一种具有ACE抑制活性的花粉多肽化合物及其应用.pdf

本发明涉及一种具有抑制血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）活性的花粉多肽化合物LLICGGSAYPR，其氨基酸序列分别为Leu-Leu-IIe-Cys-Gly-Gly-Ser-Ala-Tyr-Pro-Arg。多肽LLICGGSAYPR具有ACE抑制活性，作为高血压、心脏病和心血管病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。

权利要求书
1.  一种具有ACE抑制活性的花粉多肽化合物，其特征在于：所述多肽为 LLICGGSAYPR，具有序列表SEQ ID NO：1中氨基酸序列；该多肽的氨基酸序列 具体为，Leu-Leu-IIe-Cys-Gly-Gly-Ser-Ala-Tyr-Pro-Arg。

2.  一种权利要求1所述多肽在制备ACE抑制剂或心血管药物中的应用。

3.  按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述ACE抑制剂及降血压药 物是以多肽LLICGGSAYPR为活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅 料。

说明书一种具有ACE抑制活性的花粉多肽化合物及其应用
技术领域
本发明涉及多肽LLICGGSAYPR制备抑制血管紧张素转换酶（ACE）及降血压 中的应用。
背景技术
高血压药物研究的一个靶点是抑制血管紧张素转化酶（angiotensin- converting enzyme,ACE），ACE是存在于血管内皮细胞、上皮吸收细胞、神经 上皮细胞、雄性生殖细胞中的一种含锌的二肽羧酶。在人体肾素－血管紧张素 系统（RAS）和激肽酶释放酶－激肽系统（KKS）中，血管紧张素转换酶（ACE） 对机体血压和心血管功能起着重要的调节作用（如图1）。在RAS中，ACE是起 限速作用，ACE可将不具活性的十肽血管紧张素I转化为具有强烈收缩血管作用 的八肽血管紧张素II，同时血管紧张素II还能刺激醛固酮的分泌进而促进肾脏 对水、钠、钾的重吸收，引起钠贮量和血容量的增加，使血压升高。在KKS中， ACE还能催化与心血管系统具有相互作用的神经肽、脑啡肽和P物质等的降解。 血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂是目前常规应用的六大类降压药物之一，ACE 抑制剂不仅仅用于治疗高血压，同时已证实可以防止心力衰竭，减少心肌梗死、 脑卒中、糖尿病和肾损害发生的危险。ACE抑制剂对心血管疾病的防治具有两个 明显的特征：确切的降压疗效和独特的心脏及血管保护。ACE抑制剂可能通过阻 止心房的电重构和解剖重构，预防了心房纤颤（房颤，AF）的发生。多肽是一 类重要的ACE抑制剂，天然蛋白质的酶解肽是ACE抑制剂肽的主要来源（文献2： Lieselot Vercruysse,John Van Camp,Guy Smagghe,J.Agric.Food Chem2005, 53:8106-8115）。血管紧张素转化酶对于机体血压和心血管功能起着重要的调 节作用，因此抑制ACE活性的药物在心血管、心力衰竭等疾病的治疗中发挥重 要作用。多肽类的ACE抑制剂在降血压的同时不会引起常见降压药物的干咳等 副作用。
发明内容
本发明的目的是提供多肽LLICGGSAYPR在抑制ACE活性中的应用；多肽 LLICGGSAYPR具有ACE抑制活性，作为高血压、心脏病和心血管病的保健品和药 物先导化合物具有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明以所述多肽LLICGGSAYPR为抑制ACE活性的有效 成份。
其具有序列表SEQ ID NO：1中氨基酸序列；多肽LLICGGSAYPR为ACE抑 制剂的活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。
具有抑制ACE活性的多肽化合物LLICGGSAYPR的氨基酸序列为 Leu-Leu-IIe-Cys-Gly-Gly-Ser-Ala-Tyr-Pro-Arg。单链线性结构，分子量为 993.2Da，白色粉末状，易溶于水，对ACE活性具有很强的抑制作用，IC50为43.3μM。
多肽LLICGGSAYPR具备ACE抑制剂所要求的特征：
1.ACE倾向于C末端三肽的每个位置含有疏水性氨基酸的底物或抑制剂， C末端为Try，Phe，Tyr和Pro而N端为支链氨基酸的肽段具有较强的ACE抑 制活性。多肽LLICGGSAYPR的C末端三肽均为疏水性氨基酸分别为Try、Pro和 Arg，N末端为Leu带支链，因此满足ACE抑制剂的绝大部分要求。
2.肽的疏水性是影响其抑制活性的重要原因，抑制活性高的肽都含有较多 的疏水氨基酸。多肽LLICGGSAYPR的疏水氨基酸有Ala，Leu，Pro，IIe，含有 较多的疏水氨基酸。
经ACE抑制活性检测，多肽LLICGGSAYPR的IC50为43.3μM。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明首次从油菜花粉中获得并确定了活性化合物的结构，化合物具有较好 的抑制ACE的活性，因此作为治疗高血压、心脏病等心血管疾病药物和保健品 的先导化合物具有良好的潜力和应用前景。
附图说明
图1ACE对血压的调节作用框图。
具体实施方式
实施例1多肽LLICGGSAYPR的制备
20g油菜蜂花粉加入液氮研磨破壁后，加入pH=7.4、50mM Tris-HCl缓冲液 150ml,超声提取三次（一次：400W，超声4s，停4s，80个循环）；提取结束后 于4℃、25000g离心1h，取上清液，加入上清液4倍体积的混合溶剂（丙酮： 乙醇：乙酸=50:50:0.1（体积比））沉淀过夜；沉淀结束后将所有样品于4℃、 25000g离心30分钟，弃去上清，取沉淀用丙酮洗涤脱色，然后于4℃、25000g 离心15分钟，弃去上清，沉淀继续用丙酮反复洗涤直至上清无色，最后用体积 浓度75%乙醇洗涤沉淀并于4℃、25000g离心10分钟，弃上清，取沉淀物冷冻 干燥，得冻干蛋白。冻干蛋白用含有8M尿素的pH=7.4、100mM NH4HCO3缓冲液复 溶，以酶：蛋白=1:25（w/w）比例加入胰蛋白酶，37℃酶解20小时。上述酶解 产物经制备色谱分离，色谱柱为C18（20X250mm，10μm）,所用的流动相A为 质量浓度0.1%甲酸/水溶液，流动相B为质量浓度0.1%的甲酸/乙腈溶液，流速 为2mL/min，洗脱过程如下：5%B—35%B(V/V)—80%B(V/V)。将在280nm下所 检测到的色谱峰分别收集得到的不同组分冷冻干燥，为乳白色粉末状样品。
所得样品经反相液相色谱-串联质谱系统（RPLC-MS/MS）分析：将冷冻干燥 后的酶解样品用体积浓度0.1%甲酸溶液配制为0.4μg/μL，进样20μL进行LTQ 线性离子阱质谱（配置纳升级电喷雾源）分析。利用Xcalibur软件(Thermo) 进行系统控制和数据收集。实验得到的质谱数据结果分别在honeybee,Brassica  campestris L.蛋白质数据库（http://www.uniprot.org/）中进行检索，技术 重复3次，数据库检索软件为SEQUEST。获得序列为Leu-Leu-IIe-Cys-Gly-Gly- Ser-Ala-Tyr-Pro-Arg的多肽。
实施例2多肽LLICGGSAYPR的ACE抑制活性检测
ACE在37℃、PH8.3的条件下催化分解血管紧张素I的模拟底物 Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)产生马尿酸，该物质在228nm处有特征 紫外吸收峰。当加入ACE抑制物时，ACE对HHL的催化作用受到抑制，马尿酸的 生成量会减少。通过测定加入抑制剂前后的马尿酸紫外吸收值可以计算出抑制 活性的大小。
反应体系：
缓冲液为0.05M，PH8.3硼酸盐缓冲液；底物为 Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)，MW429.47，用上述缓冲液配成5mM； ACE（angiotensin-converting enzyme）用上述缓冲液配成0.1U/ml。
ODA（对照组，为不存在抑制剂但存在酶时的吸光值）：50μl缓冲液+50ulHHL+50 μl缓冲液于37℃水浴5min，然后加入50μlACE，37℃水浴30min，加入 200μl、1M的HCl终止反应，再加入1ml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S， 3500r/min离心5min，取0.8ml上清，90℃水浴干燥15min,重溶于0.8ml蒸 馏水中，228nm处检测吸光值为ODA。
ODB（多肽样品组，为存在抑制剂和酶时的吸光值）:50μl样品+50μlHHL+50 μl缓冲液于37℃水浴5min，然后加入50μl ACE，37℃水浴30min，加入 200μl、1M的HCl终止反应，再加入1ml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S， 3500r/min离心5min，取0.8ml上清，90℃水浴干燥15min,重溶于0.8ml蒸 馏水中，228nm处检测吸光值为ODB。
ODC（空白组，为不存在抑制剂和酶时的吸光值）：50μl缓冲液+50μlHHL+50μl 缓冲液于37℃水浴5min，然后加入50μl缓冲液，37℃水浴30min，加入 200μl、1M的HCl终止反应，再加入1ml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S， 3500r/min离心5min，取0.8ml上清，90℃水浴干燥15min,重溶于0.8ml蒸 馏水中，228nm处检测吸光值为ODC。
ACE抑制率（%）=(ODA-ODB)/(ODA-ODC)×100%
分别用0.02325mg/ml,0.04650mg/ml,0.06975mg/ml的多肽浓度，按 上述方法进行ACE抑制活性检测。结果如下表：

经IC50计算器计算该序列的IC50为42.97μg/mL，即43.3μM。