构建基因2A型丙型肝炎病毒临床分离株细胞培养模型的方法.pdf

本发明涉及一种构建基因2a型丙型肝炎病毒临床分离株细胞培养模型的方法。本发明还提供了能在病毒包装细胞中高效感染和复制的重组丙型肝炎病毒。本发明的技术方案可应用于对HCV病人的个性化治疗，开发具广谱活性的疫苗，筛选抗HCV的特异性药物等。

权利要求书
1.  一种丙肝病毒的氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3有90%以上的相同性，并且所述氨基酸序列具有选自以下至少一项条件或其任意组合：
从N末端的氨基酸残基起算，第415位氨基酸为D；第849位氨基酸为G；第862位氨基酸为P；第1388位氨基酸为H；第2100位氨基酸为R；第2432位氨基酸为R；第2584位氨基酸为T；第2955位氨基酸为F。

2.  如权利要求1所述的丙肝病毒的氨基酸序列，其特征在于，还具有选自以下至少一项条件或其任意组合：
第1100位氨基酸为L；第1676位氨基酸为S；第1931位氨基酸为S；第2941位氨基酸为V。

3.  如权利要求1所述的丙肝病毒的氨基酸序列，其特征在于，还具有选自以下至少一项条件或其任意组合：
从N末端的氨基酸残基起算，第249位氨基酸为R；第250位氨基酸为Q；第337位氨基酸为V；第384位氨基酸为G；第390位氨基酸为A；第397位氨基酸为R；第401位氨基酸为G；第402位氨基酸为F；第404位氨基酸为D；第405位氨基酸为V；第416位氨基酸为T；第417位氨基酸为K；第439位氨基酸为A；第453位氨基酸为V；第925位氨基酸为V；第1634位氨基酸为P；第1638位氨基酸为G；第2083位氨基酸为R；第2329位氨基酸为M；第2374位氨基酸为G；第2375位氨基酸为P；第2392位氨基酸为I；第2439位氨基酸为L；第2440位氨基酸为E；第2513位氨基酸为V；第2608位氨基酸为S。

4.  如权利要求1-3任一所述的丙肝病毒的氨基酸序列，其特征在于，具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

5.  编码如权利要求1-4任一项所述的氨基酸序列的多核苷酸，所述的多核苷酸为DNA或RNA。

6.  如权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是DNA，其具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

7.  权利要求1-6任一所述的蛋白或编码其的多核苷酸的用途，用于制备重组丙型肝炎病毒株；或用于制备重组丙型肝炎病毒疫苗；或用于筛选抗丙型肝炎病毒的药物。

8.  一种用于制备重组丙型肝炎病毒株的重组病毒质粒，该重组病毒质粒包含权利要求5或6所述的多核苷酸。

9.  一种制备重组丙型肝炎病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)提供如权利要求8所述的重组病毒质粒；
(b)将步骤(a)的重组病毒质粒在体外转录合成RNA后，转染病毒包装细胞，培养经转染的病毒包装细胞，获得重组丙型肝炎病毒株。

10.  如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的病毒包装细胞是人肝癌细胞系；较佳地，所述的病毒包装细胞包括但不限于：Huh7.5.1细胞、Huh7细胞、Huh7.5细胞、HepG2、IMY-N9；较佳地所述的病毒包装细胞为Huh7.5.1细胞。

11.  一种重组丙型肝炎病毒，其特征在于，所述的病毒具有权利要求5或6所述的多核苷酸组成的基因组。

12.  如权利要求11所述的重组丙型肝炎病毒，其特征在于，所述的病毒由权利要求9或10所述的方法制备。

13.  一种用于制备重组丙型肝炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：权利要求8所述的重组病毒质粒。

14.  如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：病毒包装细胞。

说明书构建基因2a型丙型肝炎病毒临床分离株细胞培养模型的方法
技术领域
本发明属于生物技术以及病毒学领域；更具体地，本发明涉及一种构建基因2a型丙型肝炎病毒临床分离株细胞培养模型的方法。
背景技术
HCV属于黄病毒科，是有包膜的单股正链RNA病毒。其基因组长9.6kb，包括5’非翻译区，开放阅读框及3’非翻译区。其开放阅读框编码一个多聚蛋白，经剪切后得到结构蛋白(core，E1，E2)，p7及非结构蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)。HCV至少可划分为6个基因型以及很多的亚型和分离株。基因型之间不仅有序列的差异，而且对抗病毒治疗的应答也不同。1b和2a是中国丙肝病人中最常见的基因型。由于HCV的RNA依赖的RNA聚合酶保真度不高，HCV在宿主体内以准种形式存在，即许多在序列上高度同源但又有差异的HCV变异株病毒群体。单基因组测序的结果显示HCV在慢性感染患者体内的序列差异很大。
全球丙型肝炎病毒(HCV)感染率约3%。感染后约80%的患者会发展成慢性肝炎，很有可能导致终末期肝病，如肝硬化和肝细胞癌。至今尚无疫苗。目前标准的治疗方案包括聚乙二醇化干扰素α和利巴韦林联用，一些直接作用于HCV小分子抑制剂也被开发出来。然而，因为病毒易产生耐药性，或不同HCV基因型或毒株对药物应答不同，常常无法建立持续性病毒应答。因此，丙肝感染仍是当今世界的一个严重的公共卫生问题。
HCV的体外培养模型对研究HCV生命周期及抗病毒药物开发至关重要。由于病人血清在Huh7来源细胞系中无感染性，体外培养HCV必须得制备感染性cDNA克隆。JFH-1是第一个被报道能在Huh7细胞系中有效产生病毒的HCV基因组(Kato,T.等，2001，Journal of medical virology64:334-339)。JFH-1的独特之处在于它可以不依赖细胞培养适应性突变就能高效复制。借助于这个cDNA克隆，基于JFH-1或嵌合体J6/JFH-1的真病毒体外感染模型才得以建立。随后，来源于其它基因型的5’非翻译区，5’非翻译区-NS2，NS3/NS4A或NS5A的与JFH-1的嵌合病毒都相继被报道。但是，还需要基于对共有序列进行有限的突变来构建高效HCV培养模型。
在筛选抗HCV的特异性药物或疫苗的过程中，由于不同HCV基因型或病毒株对药物的应答可能有很大不同，因此，在尽量多的病毒株上，尤其是不同来源、不同抗药性的病毒株上测试潜在药物或疫苗的效果就显得尤为重要。遗憾的是目前能够获得的具有在体外培养系统中高效复制感染能力的病毒株还很有限，因此亟需找到更多 的适用于体外筛药系统的病毒株，以帮助寻找具有更广泛抗HCV病毒谱的潜在药物，或开发更有效的疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种构建基因2a型丙型肝炎病毒临床分离株细胞培养模型的方法。
在本发明的第一方面，提供一种丙肝病毒的氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:3有90%以上、优选的95%以上、更优的97%以上、最优的99%以上的相同性，并且所述氨基酸序列具有选自以下至少一项条件或其任意组合：从N末端的氨基酸残基起算，第415位氨基酸为D；第849位氨基酸为G；第862位氨基酸为P；第1388位氨基酸为H；第2100位氨基酸为R；第2432位氨基酸为R；第2584位氨基酸为T；第2955位氨基酸为F。
在一个优选例中，所述的氨基酸序列还具有选自以下至少一项条件或其任意组合：第1100位氨基酸为L；第1676位氨基酸为S；第1931位氨基酸为S；第2941位氨基酸为V。
在另一优选例中，所述的丙肝病毒的氨基酸序列还具有选自以下至少一项条件或其任意组合：从N末端的氨基酸残基起算，第249位氨基酸为R；第250位氨基酸为Q；第337位氨基酸为V；第384位氨基酸为G；第390位氨基酸为A；第397位氨基酸为R；第401位氨基酸为G；第402位氨基酸为F；第404位氨基酸为D；第405位氨基酸为V；第416位氨基酸为T；第417位氨基酸为K；第439位氨基酸为A；第453位氨基酸为V；第925位氨基酸为V；第1634位氨基酸为P；第1638位氨基酸为G；第2083位氨基酸为R；第2329位氨基酸为M；第2374位氨基酸为G；第2375位氨基酸为P；第2392位氨基酸为I；第2439位氨基酸为L；第2440位氨基酸为E；第2513位氨基酸为V；第2608位氨基酸为S。
在另一优选例中，所述的丙肝病毒的氨基酸序列具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，提供编码所述的氨基酸序列的多核苷酸，所述的多核苷酸为DNA或RNA。
在一个优选例中，所述的多核苷酸是DNA，其具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供所述的蛋白或编码其的多核苷酸的用途，用于制备重组丙型肝炎病毒株；或用于制备重组丙型肝炎病毒疫苗；或用于筛选抗HCV的特异性药物。
在本发明的另一方面，提供一种用于制备重组丙型肝炎病毒株的重组病毒质粒，该重组病毒质粒包含所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种制备重组丙型肝炎病毒的方法，所述方法包括：(a)提供如所述的重组病毒质粒；(b)将步骤(a)的重组病毒质粒在体外转录合成RNA后，转染 病毒包装细胞，培养经转染的病毒包装细胞，获得重组丙型肝炎病毒株。
在另一优选例中，所述的病毒包装细胞是人肝癌细胞系；较佳地，所述的病毒包装细胞包括但不限于：Huh7.5.1细胞、Huh7细胞、Huh7.5细胞、HepG2、IMY-N9；较佳地所述的病毒包装细胞为Huh7.5.1细胞。
在本发明的另一方面，提供一种重组丙型肝炎病毒，所述的病毒具有所述的多核苷酸组成的基因组。
在另一优选例中，所述的重组丙型肝炎病毒由前面所述的方法制备。
在本发明的另一方面，提供一种用于制备重组丙型肝炎病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括所述的重组病毒质粒。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：病毒包装细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、最大似然法分析得到的PR63的进化树。进化树采用Kimura两参数模型，以MEGA5软件绘制。分析中包括的核苷酸序列有H77(登录号AF009609)，JFH-1(AB047639)，HC-J6(D00944)，HCV-J(D90208)，Con-1(AJ238799)，HCV-J8(D10988)，BEBE1(D50409)，J6CF(AF177036)，JFH-2(AB690460)，PR63共有序列(KF676351)和来源于细胞培养的PR63cc基因组(KF676352)。PR63共有序列和PR63cc以星号标出。
图2、PR63CC基因组构建流程图。JFH-1和PR63的基因组分别以白色或灰色方框表示。为了技术上的方便，我们将HCV的基因组分成3个片段：片段1(FspA I-Spe I)含有Core-NS3蛋白酶区域(核苷酸476-4111)，片段2(Spe I-Rsr II)含有NS3解旋酶-NS5A段(核苷酸4112-7465)，片段3(Rsr II-SgrA I)含有NS5B区域(核苷酸7466-9334)。带有5个适应性突变的PR63FL基因组被命名为PR63cc(即来源于细胞培养的PR63)。每个克隆中来源于PR63的序列的核苷酸的位置标注于括号内。适应性突变以点表示。
图中，5’UTR指相应于SEQ ID NO:1中第1-340位核苷酸序列；C表示核心蛋白编码序列，相应于SEQ ID NO:1中第341-913位核苷酸序列；E1指E1蛋白编码序列，相应于SEQ ID NO:1中第914-1489位核苷酸序列；E2指E2蛋白编码序列，相应于SEQ ID NO:1中第1490-2590位核苷酸序列；p7指p7蛋白编码序列，相应于SEQ ID NO:1中第2591-2779位核苷酸序列；NS2指NS2蛋白编码序列，相应于SEQ ID NO:1中第2780-3430位核苷酸序列；3指NS3蛋白编码序列，相应于SEQ ID NO:1中第3431-5323位核苷酸序列；4A指NS4A蛋白编码序列，相应于SEQ ID NO:1中第5324-5485位核苷酸序列；4B指NS4B蛋白编码序列，相应于SEQ ID NO:1中第5486-6268位核苷酸序列；5A指NS5A蛋白编码序列，相应于SEQ ID NO:1中第 6269-7666位核苷酸序列；5B指NS5B蛋白编码序列，相应于SEQ ID NO:1中第7667-9439位核苷酸序列；NS5B-3’UTR之间有一个终止密码子从9440-9442；3’UTR指相应于SEQ ID NO:1中第9443-9665位核苷酸序列。在JFH-1及SEQ ID NO:2中，序列位点的起止也如此，只有3’UTR稍有不同，JFH-1的3’UTR为9443-9678。
图3、适应性突变增加了PR63cc的感染力。(A)PR63FL，PR63FL_N1931S和PR63FL_D398G_N415D_N1931S_H2100R_T2941V(即PR63FL_GDSRV)在Huh7.5.1细胞中电转后产生病毒的动力学曲线。将10μg体外转录的RNA与细胞混合后电转，在指定时间点收样，测定上清中的感染性。虚线(10ffu/mL)为滴度测定实验中的检测下限。结果以两次实验的平均值和标准方差表示。(B)基因组PR63FL-N1931S，PR63FL-N1931S-GND，PR63FL-N1931S-H2100R-T2941V或JFH-1的NS3-3’UTR序列被整合于含有荧光素酶报告基因的亚复制子中，体外转录得到的RNA电转Huh7.5.1细胞后，在电转后4，24，48，72及96小时分别测序荧光素酶活性，来表征这些不同HCV序列的瞬时复制能力。误差由3次独立实验结果计算得到。
图4、对PR63cc的特性研究。JFH-1和PR63cc在Huh7.5.1细胞(A)及Huh7细胞(B)中的扩增曲线。细胞以感染复数约0.01接种病毒，在相应时间点测定病毒滴度。虚线(10ffu/ml)表示检测下限。(C)E2抗体对JFH-1和PR63CC的抑制。约250ffu个病毒和5倍梯度稀释(1:20–1:2500)的α-E2单克隆抗体孵育1小时后感染Huh7.5.1细胞，三天后以RT-qPCR方法测定胞内HCV RNA含量，以不含抗体的细胞培养基处理作为对照。误差表示平均值的标准方差。(D)NS5A-，NS5B-的抑制剂及IFNα对JFH-1和PR63cc的抑制曲线。感染后24小时在细胞培养上清中加入不同浓度的抑制剂，48小时后测定HCV RNA含量。NS5A的抑制剂是daclatasvir(BMS-790052)，NS5B的抑制剂是2’-C-Methyl-Adeosine(2’CMA)。(E)抑制剂对病毒的EC50。
具体实施方式
通过独特的克隆筛选策略，本发明人获得了能在病毒包装细胞中高效感染和复制的重组丙型肝炎病毒(HCV)。本发明人开发的构建HCV全长感染性克隆的方法，不仅能应用于其他临床分离株，还对HCV病人的个性化治疗，开发具广谱活性的疫苗等HCV研究领域的各方面有显著意义。
本发明人通过克隆筛选的方法已成功构建了基于基因型1b的临床分离株与JFH-1的嵌合病毒。为了验证克隆筛选的方法是否也能用于构建全长的感染性cDNA克隆，本发明人选择了一例2a型的病毒株PR63，扩增它的核心蛋白-NS3，NS3-NS5A及NS5B区，再分别与JFH-1整合得到分区段的嵌合克隆；当证明了上述这几段来源于PR63的序列均可在JFH-1骨架上产生感染性病毒粒子后，本发明人把这些PR63的序列组合在一起，得到一个接近全长PR63克隆。JFH-1的NS5B-3’非翻译区对其 体外复制非常重要。当把这两段来源于JFH-1的序列一起替换掉后无病毒产生。因此，本发明人首先把JFH-1的3’非翻译区换成PR63的序列，通过持续性细胞传代找到几个适应性突变；然后再把JFH-1的NS5B的C末端换成PR63的序列。虽然病毒产生的速率很缓慢，但本发明人第一次从全长的PR63基因组(PR63FL)出发检测到感染性病毒颗粒。对这个PR63FL持续传代后产生了额外突变，把这些突变放入PR63FL后，电转后收样滴度最高可达105.2ffu/mL。本发明人将这种来源于细胞培养的PR63病毒命名为PR63CC，它可以被E2的抗体剂量依赖地中和。本发明人还对PR63CC和JFH-1的感染动力学曲线及对抗病毒药物的敏感度做了比较。和JFH-1相比，PR63CC对NS5A的抑制剂Daclatasvir高度不敏感；IFN和2’-C-methyl-Adenosine对二者的半最大效应浓度(EC50)差不多。
氨基酸序列及编码基因
本发明涉及贡献了HCV在哺乳动物细胞中的生长适应性的突变位点，这些位点分别位于HCV的E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B上。
因此，本发明提供了一种丙肝病毒的氨基酸序列，其与SEQ ID NO:3有90%以上的相同性，并且所述氨基酸序列具有选自以下至少一项条件或其任意组合：从N末端的氨基酸残基起算，第415位氨基酸为D；第849位氨基酸为G；第862位氨基酸为P；第1388位氨基酸为H；第2100位氨基酸为R；第2432位氨基酸为R；第2584位氨基酸为T；第2955位氨基酸为F，更佳地，还具有选自以下至少一项条件或其任意组合：第1100位氨基酸为L；第1676位氨基酸为S；第1931位氨基酸为S；第2941位氨基酸为V。进一步更佳地，还具有选自以下至少一项条件或其任意组合：从N末端的氨基酸残基起算，第249位氨基酸为R；第250位氨基酸为Q；第337位氨基酸为V；第384位氨基酸为G；第390位氨基酸为A；第397位氨基酸为R；第401位氨基酸为G；第402位氨基酸为F；第404位氨基酸为D；第405位氨基酸为V；第416位氨基酸为T；第417位氨基酸为K；第439位氨基酸为A；第453位氨基酸为V；第925位氨基酸为V；第1634位氨基酸为P；第1638位氨基酸为G；第2083位氨基酸为R；第2329位氨基酸为M；第2374位氨基酸为G；第2375位氨基酸为P；第2392位氨基酸为I；第2439位氨基酸为L；第2440位氨基酸为E；第2513位氨基酸为V；第2608位氨基酸为S。
本发明还包括所述的丙肝病毒的氨基酸序列的携带突变位点的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的突变型病毒蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序 列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。但是，所述的蛋白片段、衍生物和类似物中，对应于上述任一优选方式中所限定的氨基酸突变位点是保守的。
本发明还提供了编码上述氨基酸序列的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。术语“编码多肽(蛋白)的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
重组的病毒质粒
本发明还涉及重组病毒质粒，其包含了可以实现HCV获得感染性的所有的元件(含病毒蛋白编码序列以及非编码序列)，在转染细胞后可获得病毒蛋白相应的mRNA以及病毒RNA(vRNA)，从而获得重组病毒。目前，已经有一些已知的病毒骨架质粒，例如pUC-vJFH-1质粒。尽管本发明优选pUC-vJFH-1质粒，但其它与具有类似元件及类似功能的质粒也可应用于本发明中。
本发明所述的重组病毒质粒包含有编码本发明的丙肝病毒的氨基酸序列的核苷酸序列。当本发明所述的重组病毒质粒转染病毒包装细胞，培养经转染的病毒包装细胞，可获得具有感染能力的重组HCV病毒株。
试剂盒
本发明还包括用于制备重组HCV病毒株的试剂盒，所述试剂盒中包括：本发明的重组病毒质粒。
作为本发明的优选方式，所述的试剂盒还包括：病毒包装细胞，作为所述的重 组病毒质粒的受体细胞。较佳地，所述的病毒包装细胞是人源肝癌细胞系，例如但不限于Huh7.5.1和Huh7细胞。
本领域技术人员在获得了所述的试剂盒后，可方便地来制备获得重组HCV病毒株，该重组HCV病毒株是哺乳动物细胞适应性的。
作为本发明的优选方式，所述的试剂盒还包括其它应用于进行病毒制备的试剂以及周边试剂，例如但不限于基因转染试剂，PCR扩增试剂，质粒抽提试剂，病毒包装细胞的培养基等。更佳地，所述的试剂盒中还可包括说明使用方法和说明注意点的使用说明书。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
HCV病人血清的来源
基因2a型HCV病毒株PR63来自于一例感染了慢性丙型肝炎的病人血清，该病人在上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科接受了诊断。本项研究得到瑞金医院伦理委员会的批准，符合赫尔辛基宣言精神，并获得了患者签署的知情同意书。HCV RNA定量使用了一步法HCV RT-PCR试剂盒(PG Biotech，深圳)。HCV RNA的定量及分型方法参见文章Lu，J.等；2013；Virology443:80-88。
HCV的序列扩增和确定
首先用QIAamp Viral RNA mini试剂盒(Qiagen，德国)从140μl血清样品中提取总RNA，溶解于40μl无RNA酶的水中，并保存于-80℃。以随机六聚体为引物，利用TaKaRa AMV XL逆转录酶(TaKaRa，大连，中国)将HCV RNA合成为cDNA。将HCV开放阅读框分成几个重叠的片段，用针对HCV保守区域的特异性引物(引物序列见表1)进行RT-PCR扩增，再对扩增产物直接测序。PR63的5’非翻译区序列由5’RACE方法确定(Li，Y.等，Virology 421:222-234)。3’非翻译区的可变区及polyU/UC区经扩增出来后再克隆到pEasy-T1载体(TransGen，北京)上双向测序，本发明人从12个克隆中挑选了一个有代表性的克隆序列作为PR63的序列。PR63基因组的3’非翻译区的最末端(9604-9678，共75nt)的序列缺失，直接以JFH-1中相应序列替代(GenBank登录号AB047639)。PR63的共有序列经拼接重叠片段后获得的序列见SEQ ID NO:1。欲从培养细胞中确定HCV的序列，则使用Tiangen总RNA提纯试剂盒(Tiangen，北京)，其后RT-PCR及测序与前述相同。
除非另外说明，下文基因片段或点的替换或突变操作时，JFH-1基因组序列来自pUC-vJFH-1(简称JFH-1载体)，经相应片段替换或点突变后，将改造后的质粒做模板体外转录RNA再转染细胞，进行病毒制备或传代。pUC-vJFH-1由日本Takaji Wakita 教授赠送(Zhong,J.等，2005.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102:9294-9299)
表1

HCV的转染和感染
体外转录得到的HCV RNA电转到Huh7.5.1的方法见Zhong，J.等，2005.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102:9294-9299。简单来说，10μg HCV RNA和4×106个细胞混合后在270V、100ohms和960μF条件下电击转染。对感染而言，约1×105个细胞预先铺于12孔板，次日以感染复数约0.02感染HCV病毒，每2-3天传代。以免疫荧光法检测HCV阳性细胞，一抗用HCV E2单克隆抗体AR3A(14)，二抗用Alexa Fluor555羊抗人IgG(Invitrogen)。
瞬时转染中复制力的检测
5μg体外合成的带有荧光素酶报告基因的复制子RNA电转到Huh7.5.1细胞中，按比例铺48孔板，并在转染后4，24，48，72，96小时分别收样。转染细胞的裂解液直接用于测定荧光素酶活力(Promega)。每次实验有三次重复，以绝对单位表示酶活力。
质粒及细胞构建
PR63/JFH-1重组克隆PR63C-NS3p_S10/JFH-1、PR63NS3h-5A_A6/JFH-1、PR63NS5B_13/JFH-1、PR63NS5B_21/JFH-1及PR63NS5B_23/JFH-1分别经由含PR63来源的核心蛋白-NS3蛋白酶区域，含NS3解旋酶-NS5A区域，或NS5B区域的PR63/JFH-1重组cDNA文库筛选得到。PR63C-5A_S10A6/JFH-1是将PR63C-NS3p_S10/JFH-1的FspA I-Spe I段和PR63NS3h-5A_A6/JFH-1的Spe I-Rsr II段连接得到的重组子。PR63C-5B_S10A6M50_A1676S/JFH-1是由基于PR63C-5B_A1676S/JFH-1进行的PR63-NS5B段筛选得到的可产生病毒的克隆。点突变由两步重组PCR法或Quick Change II XL点突变试剂盒(Stratagene)引入。所有的重组质粒均经测序确认。
PR63来源的携带荧光素酶报告基因的亚基因组复制子按如下方法构建：将PR63的5’非翻译区、荧光素酶-新霉素抗性基因及PR63来源的NS3基因融合后，经EcoR I和Spe I酶切后插入pSGR-luc-JFH-1质粒(Targett-Adams P等，2005，Virology86：3075-3080)。对PR63-N1931S-SGRluc，PR63-N1931S-GND-SGRluc和PR63-N1931S-H2100R-T2941V-SGRluc，相应的适应性突变均经点突变引入。GND突变会破坏NS5B的RNA聚合酶活力（Kato T等，2003，Gastroenterology125：1808-1817）。
SGR指亚基因组复制子，参见Targett-Adams P等，2005，Journal of General Virology86：3075-3080；GND指NS5B的活性中心有三个氨基酸从GDD突变为GND，使得NS5B的RNA依赖的RNA聚合酶活力丧失，参见Kato T等，Gastroenterology2003，125：1808-1817；本发明通过直接做点突变获得GND。
HCV抗病毒处理
将2×104个Huh7.5.1细胞预先铺于48孔板，以感染复数约0.1感染HCV病毒24小时，再用抗病毒药物处理48小时。收样后提取总RNA，经RT-qPCR确定HCV RNA含量，和未处理的对照相比来确定HCV RNA下降的百分比。使用的干扰素α的浓度依次为0.1，1，10，100，1000IU/mL。使用的Daclatasvir(参见Gao M等，Nature 2010，465：96-100)的浓度为6.7，67，670，6700和67000pM。使用的2’-C-Methyl-Adenosine(参见Wong KA等，Virology 2012，429：57-62)的浓度为7.98，79.8，798和7980nM。
E2抗体的中和
大约250个HCV感染性病毒颗粒与梯度稀释的HCV E2单克隆抗体(AR3A)(参见Law，M.等；2008.Nature medicine14:25-27)在37℃孵育1h后，将病毒与抗体的混合物加入预先铺有2×104个Huh7.5.1细胞的48孔板里，并在细胞培养箱中孵育3天。以实时定量荧光PCR来确定病毒的感染效率：E2抗体的中和能力和不含抗体 的细胞培养基相比进行确定。
实施例1、一例慢性丙肝病人血清中的HCV病毒株的获得及测序
本发明人从一例慢性丙型肝炎病人的血清中扩增了HCV序列(病人的编号为PR63)。血清中HCV的RNA滴度为3.5×106拷贝数/毫升。通过对一系列互相重叠的PCR片段测序产物的序列拼接，本发明人得到了PR63开放阅读框的共有序列，见SEQ ID NO:1。
对开放读码框的系统进化树分析表明PR63属于2a基因型(图1)。它的完整的5’非翻译区及部分的3’非翻译区的序列也被测定(3’末端75个核苷酸的序列信息缺失)。由于已知HCV的3’X尾高度保守(Los Alamos HCV序列数据库)，本发明人直接以JFH-1基因组中相应位置的序列(见SEQ ID NO:2中3’末端的75个碱基)替代了PR63的3’末端。PR63的共有序列和JFH-1及J6CF在核苷酸水平的同源性分别为90%和92.1%；在蛋白水平的同源性分别为92%和94.5%(表2)。
表2

a：nt，核苷酸；b：aa，氨基酸；c：NA，无。
实施例2、PR63的核心蛋白-NS3蛋白酶区、NS3解旋酶-NS5A区及NS5B区域在体外培养中具有活力
除了JFH-1，其它HCV克隆在细胞培养中均无活力：野生型MA，J6CF，DH8CF的RNA在培养的细胞中无法复制及产生感染性颗粒(Li，Y.等，2012，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109:E1101-1110；Murayama，A.，T.等，2012，Journal of virology86:2143-2152；Ramirez，S.等，2013，Hepatology(Baltimore，Md))。因此，本发明人没有从PR63出发构建它的共有序列 cDNA克隆，相反，先以JFH-1为骨架，对含有PR63序列来源的核心蛋白-NS3蛋白酶区(NS3编码序列中SpeI酶切点上游，NS3p)、NS3解旋酶(NS3编码序列中SpeI酶切点下游，NS3h)-NS5A区、NS5B区的重组病毒分别测试了体外活力(图2)。
根据已经发表的功能性克隆及选择策略(Lu，J.等，2013.Virology443:80-88)，本发明人首先从PR63的血清中经RT-PCR扩增出核心蛋白-NS3蛋白酶区域(图2中FspA I-Spe I酶切点之间的片段，片段1)，和JFH-1载体中JFH-1序列融合后(替换掉JFH-1基因组的FspA I-Spe I酶切位点之间的序列)，挑选正确的克隆并分组体外转录制备RNA。将各组HCV RNA转染Huh7.5.1细胞，在细胞传代过程中检测细胞的感染情况以及上清中病毒的滴度。只要能检测到HCV阳性细胞，就持续传代。当某组产生感染性病毒颗粒后，将这组中的每个单克隆分别转染细胞以确定可产生感染性颗粒的重组克隆。对PR63来源的核心蛋白-NS3蛋白酶区段，一共筛选了21个克隆，其中1个(编号为S10)有感染性，称为PR63C-NS3p_S10/JFH-1。
对PR63来源的NS3解旋酶(NS3h)-NS5A区域(图2中Spe I-Rsr II酶切点之间的片段，片段2)，和JFH-1载体中JFH-1序列融合后(替换掉JFH-1基因组的Spe I-Rsr II酶切位点之间的序列)，挑选正确的克隆并分组体外转录制备RNA。同前述转染Huh7.5.1细胞并鉴定有感染性的克隆。本发明人一共筛选了23个克隆，其中1个(编号为A6)有感染性，称为PR63NS3h-5A_A6/JFH-1。
对PR63来源的NS5B区域(图2中Rsr II-SgrA I酶切点之间的片段，片段3)，和JFH-1载体中JFH-1序列融合后(替换掉JFH-1基因组的Rsr II-SgrA I酶切位点之间的序列)，同前述制备RNA、转染细胞并鉴定有感染性的克隆。从35个候选克隆中一共筛选到三个克隆(编号为5B-13，5B-21和5B-23)有感染性，称为PR63NS5B_13/JFH-1、PR63NS5B_21/JFH-1和PR63NS5B_23/JFH-1。
在电转后第9天，PR63C-NS3p_S10/JFH-1嵌合病毒的滴度为102.95ffu/mL；在电转后第16天，PR63NS3h-5A_A6/JFH-1的滴度达到峰值103.78ffu/mL；PR63NS5B_13/JFH-1、PR63NS5B_21/JFH-1和PR63NS5B_23/JFH-1的感染性差不多，在电转后第9天滴度分别为103.53ffu/mL，103.88ffu/mL和103.68ffu/mL。
实施例3、将PR63有功能的区域组合，并确认能促进病毒产生的突变
本发明人尝试将PR63来源的FspA I-Spe I段，Spe I-Rsr II段及Rsr II-SgrA I段组合构建接近全长的PR63感染性克隆。然而，这三段拼接在一起替换掉JFH-1载体中相应区域，获得克隆PR63C-NS5B/JFH-1(选自：来自S10的FspA I-Spe I段＋来自A6的Spe I-Rsr II段＋来自5B13的Rsr II-SgrA I段(S10-A6-5B13)(从FspA I-SgrA I之间的序列是PR63来源的克隆，其余部分仍为JFH-1来源的序列)；来自S10的FspA I-Spe I段＋来自A6的Spe I-Rsr II段＋来自5B21的Rsr II-SgrA I段(S10-A6-5B21)或来自S10的FspA I-Spe I段＋来自A6的Spe I-Rsr II段＋来自5B23的Rsr II-SgrA I 段(S10-A6-5B23))在电转后连续传代三次均未见HCV阳性细胞。当将PR63来源的FspA I-Spe I段和Rsr II-SgrA I段拼接(将来自S10的FspA I-Spe I段和来自5B13或5B21或5B23的Rsr II-SgrA I替换掉JFH-1载体中JFH-1的相应序列)后得到三个重组克隆S10-5B13，S10-5B21和S10-5B23，在电转后第11天均可检测到低量感染性颗粒；当将PR63来源的FspA I-Spe I段和Spe I-Rsr II段组合(将将来自S10的FspA I-Spe I段和来自A6的Spe I-Rsr II替换掉JFH-1载体中JFH-1的相应序列)后，得到S10-A6克隆(PR63C-5A_S10A6/JFH-1)，在电转后第4天可检测到HCV阳性细胞。
由于在S10-A6克隆中缺失的PR63序列比S10-5B-13/21/23中的要短(前者缺少的Rsr II-SgrA I段长1.9kb，后者缺少的Spe I-Rsr II段长2.3kb)，也因为PR63的NS5B区域较NS3解旋酶-5A段更容易筛选得到阳性克隆(对NS5B段筛选的阳性率是3/35，对NS3h-5A段筛选的阳性率是1/23)，本发明人决定采用PR63C-5A_S10A6/JFH-1作为下步筛选NS5B区域(Rsr II-SgrA I)的出发点：共克隆32个质粒，分四组制备RNA电转Huh7.5.1细胞，在电转后10天中未见HCV阳性细胞。在对PR63C-5A_S10A6/JFH-1传代过程中发现病毒产生了适应性突变A1676S(NS4A，第1676位由A突变为S)和L2285I(NS5A，第2285位由L突变为I)(氨基酸残基编号均参照JFH-1参考序列AB047639)。本发明人通过定点突变将A1676S和L2285I分别单独或者一起设置到PR63C-5A_S10A6/JFH-1上，获得PR63C-5A_S10A6_A1676S/JFH-1等。A1676S的突变确实大大提高了病毒的产生速率：PR63C-5A_S10A6_A1676S/JFH-1在电转后第4天就达到感染力峰值103.9ffu/mL，比没有设置此适应性突变的PR63C-5A_S10A6/JFH-1提前了30天。
由PR63C-5A_S10A6_A1676S/JFH-1出发，本发明人成功地从79个候选质粒中筛选到一个携带PR63来源的NS5B序列的克隆(编号为M50，即PR63C-5B_S10A6M50_A1676S/JFH-1)，在电转后第96天达到滴度的峰值，为103.8ffu/mL。这个病毒经传代后测序发现其在传代过程中发生了以下突变：W849G，Q862P，C2432R，A2941T和S2955F。通过定点突变的方法，当将这5个突变设置入PR63C-5B_S10A6M50_A1676S/JFH-1中，得到PR63C-5B_A1676S_W849G_Q862P_C2432R_A2941T_S2955F/JFH-1，在电转后第10天滴度达到103.78ffu/mL。
实施例4、PR63的两端非翻译区及NS5B的C末端被替换，得到全长的PR63感染性基因组
由于克隆PR63C-5B_A1676S_W849G_Q862P_C2432R_A2941T_S2955F/JFH-1在Huh7.5.1细胞里无需额外突变即可有效扩增病毒，基于此本发明人进一步缩小JFH-1的序列。首先把JFH-1来源的5’非翻译区和核心蛋白的N端序列替换成PR63的序列(用PR63来源的5’UTR-FspA I段替换掉PR63C-5B_A1676S_W849G_Q862P_C2432R_A2941T_S2955F/JFH-1基因组中5’UTR-FspA I段)。PR63的5’非翻译区和J6CF相同，和JFH-1相比有3个核苷酸 差异。PR63来源的5’非翻译区和核心蛋白的N端很容易就实现了替换，并未对感染力造成影响，得到的替换产物简写为PR635UTR-5B/JFH-1，在电转后第12天滴度达到103.70ffu/ml。
当成功替换5’非翻译区后，本发明人再尝试将PR635UTR-5B/JFH-1上JFH-1来源的NS5B的C末端和3’非翻译区均替换成PR63的序列(SgrA I位点及其后，包括NS5B的氨基酸残基555-591及3’非翻译区)。当本发明人将NS5B的末端和3’非翻译区一起替换成PR63序列后，在电转后20天的持续传代中始终没有检测到HCV的阳性细胞。因此，本发明人决定暂时保留JFH-1NS5B的C末端，先替换3’非翻译区。利用2轮巢式PCR扩增出PR63的3’非翻译区。将这段序列进行TA克隆后测定了12个克隆的序列，挑选其中一个替换JFH-1的3’非翻译区，得到PR63/JFH-1NS5BC。PR63/JFH-1NS5BC在细胞里产生病毒的速度很慢，在第65天时才达到感染力的峰值103.48ffu/mL。此时收集的病毒序列发生了以下改变：P1100L，Y1388H，N2584T及在可变区有4个碱基变化(A9449G，A9456G，A9460G及T9481C)。本发明人把这些突变都设置到PR63/JFH-1NS5BC上得到PR63P1100L_Y1388H_N2584T_VRm/JFH-1NS5BC，这个重组克隆产生病毒的速度大大提前，在第5天感染力滴度已有104.18ffu/mL(其中，VRm指：在可变区Variable Region有突变mutation)。
在PR63P1100L_Y1388H_N2584T_VRm/JFH-1NS5BC上JFH-1来源的唯一序列就是NS5B蛋白的C末端555-591位残基。本发明人如前将这段用PR63的相应序列(PR63来源的NS5B蛋白的C末端555-591位残基)替换得到了全长的PR63FL基因组。电转后第6天就可以在上清中检测到PR63FL的感染性，到电转后第52天达到峰值103.61ffu/mL(图3A)。因此，通过本发明人构建引入的突变A1676S_W849G_Q862P_C2432R_A2941T_S2955F_P1100L_Y1388H_N2584T_VRm，基于克隆筛选得到的PR63全长基因组可以在细胞中有效复制。详细的构建PR63FL及使之在体外培养中适应的流程图见图2。
实施例5、PR63FL基因组在细胞培养中进一步适应
本发明人通过持续传代提高PR63FL的感染力。在Huh7.5.1中，经过第1、2、3次传代后PR63FL的感染力逐渐提高到103.71，104.34和104.78ffu/mL。在第一次传代后收集的病毒又发生了N1931S(NS4B)突变；从第三次传代后收集的病毒上检测到N1931S(NS4B)，D398G(E2)，N415D(E2)，H2100R(NS5A)和T2941V(NS5B)突变。如前方法，本发明人构建了PR63FL_N1931S和PR63FL_N1931S_D398G_N415D_H2100R_T2941V。前者的感染力峰值在电转后第18天测得，为103.59ffu/mL；后者在电转后第2天就在超半数的细胞中可检测到HCV蛋白表达，并在第7天达到感染力最高点105.2ffu/mL(图3A)。因此本发明人将这株能有效产生病毒的克隆(PR63FL_GDSRV)命名为PR63CC，即指来源于细胞培养的PR63病毒，核苷酸序列见SEQ ID NO:2，氨基酸序列如SEQ  ID NO:3。进化树分析表明PR63CC在所比较的若干序列中仍然和PR63共有序列同源性最高(图1)。
实施例6、PR63cc和PR63共有序列的比较
本发明人分析了PR63cc和PR63共有序列之间的差异：二者共有38处氨基酸残基的不同(表3)。其中2处(2374G和2375P)是由克隆过程中Rsr II位点引入的；24处直接来源于筛选得到的亚克隆的序列；其余12处是在病毒传代过程中产生的适应性突变。和JFH-1或J6cc的比较显示，其中8个适应性突变(N415D，W849G，Q862P，Y1388H，H2100R，C2432R，N2584T，S2955F)未见于JFH-1或J6cc基因组，提示它们可能是PR63cc的特异性适应性突变；A2941V可见于JFH-1；有趣的是，另外三个突变(P1100L，A1676S和N1931S)亦见于J6cc的6个关键性突变中。
表3


表中，列出氨基酸残基(以单字母表示)在HCV开放读码框中的位置及其所属基因，在J6cc和JFH-1中相应的氨基酸残基也列出以作比较。残基的来源分为三类：来源于筛选得到的亚克隆，来源于适应性突变或来源于克隆步骤本身。
实施例7、对PR63CC病毒的特性研究
本发明人首先比较了PR63CC和JFH-1病毒的感染动力学。将电转实验中收集的细胞培养上清以感染复数约0.02左右感染Huh7.5.1细胞及Huh7细胞，并在感染后不同时间点收样测定感染力。对JFH-1而言，感染性在第5天达到顶点，滴度为105.4ffu/mL；对PR63CC，感染力在第8天后达到平台期，达104.9ffu/mL，如图4A-B。
HCV E2抗体可阻断HCV病毒感染，即中和。本发明人将含有感染性HCV的细胞培养上清与一系列浓度梯度稀释的E2抗体AR3A混合(Law，M.等，2008.Nature medicine14:25-27)，37℃放置1小时后感染Huh7.5.1细胞，3天后抽提细胞总RNA。结果显示PR63CC相对于JFH-1而言更容易被AR3A中和：在E2抗体1：500稀释度下，约有75%的JFH-1病毒被中和，而约有95%的PR63CC不能进入细胞(图4C)。
本发明人想要分析一下在PR63FL基因组适应性突变过程中产生的非结构蛋白的突变是否促进了病毒的复制。构建了PR63来源的携带荧光素酶报告基因的HCV亚基因组复制子，这是一个双顺反子的RNA复制子，由HCV的IRES控制荧光素酶报告基因的表达，EMCV的IRES则负责调控HCV的NS3蛋白到3’非翻译区(参见Targett-Adams P等，2005，Journal of General Virology86：3075-3080)。
本发明人将N1931S，N1931S-H2100R-T2941V或N1931S-GND突变引入由PR63FL的NS3-3UTR区域来源的亚复制子基因组中，该复制子携带荧光素酶报告基因，可以在瞬时转染实验中通过测定荧光素酶活力表征HCV的复制能力。亚复制子基因组的构建参见Targett-Adams P等，Journal of General Virology86：3075-3080。体外转录的RNA电转到Huh7.5.1细胞中，在指定的时间点收集细胞裂解液测定荧光素酶活力。JFH-1-SGRLuc复制能力最强，而阴性对照PR63-SGRLuc-N1931S-GND在电转后的荧光素酶活力逐渐下降，表明没有RNA复制。在测定的PR63来源的亚基因组复制子中，PR63FL-3M(N1931S/H2100R/T2941V)的复制能力最强，然后依次为PR63FL-N1931S和PR63FL(图3B)。这说明新出现的突变H2100R和T2941V相对于 N1931S，更加增强了PR63基因组的复制能力。
实施例8、比较JFH-1和PR63CC病毒对抗病毒药物的敏感度
直接作用于病毒的抗病毒药物改善了基于干扰素的HCV治疗效果。然而，治疗过程中产生的抗药性突变及HCV各基因型对药物的不同应答使得药物开发亟需更多的HCV细胞培养模型。有了这株新构建的PR63CC感染性克隆，本发明人就可以在毒株特异性水平上研究它对于NS5A抑制剂Declatasvir，NS5B抑制剂2’C-Methyl-Adenosine(2’CMA)及干扰素α的敏感度。JFH-1或PR63CC病毒先感染Huh7.5.1细胞，再用不同剂量的抗病毒药物处理，然后通过和未处理的细胞比较，确定HCV RNA被药物抑制后的下降程度(图4D)。这两种病毒对干扰素α和2’CMA的半最大效应浓度(EC50)相似(图4D)。有趣的是，PR63CC对NS5A的抑制剂Daclatasvir(BMS-790052)要不敏感的多，Daclatasvir对它的EC50是2076pM，比该抑制剂对JFH-1的EC50高了80倍(图4D-E)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。