一种从牛血中提取多种蛋白的方法技术领域
本发明涉及牛血加工技术领域，具体而言，涉及一种从牛血中提
取多种蛋白的方法。
背景技术
目前，牛血加工技术主要指从牛血中提取各种蛋白的工艺，以提
供牛血的附加价值，提高其利用率。但现有的提取工艺效率低、提取
的蛋白品种少且提取成分的含量也低纯度不高，且存在滤液滤渣大量
丢弃的现象，大大地限制了对牛血的深加工和利用率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从牛血中提取多种蛋白的方法，此方
法能够从牛血液样品中逐一提取出多种蛋白质，且提取的纯度高，充
分挖掘了牛血液的潜在价值，提高了牛血液的利用率。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一种从牛血中提取多种蛋白的方法，其包括：
血液分离步骤：取新鲜牛血液，加入抗凝剂，分离，收集血细胞
和血浆；
血细胞提取步骤：血细胞经破碎、变性、压滤、纯化处理后分别
得到超氧化物歧化酶、血红素以及血球蛋白粉至少其中之一；
血浆提取步骤：血浆经压滤、纯化后分别得到纤维蛋白原、凝血
酶原、凝血酶、IgM、牛纤维连接蛋白、牛IgG以及血浆蛋白粉至少
其中之一。
本发明提供的一种从牛血中提取多种蛋白的方法的有益效果是：
相对于传统的提取工艺，本发明的牛血提取方法包括血液分离步骤、
血细胞提取步骤和血浆提取步骤，充分利用生物分离技术，按先分离
相近组分，再进行精细分离的原则，可以高效率地把牛血液中的超氧
化物歧化酶、血红素、纤维蛋白原、凝血酶原、凝血酶、IgM、牛纤
维连接蛋白、牛IgG逐一地高纯度地提取出来，并加工得到血球蛋白
粉和血浆蛋白粉等有效成分，充分挖掘血液的潜在价值，提高了牛血
液的利用率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中
所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发
明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通
技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图
获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例的从牛血中提取多种蛋白的方法的流程图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明
具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪
器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的从牛血中提取多种蛋白的方法进行具体
说明。
请参阅图1，本发明实施例提供的从牛血中提取多种蛋白的方
法，包括以下步骤。
S1：血液分离步骤
取新鲜牛血液，加入抗凝剂，通过血球分离机分离，并收集血细
胞和血浆。需要说明的，先处理血细胞时，可将血浆于-20℃冷冻保
存，若先处理血浆，则可将血细胞于-20℃冷冻保存。先处理血细胞
还是先处理血浆可根据实际情况选择。
其中，较佳地，抗凝剂为柠檬酸三钠。进一步地，按在血液中的
终浓度为3.6～4％的量加入柠檬酸三钠，防止牛血液凝固。
S2：血细胞提取步骤
血细胞经破碎、变性、压滤、纯化处理后可分别得到超氧化物歧
化酶、血红素以及血球蛋白粉至少其中之一。换句话说，血细胞提取
步骤包括超氧化物歧化酶提取步骤、血红素提取步骤和血球蛋白粉提
取步骤至少其中之一。以下对超氧化物歧化酶提取步骤、血红素提取
步骤和血球蛋白粉提取步骤进行具体说明。
(1)超氧化物歧化酶提取步骤
用超声波破碎血细胞(KQ-100型超声仪，功率100W、频率60K、
超声10分钟)，释放出胞内涵物，得到血细胞破碎液。往血细胞破
碎液中加入氯化铜和氯化锌，经热变性处理后、得到血细胞变性液。
压滤(型号SHXB-Z，压力0.2Mpa，两级过滤，第一级孔径为6μm、
第二级孔径为1.2μm，先过第一级再过第二级)血细胞变性液，收集
第一滤液和第一滤渣。用阴离子交换层析纯化第一滤液，收集超氧化
物歧化酶，即得到高纯度的超氧化物歧化酶。
其中，较佳地，按在血细胞破碎液中的终浓度为0.48～0.52％(质
量比)的量加入氯化铜和按终浓度为0.28～0.32％(质量比)的量加
入氯化锌。
其中，较佳地，热变性处理血细胞破碎液时，在72～77℃条件下
热处理血细胞破碎液30～35min。
(2)血红素提取步骤用水或者缓冲液溶解上述步骤中得到的第
一滤渣，调节pH至1.8～2.2，加入羧甲基纤维素钠，得到第一滤渣溶
解液。其中，羧甲基纤维素钠能够吸附血红素，利于血红素的纯化。
再压滤第一滤渣溶解液，收集第二滤液和第二滤渣。第二滤渣中
含有血红素，用水或缓冲液洗涤第二滤渣。收集洗涤后的残渣即为高
纯度的血红素，并收集洗涤第二滤渣后的洗涤液。
(3)血球蛋白粉提取步骤
喷雾干燥上述洗涤液和收集得到的第二滤液的混合液，即得到血
球蛋白粉。
需要说明的是，上述步骤可选择性地进行，例如，只进行超氧化
物歧化酶提取步骤，得到超氧化物歧化酶；或者只进行超氧化物歧化
酶提取步骤和血红素提取步骤，得到超氧化物歧化酶和血红素；当然，
也可以进行超氧化物歧化酶提取步骤、血红素提取步骤以及血球蛋白
粉提取步骤，得到超氧化物歧化酶、血红素和血球蛋白粉。
S3：血浆提取步骤
血浆经压滤、纯化后分别得到纤维蛋白原、凝血酶原、凝血酶、
牛IgM、牛纤维连接蛋白、牛IgG以及血浆蛋白粉至少其中之一。换
句话说，血浆提取步骤包括纤维蛋白原提取步骤、凝血酶原提取步骤、
凝血酶提取步骤、牛IgM和牛纤维连接蛋白提取步骤、牛IgG提取
步骤以及血浆蛋白粉提取步骤至少其中之一。以下对纤维蛋白原提取
步骤、凝血酶原提取步骤、凝血酶提取步骤、牛IgM和牛纤维连接
蛋白提取步骤、牛IgG提取步骤以及血浆蛋白粉提取步骤至少其中之
一进行具体说明。
(1)纤维蛋白原提取步骤
用浓度为0.85～0.9％(质量比)的氯化钠溶液稀释血浆，得到血
浆稀释液。可以理解的是，若是血浆被冷冻处理，应先融解冷冻的血
浆，再进行稀释操作。
压滤血浆稀释液，收集第三滤液和第三滤渣。第三滤渣中含有纤
维蛋白原，用水或缓冲液洗涤第三滤渣，收集洗涤后的残渣即为高纯
度的纤维蛋白原。
其中，较佳地，按体积比为4～6:1的量往血浆中加入氯化钠溶液。
(2)凝血酶原提取步骤
取部分第三滤液，并加入草酸钾和氯化钡，搅拌18～20min，使
其充分溶解。其中，较佳地，按在第三滤液中的终浓度为0.08～0.12％
(质量比)的量加入草酸钾和按0.18～0.22％的量加入氯化钡。
再压滤该部分第三滤液，收集第四滤液和第四滤渣，用pH6.8～7.2
的0.018～0.022M磷酸盐缓冲液溶解第四滤渣，得到第四滤渣溶解液。
用阴离子交换层析纯化(DEAE Beads 6FF，平衡用pH6.8～7.2的
0.018～0.022M磷酸盐缓冲液,洗脱用0.1-1mol/L NaCl和pH6.8～7.2的
0.018～0.022M磷酸盐缓冲液，再生用2mol/LNaCl)第四滤渣溶解液，
收集得到高纯度的凝血酶原。
质量比
(3)凝血酶提取步骤
往凝血酶原中加入氯化钙进行激活处理，得到激活后凝血酶原溶
液，再层析(SP Beads 6FF，平衡用pH5.2～6.0的0.018～0.022M磷酸
盐缓冲液，洗脱用0.1-1mol/L NaCl和pH5.2～6.0的0.018～0.022M磷
酸盐缓冲液，再生用2mol/LNaCl)该激活后凝血酶原溶液，收集得
到高纯度的凝血酶。
(4)牛IgM和牛纤维连接蛋白提取步骤
往第三滤液中加入终浓度为18～22％(质量比)硫酸铵，搅拌
18～20min，使其充分溶解。再压滤该另取的第三滤液，收集第五滤
液和第五滤渣。用pH5.0～5.5的0.008～0.012M醋酸盐缓冲液溶解第
五滤渣，得到第五滤渣溶解液。
然后用阳离子交换层析纯化(SP Beads 6FF，平衡用pH5.0～5.5
的0.018～0.022M醋酸盐缓冲液,洗脱用0.1-1mol/L NaCl和pH5.0～5.5
的0.018～0.022M醋酸盐缓冲液，再生用2mol/LNaCl)第五滤渣溶解
液，收集得到牛IgM和牛纤维连接蛋白。
其中，较佳地，按在第三滤液中的终浓度为20％的量加入酸铵。
(5)牛IgG提取步骤
往第三滤液中加入终浓度为33～37％(质量比)的硫酸铵，搅拌
18～22min，使其充分溶解。压滤该再另取的第三滤液，收集第六滤
液和第六滤渣。用pH6.8～7.2的0.008～0.012M的磷酸盐溶液溶解第
六滤渣，得到第六滤渣溶解液。
用阳离子交换层析纯化(SP Beads 6FF，平衡用pH6.8～7.2的
0.018～0.022M磷酸盐缓冲液，洗脱用0.1-1mol/L NaCl和pH6.8～7.2
的0.018～0.022M磷酸盐缓冲液，再生用2mol/LNaCl)第六滤渣溶解
液，收集得到牛IgG。
其中，较佳地，按在第三滤液中的终浓度为35％的量加入酸铵。
(6)血浆蛋白粉提取步骤
喷雾干燥第三滤液、第四滤液、第五滤液、第六滤液和第七滤液
的混合液，即得到血浆蛋白粉。
也需要说明的是，上述步骤可选择性地进行，例如，只进行纤维
蛋白原提取步骤，得到纤维蛋白原；或者只进行纤维蛋白原提取步骤
和凝血酶原提取步骤，得到纤维蛋白原和凝血酶原；或者只进行纤维
蛋白原提取步骤、凝血酶原提取步骤和凝血酶提取步骤，得到纤维蛋
白原、凝血酶原和凝血酶；或者只进行纤维蛋白原提取步骤、凝血酶
原提取步骤、凝血酶提取步骤、以及牛IgM和牛纤维连接蛋白提取
步骤，得到纤维蛋白原、凝血酶原提取步骤、凝血酶、牛IgM和牛
纤维连接蛋白；又或者上述步骤全部进行，即依次进行纤维蛋白原提
取步骤、凝血酶原提取步骤、凝血酶提取步骤、牛IgM和牛纤维连
接蛋白提取步骤、以及牛IgG提取步骤，得到纤维蛋白原、凝血酶原
提取步骤、凝血酶、牛IgM、牛纤维连接蛋白以及牛IgG。
本发明的从牛血提取多种蛋白的方法，充分利用生物分离技术，
尤其是压滤分离技术和离子交换层析技术，按先分离相近组分，再进
行精细分离的原则，先从血细胞中逐一分离出超氧化物歧化酶、血红
素等蛋白，并得到血球蛋白粉；然后从血浆中逐一分离出纤维蛋白原、
凝血酶原、凝血酶、牛IgM、纤维连接蛋白、牛IgG等蛋白，并得到
血浆蛋白粉。相对于传统的提取工艺，本发明的提取方法能够从一份
血液样品出提取出多种蛋白质，节约了原材料成本和时间，充分挖掘
血液的潜在价值，提高了牛血液的利用率。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
本实例以从牛血液中提取超氧化物歧化酶、血红素、纤维蛋白原、
凝血酶原、凝血酶、IgM、牛纤维连接蛋白、牛IgG、血球蛋白粉以
及血浆蛋白粉为例，详细说明本发明提供的从牛血中提取多种蛋白的
方法的操作过程。
首先，进行血液分离步骤。
取10L新鲜牛血液，加入柠檬酸三钠使其在牛血液中的终浓度
为3.8％抗凝。利用血球分离机分离得到5.0kg的血细胞和5.2L的血
浆。本实施例中，先处理血细胞，血浆于-20℃冷冻保存。
其次，从血细胞中依次提取超氧化物歧化酶、血红素，并得到血
球蛋白粉。其具体提取步骤如下。
(1)提取超氧化物歧化酶
用生理盐水洗涤血细胞后，再用超声波破碎仪对血细胞进行超声
波破碎，使其释放出胞内涵物，得到血细胞破碎液。
压滤血细胞破碎液，去除细胞碎片残渣，将去除细胞碎片残渣后
的血细胞破碎液转入反应釜中进行热处理，并加入终浓度为0.5％的
氯化铜和0.3％的氯化锌，升温至75℃，保温20min。
压滤热处理后的血细胞破碎液得到第一滤液和第一滤渣。
第一滤液用生理盐水稀释5陪即按4:1的体积比加入生理盐水到
第一滤液中，并调节其pH至7.6，用阴离子交换层析纯化稀释后的
第一滤液，洗脱后收集得到超氧化物歧化酶纯品200mg。
(2)提取血红素
用水或者缓冲液溶解上述步骤得到的第一滤渣，调节pH至2.0，
再加入羧甲基纤维素钠吸附，得到第一滤渣溶解液。
压滤第一滤渣溶解液，收集得到第二滤液和第二滤渣。
第二滤渣用酸性丙酮抽提，经回流后回收丙酮，浓缩物用稀碱溶
解后，得到血红素溶解液，调节血红素溶解液pH至4.0，再抽滤，
得血红素滤渣，用水洗涤该血红素滤渣，得高纯度的血红素50g。并
收集洗涤第二滤渣后的洗涤液。
(3)提取血球蛋白粉
喷雾干燥上述步骤得到的洗涤液和第二滤液的混合液，即得到血
球蛋白粉。
接着，从血浆中提取纤维蛋白原、凝血酶原、凝血酶、牛IgM、
牛纤维连接蛋白以及牛IgG。其具体提取步骤如下。
(4)提取纤维蛋白原
融解冷冻的血浆，取5L血浆，用浓度为0.9％的氯化钠溶液稀释
即按体积比为5:1的量加入氯化钠溶液到血浆中，得到血浆稀释液。
压滤血浆稀释液，收集得到第三滤液和第三滤渣，用水洗涤第三滤渣，
收集洗涤后的残渣即得到高纯度的纤维蛋白原。
(5)提取凝血酶原
往第三滤液中并加入终浓度为0.01％的草酸钾和0.2％的氯化钡，
搅拌20min，使其充分溶解，压滤，收集得到第四滤液和第四滤渣。
用pH7的0.02M磷酸盐缓冲液溶解第四滤渣，得到第四滤渣溶解液。
用阴离子交换层析纯化(DEAE Beads 6FF，平衡用pH7.0的0.02M
磷酸盐缓冲液,洗脱0.1-1mol/L NaCl和pH7.0 0.02M磷酸盐缓冲液，
再生利用2mol/L NaCl)第四滤渣溶解液，收集得到高纯度的凝血酶
原。
(6)提取凝血酶
往凝血酶原中加入0.05M氯化钙进行激活处理，得到激活后凝
血酶原溶液，再层析该激活后凝血酶原溶液，收集得到高纯度的凝血
酶50mg。
(7)提取牛IgM和牛纤维连接蛋白
往第三滤液中并加入终浓度为20％的硫酸铵，搅拌20min，使其
充分溶解，再压滤，收集得到第五滤液和第五滤渣。用pH5.0的0.01M
醋酸盐缓冲液溶解第五滤渣，得到第五滤渣溶解液。
用阳离子交换层析纯化(SP Beads 6FF，平衡用pH5.0的0.01M醋
酸盐缓冲液，洗脱用0.1-1mol/L NaCl和pH5.0的0.01M醋酸盐缓冲
液，再生用2mol/LNaCl)第五滤渣溶解液，收集得到牛IgM10g和牛
纤维连接蛋白1g。
(8)提取牛IgG
往第三滤液中加入终浓度为35％的硫酸铵，搅拌20min，使其充
分溶解。
压滤第三滤液，收集得到第六滤液和第六滤渣。用pH7的0.01M
的磷酸盐盐溶液溶解第六滤渣，得到第六滤渣溶解液。
用阳离子交换层析纯化(SP Beads 6FF，平衡用pH7.0的0.01M磷
酸盐缓冲液，洗脱用0.1-1mol/L NaCl和pH7.0的0.018～0.022M磷酸
盐缓冲液，再生用2mol/LNaCl)第六滤渣溶解液，收集得到牛IgG40g。
(9)提取血浆蛋白粉
喷雾干燥第三滤液、第四滤液、第五滤液和第六滤液的混合液，
即得到血浆蛋白粉。
需要说明的是，在其他的实施例中，上述步骤可以不用全部进行，
可以选择性进行。根据实际需求进行提取。
综上，本实施例的从牛血提取多种蛋白的方法，充分利用生物分
离技术，按先分离相近组分，再进行精细分离的原则，高效率地把牛
血液中的超氧化物歧化酶、血红素、纤维蛋白原、凝血酶原、凝血酶、
IgM、牛纤维连接蛋白、牛IgG逐一地高纯度地提取出来，并加工得
到血球蛋白粉和血浆蛋白粉等有效成分，其中每一步骤的滤液或滤渣
都能都得到利用，不会有废液或废渣的丢弃情况，其充分挖掘血液的
潜在价值，提高了牛血液的利用率。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，
对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本
发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应
包含在本发明的保护范围之内。