说明书一种EDDP人工抗原的制备方法
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种美沙酮代谢物(EDDP)人工抗原的制备方法。
背景技术
美沙酮又名美散痛，属麻醉性镇痛药，它的化学结构和吗啡相差较远，但药理作用却与吗啡非常相似。其突出的特点是镇痛作用强、口服有效，对阿片类毒品成瘾者的戒断症状抑制作用持久，反复应用持续有效，适用于成瘾病人的脱毒治疗。
美沙酮的代谢场所主要是在肝脏内，代谢途径为氮原子上的脱甲基作用，再经过自我环化得到主要代谢物2-乙缩醛-1，5二甲基-3，3-二苯基吡咯烷(EDDP)，结构式如下：
在排泄物中美沙酮原形可占到服用量的11％，在偶尔服用美沙酮的患者中代谢物浓度为美沙酮原形的一半，而在长期服用美沙酮的患者中代谢物浓度为美沙酮原形的2倍。
目前，大部分国家把美沙酮用于阿片类毒品成瘾的维持治疗，政府通过周期性检测患者尿液中的美沙酮原形或其代谢物的浓度来判断患者服用美沙酮的状况。但在患者尿液中检测美沙酮原形时经常会遇到如下问题：(1)一小部分患者对美沙酮的代谢能力特别强，在这些患者中即使他们按照政府给他们制定的疗程来服用美沙酮，但由于他们对美沙酮有特别强的代谢力，在尿液中美沙酮原形浓度过低而检测不到美沙酮，这样政府会认为患者没有服用美沙酮而强制他们再服用美沙酮，而过多服用美沙酮不但影响疗效，同时给患者带来更大的副作用；(2)另外一部分人通过在尿液中加入少量美沙酮而得到阳性结果(基于检测美沙酮原形的免疫产品)来逃过政府的检测，他们会把剩下来大量的美沙酮在市场上出售来换取阿片类毒品。鉴于以上原因，我们需要开发出检测美沙酮代谢物(EDDP)的免疫产品来检测美沙酮。
目前，对美沙酮代谢物(EDDP)的检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC),气相色谱(GC)，薄层色谱(TLC)，质朴(MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行 操作，不能达到现代检测对快速，准确的要求。而免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法,该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。因此有必要提供一种有效的美沙酮人工抗原的制备方法,制备的美沙酮人工抗原可用于免疫制备具有特异性的美沙酮抗体,进一步用于检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种美沙酮代谢物(EDDP)人工抗原的制备方法，所制备的EDDP人工抗原可进行动物免疫，取得相应的EDDP抗体，可用于各种美沙酮类免疫分析法的研究，为美沙酮的检测提供更加方便快速准确的途径。
一种美沙酮代谢产物(EDDP)人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备EDDP人工半抗原：
(a)将二苯乙腈与2-氯-N,N-二甲基丙胺盐酸盐以摩尔比为1:1.6加入150ml圆底烧瓶中，100℃下搅拌反应6小时；反应结束后反应液用乙醚提取，转干，经重结晶得到白色固体产物Ⅰ；薄层层析：层析液为乙酸乙酯，产物Rf＝0.5～0.7；
(b)将产物Ⅰ与氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯以摩尔比为1.16:1加入50ml三口圆底烧瓶中，以甲苯为溶剂，110℃下搅拌反应24hrs；反应结束后，补加之前一半摩尔量的氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯，继续反应24hrs，加入适量甲酸，三乙胺，用去离子水分出有机相，水相用乙醚萃取，得到的乙醚相分别用浓度为10％的稀盐酸、饱和氯化钠水溶液洗涤，经干燥，过滤，将溶剂转干得产物Ⅱ；薄层层析：层析液为氯仿:甲醇:氨水＝9ml:1ml:0.2ml，产物Rf＝0.8～0.9；
(c)将产物Ⅱ与98％的甲酸以摩尔比为1:8溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入锌粉，室温下搅拌反应48小时，反应结束后过滤，滤渣用二氯甲烷洗涤，将滤液转干，得到的油状物溶于适量氯仿中，并用适量10％氨水溶液洗涤，水相用氯仿萃取，合并氯仿相，经无水硫酸镁干燥，过滤，转干，得到黄色油状物，将该黄色油状物用乙醚溶解，用浓度为10％的稀盐酸萃取两次，合并水相，水相用乙醚洗涤后用氯仿萃取三次，合并氯仿相，经无水硫酸镁干燥，过滤，转干，得到黄色油状物Ⅲ；薄层层析：层析液为氯仿:甲醇:氨水＝9ml:1ml:0.2ml，产物Rf＝0.5-0.6；
(d)将黄色油状物Ⅲ溶于适量浓度为10％的稀盐酸中，加热到110℃，加入35倍摩尔量的亚硝酸钾，控制加料时间在30min左右，继续反应30min，再补加之前五分之一摩尔量的浓度为10％的稀盐酸和一半摩尔量的亚硝酸钾，控制加料时间仍为30min，回流反应30min；反应结束后，冷却至室温，用适量乙醚萃取，合并乙醚相，经无水硫酸镁干燥，过滤，转干得到黄色粉末状固体Ⅳ；薄层层析：层析液为氯仿:甲醇:氨水＝9ml:1ml:0.2ml，产物Rf＝0.8-0.9；
(e)将黄色粉末状固体Ⅳ与乙基锂以摩尔比为1:2溶于甲苯中，冰浴条件下反应1hrs；缓慢升温至室温，室温下继续反应80min，反应结束后加入适量冰水，分出有机相，有机相用适量去离子水和饱和氯化钠水溶液洗涤，经干燥，过滤，转干得到黄色油状产物Ⅴ；薄层层析：层析液为氯仿:甲醇:氨水＝9ml:1ml:0.2ml，产物Rf＝0.6～0.7；
(f)将油状产物Ⅴ与丁二酸酐以1:1.5摩尔比溶于二氯甲烷中，冰浴条件下加入5倍油状产物Ⅴ摩尔量的无水三氯化铝，等固体基本溶解后，转入35℃-40℃的油浴中回流反应过夜。停止反应，将反应液转入冰浴中，加入适量去离子水和浓盐酸，然后用去离子水洗涤3次，取有机相，将有机相直接转干，爬大板分离得到产物Ⅵ，薄层层析：层析液为氯仿:甲醇:氨水＝9ml:1ml:0.2ml，产物Rf＝0.5；
(2)制备EDDP人工抗原：
(g)将牛丙种球蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的A液；
(h)将EDDP半抗原Ⅵ置于50ml尖底离心管中，按比例加入去离子水，溶清后，再加入A液，振荡，静置，再加入与EDDP半抗原Ⅵ相同质量的EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，间断性摇晃，室温下静置反应过夜得到人工抗原混合液；其中，反应比例EDDP半抗原:去离子水:A液:EDCI＝80mg:15ml:5ml:80mg；
(i)将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于去离子水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4；
(j)将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：EDDP-牛丙种球蛋白。
本发明的技术方案分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以二苯乙腈和2-氯-N,N-二甲基丙胺盐酸盐为原料通过加成反应、酯化反应、环合反应、硝化反应及傅克反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛丙种球蛋白(BGG)结合制备EDDP的人工抗原即EDDP-牛丙种球蛋白。其反应方程式如下：
本发明制备得到的EDDP人工抗原可通过以下方法进行鉴定：
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法虽然很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制EDDP半抗原浓度为0,5,10,20,30,40ug/ml的PBS溶液，通过紫外扫面图可知EDDP半抗原的最大吸收波长为292nm，在292nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε＝吸光值/摩尔浓度。本发明计算得ε＝5320.32L/mol
偶联物蛋白浓度的测定：配制浓度为0,10,20,30,40，60,80,100,120ug/ml的牛丙种球蛋白PBS溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收，在655处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。本发明计算得EDDP抗原的蛋白浓度为2.86mg/ml。
偶联比测定：配制100ug/ml的牛丙种球蛋白PBS溶液，将EDDP人工抗原用PBS稀释到100ug/ml，在275处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1,A2,则偶联比率γ为：γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/150000),本发明计算得γ≈16。
其中ε为摩尔吸光系数(L/mol),150000为牛丙种球蛋白的分子量，100×10-3为牛丙种球蛋白浓度(ug/ml)。
本发明的有益效果：本发明合成了EDDP的人工抗原，合成工艺先进，特异性强，得到 的EDDP人工抗原用于免疫新西兰白兔，检测结果表明，EDDP人工抗原的免疫血清的效价为1：64000，完全可用于免疫分析中，为美沙酮的检测提供更加方便快速准确的途径。
附图说明
图1是EEEP人工半抗原的液相色谱图。
图2是EDDP人工半抗原的质谱图。
图3是EDDP人工抗原制备前后的紫外扫描图。
实施例1
(1)制备EDDP人工半抗原：
(a)称取20g二苯乙腈，26g 2-氯-N,N-二甲基丙胺盐酸盐，20g固体氢氧化钠，加入到150ml单口圆底烧瓶中，缓慢加热至100℃，固体基本溶解，同时析出白色固体，溶液呈柠檬黄，继续反应6小时；反应结束后，冷却至室温，反应液用150ml乙醚提取三次，收集乙醚相，乙醚相用120ml浓度为5％稀盐酸溶液提取三次，收集盐酸相，盐酸相再用浓度为25％氢氧化钠水溶液调碱，直到不再有沉淀生成为止，溶液分两层，碱性溶液再用150ml乙醚萃取三次，收集乙醚相，乙醚相用无水碳酸钾干燥，转干，用10ml石油醚经重结晶得到白色固体产物Ⅰ12.02g，冷藏备用，薄层层析：层析液为乙酸乙酯，产物Rf＝0.5～0.7；
(b)在150ml三口圆底烧瓶中，称取2.0g上述白色固体产物Ⅰ，溶于16ml甲苯中，加热至110℃回流，量取1.15ml氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯溶于8ml甲苯中，滴加入上述回流反应液中，加料时间为30min，110℃搅拌反应24hrs；反应结束后，补加0.575ml氯甲酸-2,2,2-三氯乙酯，继续反应24hrs，将反应液冷却至室温，加入0.881ml甲酸，同时缓慢加入2.289ml三乙胺，有大量白烟生成，冰浴冷却，加入32ml去离子水，用去离子水分出有机相，水相用32ml乙醚萃取，合并有机相，有机相用80ml浓度为10％的稀盐酸溶液洗涤两次，接着用32ml饱和氯化钠水溶液洗涤，接着用无水硫酸钠干燥，过滤，溶剂转干得到产物Ⅱ3.15g；薄层层析：层析液为氯仿:甲醇:氨水＝9ml:1ml:0.2ml，产物Rf＝0.8～0.9；
(c)将3.15g产物Ⅱ溶于27.6ml N,N-二甲基甲酰胺中，冰浴搅拌反应30min，加入0.766g(0.623ml)98％的甲酸，1.011g锌粉，室温下搅拌反应48小时，反应结束后过滤，滤渣用18.4ml二氯甲烷洗涤，将滤液转干，得到的油状物溶于36.8ml氯仿中，并用36.8ml浓度为10％氨水溶液洗涤两次，水相用18.4ml氯仿萃取，合并氯仿相，经无水硫酸镁干燥，过滤，转干，得到2.296g黄色油状物，将黄色油状物溶于73.6ml乙醚，用36.8ml浓度为10％稀盐酸溶液萃取乙醚溶液两次，合并水相，水相用73.6ml乙醚洗涤两次，接着水相用55.2ml氯仿萃取三次，合并氯仿相，经无水硫酸镁干燥，过滤，转干，得到黄色油状物Ⅲ1.798g；薄层层析：层析液为氯仿:甲醇:氨水＝9ml:1ml:0.2ml，产物Rf＝0.5-0.6；
(d)将1.798g黄色油状物Ⅲ溶于90ml浓度为10％稀盐酸溶液中，转入250ml三口圆底烧瓶中，加热到110℃开始回流，然后慢慢加入20g亚硝酸钾，控制加料时间在30min左右，有大量黄色气体产生，反应较剧烈，加料完成后，继续反应30min，接着加入18ml 10％稀盐酸溶液,继续加入10g亚硝酸钾，控制加料时间仍为30min，回流反应30min；反应结束后，冷却至室温，用120ml乙醚萃取三次，合并乙醚相，经无水硫酸镁干燥，过滤，转干，得到黄色固体粉末状Ⅳ610mg；薄层层析：层析液为氯仿:甲醇:氨水＝9ml:1ml:0.2ml，产物Rf＝0.8-0.9；
(e)在冰盐浴条件下，往50ml圆底烧瓶中加入13ml乙基锂，-5℃搅拌反应，将610mg黄色固体粉末状Ⅳ溶于8.7ml甲苯中，接着用注射器缓慢注入装有乙基锂的烧瓶中，注射时间为5min,注射完成后，冰浴条件下反应1小时；缓慢升温至室温(约1hrs)，室温下继续反应80min，反应结束后加入11ml冰水，分出有机相，有机相用17ml去离子水和17ml饱和氯化钠水溶液洗涤，有机相经干燥，过滤，转干，得到黄色油状产物Ⅴ376mg；薄层层析：层析液为氯仿:甲醇:氨水＝9ml:1ml:0.2ml，产物Rf＝0.6～0.7；
(f)将376mg油状产物Ⅴ溶于5.5ml二氯甲烷中，加入204.3mg丁二酸酐，转入冰浴中，冰浴条件下加入0.303g无水三氯化铝，30min后，接着加入0.303g无水三氯化铝，30min后，继续加入0.303g无水三氯化铝，等固体基本溶解后，转入35℃-40℃油浴中回流反应过夜。停止反应，将反应液转入冰浴中，加入7.07ml去离子水和0.344ml浓盐酸，用45ml去离子水洗涤3次，将有机相直接转干，爬大板分离得到产物Ⅵ74mg。薄层层析：层析液为氯仿:甲醇:氨水＝9ml:1ml:0.2ml，产物Rf＝0.5；
(2)制备EDDP人工抗原：
(g)将25mg牛丙种球蛋白溶于5ml PBS缓冲液中，得到5ml浓度为5mg/ml的A液；
(h)将EDDP半抗原Ⅵ置于50ml尖底离心管中，按比例加入13.875ml去离子水，溶解片刻，再加入4.7ml 5mg/ml的A液，振荡，混匀后静置，再加入74mg EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)，间断性摇晃，室温下静置反应过夜；得到人工抗原混合液；(反应比例：残渣/去离子水/A液/EDCI＝80mg/15ml/5ml/80mg)
(i)将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于去离子中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4；
(j)将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：EDDP-牛丙种球蛋白。
(3)本发明制备得到的EDDP人工抗原可通过以下方法进行鉴定：
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法虽然很多，但 都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制EDDP半抗原浓度为0,5,10,20,30,40ug/ml的PBS溶液，通过紫外扫面图可知EDDP半抗原的最大吸收波长为292nm，在292nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε＝吸光值/摩尔浓度。本发明计算得ε＝5320.32L/mol。
偶联物蛋白浓度的测定：配制浓度为0,10,20,30,40，60,80,100,120ug/ml的牛丙种球蛋白PBS溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收，在655处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。本发明计算得EDDP抗原的蛋白浓度为2.86mg/ml。
偶联比测定：配制100ug/ml的牛丙种球蛋白PBS溶液，将EDDP人工抗原用PBS稀释到100ug/ml，在275处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1,A2,则偶联比率γ为：γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/150000),本发明计算得γ≈16。
其中ε为摩尔吸光系数(L/mol),150000为牛丙种球蛋白的分子量，100×10-3为牛丙种球蛋白浓度(ug/ml)。