均数，并且
n表示平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿的PEG的氧乙烯单元的平均数。

68.  根据权利要求67所述的硝酰化蛋白质，其中R3为乙烯。

69.  根据权利要求67或68所述的硝酰化蛋白质，其中m为约6至约10。

70.  根据权利要求67-69中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中X为甲氧基(-OCH3)或羧酸酯(-COOH)。

71.  根据权利要求63-70中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述马来酰亚胺-PEG与血红蛋白β-亚基的半胱氨酸-93残基的硫醇部分偶联。

72.  根据权利要求63-71中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述马来酰亚胺-PEG与血红蛋白α-亚基或β-亚基的硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分偶联。

73.  根据权利要求72所述的硝酰化蛋白质，其中所述硫醇化赖氨酸残基为人血红蛋白α-亚基的硫醇化赖氨酸残基，选自由以下组成的组：赖氨酸-7、赖氨酸-11、赖氨酸-16、赖氨酸-40、赖氨酸-56、赖氨酸-60、赖氨酸-61、赖氨酸-90、赖氨酸-99、赖氨酸-127、赖氨酸-139及其组合。

74.  根据权利要求72所述的硝酰化蛋白质，其中所述硫醇化赖氨酸残基为人血红蛋白β-亚基的硫醇化赖氨酸残基，选自由以下组成的组：赖氨酸-8、赖氨酸-17、赖氨酸-59、赖氨酸-61、赖氨酸-65、 赖氨酸-66、赖氨酸-82、赖氨酸-95、赖氨酸-120、赖氨酸-132、赖氨酸-144及其组合。

75.  根据权利要求58-62中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述PEG为琥珀酰亚胺戊酸酯PEG(SVA-PEG)。

76.  根据权利要求75所述的硝酰化蛋白质，其中所述SVA-PEG与选自所述蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基部分、所述蛋白质末端缬氨酸残基的α-氨基部分或其组合的所述蛋白质氨基部分偶联。

77.  根据权利要求76所述的硝酰化蛋白质，其中与所述蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基部分或所述蛋白质末端缬氨酸残基的α-氨基部分偶联的所述SVA-PEG具有结构(IX)

其中：
Z为所述蛋白质，
N为所述蛋白质的氨基，
X为端基，
m为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的数量，并且
n为平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿的PEG的氧乙烯单元的平均数。

78.  根据权利要求77所述的硝酰化蛋白质，其中X为甲氧基(-OCH3)或羧酸酯(-COOH)。

79.  根据权利要求77或78所述的硝酰化蛋白质，其中m为平均每个四聚体约6至约10个PAO分子。

80.  根据权利要求75-79中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述SVA-PEG与血红蛋白α-亚基或β-亚基的赖氨酸残基的ε-氨基部分偶联。

81.  根据权利要求75-80中任一项所述的硝酰化蛋白质，其中所述SVA-PEG与血红蛋白α-亚基或β-亚基的末端缬氨酸残基的α-氨基部分偶联。

82.  根据权利要求80或81所述的硝酰化蛋白质，其中所述赖氨酸残基为人血红蛋白α-亚基的赖氨酸残基，选自由以下组成的组：赖氨酸-7、赖氨酸-11、赖氨酸-16、赖氨酸-40、赖氨酸-56、赖氨酸-60、赖氨酸-61、赖氨酸-90、赖氨酸-99、赖氨酸-127、赖氨酸-139及其组合。

83.  根据权利要求80或81所述的硝酰化蛋白质，其中所述赖氨酸残基为人血红蛋白β-亚基的赖氨酸残基，选自由以下组成的组：赖氨酸-8、赖氨酸-17、赖氨酸-59、赖氨酸-61、赖氨酸-65、赖氨酸-66、赖氨酸-82、赖氨酸-95、赖氨酸-120、赖氨酸-132、赖氨酸-144及其组合。

84.  一种血红蛋白四聚体，其包含根据权利要求44、47、48、50-52、57-70、72、73和75-82中任一项所述的至少一个α-亚基或根据权利要求44、47、48、53-55、57-72、74-81和83中任一项所述的至少一个β-亚基。

85.  根据权利要求84所述的血红蛋白四聚体，其包含根据权利要求44、47、48、50-52、57-70、72、73和75-82中任一项所述的至少一个α-亚基或根据权利要求44、47、48、53-55、57-72、74-81和83中任一项所述的至少一个β-亚基。

86.  根据权利要求85所述的血红蛋白四聚体，其包含根据权利要求44、47、48、50-52、57-70、72、73和75-82中任一项所述的两个α-亚基或根据权利要求44、47、48、53-55、57-72、74-81和83中任一项所述的两个β-亚基。

87.  根据权利要求84-86中任一项所述的血红蛋白四聚体，其中所述血红蛋白平均每个四聚体与5-10个PAO分子偶联。

88.  根据权利要求87所述的血红蛋白四聚体，其中所述血红蛋白平均每个四聚体与7.1-8.9个PAO分子偶联。

89.  根据权利要求84-88中任一项所述的血红蛋白四聚体，其中所述血红蛋白经氧合。

90.  根据权利要求84-89中任一项所述的血红蛋白四聚体，其中所述血红蛋白经脱氧。

91.  根据权利要求84-90中任一项所述的血红蛋白四聚体，其中所述血红蛋白与CO、NO或CO和NO的混合物配位。

92.  根据权利要求5-7、13、14、29和30中任一项所述的方法，其中所述硝酰化剂的比例按超过所述蛋白质约5倍至约100倍摩尔过量存在。

93.  根据权利要求5-7、13、14、29、30和92中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含血红蛋白四聚体的α-亚基或β-亚基。

94.  根据权利要求5-7、13、14、29、30、92和93中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含血红蛋白四聚体。

95.  根据权利要求94所述的方法，其中所述血红蛋白四聚体为非氧合血红蛋白四聚体。

96.  根据权利要求95所述的方法，其中所述非氧合血红蛋白四 聚体为CO配位血红蛋白四聚体。

97.  根据权利要求95所述的方法，其中所述血红蛋白四聚体为脱氧化血红蛋白四聚体。

98.  根据权利要求5-7、13、14、29、30、92-97中任一项所述的方法，其中所述反应在约2℃至约30℃温度下进行。

99.  根据权利要求98所述的方法，其中所述反应在约15℃至约25℃温度下进行。

100.  根据权利要求98所述的方法，其中所述反应在约2℃至约8℃温度下进行。

101.  根据权利要求98所述的方法，其中所述反应在约4℃温度下进行。

102.  根据权利要求98所述的方法，其中所述反应在约20℃温度下进行。

103.  根据权利要求5-7、13、14、29、30、92-102中任一项所述的方法，其中使所述反应进行约3至约20小时。

104.  根据权利要求103所述的方法，其中使所述反应进行约3至约6小时。

105.  根据权利要求103所述的方法，其中使所述反应进行16小时。

106.  根据权利要求5-7、13、14、29、30、92-105中任一项所述的方法，其中所述反应在水溶剂中进行。

107.  根据权利要求5-7、13、14、29、30、92-106中任一项所述的方法，其中所述反应在约6.5至约8.5的pH下进行。

108.  根据权利要求107所述的方法，其中所述反应在约7.5的pH下进行。

109.  根据权利要求107所述的方法，其中所述反应在约7.2的pH下进行。

110.  根据权利要求5-7、13、14、29、30、92-109中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含血红蛋白四聚体，所述反应在约7.2的pH和约2℃至约8℃温度下进行并且使其进行约16小时，并且其中所述方法产生具有约17个硝酰化氨基的硝酰化血红蛋白四聚体。

111.  根据权利要求5-7、13、14、29、30和92-110中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含血红蛋白四聚体，并且所述硝酰化剂以超过所述血红蛋白四聚体约10至约100倍的摩尔过量存在。

112.  根据权利要求5-7、13、14、29、30和92-111中任一项所述的方法，其中所述反应的产物为根据权利要求4、7、13、14、29、30和38-83中任一项所述的硝酰化蛋白质或根据权利要求84-91中任一项所述的血红蛋白四聚体。

113.  根据权利要求5-7、13、14、29、30和92-112中任一项所述的方法，进一步包括使所述蛋白质与聚环氧烷(PAO)偶联。

114.  根据权利要求113所述的方法，进一步包括：
向在水性稀释剂中的所述蛋白质添加琥珀酰亚胺戊酸酯PAO以形成PAO-戊酸酯偶联蛋白。

115.  根据权利要求113所述的方法，进一步包括：
使所述蛋白质与2-亚氨基硫烷(2-IT)在水性稀释剂中混合以形成硫醇化蛋白质；并且
向在所述水性稀释剂中的所述硫醇化蛋白质添加PAO-马来酰亚 胺以形成PAO-马来酰亚胺偶联蛋白。

116.  根据权利要求113-115中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含血红蛋白四聚体。

117.  根据权利要求113或116所述的方法，其中所述血红蛋白四聚体包含交联αα二聚体或交联ββ二聚体。

118.  根据权利要求115-117中任一项所述的方法，其中所述2-亚氨基硫烷以超过所述蛋白质浓度约7至约15倍摩尔过量的浓度存在。

119.  根据权利要求115-117中任一项所述的方法，其中所述2-亚氨基硫烷以超过所述蛋白质浓度约7至约8倍摩尔过量的浓度存在。

120.  根据权利要求115-117中任一项所述的方法，其中所述2-亚氨基硫烷以超过所述蛋白质浓度约7.5倍摩尔过量的浓度存在。

121.  根据权利要求115-120中任一项所述的方法，其中所述PAO-马来酰亚胺以超过所述蛋白质浓度约9至约20倍摩尔过量的浓度存在。

122.  根据权利要求115-120中任一项所述的方法，其中所述PAO-马来酰亚胺以超过所述蛋白质浓度约9至约15倍摩尔过量的浓度存在。

123.  根据权利要求115-120中任一项所述的方法，其中所述PAO-马来酰亚胺以超过所述蛋白质浓度约12倍摩尔过量的浓度存在。

124.  根据权利要求115-123中任一项所述的方法，其中所述硫醇化步骤在介于约7至约9之间的pH下进行。

125.  根据权利要求115-123中任一项所述的方法，其中所述硫醇 化步骤在约8.5的pH下进行。

126.  根据权利要求115-125中任一项所述的方法，其中向所述硫醇化蛋白质添加所述PAO-马来酰亚胺以形成PAO-马来酰亚胺偶联蛋白的步骤在介于约6.5至约8.5之间的pH下进行。

127.  根据权利要求115-125中任一项所述的方法，其中向所述硫醇化蛋白质添加所述PAO-马来酰亚胺以形成PAO-马来酰亚胺偶联蛋白的步骤在约7.5的pH下进行。

128.  根据权利要求113-127中任一项所述的方法，其中在所述蛋白质硝酰化之前，所述蛋白质与PAO偶联。

129.  根据权利要求115-128中任一项所述的方法，其中向所述硫醇化蛋白质添加所述PAO-马来酰亚胺以形成PAO-马来酰亚胺偶联蛋白的步骤与所述蛋白质的硝酰化同时进行。

130.  根据权利要求114-129中任一项所述的方法，其中向所述蛋白质添加所述琥珀酰亚胺戊酸酯PAO以形成PAO-戊酸酯偶联蛋白的步骤与所述蛋白质的硝酰化同时进行。

131.  一种药物组合物，包含根据权利要求4、7、13、14、29、30和38-83中任一项所述的硝酰化蛋白质或根据权利要求84-91中任一项所述的血红蛋白四聚体和药学上可接受的载体。

132.  根据权利要求131所述的药物组合物，其中所述组合物与血液具正常胶体渗透压。

133.  根据权利要求131或132所述的药物组合物，其中所述组合物与血液相比具高胶体渗透压。

134.  根据权利要求131-133中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包括水性稀释剂。

135.  根据权利要求134所述的药物组合物，其中所述水性稀释剂包括胶体的水溶液或非携氧组分的水溶液。

136.  根据权利要求134或135所述的药物组合物，其中所述水性稀释剂包括无细胞水溶液。

137.  根据权利要求134-136中任一项所述的药物组合物，其中所述水性稀释剂包括蛋白质水溶液、糖蛋白水溶液、多糖水溶液或其组合。

138.  根据权利要求134-137中任一项所述的药物组合物，其中所述水性稀释剂包括白蛋白的无细胞水溶液。

139.  根据权利要求131-138中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包括生理盐水、盐水-葡萄糖混合物、林格氏溶液、乳酸林格氏溶液、洛克-林格氏溶液、克雷布-林格氏溶液、哈特曼平衡盐水、肝素化柠檬酸钠-柠檬酸-右旋糖溶液、醋酸盐溶液、多电解质溶液、乳糖酸盐溶液、高分子血浆代用品或其组合。

140.  根据权利要求139所述的药物组合物，其中所述高分子血浆代用品包括聚环氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、环氧乙烷-丙二醇缩合物或其组合。

141.  根据权利要求131-140中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包括填料、盐、生理缓冲液、碳水化合物、醇、多元醇、抗氧化剂、抗菌剂、胶体渗透压剂、还原剂或其组合。

142.  根据权利要求141所述的药物组合物，其中所述还原剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸或其组合。

143.  根据权利要求131-142中任一项所述的药物组合物，其用于治疗急性肝功能衰竭、乙型地中海贫血、烧伤、慢性临界性肢体缺血、二氧化碳或氰化物中毒、慢性阻塞性肺病(COPD)、充血性心力衰竭、 缺氧、疟疾、器官缺血、外周血管疾病、卟啉症、孕期先兆子痫、脓毒症、镰状细胞病、视网膜疾病、眼内病状、睾丸扭转、创伤、休克、创伤性脑损伤、溃疡、血管痉挛或其组合。

144.  根据权利要求143所述的药物组合物，其中所述器官缺血包括急性肠缺血(扭转)、急性肠缺血(栓塞)、心源性休克、急性血管器官缺血、中风、心肌梗塞或重度心肌缺血。

145.  根据权利要求131-142中任一项所述的药物组合物，其用于治疗非创伤性出血性休克、院前创伤、创伤性出血性休克、急性肺损伤、成人呼吸窘迫综合征、创伤性脑损伤、中风、实体瘤癌症、器官退化(活体外)、器官退化(受者体内)、重型脓毒症、脓毒性休克、心肌梗塞、心肌缺血、心源性休克、急性心力衰竭、肺栓塞或其组合。

146.  根据权利要求131-142中任一项所述的药物组合物，其用作血管成形术的附属品，用作整形手术的附属品，在植入心室辅助装置中用作附属品，用作血液代用品、保心药、冷冻保护剂、血液透析附属品、肿瘤剂、器官保护剂、性能增强剂、手术附属品或伤口愈合剂；用于成像；改善肺功能；或其组合。

147.  根据权利要求131-142中任一项所述的药物组合物，其用于兽医治疗由于损伤引起的失血、溶血性贫血、感染性贫血、细菌感染、因子IV断裂、脾机能亢进和脾大、禽类出血性综合征、再生不良性贫血、再生障碍性贫血、特发性免疫溶血性病状、缺铁、同族免疫性溶血性贫血、微血管病性溶血性贫血、寄生病或手术麻醉引起的脑损伤。

148.  一种治疗方法，包括向有需要的受试者施用根据权利要求84-91中任一项所述的血红蛋白四聚体或根据权利要求131-147中任一项所述的药物组合物。

149.  根据权利要求148所述的治疗方法，其中所述受试者为动 物。

150.  根据权利要求149所述的治疗方法，其中所述受试者为人。

151.  根据权利要求148-150中任一项所述的治疗方法，其中所述方法是治疗急性肝功能衰竭、乙型地中海贫血、烧伤、慢性临界性肢体缺血、二氧化碳或氰化物中毒、慢性阻塞性肺病(COPD)、充血性心力衰竭、缺氧、疟疾、器官缺血、外周血管疾病、卟啉症、孕期先兆子痫、脓毒症、镰状细胞病、视网膜疾病、眼内病状、睾丸扭转、创伤、休克、创伤性脑损伤、溃疡、血管痉挛或其组合的方法。

152.  根据权利要求151所述的方法，其中所述器官缺血包括急性肠缺血(扭转)、急性肠缺血(栓塞)、心源性休克、急性血管器官缺血、中风、心肌梗塞或重度心肌缺血。

153.  根据权利要求148-150中任一项所述的治疗方法，其中所述方法是治疗非创伤性出血性休克、院前创伤、创伤性出血性休克、急性肺损伤、成人呼吸窘迫综合征、创伤性脑损伤、中风、实体瘤癌症、器官退化(活体外)、器官退化(受者体内)、重型脓毒症、脓毒性休克、心肌梗塞、心肌缺血、心源性休克、急性心力衰竭、肺栓塞或其组合的方法。

154.  根据权利要求148-150中任一项所述的治疗方法，其中施用所述血红蛋白四聚体或药物组合物作为血管成形术的附属品，作为整形手术的附属品或在植入心室辅助装置中作为附属品；作为血液代用品、保心药、冷冻保护剂、血液透析附属品、肿瘤剂、器官保护剂、性能增强剂、手术附属品或伤口愈合剂；用于成像；改善肺功能；或其组合。

155.  根据权利要求148-150中任一项所述的治疗方法，其中施用所述血红蛋白四聚体或药物组合物作为血管成形术的附属品，作为胸主动脉修复的附属品，作为心肺分流术的附属品，或作为心肺分流术 的预充液。

156.  根据权利要求148或149所述的治疗方法，其中所述受试者为非人类动物并且所述方法是兽医治疗由于损伤引起的失血、溶血性贫血、感染性贫血、细菌感染、因子IV断裂、脾机能亢进和脾大、禽类出血性综合征、再生不良性贫血、再生障碍性贫血、特发性免疫溶血性病状、缺铁、同族免疫性溶血性贫血、微血管病性溶血性贫血、寄生病或手术麻醉引起的脑损伤的方法。

157.  一种向组织输送氧、一氧化氮、一氧化碳或其混合物并且在微脉管系统中将亚硝酸盐还原为一氧化氮(NO)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求4、7、13、14、29、30和38-83中任一项所述的硝酰化蛋白质或根据权利要求131-147中任一项所述的药物组合物，其中在施用之后，所述血红蛋白变为未配位并且在微脉管系统中将亚硝酸盐还原为一氧化氮。

说明书琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物及其用于蛋白质硝酰化的使用方法
技术领域
本发明总体上涉及琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物及合成琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物的方法。本发明还涉及琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物用于制备硝酰化蛋白质，例如硝酰化血红素蛋白(例如，硝酰化血红蛋白和硝酰化肌红蛋白)的用途。所述硝酰化蛋白质还任选地与聚环氧烷(PAO)，例如与聚乙二醇(PEG)偶联。聚硝酰化血红素蛋白用作携氧治疗剂(OTA)并且能够输送分子氧、一氧化碳、一氧化氮及其混合物。因此，本发明进一步包括所述硝酰化蛋白质的药物组合物和使用硝酰化蛋白质治疗各种病状的方法。
发明背景
早已将血红蛋白类氧载体(“HBOC”)与归因于血红素清除一氧化氮(NO)的血管收缩联系起来。用作氧治疗剂(有时称为“携氧血浆扩容剂”)的氧载体，例如稳定血红蛋白(Hb)，已经证实功效有限，这是因为它们清除了一氧化氮，引起血管收缩和高血压。在动物和人类中，这些携氧溶液引起血管收缩的倾向可表现为高血压。虽然HBOC血管收缩效应的根本机制不是很清楚，但是已经表明血红素铁可能迅速且不可逆地与内源NO，一种强效的血管扩张剂结合，从而引起血管收缩。
部分由于这些血管收缩效应，虽然包含经修饰无细胞Hb的产品已经是最有前景的，但是至今尚无氧载体完全成功地用作携氧治疗剂(OTA)。美国军方已经研发了α链与双-二溴水杨酸-富马酸酯(ααHb)之间交联的人Hb，作为模型红细胞代用品，但是其在表现出肺部和 全身血管阻力严重增加后被放弃(Hess，J.等，1991，Blood 78：356A)。这种产品的商业形式在令人失望的III期临床试验后也被放弃(Winslow，R.M.，2000，Vox Sang 79：1-20)。
在尝试克服Hb的NO结合活性中已经提出了两种分子方法。第一种方法使用远端血红素口袋的定点诱变以试图产生NO结合亲和力降低的重组血红蛋白(Eich，R.F.等，1996，Biochem.35：6976-83)。第二种方法使用化学改性法，其中通过寡聚化增大Hb的尺寸，以试图降低或可能完全抑制Hb从血管间隙外渗到胞间隙(Hess，J.R.等，1978，J.Appl.Physiol.74：1769-78；Muldoon，S.M.等，1996，J.Lab.Clin.Med.128：579-83；Macdonald，V.W.等，1994，Biotechnology 22：565-75；Furchgott，R.，1984，Ann.Rev.Pharmacol.24：175-97；和Kilbourne，R.等，1994，Biochem.Biophys.Res.Commun.199：155-62)。
事实上，已经生成了在大鼠最大负载实验中血压不那么高，对NO的缔合结合率降低的重组Hb(Doherty，D.H.等，1998，Nature Biotechnology 16：672-676和Lemon，D.D.等1996，Biotech 24：378)。然而，研究表明NO结合可能不是Hb血管活性的唯一解释。已经发现，某些Hb大分子，例如经聚乙二醇(PEG)改性的Hb大分子，实际上没有血管收缩，即使其NO缔合率与严重高血压ααHb相等(Rohlfs，R.J.等1998，J Biol.Chem.273：12128-12134)。此外，发现在出血之前作为交换输血给出时，PEG-Hb对预防出血后果非常有效(Winslow，R.M.等1998，J.Appl.Physiol.85：993-1003)。
PEG与Hb的偶联降低了其抗原性并且延长了其循环半衰期。然而，已经报道PEG偶联反应导致Hb四聚体解离成αβ-二聚体亚基，在接受Hb单体单元的PEG偶联物的交换输血大鼠体内产生低于40,000道尔顿(“Da”)的总血色蛋白尿(Iwashita和Ajisaka Organ-Directed Toxicity：Chem.Indicies Mech.，Proc.Symp.，Brown等1981年编辑，Pergamon，Oxford，England，第97-101页)。由Enzon，Inc.制备了分子量大于84,000道尔顿的聚环氧烷(“PAO”)偶联Hb(美国专 利号5,650,388)，其携带了约10个拷贝的PEG-5,000链，在其α和ε-氨基处与Hb连接。将这种取代度描述为避免了哺乳动物中血红蛋白尿相关的临床显著肾毒性。然而，偶联反应产生了异种偶联物群体并且含有必须通过柱色谱法去除的其它有害反应物。
PEG偶联通常通过活化PEG部分与生物分子表面上官能团的反应进行。最常见的官能团为赖氨酸的氨基、组氨酸残基的咪唑基和蛋白质的N末端；半胱氨酸残基的硫醇基；及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基和所述蛋白质的C末端。通常通过将羟基末端转化为能够在适度含水环境中与这些官能团反应的反应性部分活化PEG。用于偶联治疗性生物药品的最常见单官能PEG之一是甲氧基-PEG(“mPEG-OH”)，其只有一个官能团(即，羟基)，从而将双官能PEG相关的交联和聚集问题减到最少。然而，由于其生产工艺，mPEG-OH常常受范围可高达10-15％的高分子量双官能PEG(即“PEG二醇”)污染(Dust J.M.等人1990，Macromolecule 23：3742-3746)。这种双官能PEG二醇具有约略为所需单官能PEG两倍的尺寸。随着PEG分子量增加，污染问题进一步加重。mPEG-OH的纯度对PEG话生物治疗剂的生产尤其重要，因为FDA在最终药物产品的生产工艺和质量方面要求有高水平的再现性。
已经在氧合和脱氧状态下进行了Hb与PAO的偶联。美国专利号6,844,317描述了在氧合或“R”状态下偶联Hb，通过在偶联之前用大气使Hb平衡以增强所生成的PEG-Hb偶联物的氧亲和力。其他人描述了偶联之前为减弱氧亲和力并增加结构稳定性的的脱氧步骤，使Hb能够经受住化学修饰、渗滤和/或无菌过滤和巴氏杀菌(pasteurization)的物理应力(美国专利号5,234,903)。对于Hb的分子内交联，表明为使α-链的赖氨酸99暴露于交联剂，可能需要在修饰之前使Hb脱氧(美国专利号5,234,903)。
Acharya等人研究了在与PEG偶联之前，用2-亚氨基硫烷硫醇化Hb的动力学(美国专利号7,501,499)。观察到，使亚氨基硫烷浓度从 每个四聚体平均引入5个外来硫醇的10倍增加到30倍几乎使Hb上的外来硫醇数量翻倍。然而，即使有双倍数量的硫醇，PEG偶联后所见的尺寸增加只有少量。这表明在20倍摩尔过量的马来酰亚胺基PEG-5000存在下的偶联反应用较少反应性硫醇覆盖Hb表面，导致了抵御用更多反应性硫醇进一步修饰Hb的立体干扰。因此，为达到经修饰Hb的所需偶联度(即6±1个PEG/个Hb分子)，Acharya等人用8-15摩尔过量的亚氨基硫烷硫醇化Hb，然后使硫醇化Hb于16-30倍摩尔过量的马来酰亚胺基PEG-5000反应。然而，在大规模生产中这些高摩尔过量的反应物浓度明显增加了制备HBOC的成本并且增加了最终产物的异质性。而且，这种高摩尔过量的马来酰亚胺基PEG-5000还随着更多数量的不必要副反应物的生成，产生了更异质的产品。
在先前的研究中，观察到表面经修饰的血红蛋白的分子大小必须足够大以免被肾脏清除和达到所需循环半衰期。Blumenstein，J.等人确定，这可在或高于84,000道尔顿(“Da”)的分子量下实现(“Blood Substitutes and Plasma Expanders，”Alan R.Liss编者，New York，N.Y.，第205-212页(1978))。在该研究中，作者使不同分子量的葡聚糖与Hb偶联。他们报道称，Hb(分子量为64,000Da)和葡聚糖(分子量为20,000Da)的偶联物“通过从循环中缓慢清除并且可以忽略通过肾脏清除”。进一步地，观察到增加分子量到高于84,000Da并未明显改变这些清除曲线。分子内交联将四聚体血红蛋白单元的亚基化学结合在一起以防止形成由肾脏过早分泌的二聚体。(见，例如，美国专利号5,296,465)
硝基氧是得到确认的低毒性抗氧化合物，其在炎性疾病动物模型中减弱了氧化损伤并且保护了生物可用NO气体。据信它们主要通过起到SOD模拟物或自由基清除剂的作用发挥保护作用。因此，聚硝酰化化合物具有抗氧化和抗炎性质。这不得与结合HBOC与一氧化氮(NO)供体分子相混淆，已经报道这样增强了血管舒张。见，例如，美国专利申请公布号2010/0311657。然而，SOD-模拟硝基氧由于其 尺寸小，血浆半衰期短，因此难以在体内维持这些分子的抗氧化功效。
鉴于以上，本领域需要不引起血管收缩和高血压并且具有抗氧化和抗炎性质的携氧治疗剂。
而且，目前活化用作硝酰化剂的硝基氧的方法是多步骤且昂贵的工艺。因此本领域需要简单价廉的制备用作硝酰化剂的硝基氧化合物的方法。
发明概述
本发明的一方面涉及式(I)的硝酰化剂：

R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；X为氧、硫、氮、磷或硅；Y为CH2；n为0或1；并且m为0或1。
本发明的另一方面涉及制备式(II)的硝酰化剂的方法：

包括使具有式(III)的化合物

与N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)在有机碱的存在下反应；其中R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；X为氧、硫、氮、磷或硅；Y为CH2；并且m为0或1。
本发明的再一方面涉及制备式(IV)的硝酰化剂的方法：

包括使具有式(V)的化合物

与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)的存在下反应；其中R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；Y为CH2；并且m为0或1。
又一方面是包含至少一个硝酰化氨基的硝酰化蛋白质并且所述硝酰化蛋白质可具有结构(VI)：

其中Z表示所述蛋白质；R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；X为氧、硫、氮、磷或硅；Y为CH2；m为0或1；n为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的平均数，所述-NH-基团为所述蛋白质的胺基并且N为所述蛋白质的氮。
本发明的再一方面是可包含至少一个硝酰化氨基的硝酰化蛋白质，所述硝酰化蛋白质具有结构(VII)：

其中Z表示所述蛋白质；R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；Y为CH2；m为0或1；n为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的平均数，所述-NH-基团为所述蛋白质的胺基；并且N为所述蛋白质的氮。
另一方面是具有为马来酰亚胺-PEG的偶联PEG的硝酰化蛋白质，其中与半胱氨酸残基的固有硫醇部分偶联或与硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分偶联的马来酰亚胺-PEG具有结构(VIII)

其中Z表示所述蛋白质，S为所述蛋白质的硫醇基，R3为亚烃基或亚苯基，X为端基，m为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的平均数，并且n表示平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿的PEG的氧乙烯单元的平均数。
又一方面是具有为马来酰亚胺-PEG的偶联PEG的硝酰化蛋白质，其中与半胱氨酸残基的固有硫醇部分偶联或与硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分偶联的马来酰亚胺-PEG具有结构(VIII)

其中Z表示所述蛋白质，S为所述蛋白质的硫醇基，R3为亚烃基或亚苯基，X为端基，m为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的平均数，并且n表示平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿的PEG的氧乙烯单元的平均数。
本发明的另一方面是制备硝酰化蛋白质的方法，包括使所述蛋白质与式(IV)的硝酰化剂反应：

其中R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；Y为CH2；并且m为0或1。根据权利要求G2所述的方法，其中R1、R2、R3和R4的每一个独立地为-CH3。
又一方面是使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中与半胱氨酸残基的固有硫醇部分偶联的马来酰亚胺-PEG具有结构(VIII)

其中Z表示所述蛋白质，R3为亚烃基或亚苯基，S为所述蛋白质的硫醇基，m为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的平均数，并且n表示平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿的PEG的氧乙烯单元的平均数。
附图简述
图1示出了4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧(TEMPOL)的ESI-TOF高精度质谱法的结果。
图2示出了确认4-琥珀酰亚胺-TEMPO-碳酸酯(4-STC)的分子结构的ESI-TOF高精度质谱法的结果。
图3示出了对TEMPOL、N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)、来自TEMPOL和DSC的反应在6小时时间点的反应产物和最终4-STC反应产物进行的薄层色谱法(TLC)结果。
图4示出了聚硝酰化之前和之后(PN-MP4)，TEMPOL和PEG化血红蛋白(MP4)的电子顺磁共振(EPR)图谱。
图5示出了PEG化血红蛋白(PEG-Hb)和聚硝酰化PEG化血红蛋 白(PEG-Hb-PN)的尺寸排阻分析图。
图6示出了聚硝酰化PEG化血红蛋白(PEG-Hb-PN)的特征紫外-可见光谱图。
图7示出了在向大鼠施用PEG-Hb-PN后血浆血红蛋白的紫外-可见光谱图。
图8示出了其中按超过PEG化血红蛋白1∶5-1∶100摩尔过量，使用4-琥珀酰亚胺-TEMPO-碳酸酯(4-STC)硝酰化PEG化血红蛋白的实验的代表性结果。
图9和13示出了人血清白蛋白(HSA)的MALDI-TOF图谱。
图10-12和14-16示出了按超过HSA的1∶5-1∶100摩尔过量，使用4-琥珀酰亚胺-TEMPO-碳酸酯聚硝酰化HSA的MALDI-TOF图谱。
图17示出了其中按超过HSA的1∶5-1∶100摩尔过量，使用4-琥珀酰亚胺-TEMPO-碳酸酯(4-STC)硝酰化HAS的实验的代表性结果。
定义
当在本公开中使用术语“一”、“一个”或“一种”时，除非另外指出，它们意指“至少一个”或“一个或多个”。
如本文所使用，“活化聚环氧烷”或“活化PAO”指具有至少一个官能团的PAO分子。官能团是与分子上要与PAO偶联的游离胺、巯基或羧基相互作用的反应性部分。例如，与游离巯基反应的一个此类官能团为马来酰亚胺基。与游离胺反应的官能团为琥珀酰亚胺基。
“脱氧血红蛋白”或“非配位血红蛋白”指没有外源配体与血红素结合的任何血红蛋白。
“血红蛋白”或“Hb”通常指运输氧的血红素蛋白。在人类中，每个 Hb分子有4个亚基、2个α-链亚基和2个β-链亚基，其呈四聚体结构排列。每个亚基还含有一个血红素基团，所述血红素基团是亚铁(Fe2+)中结合配体O2、NO或CO的含铁中心。因此，每个Hb分子可以结合多达4个配体分子，分别生成HbO2、HbNO或HbCO配位化合物。另外，血红蛋白可与O2、NO或CO的混合物配位。
“血红蛋白类氧载体”(HBOC)指携带氧，但是也用于携带其它分子气体，例如一氧化碳和一氧化氮的血红蛋白。
“高氧亲和力”指已经修饰表现出高于无基质血红蛋白(SFH)的氧亲和力的血红蛋白。因此，“高氧亲和力”Hb的P50低于SFH，在37℃和pH 7.4下测量，SFH的P50为15mmHg。
“配位血红蛋白”指外源配体与血红素结合的血红蛋白。常见优选配体包括氧气、一氧化碳和一氧化氮。
“MalPEG”指马来酰亚胺基聚乙二醇，并且包括经由接头与聚乙二醇连接的马来酰亚胺基部分。
“MalPEG-Hb”指已经与马来酰亚胺基活化PEG偶联的Hb。通过使MalPEG与Hb上的硫醇基(并且在较小程度上，与氨基)反应形成MalPEG-Hb进行所述偶联。在Hb氨基酸序列中存在的半胱氨酸残基中发现硫醇基，例如βCys 93处的两个固有硫醇，并且也可以通过将表面氨基修饰为含有硫醇基而引入。称为MP4(Sangart，Inc.)的示例性MalPEG-Hb具有下式：

其中Hb为血红蛋白；S为血红蛋白上的硫醇基；n为5,000道尔 顿聚环氧烷聚合物的氧乙烯单元的数量；并且m为与血红蛋白偶联的马来酰亚胺基活化聚环氧烷聚合物的平均数并且为7-8。
“高铁血红蛋白”或“metHb”指含有呈高铁状态的铁的Hb氧化形式。MetHb并未起氧或CO载体的作用。如本文所使用，术语“高铁血红蛋白％”指氧化Hb占总Hb的百分比。
“甲氧基-PEG”或“mPEG-OH”指其中羟基末端的氢经甲基(-CH3)置换的PEG。
“经修饰血红蛋白”或“经修饰Hb”指已经通过化学反应，例如分子内和分子间交联、聚合、偶联和/或重组技术改变的Hb，以致Hb不再呈其“天然”状态。除非另外指出，如本文所使用，术语“血红蛋白”或“Hb”指天然未经修饰的Hb和经修饰的Hb。
“亚硝酸还原酶活性”或“NRA”是血红蛋白或血红蛋白基蛋白质将亚硝酸盐还原为一氧化氮的能力。“最高亚硝酸还原酶活性”是血红蛋白或血红蛋白基蛋白质能够将亚硝酸盐还原为一氧化氮的最大速率。“初始亚硝酸还原酶活性”是向完全脱氧蛋白添加亚硝酸盐时，血红蛋白或血红蛋白基蛋白质将亚硝酸盐还原为一氧化氮的初速速率。
术语“非氧合”意指，血红素蛋白或血红蛋白呈非配位、脱氧状态，或其与除O2外的气体，例如NO或CO配位。
“氧亲和力”指氧载体，例如Hb，结合分子氧的亲和性。用将Hb分子的氧饱和度(Y轴)与氧分压(X轴)联系起来的氧平衡曲线定义这种特征。用“P50”值表示该曲线的位置，“P50”值是氧载体受氧气半饱和的氧分压并且与氧亲和力负相关。因此，P50越低，氧亲和力越高。可通过本领域已知的各种方法测量全血(和全血组分，例如红细胞和Hb)的氧亲和力。(见，例如，Winslow，R.M.等人，J.Biol.Chem.1977，252：2331-37)。也可使用市场上可买到的HEMOXTM分析仪(TCSScientific Corporation，New Hope，PA)测定氧亲和力。(见，例如， Vandegriff和Shrager在“Methods in Enzymology”中(Everse等人编辑)232：460(1994))；和Vandegriff等人，Anal.Biochem.256(1)：107-116(1998))。
如本文所使用，术语“携氧治疗剂”指能够结合并携带分子氧到有需要的细胞/组织/器官的血红素蛋白。当呈CO或NO配位血红素蛋白形式施用时，CO或NO一旦从血红素部分释放，血红素基团就自由结合并携带分子氧。
“聚乙二醇”或“PEG”指化学通式H(OCH2CH2)n OH的聚合物，其中“n”大于或等于4，优选约45至约500，更优选约70至约250，并且最优选约90至约140，或约115。所述聚合物可经取代或未经取代，并且末端羟基可经不同常规端基，例如甲氧基或羧基置换。PEG可从许多来源购买得到(例如，CarbowaxTM(Dow Chemical，Midland，MI)、Poly-(Arch Chemicals，Norwalk，CT)和Solbase)。
“聚乙二醇偶联血红蛋白”、“PEG-Hb偶联物”或“PEG-Hb”指至少一个PEG共价连接的Hb。
“溶液”指液体混合物并且术语“水溶液”指含有一些水并且可能还含有一种或多种其它液体物质与水一起形成多组分溶液的溶液。
“无基质血红蛋白”或“SFH”指已经从中去除了红细胞膜的Hb。
“表面修饰血红蛋白”指化学基团，通常为聚合物，例如葡聚糖或聚环氧烷已经与之连接的血红蛋白。术语“表面修饰氧合血红蛋白”指当其经表面修饰时，呈“R”状态的Hb。
“末端活性”是经能够与血红素蛋白或血红蛋白的反应基反应的部分官能化的PAO百分比的表示。“100％末端活性”表明，在所有PAO均具有能够与血红素蛋白或血红蛋白的反应基反应的部分的基础上，表示偶联反应中使用的PAO的摩尔过量。例如，如果可用Mal-PEG具有80％末端活性，以致80％的PEG经Mal官能化，并且使用超过 血红蛋白20倍摩尔过量的Mal-PEG，则可基于100％末端活性将这个摩尔比表示为Mal-PEG超过血红蛋白16倍摩尔过量。
“硫醇化”指增加分子上巯基的数量的过程。例如，使蛋白质与2-亚氨基硫烷(“2-IT”)反应将蛋白质表面的游离胺转化为巯基。然后这些巯基可用于和硫醇反应部分，例如马来酰亚胺反应。
“非配位血红蛋白”指含有至少一个未与分子气体，例如氧气、一氧化碳或一氧化氮配位的血红素部分的任何血红蛋白。正因如此，如果仅有一个血红素部分未与分子气体配位，则将血红蛋白视为“非配位”。
如本文所使用，术语“血红素蛋白”指载有结合气体，例如氧气、一氧化氮或一氧化碳的血红素部分的任何单链或多链蛋白质。
如本文所使用，术语“硝基氧”指稳定硝基氧自由基、其前体及其衍生物。不得将该术语与一氧化氮供体分子混淆。
发明详述
本发明总体上涉及可用于硝酰化蛋白质的琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物。例如，这种硝酰化合物可用于硝酰化血红素蛋白例如血红蛋白。用琥珀酰亚胺活化型硝酰化合物硝酰化血红素蛋白抵抗NO和其它生物分子受氧化物，例如过氧化物和过氧化氢氧化。本发明的硝酰化血红素蛋白用作能够输送分子氧、一氧化碳、一氧化氮及其混合物的(OTA)。
琥珀酰亚胺基硝基氧试剂
本发明涉及可用于硝酰化蛋白质的氨基的琥珀酰亚胺基硝基氧试剂。琥珀酰亚胺基硝基氧试剂通常包含与硝基氧基，例如TEMPO(2，2，6，6-四甲基-哌啶-1-氧)或PROXYL(2，2，5，5-四甲基吡咯烷-N-氧)硝基氧基连接的琥珀酰亚胺。琥珀酰亚胺和硝基氧之间的连接 可为(例如)羧基连接或碳酸连接。此类试剂，例如硝酰基琥珀酰亚胺基碳酸酯具高度活性，使蛋白质的胺和琥珀酰亚胺之间的偶联非常有效。
例如，本发明涉及式(I)的硝酰化剂：

其中R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；X为氧、硫、氮、磷或硅；Y为CH2；n为0或1；并且m为0或1。
式(I)的硝酰化剂可具有其中X、Y、n和m如以上所定义并且R1、R2、R3和R4的每一个均为-CH3的结构。
同样，式(I)的硝酰化剂可具有其中R1、R2、R3、R4、Y、n和m如以上所定义并且X为氧或硫的结构。
进一步地，式(I)的硝酰化剂可具有其中R1、R2、R3、R4、Y、n和m如以上所定义并且X为氧的结构。
式(I)的硝酰化剂可具有其中Y、n和m如以上所定义，X为氧并且R1、R2、R3和R4的每一个均为-CH3的结构。
另外，式(I)的硝酰化剂可具有其中R1、R2、R3、R4、Y和m如以上所定义并且n为0的结构。
式(I)的硝酰化剂还可具有其中R1、R2、R3、R4、Y和m如以上所定义并且n为1的结构。
进一步地，式(I)的硝酰化剂可具有其中R1、R2、R3、R4、Y和n如以上所定义并且m为0的结构。
式(I)的硝酰化剂还可具有其中R1、R2、R3、R4、Y和n如以上所定义并且m为1的结构。
例如，式(I)的硝酰化剂可选自由以下组成的组4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯(4-STC)、3-琥珀酰亚胺基-PROXYL-碳酸酯(3-SPC)、4-琥珀酰亚胺基-羧基-TEMPO(4-SCT)和3-琥珀酰亚胺基-羧基-PROXYL(3-SCP)。下面示出了这些化合物中每一个的结构：

4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯(4-STC；1-(((2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧基)-4-氧基羰基)氧基)-2，5-吡咯烷二酮)

3-琥珀酰亚胺基-PROXYL-碳酸酯(3-SPC；1-(((2，2，5，5-四甲基-1-吡咯烷氧基)-3-氧基羰基)氧基)-2，5-吡咯烷二酮)

4-琥珀酰亚胺基-羧基-TEMPO(4-SCT；1-(((2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧基)-4-羰基)氧基)-2，5-吡咯烷二酮)

3-琥珀酰亚胺基-羧基-PROXYL(3-SCP；1-(((2，2，5，5-四甲基-1-吡咯烷氧基)-3-羰基)氧基-2，5-吡咯烷二酮)
例如，式(I)的硝酰化剂可具有以下结构：

合成琥珀酰亚胺基硝基氧试剂的方法
可使用简单的一步活化化学方法，使用现成的试剂合成琥珀酰亚 胺基硝基氧试剂。此外，可在温和条件下进行活化反应。
因此，本发明进一步涉及制备式(II)的硝酰化剂的方法：

包括使具有式(III)的化合物

与N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)在有机碱的存在下反应；其中R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；X为氧、硫、氮、磷或硅；Y为CH2；并且m为0或1。
制备式(II)的硝酰化剂的方法可具有式(II)和(III)的结构，其中X、Y和m如以上所定义并且R1、R2、R3和R4的每一个均为-CH3。
制备式(II)的硝酰化剂的方法可具有式(II)和(III)的结构，其中R1、R2、R3和R4、Y和m如以上所定义并且X为氧或硫。
制备式(II)的硝酰化剂的方法可具有式(II)和(III)的结构，其中R1、R2、R3和R4、Y和m如以上所定义并且X为氧。
制备式(II)的硝酰化剂的方法可具有式(II)和(III)的结构，其中Y和m如以上所定义，X为氧并且R1、R2、R3和R4的每一个均为-CH3。
制备式(II)的硝酰化剂的方法可具有式(II)和(III)的结构，其中R1、R2、R3和R4、X和Y如以上所定义并且m为0。
制备式(II)的硝酰化剂的方法可具有式(II)和(III)的结构，其中R1、R2、R3和R4、X和Y如以上所定义并且m为1。
制备式(II)的硝酰化剂的方法可具有式(II)和(III)的结构，其中R1、R2、R3和R4、X、Y和m如以上所定义，并且其中所述有机碱包括三乙胺(TEA)、N，N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、吡啶、N-甲基哌啶或其组合。
制备式(II)的硝酰化剂的方法可具有式(II)和(III)的结构，其中R1、R2、R3和R4、X、Y和m如以上所定义，并且其中所述有机碱包括三乙胺。
制备式(II)的硝酰化剂的方法可具有式(II)和(III)的结构，其中R1、R2、R3和R4、X、Y和m如以上所定义，其中所述有机碱包括三乙胺，并且其中式(III)的化合物、N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和三乙胺按约1∶2∶3的比例存在。
在以上任一种制备式(II)的硝酰化剂的方法中，所述反应可在约2℃至约30℃、约15℃至约25℃、约4℃或约20℃温度下进行。
在以上任一种制备式(II)的硝酰化剂的方法中，可使所述反应进行约3至约6小时。
在以上任一种制备式(II)的硝酰化剂的方法中，所述反应可在极性非质子溶剂中进行。所述极性非质子溶剂可包含乙腈(ACN)、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯(EtOAc)、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)或其组合。例如，所述极性非质子溶剂可包含乙腈。
下面示出了制备4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯的反应图解。

如上所示，使用一步活化化学方法，将4-羟基-TEMPO(4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶1-氧)用于制备4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯。通过在三乙胺的存在下TEMPOL与N，N’-二琥珀酰亚胺基-碳酸酯的反应实现TEMPOL活化为4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯。有机碱(在以上反应图解中为TEA)用作使羟基硝基氧(在以上反应图解中为TEMPOL)的-OH基团去质子化的催化剂，使其更具反应性，以致其可作为亲核试剂并攻击N，N’-二琥珀酰亚胺基-碳酸酯(DSC)的亲电子羰基。
本发明还涉及一种制备式(IV)的硝酰化剂的方法：

包括使具有式(V)的化合物

与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)的存在下反应；其中R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；Y为CH2；并且m为0或1。
制备式(IV)的硝酰化剂的方法可使用式(IV)和(V)的结构，其中Y和m如以上关于式(IV)和(V)所定义并且其中R1、R2、R3和R4的每一个独立地为-CH3。
在制备式(IV)的硝酰化剂的方法中，式(IV)的化合物、N-羟基琥珀酰亚胺和N，N’-二环己基碳二亚胺可按约1∶1.1∶1.1的摩尔比存在于反应混合物中。
制备式(IV)的硝酰化剂的方法可使用式(IV)和(V)的结构，其中Y和R1、R2、R3和R4如以上关于式(IV)和(V)所定义并且m为0。所述方法也可使用其中m为1的结构。
在以上任一种制备式(IV)的硝酰化剂的方法中，所述反应在约2℃至约30℃、约15℃至约25℃、约4℃或约20℃温度下进行。
在以上任一种制备式(IV)的硝酰化剂的方法中，可使所述反应进行约6至约24小时。
在以上任一种制备式(IV)的硝酰化剂的方法中，所述反应可在约7.2至约7.6的pH下或在约7.4的pH下进行。
硝酰化蛋白质和硝酰化PAO修饰蛋白
本发明还涉及具有至少一个硝酰化氨基的硝酰化蛋白质。所述硝酰化蛋白质还任选与一个或多个聚环氧烷(PAO)分子，例如与一个或多个聚乙二醇(PEG)分子偶联。
用于偶联蛋白质的聚环氧乙烷包括但不限于聚环氧乙烷、聚环氧丙烷和聚环氧乙烷/聚环氧丙烷共聚物。PAO的分子量为约2,000至约20,000道尔顿，优选约3,000至约10,000道尔顿，更优选约4,000至约6,000道尔顿，并且最优选约5,000道尔顿。目前用于修饰蛋白质表面的最常见的PAO为PEG，这是由于其药学可接受性和商业可用性。基于分子内环氧乙烷重复亚基(即-CH2CH2O-)的数量，可用多种分子量的PEG，以基于与蛋白质偶联的PEG分子的数量和尺寸达到所需分子量。
PAO聚合物的一个或两个末端基团转化为反应性官能团(“活化”)。例如，PEG-OH已经用于制备PEG-卤化物、甲磺酸盐或甲苯磺酸盐，然后通过进行与氨水(Zalipsky，S.等人，1983，Eur.Polym.J.19：1177-1183)、叠氮化钠或邻苯二甲酰亚胺钾的亲核置换反应将其转化为PEG-胺(“PEG-NH2”)。然后可通过PEG胺基(“-NH2”)与蛋白质羧基(“-COOH”)的相互作用使活化PEG与蛋白质偶联。
除用胺基官能化PEG并将其转化为马来酰亚胺基外，已知由此活化的PEG用于本领域中。例如，举几个例来说，PEG可经对硝基苯碳酸酯、醛、氨丙基、氨乙基、硫醇、氨氧基、酰肼和碘乙酰胺活化。可使用已知方法使这种官能PEG与蛋白质的表面氨基酸侧链偶联。
可进一步官能化PEG-NH2以与除羧基外的基团偶联。例如，美国专利号6，828，401公开了PEG-NH2与马来酰亚胺的反应，以生成mPEG-马来酰亚胺。在该反应中，mPEG-OH与甲苯磺酰化试剂(对甲苯磺酰氯)和碱催化剂(三乙烯胺)在有机溶剂(二氯甲烷)的存在下反应，生成mPEG-甲苯磺酸酯。然后mPEG-甲苯磺酸酯与28％氨水和 马来酸酐在N，N-二甲基乙酰胺(“DMAc”)和N-环己基吡咯烷酮(“CHP”)的有机溶剂混合物中反应，以生成马来酰胺酸化合物。然后使这种化合物与三氟乙酸五氟苯酯在二氯甲烷的存在下反应，以生成mPEG-马来酰亚胺。
可选地，可通过使mPEG-OH与甲苯磺酰化试剂(对甲苯磺酰氯)和碱催化剂(三乙烯胺)在有机溶剂(二氯甲烷)的存在下反应生成mPEG-甲苯磺酸酯，制备mPEG-马来酰亚胺。然后使mPEG-甲苯磺酸酯与28％氨水反应以制备mPEG-NH2。然后使mPEG-NH2与N-甲氧基羰基马来酰亚胺(MCM)在饱和碳酸氢钠(NaHCO3)的存在下反应以生成mPEG-马来酰亚胺。
下面表1中呈现了可使用胺反应化学方法修饰以与PAO偶联的人Hb氨基酸残基侧链的非限制性实例：
表1-胺反应化学方法和可能的修饰位点

增加Hb上可用偶联位点数量的一种方法是引入往往比游离胺更 易与MalPEG反应的巯基(也称为硫醇化)。已知多种方法用于蛋白质硫醇化。在一种方法中，使蛋白质游离胺与琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯反应，接着用二硫苏糖醇(“DTT”)或三(2-羧基乙基)膦(“TCEP”)还原。该反应释放出可用于测定硫醇化程度的2-吡啶硫酮发色团。也可通过与琥珀酰亚胺乙酰硫代乙酸酯反应，接着与50mM羟胺或肼在近中性pH下反应，间接硫醇化胺。
美国专利号5，585,484中描述的另一种方法在偶联后保持了Hb氨基(α-或ε-)的正电荷。这种方法牵涉用2-IT脒化Hb的ε-氨基以向蛋白质上引入巯基。这种方法具有至少两个优于先前使用的琥珀酰亚胺基化学法的附加优点：1)马来酰亚胺基于巯基的高度反应性和选择性利于用有限过量的试剂接近定量的修饰硫醇，和2)2-IT的硫醇基隐藏并且由于所述试剂与蛋白质氨基的反应而仅在原位生成。这些优点提供了一个附加益处；它们允许用硫醇化和PEG化试剂同时温育Hb，进行表面装饰。
例如，可通过硫醇化Hb的胺以在Hb表面引入硫醇基使MalPEG与Hb偶联。可用于反应的Hb的两个固有硫醇基在βCys93处，Hb表面添加的硫醇基能够与马来酰亚胺基PAO的马来酰亚胺反应形成聚乙二醇化Hb偶联物。
马来酰亚胺-PEG包括连接马来酰亚胺与PEG的接头。接头包括但不限于亚烃基例如乙烯、丙烯、异丙烯、亚苯基、酰胺(-NH-C(O)-)或苯基氨基甲酸酯(例如，-Ph-NH-C(O)-)。
下面表2中呈现了可使用硫醇反应化学方法修饰的氨基酸残基侧链的非限制性实例。
表2-硫醇反应化学方法和可能的修饰位点


可通过偶联反应调节PAO-Hb的分子量。传统思想认为增大反应物的摩尔比会增加与Hb结合的PEG分子数量。这包括Hb硫醇化过程(即增大硫醇化剂与Hb的摩尔比)和偶联过程(即增大硫醇活化PEG与硫醇化Hb的摩尔比)。然而，这些过量摩尔比导致每个Hb仅结合6±1个PEG分子(见美国专利号7,501,499)。
最近确定，可使用较低摩尔比的反应物使更多数量的PAO分子与Hb结合。使用二硫代吡啶比色测定法测定硫醇化前后和偶联之后，Hb上可用硫醇基的数量(Ampulski，R.S.等人，1969，Biochem.Biophys.Acta 32：163-169)。人Hb在β93半胱氨酸残基处含有两个固有、反应性硫醇基，这通过二硫代吡啶反应确定。用2-IT硫醇化SFH后，反应性硫醇基的数量从2个增加到7个以上。在该实例中，平均8个PEG分子与Hb结合。这在硫醇化反应中使用超过SFH 7.5倍摩尔过量的2-IT和在偶联反应中使用超过硫醇化Hb 12倍摩尔过量的MalPEG实现。
血红蛋白在呈氧合状态时与聚环氧烷偶联，以增加Hb-PAO偶联物的氧亲和力。
硝酰化蛋白质
硝酰化蛋白质具有至少一个硝酰化氨基。硝酰化蛋白质包含至少一个硝酰化氨基并且硝酰化蛋白质可具有结构(VI)：

其中Z表示所述蛋白质；R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；X为氧、硫、氮、磷或硅；Y为CH2；m为0或1；n为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的平均数，所述-NH-基团为所述蛋白质的胺基并且N为所述蛋白质的氮。
硝酰化蛋白质可包含至少一个硝酰化氨基，硝酰化蛋白质可具有结构(VI)，其中R1、R2、R3、R4、Y、m、n和Z如以上关于式(VI)所定义并且X为氧或硫。
硝酰化蛋白质可包含至少一个硝酰化氨基，硝酰化蛋白质可具有结构(VI)，其中R1、R2、R3、R4、Y、m、n和Z如以上关于式(VI)所定义并且X为氧。
硝酰化蛋白质可包含至少一个硝酰化氨基，硝酰化蛋白质可具有结构(VI)，其中Y、m、n和Z如以上关于式(VI)所定义，X为氧，并且R1、R2、R3和R4的每一个均为-CH3。
硝酰化蛋白质可包含至少一个硝酰化氨基，硝酰化蛋白质具有结构(VII)：

中Z表示所述蛋白质；R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；Y为CH2；m为0或1；n为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的平均数，所述-NH-基团为所述蛋白质的胺基；并且N为所述蛋白质的氮。
硝酰化蛋白质可包含至少一个硝酰化氨基，硝酰化蛋白质可具有 结构(VI)或(VII)，其中X、Y、m、n和Z如以上关于式(VI)或(VII)所定义并且R1、R2、R3和R4的每一个均为-CH3。
硝酰化蛋白质可包含至少一个硝酰化氨基，硝酰化蛋白质可具有结构(VI)或(VII)，其中R1、R2、R3、R4、X、Y、M、n和Z如以上关于式(VI)或(VII)所定义并且m为0。
硝酰化蛋白质可包含至少一个硝酰化氨基，硝酰化蛋白质可具有结构(VI)或(VII)，其中R1、R2、R3、R4、X、Y、M、n和Z如以上关于式(VI)或(VII)所定义并且m为1。
在以上任何硝酰化蛋白质中，所述至少一个硝酰化氨基可为所述蛋白质的N端氨基或赖氨酸残基的E(ε)-氨基。
硝酰化蛋白质可适当地为聚硝酰化蛋白质。例如，对于具有式(VI)或(VII)的结构的硝酰化蛋白质而言，n为约1至约25；n为至少约2；n为至少约5；n为至少约10；或n为约15至约20。
所述聚硝酰化蛋白质可为聚硝酰化血红素蛋白。
血红素蛋白用于本发明的实践。除四聚体血红蛋白(Hb)外，这包括单链(单体)天然或重组血红素蛋白，例如BMC Structural Biology，11：13中描述的血红素蛋白，可在http：//www.biomedcentral.com/content/r)df/1472-6807-11-13.Ddf访问。在The Joumal of Experimental Bi ology，201：1085-1098(1998)中可找到血红素蛋白的其它实例。
与本发明一起利用了多种Hb。Hb可从动物来源得到，例如人、牛、猪或马血红蛋白。优选人Hb。Hb可从自然来源得到或可通过已知的重组方法生成。
本发明的血红蛋白的氧亲和力高于无基质血红蛋白。这意味着在37℃和pH 7.4下测量，血红蛋白的P50将小于15mmHg，优选约2至约10mmHg，并且最优选约2至约8mmHg或约2至约5mmHg。
例如，硝酰化蛋白质可包含血红蛋白α-亚基、血红蛋白β-亚基、血红蛋白四聚体或肌红蛋白。
硝酰化蛋白质可包含血红蛋白α-亚基、血红蛋白β-亚基、血红蛋白四聚体、肌红蛋白或白蛋白。
硝酰化蛋白质为白蛋白时，硝酰化蛋白质可包含血清白蛋白。血清白蛋白可包括人血清白蛋白(HSA)。HAS为具有585个氨基酸的单条多肽。BSA含有60个赖氨酸、17对二硫桥和1个游离半胱氨酸，并且分子量为约～67kD。
硝酰化蛋白质可包含血红蛋白α-亚基或血红蛋白β-亚基或血红蛋白四聚体。硝酰化蛋白质可包含动物血红蛋白α-亚基、动物血红蛋白β-亚基或包含动物血红蛋白α-亚基和β-亚基的血红蛋白四聚体。
硝酰化蛋白质可包含人血红蛋白α-亚基、人血红蛋白β-亚基或包含人血红蛋白α-亚基和β-亚基的血红蛋白四聚体。
硝酰化蛋白质为血红蛋白四聚体时，血红蛋白可分子内交联。分子内交联的血红蛋白阻止解离成二聚体并且避免受肾脏清除，延长了循环半衰期。在本领域中已知多种方法用于分子内交联Hb。化学交联剂包括戊二醛(美国专利号7,005,414)、聚醛(美国专利号4,857,636)、琥珀酰水杨酸(美国专利号4,529,719)、吡啶氧杂基-5′-磷酸酯(美国专利号4,529,719)、均三苯甲酰三(磷酸甲酯)(美国专利号5,250，665)、二炔烃(用于和具有叠氮化物接头的血红蛋白反应)。见Foot等人，Chem.Commun.2009，7315-7317；Yang等人，Chem.Commun.2010，46：7557-7559)并且血红蛋白可经由重组法交联。
例如，血红蛋白四聚体可包含交联αα二聚体或交联ββ二聚体。
如以上表1所示，人血红蛋白的α-和β-亚基在N端氨基处含有可经硝酰化的N-端缬氨酸残基。另外，人血红蛋白的α-和β-亚基在ε-氨基处含有许多可经硝酰化的赖氨酸基团。
另外，硝酰化蛋白质可包含人血红蛋白α-亚基。人血红蛋白α-亚基可在N端缬氨酸残基的α-氨基处经硝酰化。进一步地，人血红蛋白α-亚基可在选自由赖氨酸-7、赖氨酸-11、赖氨酸-16、赖氨酸-40、赖氨酸-56、赖氨酸-60、赖氨酸-61、赖氨酸-90、赖氨酸-99、赖氨酸-127、赖氨酸-139及其组合组成的组的赖氨酸残基的ε-氨基处经硝酰化。
硝酰化蛋白质还可包含人血红蛋白β-亚基。人血红蛋白β-亚基可在N端缬氨酸残基的α-氨基处经硝酰化。进一步地，人血红蛋白β-亚基也可在选自由赖氨酸-8、赖氨酸-17、赖氨酸-59、赖氨酸-61、赖氨酸-65、赖氨酸-66、赖氨酸-82、赖氨酸-95、赖氨酸-120、赖氨酸-132、赖氨酸-144及其组合组成的组的赖氨酸残基的ε-氨基处经硝酰化。
进一步地，硝酰化蛋白质可包含血红蛋白四聚体并且所述血红蛋白四聚体可包含约17个硝酰化氨基。
硝酰化和PAO偶联蛋白
硝酰化蛋白质也可与聚环氧烷(PAO)偶联。所述PAO可为聚乙二醇(PEG)。
PEG的平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿；约3,000至约10,000道尔顿；约4,000至约6,000道尔顿；或约5,000道尔顿。
硝酰化蛋白质也可与为马来酰亚胺-PEG的PEG偶联。马来酰亚胺可经由亚烃基或亚苯基接头与PEG连接。亚烃基接头可为乙烯接头。
同样，硝酰化蛋白质可具有偶联PEG，其为与选自由蛋白质半胱氨酸残基的固有硫醇部分、蛋白质硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分及其组合组成的组的蛋白质硫醇部分偶联的马来酰亚胺-PEG。
硝酰化蛋白质可具有为马来酰亚胺-PEG的偶联PEG，其中与半胱氨酸残基的固有硫醇部分偶联或与硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分偶联的马来酰亚胺-PEG具有结构(VIII)

其中Z表示所述蛋白质，S为所述蛋白质的硫醇基，R3为亚烃基或亚苯基，X为端基，m为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的平均数，并且n表示平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿的PEG的氧乙烯单元的平均数。
硝酰化蛋白质可具有式(VIII)的结构，其中R3为乙烯。
硝酰化蛋白质可具有式(VIII)的结构，其中m为约6至约10。
硝酰化蛋白质可具有式(VIII)的结构，其中X为甲氧基(-OCH3)或羧酸酯(-COOH)。
硝酰化蛋白质可具有式(VIII)的结构，其中马来酰亚胺-PEG与血红蛋白β-亚基的半胱氨酸-93残基的硫醇部分偶联。
硝酰化蛋白质具有式(VIII)的结构，其中马来酰亚胺-PEG与血红蛋白α-亚基或β-亚基的硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分偶联。硝酰化蛋白质具有式(VIII)的结构，其中硫醇化赖氨酸残基为人血红蛋白α-亚基，选自由以下组成的组：赖氨酸-7、赖氨酸-11、赖氨酸-16、赖氨酸-40、赖氨酸-56、赖氨酸-60、赖氨酸-61、赖氨酸-90、赖氨酸-99、赖氨酸-127、赖氨酸-139及其组合的硫醇化赖氨酸残基。硝酰化蛋白质具有式(VIII)的结构，其中硫醇化赖氨酸残基为人血红蛋白β-亚基，选自由以下组成的组：赖氨酸-8、赖氨酸-17、赖氨酸-59、赖氨酸-61、赖氨酸-65、赖氨酸-66、赖氨酸-82、赖氨酸-95、赖氨酸-120、赖氨 酸-132、赖氨酸-144及其组合的硫醇化赖氨酸残基。
硝酰化血红蛋白四聚体
血红蛋白四聚体包含本文所述任一种硝酰化血红蛋白的至少一个α-亚基或至少一个β-亚基。
这些血红蛋白四聚体可具有本文所述任一种硝酰化血红蛋白的至少一个α-亚基和至少一个β-亚基。
血红蛋白四聚体可包含本文所述任一种硝酰化血红蛋白的两个α-亚基和两个β-亚基。
本文所述的血红蛋白四聚体，其中血红蛋白每个四聚体平均与5-10个PAO分子偶联，血红蛋白每个四聚体平均与7.1-8.9个PAO分子偶联。
所述血红蛋白四聚体，其中所述血红蛋白经氧合。
所述血红蛋白四聚体，其中所述血红蛋白经脱氧。
所述血红蛋白四聚体，其中所述血红蛋白与CO、NO或CO和NO的混合物配位。
本发明的血红蛋白偶联物可呈氧合或脱氧形式，可与CO或NO配位，或可为包括这4种形式其中两种或更多种的混合物。通过用空气、纯O2气或O2/氮气混合物使非氧合血红蛋白平衡制备HbO2。
可通过本领域已知的任何方法进行脱氧。一种简单方法是将血红蛋白溶液暴露于惰性气体，例如氮气、氩气或氦气。为确保脱氧相对均匀，使Hb溶液在这个过程中循环。可通过使用Co-血氧计682(Instrument Laboratories)进行监测脱氧以达到所需水平。如果需要部分再氧合，可将脱氧Hb暴露于氧气或含有氧气的气体混合物，例如空气。
可通过气体渗透膜，例如聚丙烯或醋酸纤维素膜实现气体交换，以用另一种气体更换分子氧。见，例如，公布的美国专利申请号2006/0234915。市场上可买到的利用这些膜的气体交换装置包括来自Hoechst-Celanese(Dallas，TX)的CelgardTM聚丙烯微孔中空纤维装置或来自American Laboratory(East Lyme，CT)的Cell-PharmTM中空纤维氧合器。在Hoechst-Celanese CelgardTM装置中，通过使Hb水溶液按10-100ml/min/ft2通过聚丙烯微孔中空过滤器使氧合Hb脱氧，同时在5-20psi下用氮气吹洗系统。通常使Hb循环约5-30min以达到所需脱氧Hb百分比。生成脱氧Hb的另一种方法包括将Hb溶液暴露于化学还原剂，例如抗坏血酸钠、连二硫酸钠和亚硫酸氢钠。通过调节还原剂浓度、反应时间和温度使Hb部分脱氧。可选地，还原剂可用于大体上使Hb脱氧，然后可再引入氧气以形成部分脱氧产物。例如，在添加抗氧化剂之前可使Hb暴露于100mM浓度的亚硫酸氢钠约1小时。
可使用形成氧合血红蛋白的任何已知方法，仅用CO代替O2，使Hb与CO配位。这通常牵涉向血红蛋白溶液引入CO源，以致血红蛋白变得与CO配位，而不是O2(K.D.Vandegriff等人，Biochem.J.382：183-189(2004))。因为血红蛋白对CO的亲和力比对氧气高，所以不必先使血红蛋白脱氧。相应地，形成CO-Hb复合物最方便的方式是向血红蛋白溶液引入100％气态CO。
可通过使脱氧血红蛋白与一氧化氮气体反应，或通过将CO-Hb暴露于NO气体，以致NO交换CO，制备HbNO。也可通过使脱氧血红蛋白与NO供体小分子，如PROLI NONOateTM(即，1-(羟基-NNO-氧化偶氮基)-L-脯氨酸、二钠盐Cayman Chemical，Ann Arbor，Michigan)反应制成HbNO。
应当指出的是，NO自由基与球蛋白链中的氨基酸侧基结合的血红蛋白并非本文所定义的NO-Hb，这是因为这种化合物在血红素口袋中不含作为配体，代替氧的二价(非离子型)NO。例如，将天然血红 蛋白在使其与游离巯基结合的条件下暴露于NO供体时，形成亚硝酰基血红蛋白(美国专利号6,627,738)。这种亚硝酰基血红蛋白仍携带有氧，而本发明的NO-Hb复合物没有。此外，当通过例如以上所述针对巯基部分的反应形成经修饰血红蛋白时，这些部分不再可用于NO结合。
硝酰化蛋白质和PAO修饰蛋白的方法
本发明还涉及硝酰化蛋白质，包括PAO修饰蛋白的方法。本发明的方法提供了定点硝酰化并且可在有利反应条件下进行。使用这些方法生成的硝酰化-PEG化血红蛋白具有更长的循环时间和蛋白质稳定性以及高氧亲和力。
可通过使所述蛋白质与式(II)的硝酰化剂反应制备硝酰化蛋白质

其中R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；X为氧、硫、氮、磷或硅；Y为CH2；并且m为0或1。
制备硝酰化蛋白质的方法，其中式(II)的硝酰化剂具有如以上关于式(II)所定义的R1、R2、R3、R4、Y和m并且X为氧或硫。
制备硝酰化蛋白质的方法，其中式(II)的硝酰化剂具有如以上关于式(II)所定义的R1、R2、R3、R4、Y和m并且X为氧。
制备硝酰化蛋白质的方法，其中式(II)的硝酰化剂具有如以上关于式(II)所定义的Y和m，X为氧并且R1、R2、R3和R4的每一个均为-CH3。
一种制备硝酰化蛋白质的方法，包括使所述蛋白质与式(IV)的硝酰化剂反应：

其中R1、R2、R3和R4的每一个独立地为C1-C4烷基；Y为CH2；并且m为0或1。根据权利要求G2所述的方法，其中R1、R2、R3和R4的每一个独立地为-CH3。
制备硝酰化蛋白质的方法，其中式(II)或(IV)的硝酰化剂具有如以上关于式(II)或(IV)所定义的X、Y和m并且R1、R2、R3和R4的每一个均为-CH3。
制备硝酰化蛋白质的方法，其中式(II)或(IV)的硝酰化剂具有如以上关于式(II)或(IV)所定义的R1、R2、R3、R4、X和Y并且m为0。
制备硝酰化蛋白质的方法，其中式(II)或(IV)的硝酰化剂具有如以上关于式(II)或(IV)所定义的R1、R2、R3、R4、X和Y并且m为1。
制备硝酰化蛋白质的方法，其中式(II)或(IV)的硝酰化剂的比例以超过所述蛋白质5至约100倍摩尔过量存在。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中所述蛋白质包含血红蛋白四聚体的α-亚基或β-亚基。所述方法，其中所述蛋白质包含血红蛋白四聚体。所述方法，其中所述血红蛋白四聚体为非氧合血红蛋白四聚体。所述方法，其中所述非氧合血红蛋白四聚体为CO配位血红蛋白四聚体。所述方法，其中所述血红蛋白四聚体 为脱氧血红蛋白四聚体。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中所述反应在约2℃至约30℃，约15℃至约25℃，约2℃至约8℃，约4℃或约20℃温度下进行。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中使所述反应进行约3至约20小时，约3至约6小时，或约16小时。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中所述反应在水溶剂中进行。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中所述反应在约6.5至约8.5的pH，约7.5的pH或约7.2的pH下进行。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中所述蛋白质包含血红蛋白四聚体，所述反应在约7.2的pH和约2℃至约8℃温度下进行并使其进行约16小时，并且其中所述方法产生具有约17个硝酰化氨基的硝酰化血红蛋白四聚体。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中所述蛋白质包含血红蛋白四聚体，并且所述硝酰化剂以超过血红蛋白四聚体约10至约100倍摩尔过量存在。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中所述反应的产物为式(VI)或(VII)的硝酰化蛋白质或本文所述的血红蛋白四聚体。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，进一步包括使所述蛋白质与聚环氧烷(PAO)偶联。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，进一步包括向在水性稀释剂中的蛋白质添加琥珀酰亚胺戊酸酯PAO以形成 PAO-戊酸酯偶联蛋白。所述方法进一步包括将所述蛋白质与2-亚氨基硫烷(2-IT)混于水性稀释剂中以形成硫醇化蛋白质；并且向在水性稀释剂中的硫醇化蛋白质添加PAO-马来酰亚胺以形成PAO-马来酰亚胺偶联蛋白。所述方法，其中PAO为聚乙二醇(PEG)。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，进一步包括使所述蛋白质与聚环氧烷(PAO)偶联并且其中PAO为聚乙二醇(PEG)，其中PEG的平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿，约3,000至约10,000道尔顿，约2,000至约6,000道尔顿，或约5,000道尔顿。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中PEG为马来酰亚胺-PEG。所述方法，其中马来酰亚胺经由亚烃基或亚苯基接头与PEG连接。所述方法，其中亚烃基接头为乙烯接头。所述方法，其中马来酰亚胺-PEG与选自由蛋白质半胱氨酸残基的固有硫醇部分、蛋白质硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分及其组合组成的组的蛋白质硫醇部分偶联。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中与半胱氨酸残基的固有硫醇部分偶联的马来酰亚胺-PEG具有结构(VIII)

其中Z表示所述蛋白质，R3为亚烃基或亚苯基，S为所述蛋白质的硫醇基，m为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的平均数，并且n表示平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿的PEG的氧乙烯单元的平均数。
所述方法，其中与半胱氨酸残基的固有硫醇部分偶联的马来酰亚胺-PEG具有结构(VIII)，其中R3为乙烯。所述方法，其中所述蛋白 质包含血红蛋白α-亚基、血红蛋白β-亚基、血红蛋白四聚体、肌红蛋白或白蛋白。所述方法，其中所述蛋白质包含血清白蛋白。所述方法，其中所述血清白蛋白包含人血清白蛋白(HSA)。所述方法，其中所述蛋白质包含血红蛋白四聚体。
所述方法，其中所述血红蛋白四聚体包含交联αα二聚体或交联ββ二聚体。所述方法，其中所述马来酰亚胺-PEG与血红蛋白β-亚基的半胱氨酸-93残基的硫醇部分偶联。所述方法，其中所述来酰亚胺-PEG与血红蛋白α-亚基或β-亚基的硫醇化赖氨酸残基的硫醇部分偶联。所述方法，其中所述硫醇化赖氨酸残基为人血红蛋白α-亚基的硫醇化赖氨酸残基，选自由以下组成的组：赖氨酸-7、赖氨酸-11、赖氨酸-16、赖氨酸-40、赖氨酸-56、赖氨酸-60、赖氨酸-61、赖氨酸-90、赖氨酸-99、赖氨酸-127、赖氨酸-139及其组合。所述方法，其中所述硫醇化赖氨酸残基为人血红蛋白β-亚基的硫醇化赖氨酸残基，选自由以下组成的组：赖氨酸-8、赖氨酸-17、赖氨酸-59、赖氨酸-61、赖氨酸-65、赖氨酸-66、赖氨酸-82、赖氨酸-95、赖氨酸-120、赖氨酸-132、赖氨酸-144及其组合。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中2-亚氨基硫烷以超过蛋白质浓度约7至约15倍摩尔过量，超过蛋白质浓度约7至约8倍摩尔过量或超过蛋白质浓度约7.5倍摩尔过量的浓度存在。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中PAO-马来酰亚胺以超过蛋白质浓度约9至约20倍摩尔过量，超过蛋白质浓度约9至约15倍摩尔过量或超过蛋白质浓度约12倍摩尔过量的浓度存在。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中硫醇化步骤在介于约7和约9之间的pH下或在约8.5的pH下进行。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中在介 于约6.5和约8.5之间的pH下或在约7.5的pH下进行向硫醇化蛋白质添加PAO-马来酰亚胺以形成PAO-马来酰亚胺偶联蛋白的步骤。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中PEG为SVA-PEG。所述方法，其中琥珀酰亚胺经由-C(O)-(CH2)4-与PEG连接。SVA-PEG可与选自蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基部分、蛋白质末端缬氨酸残基的α-氨基部分或其组合的蛋白质氨基部分偶联。也可与蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基部分或蛋白质末端缬氨酸残基的α-氨基部分偶联的SVA-PEG具有结构(IX)

其中Z为所述蛋白质，N为所述蛋白质的氨基，X为端基，m为与所述蛋白质偶联的活化PEG聚合物的数量，并且n为平均分子量为约2,000至约20,000道尔顿的PEG的氧乙烯单元的平均数。
X为PAO的端基，并且可为羟基、芳氧基(例如苄氧基)或C1-C20烷氧基，更优选C1-C10烷氧基，并且还更优选C1-C5烷氧基例如甲氧基或乙氧基。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中对于式IX而言，m为每个四聚体平均约6至约10个PAO分子。SVA-PEG与血红蛋白α-亚基或β-亚基的赖氨酸残基的ε-氨基部分偶联。SVA-PEG与血红蛋白α-亚基或β-亚基的末端缬氨酸残基的α-氨基部分偶联。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中对于式IX而言，赖氨酸残基为人血红蛋白α-亚基，选自由以下组成的组：赖氨酸-7、赖氨酸-11、赖氨酸-16、赖氨酸-40、赖氨酸-56、赖氨酸-60、赖氨酸-61、赖氨酸-90、赖氨酸-99、赖氨酸-127、赖氨酸-139及其组 合的赖氨酸残基。赖氨酸残基为人血红蛋白β-亚基，选自由以下组成的组：赖氨酸-8、赖氨酸-17、赖氨酸-59、赖氨酸-61、赖氨酸-65、赖氨酸-66、赖氨酸-82、赖氨酸-95、赖氨酸-120、赖氨酸-132、赖氨酸-144及其组合的赖氨酸残基。
使用式(II)或(IV)的硝酰化剂制备硝酰化蛋白质的方法，其中蛋白质硝酰化之前，蛋白质与PAO偶联。向硫醇化蛋白质添加PAO-马来酰亚胺以形成PAO-马来酰亚胺偶联蛋白的步骤可与蛋白质硝酰化同时进行。向蛋白质添加琥珀酰亚胺戊酸酯PAO以形成PAO-戊酸酯偶联蛋白的步骤与蛋白质硝酰化同时进行。
在以上任何方法中，可使用电子顺磁共振(EPR)或MALDI-TOF质谱法评估和量化硝酰基取代程度。
药物组合物
可将本发明的PAO-Hb偶联物配制成在供肠胃外施用的药学上可接受的载体，例如水性稀释剂中包含PAO-Hb偶联物的药物组合物。载体中PAO-Hb偶联物的浓度可根据应用而改变。优选地，PAO-Hb偶联物浓度范围从约0.1g/dl至约10g/dl，更优选从约2.0g/dl至约8.0g/dl，并且最优选约4.0至约6.0g/dl。血红蛋白适当浓度的选择取决于血红蛋白最终产物的胶体渗透性(胶体渗透压)特性。优选地，本发明的组合物与全血相比具正常胶体渗透压或与血浆相比具高胶体渗透压。可以调节血红蛋白浓度以获得每种适应征的所需胶体渗透压。
将所述组合物配制成肠道外注射物时，所述溶液通常包含与全血等渗并且维持血红蛋白可逆性携带和输送氧气、CO-或NO-的性质的生理相容电解质载体。
药学上可接受的载体可为水性稀释剂。所述水性稀释剂可包含胶体水溶液或非携氧组分溶液，例如蛋白质(例如白蛋白)水溶液、糖蛋 白水溶液、多糖水溶液或其组合。水性稀释剂可包含无细胞水溶液。
适合的水性稀释剂包括但不限于生理盐水、盐水-葡萄糖混合物、林格氏溶液(Ringer′s solution)、乳酸林格氏溶液、洛克-林格氏溶液(Locke-Ringer′s solution)、克雷布-林格氏溶液(Krebs-Ringer′s solution)、哈特曼平衡盐水(Hartmann′s balanced saline)、肝素化柠檬酸钠-柠檬酸-右旋糖溶液、醋酸盐溶液、多电解质溶液(例如，来自于Baxter International，Deerfield，IL的Plasma或Plasma)、乳糖酸盐溶液和高分子血浆代用品(例如聚环氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、环氧乙烷-丙二醇缩合物)或其组合。
所述组合物可另外包含药学上可接受的填料、盐和本领域众所周知的其它物质，其选择取决于剂型、治疗的病状、根据本领域普通技术人员的决定要达到的特定目的和此类添加剂的特性。例如，所述组合物可包括生理缓冲液、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖醇或山梨糖醇)、醇或多元醇、药学上可接受的盐(例如，氯化钠或氯化钾)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80)、抗氧化剂、抗菌剂、胶体渗透压剂(例如，白蛋白或聚乙二醇)或还原剂(例如，抗坏血酸、谷胱甘肽或N-乙酰半胱氨酸)。
药物组合物的粘度为至少约厘泊(cP)。更具体而言，粘度范围从约2至约5cP，并且特别为约2.5至约4.5cP。
为避免复杂化，药物组合物具有高纯度，即没有基质、磷脂和热原，通过LAL(鲎变形细胞溶解物)试验测量，具有不超过0.25EU/ml的内毒素水平，并且具有小于8％的高铁血红蛋白。
可经肠胃外，例如通过皮下、静脉或肌肉注射，或作为大量胃肠外给液施用药物组合物。
血红蛋白偶联物作为治疗剂的典型剂量可从约1至约15,000mg血红蛋白/kg患者体重。例如，用作氧疗剂时，剂量范围将介于100 至7500mg/kg患者体重，更优选500-5000mg/kg体重，并且最优选700-3000mg/kg体重。因此，用于人类患者的典型剂量可能从1g到1000g以上。应认识到，每种剂型的单一剂量中所含活性成分的单位含量本身无须构成有效量，因为可通过施用许多单一剂量达到必需的有效量。剂量的选择取决于利用的剂型、治疗的病状和根据本领域技术人员的决定要达到的特定目的。
治疗方法
PAO-Hb偶联物和药物组合物可用于向受试者输送氧气、CO和/或NO。向组织输送氧气、一氧化氮、一氧化碳或其混合物和还原亚硝酸盐以在微脉管系统中进一步生成内源一氧化氮(NO)的方法包括向有需要的受试者施用血红蛋白偶联物或所述组合物，其中在施用之后，血红蛋白变成未配位并且在微脉管系统中将亚硝酸盐转化为一氧化氮。
本发明的血红蛋白偶联物及其组合物可用于：治疗急性肝功能衰竭、乙型地中海贫血、烧伤、慢性临界性肢体缺血、二氧化碳或氰化物中毒、慢性阻塞性肺病(COPD)(例如，急性加重)、充血性心力衰竭(例如，急性心力衰竭、慢性心力衰竭)、缺氧(例如，高海拔地区使用，包括用于肺水肿、减压病)、疟疾(例如，脑型疟疾(恶性疟原虫闭塞事件))、器官缺血(例如，急性肠缺血(扭转)、急性肠缺血(栓塞)、心源性休克、急性血管器官缺血、中风(CAT扫描前)、中风(CAT扫描后)、心肌梗塞/重度心肌缺血)、外周血管疾病、卟啉症、孕期先兆子痫、脓毒症、镰状细胞病(例如，中风/短暂性缺血发作、脾隔离症、肝隔离症、阴茎持续勃起症)、视网膜疾病/眼内病状(例如，视网膜中央动脉阻塞、中央静脉阻塞)、睾丸扭转、创伤/休克(例如，创伤性出血性休克、非创伤性出血性休克、院前/现场使用(军用/急诊)、创伤性脑损伤/爆炸)、溃疡或血管痉挛；用作血管成形术的附属品，用作整形手术的附属品(皮瓣)(例如，急性治疗、慢性治疗)，或在植入心室辅助装置中用作附属品；用作血液代用品(例如，用于急性失血、难以 交叉匹配患者的耶和华见证人(Jehovah′s Witness)、稀有血型组、镰状细胞再生障碍危象、镰状细胞贫血围手术期处理、急性溶血性贫血(自身免疫性)、急性溶血性贫血(毒素)或其它难治性贫血)、保心药、冷冻保护剂、血液透析附属品、肿瘤剂(例如，放射疗法或化学疗法的附属品，实体瘤)、器官保护剂(例如，活体外、供体内、受者体内)、性能增强剂(例如民用/运动员用、军用)、手术附属品(例如，心肺分流术(预充)、心肺分流术(调节)、肺缺血、手术前调节、破裂性主动脉瘤、代替胸主动脉(夹层形成或动脉瘤))或伤口愈合剂；用于成像(x射线或磁共振成像(MRI))；改善肺功能(例如，急性肺损伤、慢性肺损伤、短暂性病毒性肺炎、新生儿呼吸窘迫综合征)；或其组合。此类用法包括向有需要的受试者施用所述偶联物或组合物。
进一步地，本发明的血红蛋白和组合物可用于治疗非创伤性出血性休克、院前创伤(pre-hospital setting trauma)、创伤性出血性休克、急性肺损伤、成人呼吸窘迫综合征、创伤性脑损伤、中风、实体瘤癌症、器官退化(活体外)、器官退化(受者体内)、重型脓毒症/脓毒性休克、心肌梗塞/心肌缺血、心源性休克、急性心力衰竭、肺栓塞、各种因手术出现的病状(例如，作为血管成形术的附属品、胸主动脉修复的附属品、心肺分流术的附属品、心肺分流术的预充液)或其组合。
其中本发明的血红蛋白和组合物有用的许多临床环境包括以下：
创伤。全血急性损失可导致液体从间质和胞内间隙转移以代替失去的学量，同时血液分流远离包括皮肤和肠在内的低优先级器官。血液分流远离器官降低并且有时消除了这些器官中的O2水平并且导致渐进性组织死亡。首要目标是氧合受影响的组织。这种创伤可处于院前环境或可导致创伤性出血性休克或创伤性脑损伤。
缺血。所述偶联物及其组合物也可用于向红细胞或许多其它氧疗剂不能渗透的区域输送氧气、CO和/或NO。这些区域包括位于红细胞流障碍物下游的任何组织区域，例如血栓、镰状细胞阻塞、动脉阻 塞、血管成形术球囊、手术器械下游区域和遭受氧气匮乏或缺氧的任何组织。所有类型的组织缺血均可治疗，包括(例如)中风、新兴中风、短暂性缺血发作、心肌顿抑和冬眠、急性或不稳定性心绞痛、新兴心绞痛、梗塞等。具体而言，导致缺血的病状包括急性心力衰竭、心源性休克、心肌梗塞/心肌缺血、中风、肺栓塞、非创伤性出血性休克或脑血管创伤。
血液稀释。在这种应用中，施用治疗剂以代替(取代)取出的自体血的O2水平。这样允许在手术期间使用取出的自体血进行必要的输血。一个这样需要术前除血的手术将为心肺转流术。
脓毒症/脓毒性休克。在脓毒症期间，尽管有大量输液疗法和用血管收缩剂治疗，但是一些患者也可能变成高血压。在这种情况下，一氧化氮(NO)过量生成导致血压降低。因此血红蛋白是治疗这些患者的理想试剂，因为血红蛋白以高亲和性结合NO。
低血氧症。当患者有肺炎或胰腺炎引起的急性肺损伤时，可观察到低血氧症并且可通过提供本发明的血红蛋白或组合物以氧合受影响的组织而减轻。
癌症。向实体瘤肿块的缺氧内核输送O2增加了其对放射疗法和化学疗法的敏感性。因为肿瘤的微脉管系统与其它组织不同，所以通过增加O2水平敏化需要O2在缺氧核内卸载。换言之，P50应非常低以防止O2早期卸载，增加O2水平以确保使肿瘤对后续放射和化学疗法治疗最佳敏化。
手术。在各种外科手术期间可使用本发明的血红蛋白和组合物。例如，它们可用作血管成形术、胸主动脉修复、心肺分流术期间的附属品或作为心肺预充液。
器官灌注。在将器官保存在活体外或在器官捐赠受者体内期间，维持O2含量有助于保持结构和细胞完整性并且将梗塞形成减到最 少。所述血红蛋白和组合物可维持此类器官的氧气需求。
所述血红蛋白及其组合物也可用于非人类，例如家畜(例如，牲畜和宠物如狗、猫、马、鸟、爬行动物)。预计，本发明发现了在紧急治疗遭受由于损伤、溶血性贫血等引起的失血的家畜和野生动物中的实用性。兽用包括治疗由于损伤、溶血性贫血、马感染性贫血、猫感染性贫血、细菌感染、因子IV断裂、脾机能亢进和脾大、禽类出血性综合征、再生不良性贫血、再生障碍性贫血、特发性免疫溶血性病状、缺铁、同族免疫性溶血性贫血、微血管病性溶血性贫血、寄生病或手术麻醉引起的脑损伤引起的失血。
实施例
实施例1.4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯的合成(4-STC；1-(((2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧基)-4-氧基羰基)氧基)-2，5-吡咯烷二酮)
将1g的4-羟基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧(TEMPOL)溶于20mL无水乙腈中并且在室温下混合5min。一旦TEMPOL溶解，就向反应添加2.975g的N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)(2个当量)和2.425mL三乙胺(3.0个当量)。在室温、厌氧条件下进行反应6-8小时。反应完成后，减压蒸发溶剂。将残渣溶于乙酸乙酯中并用饱和CuSO4水溶液洗涤。分离有机相并向有机相添加0.5g的Na2SO4/gTEMPOL。在室温下混合溶液15min，接着过滤。减压蒸发滤过溶液。通过添加正庚烷使产物，4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯沉淀，过滤并在室温真空下干燥。
下面示出了制备4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯的反应图解：

实施例2.4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯(4-STC)的分析
对原材料TEMPOL和最终产物4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯(4-STC)进行ESI-TOF高精度质谱法以确认TEMPOL转化为4-STC(图1和2)。
另外，如图3所示，对原材料TEMPOL(条带1)和N，N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC，条带3)及6小时时的反应产物(条带4)和沉淀后的最终产物4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯(条带5)进行薄层色谱法。条带2载有N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)，反应期间从DSC释放的反应副产物。正如从图3可见，最终产物不含任何原材料或副产物。
实施例3.3-琥珀酰亚胺基-PROXYL-碳酸酯的合成(3-SPC；1-(((2，2，5，5-四甲基-1-吡咯烷氧基)-3-氧基羰基)氧基)-2，5-吡咯烷二酮)
可使用与以上实施例1中对4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯描述类似的方法，使用3-羟基-2，2，5，5-四甲基吡咯烷-1-氧代替TEMPOL作为原材料制备3-琥珀酰亚胺基-PROXYL-碳酸酯。
实施例4.4-琥珀酰亚胺基-羧基-TEMPO的合成(4-SCT；1-(((2，2，6，6-四甲基-1-哌啶氧基)-4-羰基)氧基)-2，5-吡咯烷二酮)
将1g的4-羧基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧(4-羧基TEMPO)溶于75mL四氢呋喃中并且在室温下混合5min。一旦4-羧基TEMPO溶解，就向反应添加0.632g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(1.1个当量)和1.15g的N，N’-二环己基碳二亚胺(1.1个当量)。在室温、厌氧条件下进行反应24小时。反应完成后，过滤并减压蒸发溶液。将残渣溶于乙酸乙酯中并用水洗涤。分离有机相并向有机相添加0.5g的Na2SO4/g 4-羧基TEMPO。在室温下混合溶液15min，接着过滤。减压蒸发滤过溶液。通过添加正庚烷使产物，4-琥珀酰亚胺基-羧基-TEMPO沉淀，过滤并在室温真空下干燥。
下面示出了制备4-琥珀酰亚胺基-羧基-TEMPO的反应图解：

实施例5.3-琥珀酰亚胺基-羧基-PROXYL的合成(3-SCP；1-(((2，2，5，5-四甲基-1-吡咯烷氧基)-3-羰基)oxy-2，5-吡咯烷二酮)
可使用与以上实施例3对4-琥珀酰亚胺基-羧基-TEMPO描述的相同化学方法，使用3-羧基-2，2，5，5-四甲基吡咯烷-1-氧(3-羧基PROXYL)代替4-羧基TEMPO作为原材料合成3-琥珀酰亚胺基-羧基Proxyl。
实施例6.聚硝酰化PEG化血红蛋白(PN-PEG-Hb)的制备
以两步法制备聚硝酰化血红蛋白：a)制备PEG偶联血红蛋白和b)聚硝酰化PEG-Hb。
通过使SFH与9倍摩尔过量的2-亚氨基硫烷(2-IT)反应2.5小时与16倍摩尔过量的马来酰亚胺PEG 5000(MalPEG5000)反应2小时使PEG与无基质血红蛋白(SFH)偶联。在pH 7.4下于磷酸盐缓冲盐水 (PBS)中进行硫醇化和PEG化反应。如下面的反应图解所示，2-亚氨基硫烷使赖氨酸硫醇化并且MalPEG5000与β-Cys93残基和硫醇化赖氨酸残基的固有硫醇反应：

R1、R2和R3表示其余血红蛋白主链，R4为乙烯，并且n表示5,000道尔顿PEG链中氧乙烯单元的数量。虽然以上的反应图解将硫醇化和PEG化显示为独立步骤，但是所述反应作为“一锅”反应进行，SFH、2-IT和MalPEG 5000包括在单一反应混合物中。
使用羧基-PEG-Hb进行PEG-Hb的聚硝酰化。使用超过血红蛋白30倍摩尔过量的4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯(4-STC)在室温CO气氛或冷藏条件下进行所述反应。可通过改变4-STC超过血红蛋白 的摩尔过量、进行反应的温度和/或反应时间改变每个血红蛋白的硝酰基数量。使用70kDa切向流过滤纯化聚硝酰化血红蛋白并且无菌过滤最终产物并储存在CO气氛下。下面示出了由PEG-Hb制备PN-PEG-Hb的反应图解：

R1、R2和R3表示其余血红蛋白主链。
实施例7.聚硝酰化PEG化血红蛋白的表征(PN-PEG-Hb)
图4示出了聚硝酰化之前(中图)和之后(下图)(PN-MP4)，TEMPOL(上图)和PEG化血红蛋白(MP4)的非配对电子的电子顺磁共振(EPR)图谱。
图5示出了PEG化血红蛋白(PEG-Hb；上图)和聚硝酰化PEG化血红蛋白(PEG-Hb-PN；下图)的尺寸排阻分析图。使用Superose-12 柱进行尺寸排阻分析并且使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗脱蛋白质。
图6示出了聚硝酰化PEG化血红蛋白(PEG-Hb-PN)的特征紫外-可见光谱图。
通过在大鼠体内施加10％最大负载，在体内测试PEG-Hb-PN的稳定性。图7示出了在输注结束时和在输注1小时后血浆血红蛋白的紫外-可见光谱图。
图8示出了其中使用5、10、20、30、50或100倍摩尔过量的4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯(4-STC)硝酰化PEG化血红蛋白(MP4)的实验结果。当4-STC的摩尔过量从5倍增加到30倍时，硝酰化程度以剂量依赖方式增大。当使用30倍、50倍或100倍摩尔过量的4-STC时，硝酰化程度大致相同。
实施例8.聚硝酰化白蛋白(PN-AIb)的制备
使用25％人血清白蛋白溶液进行白蛋白的聚硝酰化。通过改变4-STC超过白蛋白的摩尔过量改变每个白蛋白分子的硝酰基数量。在室温或冷藏条件下使用超过白蛋白5、10、20、30、50或100倍摩尔过量的4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯(4-STC)，在pH 7.4下进行所述反应17-24h。通过凝胶过滤纯化聚硝酰化白蛋白并通过MALDI-TOF质谱法分析以鉴定每个白蛋白分子的硝酰基数量。下面示出了使用4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯(4-STC)由白蛋白制备PN-白蛋白的反应图解：

R1和R2表示其余白蛋白主链。
图9和13(非硝酰化HSA)、10-12和14-16(分别使用5、10、20、 30、50或100倍摩尔过量的4-STC硝酰化HSA)示出了MALDI-TOF质谱。图17提供了这些数据的图示，并且显示当4-STC的摩尔过量从5倍增加到100倍时，硝酰化程度以剂量依赖方式增大。
实施例9.聚硝酰化PEG化白蛋白(PN-PEG-Alb)的制备
以两步法制备聚硝酰化PEG化白蛋白：a)制备PEG偶联白蛋白和b)聚硝酰化PEG-Alb。
通过使白蛋白与9倍摩尔过量的2-亚氨基硫烷(2-IT)反应2.5小时与16倍摩尔过量的马来酰亚胺PEG 5000(MalPEG5000)反应2小时使PEG与白蛋白偶联。在pH 7.4下于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行硫醇化和PEG化反应。PEG化2小时后，使PEG-白蛋白偶联物通过70kDa切向流过滤以去除未反应的试剂并配制于制剂缓冲液中。在室温或冷藏条件下，使用超过白蛋白100倍摩尔过量的4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯(4-STC)，使PEG-白蛋白与4-琥珀酰亚胺基-TEMPO-碳酸酯(4-STC)反应进行聚硝酰化。可通过改变4-STC超过白蛋白的摩尔过量、进行反应的温度和/或反应时间，改变每个白蛋白分子的硝酰基数量。使用70kDa切向流过滤纯化聚硝酰化白蛋白。下面示出了由PEG-Alb制备PN-PEG-Alb的反应图解：

R1、R2和R3表示其余白蛋白主链，R4为乙烯，并且n表示5,000道尔顿PEG链中氧乙烯单元的数量。