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1、10申请公布号CN104208703A43申请公布日20141217CN104208703A21申请号201410437407022申请日20140829A61K47/04200601A61K47/34200601A61K47/26200601A61P35/00200601A61K31/70420060171申请人东华大学地址201620上海市松江区松江新城人民北路2999号72发明人史向阳郭睿陈光祥74专利代理机构上海泰能知识产权代理事务所31233代理人黄志达54发明名称一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用57摘要本发明涉及一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒。
2、及其制备和应用，包括1用一端是氨基另一端是羧基的聚乙二醇与乳糖酸反应，得到聚乙二醇化乳糖酸；2用3氨基丙基二甲基乙氧基硅烷修饰在锂皂石使其表面带有一定数量的氨基；3用聚乙二醇化乳糖酸修饰纳米粘土锂皂石，得到乳糖酸修饰的功能化锂皂石纳米复合材料；该材料可用于制备具有乳糖酸靶向功能的纳米载药体系。本发明不仅提高了纳米颗粒的稳定性和生物相容性，而且对去唾液酸糖蛋白受体高表达的肝癌细胞具有特异性的靶向作用，因此合成的纳米载药复合材料可应用于靶向输送抗癌药物。本发明的制备方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。51INTCL权利要求书2页说明书6页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局。
3、12发明专利申请权利要求书2页说明书6页附图4页10申请公布号CN104208703ACN104208703A1/2页21一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒，其特征在于所述的氨基化锂皂石纳米颗粒为3氨基丙基二甲基乙氧基硅烷修饰的锂皂石，纳米颗粒中聚乙二醇乳糖酸的质量分数在49175109，聚乙二醇与乳糖酸的摩尔比为10681076。2一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，包括1用溶剂溶解乳糖酸LA，加入活化剂活化羧基24H，然后在搅拌的情况下逐滴加入一端是氨基另一端是羧基的聚乙二醇溶液，反应7074H后，透析，冷冻干燥得到聚乙二醇化乳糖酸LAPEGCOOH；2配置L。
4、AP分散液，取3氨基丙基二甲基乙氧基硅烷逐滴加入到LAP分散液中，然后50水浴中静置1418H，透析，制得氨基化的锂皂石溶液LMNH2；3取1中所得的LAPEGCOOH配成溶液，经活化剂活化过3H后，边搅拌边逐滴加入步骤2所得LMNH2溶液中，反应7074H后，透析，最后得到纯化的聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LMPEGLA。3根据权利要求2所述的一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，其特征在于步骤1中所述的溶解乳糖酸和3中聚乙二醇乳糖酸的溶剂为PH6的磷酸盐缓冲液。4根据权利要求2所述的一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，其特征在于步骤1中乳糖。
5、酸溶液浓度为68MG/ML。5根据权利要求2所述的一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，其特征在于步骤1和步骤3中活化剂为1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺EDC和N羟基丁二酰亚胺NHS，步骤1中EDC、NHS与羧酸基团的摩尔比为111，步骤3中EDC、NHS与羧酸基团的摩尔比55110101。6根据权利要求2所述的一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，其特征在于步骤2中锂皂石纳米颗粒的水溶液浓度为810MG/ML，锂皂石和硅烷偶联剂的质量比2131。7根据权利要求2所述的一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，其特征在于步骤3中氨基化锂皂石与。
6、聚乙二醇乳糖酸的摩尔比为1125115。8根据权利要求2所述的一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，其特征在于步骤1和步骤3中所述的搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为100150R/MIN。9根据权利要求2所述的一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，其特征在于步骤1中透析工艺为将反应产物转移到透析袋中，在磷酸盐缓冲液和蒸馏水中分别透析共72H；所述的透析袋截留分子量为1000，步骤2和步骤3中所述的透析袋截留分子量为800014000。10根据权利要求2所述的一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应用，其特征在于将阿霉素水DOX溶液逐滴加入聚乙二醇乳糖酸修饰。
7、的氨基化锂皂石纳米颗粒水溶液，搅拌1224H，离心，洗涤并分散，得到负载阿霉素的聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LMPEGLA/DOX。权利要求书CN104208703A2/2页311根据权利要求10所述的一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应用，其特征在于所述阿霉素的浓度为12MG/ML，聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒和阿霉素的质量比为4121。12根据权利要求10所述的一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应用，其特征在于所述搅拌为磁力搅拌，搅拌时间为1224H，搅拌速度为100150R/MIN；离心的速率为5000R/MIN，离心的时间为10MIN。权。
8、利要求书CN104208703A1/6页4一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用技术领域0001本发明属于纳米载药材料及其制备和应用领域，特别涉及一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用。背景技术0002一直以来，肿瘤都是危害人类生命的头号杀手，肿瘤具有死亡率高、难治疗以及恶化迅速等特点。据世界卫生组织报告，每年全球癌症新发病例1000多万，死亡700多万，占总死亡人数的12。肿瘤已经成为困扰人类健康的一大难题。随着社会生产力的发展与社会的进步，人类对于治愈恶性肿瘤的要求更加迫切；虽然治疗肿瘤的药物很多，但是许多药物都或多或少存在缺陷，最明显的是药物作用周。
9、期短和药物不能特异性地作用于肿瘤细胞这两个问题。因此，寻找一种能够使药物缓慢释放并且靶向作用于肿瘤细胞的药物输送系统显得尤为重要。0003理想的药物载体应具有很好的生物相容性、生物可降解性、理化及生物稳定性和较高的药物负载能力。近年来随着药物载体研究的不断发展，具有良好吸附性能、无毒、生物相容性好的无机材料已经成为药物载体的研究热点。天然粘土矿物锂皂石LAPONITE，简称LAP就是其中之一。锂皂石是属于蒙皂石族的一种矿物，分散在水中能形成扁平状晶体。锂皂石具有特殊空间夹层结构并且表面带有大量的负电荷，可以有效地包载药物，在疏水性药物依曲康唑、抗肿瘤药物阿霉素等的负载与输送中体现了优势。000。
10、4但是，寻找合适的载体还远远不够，许多抗癌药物不能穿过细胞膜，即使药物载体将药物载至肿瘤细胞表面，仍缺乏有效的内化机制。随着对肿瘤细胞研究的深入，研究者发现肿瘤细胞具有一系列过量表达的受体，可将与受体相关的配体或抗体连接在药物或药物载体表面，通过受体介导的内吞作用将所载药物靶向转运到特定的组织和肿瘤细胞，这个方法的特异性和对肿瘤细胞的亲和性都非常高，大大提高了药物的靶向性和转运效率。0005去唾液酸糖蛋白受体ASIALOGLYCOPROTEINRECEPTORS，ASGPR是一种药物投递系统的靶点。ASGPR在人肝癌细胞表面大量存在，并能够特异性识别含有半乳糖基寡糖或半乳糖化的载体，并与之稳定。
11、结合利于细胞内吞。乳糖酸LA，LACTOBIONICACID在化学结构上具有半乳糖的结构，修饰到纳米载体表面后能够通过LA上半乳糖残基与肝癌细胞表面的ASGPR受体的相互作用实现靶向性输送。聚乙二醇PEG是一种具有良好生物相容性的链状聚合物，修饰到纳米材料表面能够显著提高材料在水中的稳定性与生物相容性。查阅相关文献可以发现，如果将靶向分子LA链接到PEG末端得到PEGLA，然后再修饰到合适的纳米载体表面，不仅可以利用PEG分子链的修饰提高材料的稳定性，降低毒性，还能够通过LA增强药物在肿瘤部位的富集，提高治疗效果。0006因此，利用LAP的自身结构特点负载抗肿瘤药物盐酸阿霉素，再通过表面修饰P。
12、EGLA的方式赋予载体靶向性，将有望提高阿霉素的抗肿瘤效果、降低毒副作用，具有重要的理论意义和实用价值。说明书CN104208703A2/6页5发明内容0007本发明提供了一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用，以克服现有技术存在的缺陷，满足有关领域发展的需要。0008本发明所述的一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒，其特征在于所述的氨基化锂皂石纳米颗粒为3氨基丙基二甲基乙氧基硅烷修饰的锂皂石；聚乙二醇乳糖酸的质量分数在49175109左右，聚乙二醇与乳糖酸的摩尔比为10681076。0009本发明所述的一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒用于抗肿瘤药物的负。
13、载，聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒和阿霉素盐酸盐的质量比为4121，在此条件下药物的负载效率为913。0010一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，包括00111用少量的溶剂溶解一定量的乳糖酸LA，加入一定量的活化剂活化羧基3H，然后在搅拌的情况下逐滴加入一端是氨基另一端是羧基的聚乙二醇溶液，反应72H后，将反应产物转移到透析袋中，在磷酸盐缓冲液和蒸馏水中分别透析共72H，冷冻干燥得到聚乙二醇化乳糖酸LAPEGCOOH；00122配置一定浓度的LAP分散液，取一定量的3氨基丙基二甲基乙氧基硅烷逐滴加入到LAP分散液中，然后50水浴中静置16H，将反应产物转移到透析袋。
14、中，在磷酸盐缓冲液和蒸馏水中分别透析共72H，制得氨基化的锂皂石溶液LMNH2。00133取1中所得的LAPEGCOOH配成一定浓度溶液，经活化剂活化过3H后，边搅拌边逐滴加入步骤2所得一定浓度的LMNH2溶液中，反应72H后，将反应产物转移到透析袋中，在磷酸盐缓冲液和蒸馏水中分别透析共72H，最后得到纯化的聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LMPEGLA；0014步骤1中所述的溶解乳糖酸和3中聚乙二醇乳糖酸的溶剂为PH6的磷酸盐缓冲液。0015所述步骤1中乳糖酸溶液浓度为68MG/ML。0016所述步骤1中的聚乙二醇PEG为NH2PEGCOOH，分子量大小为2000。0017所述步骤1。
15、中得到的PEGLA中PEG和LA的摩尔比为10681076。0018所述步骤1和步骤3中活化剂为1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺EDC和N羟基丁二酰亚胺NHS，步骤1中EDC、NHS与羧酸基团的摩尔比为111，步骤3中EDC、NHS与羧酸基团的摩尔比为55110101。0019所述步骤2中锂皂石纳米颗粒的水溶液浓度为810MG/ML。锂皂石和硅烷偶联剂的质量比2131。0020所述步骤3中氨基化锂皂石与聚乙二醇乳糖酸的用量摩尔比为1125115。0021所述步骤3中所得到的LMPEGLA中，PEGLA的质量分数在49175109。0022所述步骤1和步骤3中所述的搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为10。
16、0150R/MIN。0023所述步骤1中所述的透析袋截留分子量为1000。步骤2和步骤3中所述的透析袋截留分子量为800014000。说明书CN104208703A3/6页60024一种聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应用，其特征在于将阿霉素DOX水溶液逐滴加入聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒水溶液，搅拌1224H，离心，洗涤并分散，得到负载阿霉素的聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LMPEGLA/DOX。0025所述抗肿瘤药物阿霉素的浓度为12MG/ML，聚乙二醇乳糖酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒和阿霉素的质量比为4121。0026药物包裹所述搅拌为磁力搅拌，搅拌时间为。
17、1224H搅拌速度为100150R/MIN；离心的速率为5000R/MIN，离心的时间为10MIN。0027所得到的LMPEGLA/DOX中，LMPEGLA纳米颗粒对DOX的负载效率为913。0028本发明采用硅烷偶联剂修饰LAP表面得到氨基化的纳米颗粒LMNH2，再化学键合PEGLA得到了乳糖酸修饰的LMPEGLA。这一载体不仅可以通过乳糖酸的靶向作用被肿瘤细胞主动摄取，同时引入的长链聚合物PEG可以延长载体在体内的循环时间，降低材料毒性，提高材料稳定性，改善药物释放特性，并且可以有效减少乳糖酸与去唾液酸糖蛋白受体结合时的空间位阻，提高LMPEGLA/DOX与去唾液酸糖蛋白受体表达的肿瘤细胞。
18、的亲和力。本发明的LMPEGLA载体用于抗肿瘤药物负载，对去唾液酸糖蛋白受体高表达的肿瘤细胞具有良好的靶向效果，可作为理想的靶向纳米载体，实现药物、基因或诊断分子探针的负载与靶向输送。0029本发明使用1H核磁分析、红外分析等方法表征本发明制备的靶向修饰的锂皂石纳米颗粒，紫外可见光谱测试可以验证药物的成功负载。同时用MTT细胞毒性法、流式细胞术分析和激光共聚焦显微镜来检验本发明的LMPEGLA/DOX对表面去唾液酸糖蛋白受体表达的人肝癌细胞HEPG2细胞的毒性与靶向性。具体测试结果如下00301核磁分析0031附图1中A，B和C分别为PEGLA、LMMPEG和LMPEGLA的1H核磁图谱。图A。
19、中可以看出，在35PPM处有较强的吸收峰为PEG中亚甲基的特征峰，在3643PPM处的一系列弱峰为LA的特征峰，证明LA已经成功连接到PEG分子链上。通过积分可以算出，连接上的PEG与LA的比值为1072。在图B与C中出现了在35PPM处的吸收峰，说明PEG已经连接到LAP表面。与图B相比，图C在38PPM处的峰为LA的特征峰，证明PEGLA已经成功修饰到了LMNH2表面。00322红外分析0033在附图2所示的红外测试结果中，1260CM1处为SIO键的伸缩振动，证明硅烷偶联剂已成功修饰到LAP表面，制备得到了LMNH2。在PEGLA的红外光谱中，2884，1466，1341，1282和12。
20、42CM1分别为PEG中CH2拉伸振动和亚甲基醚键的弯曲振动，在1148和1105CM1有一个强的振动峰，为COC的特征振动峰。在LMPEGLA中，在2880，1460和1097CM1处出现新的振动峰，为PEG分子链中CH2和COC键的峰，证明PEGLA已经接在了LMNH2上。00343紫外可见光谱测试0035在附图3所示的紫外可见光谱测试结果中，载药前LMPEGLA在200到800NM波长范围内均没有明显的吸收峰。在负载DOX之后，LMPEGLA/DOX材料在480NM附近显示出一个明显的吸收峰。根据文献报道，这个吸收峰为DOX的紫外特征吸收峰。因此，表面修饰的锂皂石纳米颗粒仍然能够负载抗肿。
21、瘤药物DOX。通过紫外定量分析，在投料比为说明书CN104208703A4/6页7LMPEGLADOX31的条件下，LMPEGLA的载药效率为913。00364体外释放试验0037附图4为LMPEGLA/DOX的体外累积释放曲线。在100小时中，DOX在PH54的弱酸性环境中从LMPEGLA/DOX中累计释放比在PH74的中性环境中累计释放量高。这说明基于锂皂石的载药体系均具有PH响应性，即在与肿瘤组织类似的弱酸性环境中的释放速度快，累积释放率高，而在正常组织的中性环境中释放速度慢，累积释放率低，说明这一体系可以有效减少DOX在体内循环过程中在正常组织处的释放，将药物集中在肿瘤组织部位释放，减。
22、少了DOX对正常组织的毒性，提高对肿瘤细胞恶性增殖的抑制效果。00385MTT细胞毒性试验0039为评价载体的生物相容性，选择人肝癌细胞HEPG2细胞作为模型，通过MTT比色法测定HEPG2细胞与不同浓度的LMPEGLA和LMMPEG纳米颗粒共培养后的细胞活力，如图5A。与PBS对照组相比，LMPEGLA和LMMPEG在实验浓度05到64G/ML范围内对细胞的存活率没有显著性差异细胞存活率均在88以上，表明材料具有良好的生物相容性。为了验证载药纳米颗粒的抗肿瘤效果，通过MTT比色法测定了与不同浓度的单纯DOX，LMPEGLA/DOX和LMMPEG/DOX共培养24H的HEPG2细胞的活力，如图。
23、5B。在相同的药物浓度条件下，经LMPEGLA/DOX处理的HEPG2的细胞活性明显低于经纯药DOX和LMMPEG/DOX处理的细胞活性。这一结果表明本发明所述的靶向材料LMPEGLA/DOX具有良好的生物相容性，并且表现出优于非靶向材料和裸药的抗肿瘤效果。00406细胞吞噬实验0041HEPG2细胞经PBS、LMPEGLA/DOX和LMMPEG/DOX处理后的共聚焦显微镜观察，如图6。其中细胞核经染色显示蓝色荧光，DOX具有红色荧光。对比LMPEGLA/DOX和LMMPEG/DOX处理的HEPG2细胞发现，乳糖酸修饰的材料具有更强的红色荧光，表明LMPEGLA/DOX更容易被ASGPR高表达。
24、的HEPG2细胞摄取。HEPG2细胞经PBS、LMPEGLA/DOX和LMMPEG/DOX处理后的流式细胞仪检测结果如图7所示。HEPG2细胞分别经LMPEGLA/DOX和LMMPEG/DOX处理后，乳糖酸修饰的材料更容易被ASGPR高表达的HEPG2细胞摄取，其荧光强度值明显高于LMMPEG/DOX处理后的HEPG2细胞。共聚焦显微镜观察图片和流式细胞仪数据充分说明乳糖酸修饰的载体材料显著提高药物输送体系的特异性结合能力，促进癌细胞对载药复合物的摄取，赋予了载药体系主动靶向肿瘤的特性。0042综上所述，本发明所述的LMPEGLA/DOX可以明显提高肿瘤细胞对DOX的摄取，改善了DOX的抗癌效。
25、果，具有良好的应用前景。0043有益效果00441本发明的LMPEGFA/DOX载药纳米颗粒具有良好的药物缓释效果与PH响应性释放特性，对高叶酸受体表达的肿瘤细胞具有靶向性和明显的抑制效果，可用于癌细胞的靶向治疗；00452本发明制备方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。附图说明0046图1为APEGLA，BLMMPEG和CLMPEGLA的1H核磁共振谱图；0047图2为LMNH2，LMPEGLA和PEGLA的红外光谱图；说明书CN104208703A5/6页80048图3为LMPEGLA，DOX和LMPEGLA/DOX的紫外吸收光谱图；0049图4为在不同PH条件下DOX从。
26、LMPEGLA/DOX中释放的累积释放曲线；0050图5为MTT法测定的HEPG2细胞经不同浓度的LMMPEG和LMPEGLAA，纯DOX，LMMPEG/DOX和LMPEGLA/DOXB处理24H后的细胞活力P005，P0005，P0001；0051图6为HEPG2细胞经PBS、LMMPEG/DOX和LMPEGLA/DOX处理4H后的细胞内荧光分布，其中材料中DOX浓度2G/ML，细胞核用HOECHST33342染成蓝色；0052图7为流式细胞术测定的经PBS、LMMPEG/DOX和LMPEGLA/DOX处理4H后，HEPG2细胞对DOX的吞噬情况纵坐标为细胞内吞DOX后的平均荧光强度，与吞噬。
27、量成正比，P005，P0005，P0001。具体实施方式0053下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。0054实施例100551用20ML的PH6的缓冲溶液溶解32MG的乳糖酸LA购于国药集团化学试剂有限公司，加入1ML浓度为169MG/ML的1乙基3二甲基氨基丙基碳酰二亚胺EDC搅拌05H，然后加入1ML浓度为101MG/MLN羟基丁二酰亚胺NHS活化3H，缓慢加入含有2ML浓度为4420MG/。
28、ML的NH2PEGCOOHMW2000溶液，反应72H后，将反应产物用1000的透析袋在磷酸盐缓冲液中透析24H，然后再用蒸馏水透析48H，最后将纯化的产物冷冻干燥得到乳糖酸修饰的聚乙二醇固体产物LAPEGCOOH；00562取一定质量的LAP粉末分散于一定体积的超纯水中，制得浓度为10MG/ML的分散液，取40L3氨基丙基二甲基乙氧基硅烷边振荡边滴加入10MLLAP分散液中，然后置于50水浴中16H，将反应产物用800014000透析袋在磷酸盐缓冲液中透析24H，然后再用蒸馏水透析48H，制得氨基化的锂皂石LM溶液。00573称取2MG的PEGLA粉末溶于1ML的PH6缓冲溶液中，向其中加入。
29、1ML浓度为22MG/ML的EDC，搅拌均匀，然后加入1ML浓度为132MG/ML的NHS溶液，磁力搅拌3小时。将活化后的PEGLA溶液缓慢加入1ML浓度为4MG/ML的氨基化锂皂石LMNH2水溶液中，磁力搅拌反应3天。反应结束后，将反应液全部转移到截留分子量大小为800014000的透析袋中，在磷酸盐缓冲液中透析24H，然后再用蒸馏水透析48H。透析结束后，将透析袋内产品转移到15ML离心管，4保存。0058实施例20059配置浓度为1MG/ML的DOX水溶液，取2MLDOX水溶液加入到取2ML浓度为3MG/ML的LMPEGLA水溶液中，在避光的条件下磁力搅拌反应24小时。反应结束后，将溶液。
30、转移到15ML离心管中，在转速为5000RPM条件下离心10MIN，得到的沉淀用去离子水洗涤3次，即可得到载药纳米颗粒LMPEGLA/DOX。0060实施例3说明书CN104208703A6/6页90061将LMPEGLA/DOX分别用PH74和PH54的缓冲液配置成DOX浓度为1MG/ML的溶液，取1ML上述溶液放入透析袋中，置于含有9ML的相同PH缓冲液中，放在37摇床中振荡。开始的12H内每隔2H取一次样，以后每隔24H取一次样。每次取透析袋外液体1ML，再向透析袋外加入对应的缓冲溶液1ML。测量取出的透析液在480NM处的吸光度值，计算得到体外不同PH条件下DOX从LMPEGLA/DO。
31、X中释放的释放曲线。图40062实施例40063收集对数生长期HEPG2细胞，具体条件是HEPG2细胞采用DMEM培养基，培养基均含10胎牛血清，1双抗。培养箱温度为37，二氧化碳浓度为5。取配制一定浓度的PBS溶液，并用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台用新鲜培养基配制浓度分别为05、1、2、4、8、16、32和64G/ML的LMPEGLA和LMMPEG纳米颗粒悬浮液。HEPG2细胞种植于96孔板后分别与含有LMPEGLA和LMMPEG纳米颗粒的新鲜培养基浓度为05、1、2、4、8、16、32和64G/ML在37下共培养24H。然后，向培养板孔中加入20LMTT5MG/ML，继续在37下培养。
32、4H后，弃去培养液，并加入200LDMSO，振荡15分钟使结晶体完全溶解后，使用酶联免疫检测仪在570NM处测量各孔溶液的吸光值，并根据此值计算细胞的活力。不同浓度的材料对细胞增殖的影响以缓冲液PBS为对照组进行比较。图5A0064为了证明所合成的LMPEGLA/DOX复合物的抗肿瘤药效仅和其所负载的抗肿瘤药物DOX相关，且具有靶向杀死细胞的能力。配制含不同的DOX浓度01，02，04，08，12，16和20G/MLLMPEGLA/DOX和LMMPEG/DOX的材料。HEPG2细胞种植于96孔板后分别与含有LMPEGLA/DOX和LMMPEG/DOX纳米颗粒的新鲜培养基含DOX浓度分别为01，。
33、02，04，08，12，16和20G/ML在37下共培养24H。然后，向培养板孔中加入20LMTT5MG/ML，继续在37下培养4H后，弃去培养液，并加入200LDMSO，振荡15分钟使结晶体完全溶解后，使用酶联免疫检测仪在570NM处测量各孔溶液的吸光值，并根据此值计算细胞的活力。以缓冲液PBS为对照组进行比较不同浓度的材料对细胞增殖的影响。图5B0065实施例50066收集对数生长期HEPG2细胞，将盖玻片放置于12孔细胞培养板中并用新鲜DMEM培养基浸泡12H，然后弃去培养基后每孔补充10ML新鲜培养基并接种5104个HEPG2细胞，过夜培养细胞，贴壁后弃去培养基，细胞再分别与含有PBS。
34、、材料LMPEGLA/DOX和对照材料LMMPEG/DOXDOX浓度为2G/ML纳米颗粒的培养基在37下共培养4H，接着用PBS清洗三次，然后依次用25戊二醛05ML固定15分钟、HOCHEST3334308ML染色30分钟，最后将盖玻片放置于载玻片上，通过油镜63观察细胞的形貌。图60067用新鲜细胞培养液分别将LMPEGLA/DOX和LMMPEG/DOX配制成DOX浓度为1和2G/ML的两种纳米颗粒溶液。HEPG2细胞先以2105/孔的密度种植于12孔板，过夜培养细胞贴壁后，先弃掉培养液，然后细胞再分别与LMPEGLA/DOX和LMMPEG/DOX纳米颗粒的培养基溶液在37下共培养4H，并且以PBS处理的细胞作为对照组。共培养后细胞用PBS清洗三次，再用胰酶消化并离心，弃上清液，将细胞悬浮于1MLPBS中。通过流式细胞仪检测细胞吞噬纳米颗粒后的平均荧光强度。图7说明书CN104208703A1/4页10图1说明书附图CN104208703A102/4页11图2图3说明书附图CN104208703A113/4页12图4图5说明书附图CN104208703A124/4页13图6图7说明书附图CN104208703A13。