一种产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL11及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102816720 A(43)申请公布日 2012.12.12CN102816720A*CN102816720A*(21)申请号 201210284868.X(22)申请日 2012.08.10CGMCC NO.6290 2012.06.26C12N 1/20(2006.01)C12N 9/88(2006.01)C12P 17/10(2006.01)C12P 1/04(2006.01)A01N 63/02(2006.01)A01P 21/00(2006.01)B09C 1/10(2006.01)C12R 1/43(2006.01)(71)申请人哈尔滨师范大学地址 15。

2、0025 黑龙江省哈尔滨市利民经济技术开发区师大南路1号(72)发明人郭长虹 刘佳莉 郇菲菲 束永俊陶楠(74)专利代理机构西安通大专利代理有限责任公司 61200代理人陆万寿(54) 发明名称一种产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11及其应用(57) 摘要本发明公开了一种产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11及其应用其分类命名为粘质沙雷氏菌LJL-11（Serratia marcescens），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC NO.6290。可以1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）为唯一氮源生长，同时将其分解。该细菌的ACC脱氨酶活性最高。

3、可达38.52mol -KA (mg Prh)-1；随着L-Trp的浓度增加其合成IAA的量增加；且可以合成嗜铁素。该菌株可在盐碱、干旱、金属、有机物污染等胁迫环境下提高植物的抗逆能力，促进植物生长；对石油污染的盐碱土中对燕麦的生长有促进作用。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书6页序列表2页 附图2页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 6 页序列表 2 页 附图 2 页1/1页21.一种产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11，其特征在于，其分类命名为粘质沙雷氏菌LJL-11（Serratia marcescens）。

4、，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC NO.6290。2.如权利要求1所述的产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11，其特征在于，该菌能够在胞内合成ACC脱氨酶，在好氧条件下将ACC作为唯一氮源进行生长，同时将其分解。3.如权利要求1所述的产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11，其特征在于，该菌能够合成吲哚乙酸。4.如权利要求1所述的产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11，其特征在于，该菌能够合成嗜铁素。5.权利要求1所述的产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11在促植物生长的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，在制备促植物生长的制。

5、剂或提高植物抗逆性的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的制剂为抑制ACC生成的制剂、促吲哚乙酸合成的制剂、促嗜铁素合成的制剂中的一种或几种。8.权利要求1所述的产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11在石油污染的土壤的植物修复中的应用。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，在制备提高植物在石油污染的盐碱土壤中的抗逆性的制剂的应用。10.权利要求1所述的产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11在植物在胁迫环境下通过抑制体内乙烯合成以提高抗逆能力中的应用。权 利 要 求 书CN 102816720 A1/6页3一种产 ACC 脱氨酶的粘质沙雷氏菌 LJL-11 及其应用技术领域0。

6、001 本发明属于植物促生菌技术领域，涉及一种产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11及其应用。背景技术0002 近年来，随着经济发展以及全球环境变化，土壤盐碱化、重金属污染、干旱以及有机物污染越来越严重，这些逆境条件造成了农作物的减产。如何有效提高植物的抗逆能力和增加农作物的产量已经成为了广泛关注的问题。0003 环境胁迫可以导致植物体内胁迫乙烯的大量积累，而过量的乙烯会导致植物生长受阻甚至死亡。1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carbo xylate，ACC）是物体内乙烯的合成前体。很多研究发现，多种植物根际促生细菌（plant growth-prom。

7、oting rhizobacteria，PGPR）能分泌一种能抑制植物体内乙烯合成的胞内聚合酶，ACC脱氨酶（ACC deaminase），可将ACC分解为-丁酮酸和氨，可减少胁迫乙烯的产生，从而提高植物在逆境胁迫下的适应能力。因此，亟待开发一种能够有效缓解逆境胁迫的危害且能够促进植物生长的植物根际促生细菌。发明内容0004 本发明解决的问题在于提供一种产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11及其应用，该粘质沙雷氏菌是一种新的植物促生菌，有望在石油污染的盐碱土壤的植物修复中发挥重要作用。0005 本发明是通过以下技术方案来实现：0006 一种产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11，其分类命名。

8、为粘质沙雷氏菌LJL-11（Serratia marcescens），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC NO.6290。0007 该菌能够在胞内合成ACC脱氨酶，在好氧条件下将ACC作为唯一氮源进行生长，同时将其分解。0008 进一步的，该菌能够合成吲哚乙酸。0009 而且，该菌能够合成嗜铁素。0010 该菌的应用包括：0011 所述粘质沙雷氏菌LJL-11在促植物生长的应用。0012 所述在制备促植物生长的制剂或提高植物抗逆性的应用。0013 所述的制剂为抑制ACC生成的制剂、促吲哚乙酸合成的制剂、促嗜铁素合成的制剂中的一种或几种。0014 。

9、所述的产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11在石油污染的土壤的植物修复中的应用。0015 所述在制备提高植物在石油污染的盐碱土壤中的抗逆性的制剂的应用。说 明 书CN 102816720 A2/6页40016 所述的产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11在植物在胁迫环境下通过抑制体内乙烯合成以提高抗逆能力中的应用。0017 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：0018 本发明提供的产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11，是以ACC作为唯一N源的培养基对从石油污染的盐碱土中生长的植物的根际土中的微生物进行筛选分离，得到的能够以ACC作为唯一N源生长的微生物，检测结果表明该菌是一种。

10、能够合成ACC脱氨酶的新的粘质沙雷氏菌，分类命名为Serratia marcescens。0019 本发明提供的产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11，由于其合成ACC脱氨酶，所有能够抑制植物体内ACC的合成，进而降低由于环境胁迫所导致植物体内乙烯的大量积累，从而提高其抗逆性。0020 本发明提供的产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11，还能够合成吲哚乙酸和嗜铁素，从而能够帮助植物提供吲哚乙酸及促进铁元素的吸收，起到促植物生长的作用。0021 本发明提供的产ACC脱氨酶的粘质沙雷氏菌LJL-11，在石油污染的盐碱土中对燕麦的生长有促进作用，包括株高、株鲜重、根长及根鲜重的促生长作用：与对照。

11、相比，株高增加42.57%，植株鲜重/5株增加9.83%，根长增加10.22%，根鲜重/5株增加3.45%。该菌株可在盐碱、干旱、金属、有机物污染等胁迫环境下提高植物的抗逆能力，促进植物生长。0022 保藏说明0023 本发明所述的粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11进行了下述保藏：0024 保藏时间：2012年6月26日，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC；保藏号为CGMCC NO.6290。附图说明0025 图1为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens。

12、）LJL-11在ADF培养基上的生长状况。0026 图2为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11在不同浓度L-Trp中IAA合成量的变化。0027 图3为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11在铬奥醇CAS固体培养基上形成橘黄色晕圈。0028 图4为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11对燕麦促生3周时盆栽效果。具体实施方式0029 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。0030 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。0031 下述实施例中所用的材料、。

13、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。0032 实施例1、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11的分离和鉴定0033 1、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11的分离说 明 书CN 102816720 A3/6页50034 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11的分离包括取样，筛选和纯化两个步骤，具体方法如下：0035 1.1、取样0036 筛选植物根际促生菌的土壤取自黑龙江省大庆市采油厂附近盐碱土中生长的燕麦的根际土，将根际土装入灭过菌的采集瓶中带回实验室，放入4冰箱保存备用。0037 1.2、筛选和纯化。

14、0038 （1）取1g根际土样于50mL PAF培养基中，28振荡培养24h。该PAF培养基中含有蛋白胨，酪蛋白水解物，MgSO4，K2HPO4，甘油，具体参照Penrose D M,Glick B R.Methods for isolating and characterizing ACC deaminase-containing plant growth-promoting rhizobacteriaJ.Physiologia Plantarum,2003,118(1):10-15来配制。0039 （2）取1mL上述（1）震荡后的PAF培养液（混悬液），于50mL PAF培养基中，28振荡。

15、培养24h。0040 （3）取1mL上述（2）得到的PAF培养液，于50mL DF盐培养液中，28振荡培养24h。该DF盐培养液含有KH2PO4，Na2HPO4，MgSO4，FeSO4，葡萄糖，葡萄糖酸，柠檬酸，(NH4)2SO4，H3BO3，MnSO4，ZnSO4，CuSO4，MoO3。0041 （4）取1mL上述（3）得到的DF盐培养液，于50mL不含(NH4)2SO4，但含有3mM 1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）的DF盐培养液中（即以ACC作为唯一N源），28振荡培养48h。0042 （5）取1mL上述（4）得到的培养液，涂布于含3mM ACC的DF盐琼脂培养基上，28培养。0043。

16、 （6）取上述（5）培养基上生长的菌落，在ADF培养基上划线纯化，得到单一菌落。0044 这样经过以ACC作为唯一N源的培养基对根际土中能够利用其作为N源生长的细菌进行筛选，从而得到了单一菌落。0045 2、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11的鉴定0046 对上述分离纯化得到的纯培养菌株进行一系列生理生化鉴定，并进行DNA提取，16S rDNA的扩增和测序。0047 2.1该菌株在ADF培养基上形成红色、不透明、边缘不规则的菌落，如图1所示。0048 2.2利用引物F8和R1541进行扩增16S rDNA，引物序列如下：0049 F8：5AGAGTTTGATCC。

17、TGGCTCAG3，0050 F 1541：5AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3。0051 PCR扩增条件为：943min；9430s，5530s，7290s，30个循环；7210min。0052 对PCR扩增产物进行测序，测序结果如SEQ.ID.NO.1所示。0053 将上述获得的纯培养菌株中的一株命名为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11，并将其保藏，保藏号为CGMCC NO.6290。0054 实施例2、CGMCC NO.6290的ACC脱氨酶活性测定0055 供试菌株CGMCC NO.6289在TSB培养液（胰蛋白胨17.0g，大豆胨3.0g，Na。

18、Cl 5.0g，葡萄糖2.5g，K2HPO42.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.5）中过夜培养，4离心收集菌体。菌体细胞用DF培养液洗涤三次，重新悬浮于ADF培养液，室温28振荡培养2天后，4离心收集菌体，用0.1molL-1Tris-HCl缓冲液（pH=7.6）洗涤离心三次，重悬浮于600L 0.1molL-1Tris-HCl缓冲液（pH=8.0）中，加入30L甲苯并迅速振荡30s以破碎细胞，转说 明 书CN 102816720 A4/6页6移200L含甲苯的细胞提取物至1.5mL离心管中，加入20L 0.5molL-1ACC混匀，同时做不添加ACC的空白试验，30培养15min。添加1。

19、mL 0.56molL-1HCl，16000g离心5min，取1mL悬浮液至试管中，加入800L 0.56mol L-1HCl和300L 2,4-二硝基苯肼，30孵育30min，加入2mL 2molL-1NaOH，540nm波长测吸光度。以1mL浓度为0、0.1、0.3、0.7、1和2molL-1的-丁酮酸为标准液，测540nm波长下吸光值。0056 蛋白质测定采用考马斯亮蓝法测定。以1mL浓度为0、20、40、60、80和100g L-1的牛血清白蛋白溶液为标准溶液，加5mL考马斯亮蓝G250染色液，反应5min后测定595nm下吸光值。0057 ACC脱氨酶的活性以在测酶体系中每毫克蛋白每。

20、小时形成-丁酮酸的量表示，单位为mol-KA(mgPrh)-1。酶活性测定均扣除样品对照空白后计算，重复3次。0058 采用-丙酮酸标准品为标准样制作标准曲线，标准曲线方程（方程甲）如下：y=3.6928x-0.035（R2=0.9879），其中x代表OD540nm数值，y代表-丁酮酸含量（mol）。采用考马斯亮蓝法检测细胞提取物的总蛋白含量。以采用牛血清白蛋白为标准品制作标准曲线，标准曲线方程（方程乙）如下：y=205.73x-1.3251（R2=0.9846），其中x代表OD595nm数值，y代表蛋白含量（mg）。0059 根据制作标准曲线和检测结果，即可获得ACC脱氨酶活性的活性。检测结。

21、果表明CGMCC NO.6289的细胞破碎物中具有ACC脱氨酶活性，酶活性最高可达38.52mol -KA(mg Prh)-1，这表明CGMCC NO.6290能够胞内合成ACC脱氨酶。0060 实施例3、CGMCC NO.6290的IAA合成量测定0061 将CGMCC NO.6290先在DF培养液中培养2天，再微量转入添加不同浓度色氨酸（L-Trp）的DF培养液（含0、50、100、200和500g L-Trp mL-1）中继续培养2天，取样测菌液OD600，其余培养液室温下8000g离心，取500L上清液，添加2mL Salkowski试剂（含150mL H2SO4、250mL ddH2。

22、O和7.5mL 0.5molL-1FeC13），黑暗下室温培养20min后，在535nm处测吸光值（OD535），无菌培养基同上做相同的处理作为对照调零。以浓度为0、0.01、0.05、0.25、0.5mgmL-1的IAA标准液同方法做标准曲线，标准曲线方程如下：y=0.1701x-0.0237（R2=0.9855），其中x代表OD535nm数值，y代表IAA浓度（gmL-1）。0062 根据制作标准曲线和检测结果，即可获得CGMCC NO.6290的IAA合成量；而且检测结果还表明，粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11能够利用色氨酸产生吲哚乙酸；如图2所示，而且。

23、随着L-Trp浓度的增加，粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11合成的IAA的量不变。0063 CGMCC NO.6290以色氨酸（L-Trp）为前体合成植物生长激素吲哚乙酸（IAA），可以吸附在种子和根的表面被植物所利用，同时也可以和植物内生的IAA共同作用刺激植物细胞生长和增殖，可促进植物根系的生长发育及有效吸收土壤中的水分和养分，同时对植物的其他生命活动进行调节。0064 实施例4、CGMCC NO.6290的嗜铁素合成量测定0065 参照Schwyn和Neilands的方法（Schwyn B,Neilands J B.Universal chemical a。

24、ssay for the detection and determination of siderophoresJ.Analytical Biochemistry,1987,160:47-56.），对粘质沙雷氏菌LJL-11进行嗜铁素合成定性实验。将粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11接于铬奥醇CAS（chrome azurol S）固体培说 明 书CN 102816720 A5/6页7养基上，28培养48h，观察菌落周围的颜色变化，有橘黄色圈产生即可产生嗜铁素。0066 检测结果如图3所示，粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11在CA。

25、S琼脂平板上菌落周围有橘黄色晕圈形成，即产生了嗜铁素。0067 参照赵翔等的方法测定嗜铁素。将粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11接种于MKB培养基中，28180rmin-1摇床培养48h；菌液离心，取上清液，以1:1的体积比加入CAS检测液，充分混匀。静止1h后，630nm处测吸光值（A），去离子水与CAS检测液等体积混合测得的Ar为对照，A/Ar代表样品中嗜铁素的相对含量，该值越低，表明嗜铁素含量越高。A/Ar0.5，可认为产嗜铁素能力较高。结果表明，粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11的A/Ar值为0.71，接近于0.5，说明其。

26、合成嗜铁素能力比较高。这样CGMCC NO.6290能通过产生和分泌对铁具有高亲和力的嗜铁素，溶解并结合土壤中的铁元素供植物细胞利用，增加铁营养，促进植物生长。0068 实施例5、CGMCC NO.6290在石油污染盐碱土壤环境下对燕麦的促生效应0069 用于CGMCC NO.6290对燕麦促生实验的盐碱土壤取于黑龙江省大庆市，采集样品时在每个区域内设置5个样方，样方面积为11m2，收集表层土壤（020cm），土壤混合后，装入事先准备好的干净保鲜袋中，迅速将土样带回实验室，土壤经碾碎，混匀，风干后过筛保存。供试土壤的理化性质见表1。0070 表1供试土壤理化性质0071 0072 CGMCC 。

27、NO.6290接种于TSB液体培养基中，28下振荡培养，4离心收集菌体，用无菌水洗涤离心2次后重悬浮于无菌水中，使活菌数在无菌水中的终浓度达109CFU/mL。0073 将燕麦种子用0.5%(V/V)次氯酸钠表面消毒10min后用无菌水洗涤，然后用CGMCC NO.6290的培养液浸种处理2h，使其附着在种子表面。0074 将CGMCC NO.6290处理2h的燕麦种子及不用CGMCC NO.6290处理的燕麦种子（CK），分别均匀种在混有石油的盐碱土（石油浓度为4.5g/kg干土）中，每盆10株，重复3次，于培养室内（25）培养，隔天浇水。3周后称量单株高，根长及5株植株鲜重及根鲜重。007。

28、5 外观对照如见图4所示，可以看见，经LJL-11处理后燕麦的长势明显好于未处理的对照。0076 所称量单株高、株鲜重、根长及根鲜重的对比数值的结果如表2所示。0077 结果表明粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11活菌对燕麦的株高具有显著的促进作用。测定经粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）LJL-11处理的燕麦，与对照相比，株高增加42.57%，植株鲜重/5株增加9.83%，根长增加10.22%，根鲜重/5株增加3.45%。结果见表2。0078 表2粘质沙雷氏菌LJL-11在石油污染盐碱土中对燕麦的促生效果0079 说 明 书CN 102816。

29、720 A6/6页8单株高（cm） 植株鲜重（g）/5株 根长（cm） 根鲜重（g）/5株CK 16.161.58b 0.610.07a 11.742.19b 0.290.09aLJL-11 23.040.29a 0.670.08a 12.940.61a 0.300.04a0080 注：表中字母表示在0.05水平上的显著差异0081 综上检测表明，CGMCC NO.6290其合成ACC脱氨酶，所以能够抑制植物体内ACC的合成，进而降低由于环境胁迫所导致植物体内乙烯的大量积累，从而提高其抗逆性；而且还能够合成吲哚乙酸和嗜铁素，从而能够帮助植物提供吲哚乙酸及促进铁元素的吸收，起到促植物生长的作用。因此，由于上述作用所具有的促植物生长的共性，所以该菌还能够作为一种广泛的促生菌应用于植物促生长当中。0082 更进一步，CGMCC NO.6290在对石油污染的石油污染盐碱土壤环境下对燕麦的促生效应表明，该菌可通过提高植物在胁迫环境下的抗逆能力的应用，从而应用于石油污染的土壤的植物修复；而且提高胁迫主要是通过降解胁迫环境下植物中ACC的累积，所以胁迫环境包括盐碱、干旱、金属、有机物污染等胁迫环境。说 明 书CN 102816720 A1/2页90001 0002 序 列 表CN 102816720 A2/2页10序 列 表CN 102816720 A10。