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1、10申请公布号CN104208707A43申请公布日20141217CN104208707A21申请号201410441009622申请日20140902A61K47/34200601A61K47/22200601A61K9/51200601A61K31/513200601A61P35/00200601A61P35/0420060171申请人中国人民解放军第二军医大学地址200433上海市杨浦区翔殷路800号72发明人张黎侯静范婷婷朱鹏熹盛丹丹马建丽赵娜萍宋云龙张姗姗韩志鹏卫立辛芮耀诚辛海量刘厚佳74专利代理机构上海卓阳知识产权代理事务所普通合伙31262代理人巫蓓丽54发明名称叶酸修饰的普朗。
2、尼克P85共聚物的制备及其在5氟尿嘧啶纳米药物中的应用57摘要本发明涉及生物医药技术领域，首先提供了一类叶酸修饰的普朗尼克P85共聚物，还涉及5氟尿嘧啶的抗癌纳米药物的制备。实验发现，采用叶酸修饰的普朗尼克P85共聚物制备的5氟尿嘧啶纳米药物，可以显著抑制肿瘤细胞生长；而且在小鼠结肠癌肝转移模型中，能显著减少结肠癌肝转移瘤形成，并能显著延长小鼠生存期，表明其具有良好的抗结肠癌肝转移的作用。因此有望成为有临床应用前景的抗肿瘤药。51INTCL权利要求书2页说明书7页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书7页附图1页10申请公布号CN104208707ACN1。
3、04208707A1/2页21一种叶酸修饰的普朗尼克P85共聚物，其结构如下式式中，N18。2根据权利要求1所述的共聚物，其特征在于，N24。3根据权利要求1所述的共聚物，其特征在于，N2。4根据权利要求1所述的共聚物的制备方法，包括以下步骤（1）氮气保护下，普朗尼克P85在乙腈中与CDI室温搅拌，反应得到P85CDI；（2）P85CDI溶于乙腈中，慢慢滴加到H2NCH2NNH2中，室温搅拌反应得到P85NH2；（3）P85NH2与叶酸、缩合剂溶解于DMSO中，溶液中加入三乙胺，在氮气保护下室温搅拌反应，合成含有末端叶酸修饰的普朗尼克P85共聚物。5根据权利要求4所述的共聚物的制备方法，其特征。
4、在于，所述的缩合剂为N羟基丁二酰亚胺NHS和N,N二环己基碳二亚胺。6一种抗肿瘤组合物，包含权利要求1所述的叶酸修饰的普朗尼克P85共聚物、安全有效量的临床上常用的抗肿瘤化合物和药学上接受的载体。7如权利要求6所述的一种抗肿瘤组合物，其特征在于，所述的临床上常用的抗肿瘤化合物为5氟尿嘧啶。8如权利要求6所述的抗肿瘤组合物在用于制备抗结直肠癌药物中的应用。9如权利要求6所述的抗肿瘤组合物在用于制备抗结直肠癌肝转移药物中的应用。10一种荷载5氟尿嘧啶的纳米药物的制备方法，其特征在于，取叶酸修饰的普朗尼克P85共聚物和5氟尿嘧啶于圆底烧瓶中，用适量乙腈溶解后，除去有机溶剂，得干燥权利要求书CN104。
5、208707A2/2页3药膜，水浴加热，溶解固体骨架，加入等温度纯化水搅拌，用022M滤膜过滤，得到荷载5氟尿嘧啶的纳米药物的胶束溶液。权利要求书CN104208707A1/7页4叶酸修饰的普朗尼克P85共聚物的制备及其在5氟尿嘧啶纳米药物中的应用技术领域0001本发明涉及药物应用技术领域，具体地说，是关于叶酸修饰的普朗尼克P85共聚物（P85FA）的制备，本发明还涉及5氟尿嘧啶抗癌纳米药物的制备，特别是在抗结直肠癌肝转移中的用途。背景技术0002结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，可发生在结直肠的任何部位，其发病率在全球范围内呈逐年上升趋势，已成为导致患者死亡的三大癌症之一。结直肠癌转移多发生在肝。
6、脏，据报道3040的患者在疾病的早期就伴有肝转移；而在疾病晚期，95的患者都出现肝转移，并且结直肠癌患者的死亡原因多为肝部转移灶的发展。目前虽有以手术治疗为主的多种治疗方案，可提高结直肠癌的治愈率，但对结直肠癌肝转移的患者并没有更有效的治疗方法。0003普朗尼克（PLURONIC）是由聚氧乙烯聚氧丙稀聚氧乙烯（PEOPPOPEO）形成的两性分子纳米共聚物。具有合适组成比和相对分子质量的普朗尼克在水溶液中能自发形成胶束，其直径通常为10100纳米。普朗尼克可以与抗肿瘤药物形成共聚物胶束，其胶束中心由疏水的PPO组成，可结合药物、DNA或蛋白等分子；亲水的PEO链组成胶束外壳，从而提高药物的靶向性。
7、和稳定性。近年来研究发现，药物普朗尼克共聚物胶束本身具有很强的稳定性，可以显著增加肿瘤对药物的敏感性，减小药物的毒副反应，如普朗尼克P85PEO26PPO40PEO26可以与化疗药物阿霉素形成共聚物胶束P85DOX，与单独使用阿霉素药物组相比，可以显著抑制人白血病细胞株P388细胞中耐药蛋白PGP的表达，诱导ATP衰竭，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。单独使用有效剂量的普朗尼克P85对细胞没有毒副作用，具有较高的生物安全性。普朗尼克L61、F127、P123及F88对增强化疗药物敏感性方面的作用显著低于P85。00045氟尿嘧啶（5FLUOROURACIL，5FU）是结直肠癌首选的化疗药物，然。
8、而5FU严重的骨髓抑制及胃肠道毒副反应，很大程度上限制了其在临床的广泛应用。近年，学者们开展了许多对5FU新剂型的研究工作，但均未解决增强靶向性及减轻毒副作用的问题。目前与5FU联合用药的化疗方案仍然是结肠癌的一线治疗方案。临床使用时，需要提前给予叶酸FOLICACID，FA类制剂，以增强5FU的作用，降低5FU的毒副反应，临床使用较为不便。叶酸是人体必需的小分子维生素，其对于细胞所必须的核苷酸的生物合成以及维持一碳单位的正常代谢通路起重要作用。叶酸对叶酸受体FOLATERECEPTOR，FR表现出极高的亲和力。FR表达水平与上皮源性肿瘤组织的恶性程度及转移侵袭力存在正相关关系。叶酸修饰的聚合。
9、胶束对叶酸受体过表达的结肠癌细胞具有强亲和力，能有效地将所载药物导入肿瘤细胞。0005因此，本发明人将叶酸与纳米载体通过化学连接方式连接，方法简单，不易引起免疫反应，能显著增加5FU的抗肿瘤作用，降低其毒副反应，临床操作更为简便，具有非常好说明书CN104208707A2/7页5的抗肿瘤药物开发前景。发明内容0006本发明的目的是针对现有治疗措施中的不足，提供一种叶酸修饰的普朗尼克P85的共聚物及其在5氟尿嘧啶抗肿瘤纳米药物的制备方法，特别是结直肠癌肝转移中的应用。0007本发明首先提供了一类叶酸修饰的普朗尼克P85的共聚物，结构为式中，N18。优选地，N24。更优选地，N2，结构见附图1。0。
10、008本发明其次提供了上述的叶酸修饰的普朗尼克P85共聚物的制备方法，合成步骤如下式包括以下步骤（1）氮气保护下，普朗尼克P85在乙腈中与CDI室温搅拌，反应得到P85CDI；（2）P85CDI溶于乙腈中，慢慢滴加到H2NCH2NNH2中，室温搅拌反应得到P85NH2；（3）P85NH2与叶酸、缩合剂溶解于DMSO中，溶液中加入三乙胺，在氮气保护下室温搅拌反应，合成含有末端叶酸修饰的普朗尼克P85共聚物。0009优选地，上述的共聚物的制备方法，在第（3）步使用的缩合剂为N羟基丁二酰亚胺NHS和N,N二环己基碳二亚胺。0010本发明还提供了一种抗肿瘤组合物，包含上述的叶酸修饰的普朗尼克P85共聚。
11、说明书CN104208707A3/7页6物、安全有效量的临床上常用的抗肿瘤化合物和药学上接受的载体。优选地，所述的临床上常用的抗肿瘤化合物为5氟尿嘧啶。0011本发明涉及的药用组合物，可以是固体形式或是液体形式，所述的药物剂型可以是片剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、混悬剂或注射剂。当本发明化合物用于上述用途时，可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药片剂、丸剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液含有如约0055悬浮剂、糖浆含有如约1050糖、和酏剂含有约2050乙醇，或以外用方式给药软膏剂、凝胶、含药胶布等，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式在等渗介质中。
12、含有约0055悬浮剂进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约00199，更佳地约为0190重量的活性成分。0012“安全有效量”指的是化合物的量足以改善病情，而不至于产生严重的副作用。安全有效量根据治疗对象的年龄、病情、疗程等来确定。0013“药学上接受的载体”指的是一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指代是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的疗效。药学上可接受的载体部分例子有糖（如葡萄糖、蔗糖、乳糖等），淀粉（如玉米淀粉、马铃薯淀粉等），纤维素及其衍生物（如羧甲基纤维素。
13、钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等），明胶，滑石粉，固体润滑剂（如硬脂酸钠、硬脂酸镁），硫酸钙，植物油（如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等），多元醇（如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等），乳化剂（如吐温类），润湿剂（如十二烷基磺酸钠），着色剂，调味剂，稳定剂，抗氧化剂，防腐剂，无热原水等。0014“临床上常用的抗肿瘤化合物”包括但不限于下列临床常用抗肿瘤化合物（1）烷基化试剂，如烷基磺酸酯（白消安）、氮烯咪胺、甲基苄肼、氮芥类化合物（氯甲川、苯丙氨酸氮芥、瘤可宁）、环磷酰胺或异环磷酰胺；（2）亚硝基脲类，如卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀或链脲菌素；（3）抗肿瘤生物碱，如长春新碱或长春碱；（4）紫杉烷类。
14、，如紫杉醇或泰素帝TAXOTERE；（5）抗肿瘤抗生素类，如放线菌素；（6）叶酸拮抗剂，如甲氨蝶呤；（7）嘌呤合成抑制剂；嘌呤类似物，如6巯鸟嘌呤；（8）嘧啶合成抑制剂、卡培它滨或嘧啶类似物，如氟尿嘧啶、吉西他滨、阿糖胞苷和胞嘧啶阿拉伯糖苷；（9）拓扑异构酶抑制剂，如喜树碱或依托泊甙；（10）抗癌激素激动剂和拮抗剂，包括它莫西芬；（11）激酶抑制剂，如甲磺酸伊马替尼等。0015本发明还提供了一种如上所述的抗肿瘤组合物在用于制备抗结直肠癌药物中的应用。0016本发明还提供了一种如上所述的抗肿瘤组合物在用于制备抗结直肠癌肝转移药物中的应用。0017本发明最后提供了一种荷载5氟尿嘧啶的纳米药物的制备。
15、方法，其特征在于，取叶酸修饰的普朗尼克P85共聚物和5氟尿嘧啶于圆底烧瓶中，用适量乙腈溶解后，除去有机溶剂，得干燥药膜，水浴加热，溶解固体骨架，加入等温度纯化水搅拌，用022M滤膜过滤，得到荷载5氟尿嘧啶的纳米药物的胶束溶液。0018本发明优点在于本发明的叶酸修饰的普朗尼克P85的共聚物/5FU纳米载体药物是一种安全、高效、稳定、毒副作用低的抗肿瘤药物，显著抑制肿瘤细胞的生长。对结直肠说明书CN104208707A4/7页7癌肝转移具有较好的治疗效果，疗效优于5氟尿嘧啶。附图说明0019附图1P85FA的结构图。0020附图2荷载5FU的P85FA纳米胶束粒径检测图。具体实施方式0021下面结。
16、合具体实施例进一步描述本发明，本发明的有点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例，并不对本发明的范围构成任何限制。在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围之内。0022实施例1叶酸修饰的普朗尼克P85P85FA的合成（1）N,N羰基二咪唑CDI活化的普朗尼克P85P85CDI的合成P85CDI的合成采用了文献中的方法（1WZHANG,YSHI,YCHEN,JYE,XSHA,XFANG,MULTIFUNCTIONALPLURONICP123/F127MIXEDPOLYMERICMICELLESLOADEDWITHP。
17、ACLITAXELFORTHETREATMENTOFMULTIDRUGRESISTANTTUMORS,BIOMATERIALS,32201128942906）。取10G普朗尼克P85022MMOL溶于7ML干燥乙腈中，慢慢滴加到含有CDI035G,215MMOL的7ML干燥乙腈溶液中。氮气保护下，室温搅拌反应一夜。反应完全后，溶液减压浓缩，倒入过量的乙醚。采用离心的方法去除过量的CDI，离心速度为10000转/MIN，收集乙醚层。重复此步骤三次，合并的乙醚层减压浓缩，得到透明油状物P85CDI054G，1HNMR600MHZ,CDCL3113BR,120H,342BR,40H,352BR,80。
18、H,364371BR,208H,708D,2H,743D,2H,818S,2H。0023（2）含有末端氨基的普朗尼克P85P85NH2的合成取05GP85CDI溶于干燥的乙腈中，慢慢滴加到03ML的乙二胺中，室温搅拌反说明书CN104208707A5/7页8应一夜。反应完全后，过量的乙二胺减压浓缩去除，得到透明油状物P85NH2，1HNMR600MHZ,CDCL3112BR,120H,291T,4H,330T,4H,339BR,40H,352BR,80H,364371BR,208H。此中间体可以直接应用于下一步反应。0024（3）叶酸修饰的普朗尼克P85P85FA的合成P85FA的合成参照文献。
19、中的方法1。取03GP85NH2，叶酸（30MG，0072MMOL），NHS18MG，0156MMOL和DCC324MG,0156MMOL溶解在5ML的DMSO中。溶液中加入005ML三乙胺，在氮气保护下室温搅拌反应一夜。反应完全后，加入10ML去离子水，溶液变浑浊，采用离心的方法去除产生的DCU。用透析袋透析上清液两天，冻干透析袋中的液体，得到目标产物为022G黄色粉末P85FA，1HNMR600MHZ,DMSOD6102D,120H,266M,8H,332BR,4H,341BR,4H,343350M,328H,446M,4H,662M,4H,757M,4H,863S,2H。0025实施例2。
20、P85FA/5FU的制备P85FA/5FU胶束的制备采用薄膜水化法，取300MGP85FA和一定量的5FU于50ML圆底烧瓶中，用适量乙腈溶解后，60、100R/MIN旋转蒸发1H将有机溶剂蒸干，真空干燥5H除去残留有机溶剂，得干燥药膜。水浴加热，溶解固体骨架，以获得透明凝胶样样品。加入10ML等温度纯化水，恒速搅拌30MIN700R/MIN，用022M滤膜过滤，即得P85FA/5FU胶束溶液。0026实施例3P85FA/5FU粒径的测定采用MALVERN粒度分析仪测定P85FA/5FU的粒径，粒径测定参数如下HENE激光（波长635NM），折光率和粘度分别为N1330和0888CP，测定温度。
21、为25。样品浓度为04MG/ML。所构建的P85FA/5FU粒径在10100NM之间。（见附图2）实施例4P85FA/5FU纳米药物对小鼠结肠癌肝转移的作用实验材料BALB/C小鼠60只，68周龄雄性，清洁级，体重2025克，由中国人民解放军第二军医大学实验动物中心提供。小鼠源性结肠癌CT26细胞株购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。0027小鼠结肠癌细胞系CT26细胞准备用含10胎牛血清的1640培养基传代培养，经消化离心后,生理盐水重悬收集至EP管内，细胞浓度均为2105/ML，放入冰盆中备用。0028实验方法结肠癌肝转移小鼠模型建立小鼠手术。
22、前禁食12H，4水合氯醛进行麻醉，每只老鼠注射水合氯醛200L，约5MIN后待小鼠完全麻醉后固定于操作台上。用酒精对小鼠腹部消毒后用剪刀沿腹中线剪开，用湿润的棉签找到小鼠脾脏，将事先准备好的约5CM长的缝合线用镊子穿过小鼠脾脏下方，左手拉住两端线头拉起脾脏后，右手持胰岛素注射器（内有事先消化好的C26细胞200L）缓缓向脾脏内注射细胞，注射时间大概为1MIN。注射完毕后约5MIN取下小鼠脾脏，缝合小鼠。0029实验分组将实验小鼠随机分为6组，每组10只对照组生理盐水；5FU低剂量组5FU（1MG/KG）；5FU高剂量组5FU（10MG/KG）；P85/5FU组P85（002）/5FU（1MG/。
23、说明书CN104208707A6/7页9KG）；P85FA/5FU组P85FA（002）/5FU（1MG/KG）P85组P85（002）。0030给药方法连续给药两周后，每组杀掉4只，取出肝脏，取下肝脏上的转移瘤，电子天平对每只小鼠的转移瘤称重并记录，排水法检测小鼠肝脏转移瘤的体积。每组剩余的6只小鼠在继续给药的情况下自然死亡，并记录死亡时间，制作生存曲线。0031实验结果观察小鼠成瘤的情况各组小鼠结肠癌肝脏转移瘤各组小鼠肝脏均可见肝脏转移，对照组肝脏可见多发性转移结节，甚至是全肝性的转移灶占据了整个肝脏组织，大小不一，弥漫分布；P85/5FU组也可见多发性转移结节，但是与对照组相比，结节数量。
24、、大小均相对降低，P85FA/5FU组可见少量转移结节，部分为单发性，与前两者相比，结节数量更少。对照组、5FU低剂量组、5FU高剂量组、P85/5FU组、P85FA/5FU组及P85组肝脏转移瘤肿瘤体积大小分别为（992502）、（838507）、（896466）、（682507）、（578432）、（947438）MM2，对照组与P85FA/5FU药物处理组之间差异均有统计学意义，P005；对照组、5FU低剂量组、5FU高剂量组、P85/5FU组、P85FA/5FU组及P85组肝脏转移瘤数目分别为（1700450）、（115700128）、（1423087）、（671132）、（20012。
25、8）、（1606127）个，模型组与药物处理组之间差异均有统计学意义，P005。由此可见，P85FA/5FU可降低结肠癌肝转移模型小鼠转移瘤的数目和大小，在一定程度上防治结肠癌肝转移的发生发展。0032P85FA/5FU对结肠癌肝转移模型小鼠生存期的影响每组剩余6只小鼠继续给药对其生存期进行观察,记录各组小鼠死亡时间，P85FA/5FU组存活时间较对照组明显增加，分别为36、36、37、44、46、51天，P85/5FU组与对照组相比，小鼠存活时间略有增加，分别为31、31、34、34、37、42天，但低于P85FA/5FU组，对照组小鼠存活时间分别为19、24、24、26、27、28天。P8。
26、5FA/5FU对结肠癌肝转移模型小鼠生存期影响结果见表1。0033由实验结果可见，P85FA/5FU组、P85/5FU组分别与对照组比较，小鼠存活时间分别提高了689和267，差异显著。本研究表明P85FA/5FU组可显著延长结肠癌肝转移模型小鼠生存期。0034实验结论不同药物处理的结肠癌肝转移小鼠模型对其肝脏转移瘤大小影响不同，P85FA/5FU药物处理组对小鼠肝脏转移瘤的抑制效果最强，小鼠生存期最长。结果提示P85FA/5FU组抑瘤效果显著优于其他各组。0035实施例5P85FA/5FU纳米药物对小鼠结肠癌细胞系CT26增殖的影响说明书CN104208707A7/7页10实验材料小鼠结肠癌。
27、细胞系CT26细胞准备加入10FBS及1双抗的M5A培养基培养细胞，将细胞消化离心，计数，按每孔10000个细胞铺96孔板。混匀后置于细胞培养箱内5CO2，37条件下培养24H。0036实验方法待细胞完全贴壁后，对每组细胞进行药物处理，将细胞分为6组，分别为对照组、5FU低剂量组（0025MG/ML）、5FU高剂量组（025MG/ML）、P850001/5FU（0025MG/ML）组及P85FA0001/5FU（0025MG/ML）组，P85组0001。将药物稀释后按药物浓度每组加入药物2L（将药物混入培养基内混匀后排枪加入96孔板内）。将96孔板放入细胞培养箱内5CO2，37条件下培养48H。
28、。0037实验结果每组设8个复孔，每孔加入CELLCOUNTINGKIT8试剂10L，同样条件下继续孵育1H，用酶标仪于450NM处检测其OD值，计算不同药物处理组的细胞存活率。各组细胞存活率值见表2。0038实验结论CELLCOUNTINGKIT8实验结果显示，P85FA/5FU可显著抑制小鼠结肠癌细胞系CT26的增殖能力，其抑制能力高于单用5FU，该结果在体外证明了P85FA/5FU可在一定程度上抑制结肠癌的发生发展。0039实施例6P85FA/5FU纳米药物的急性毒性研究实验材料ICR小鼠50只（由第二军医大学动物中心提供），雌雄各半，体重1825G，动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水。。
29、0040P85FA/5FU胶束由实施例2制备，配制成可灌胃的浓度为2MG/ML的混悬液。0041实验方法ICR小鼠按体重单次灌胃P85FA/5FU胶束20MG/KG，观察给药后动物14天内的毒性反应及死亡情况。结果发现，小鼠单次灌胃给药后，小鼠活动滞缓，静卧少动，3050分钟后即恢复正常。给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。0042实验结果上述急性毒性实验结果表明，单次灌胃给药P85FA/5FU胶束的最大耐受量MTD不低于20MG/KG，说明P85FA/5FU胶束的急性毒性较低。说明书CN104208707A101/1页11图1图2说明书附图CN104208707A11。