单细胞定位微孔膜及应用和单细胞自动化获取装置技术领域
本发明属于稀有细胞检测领域，具体涉及一种从细胞悬液中获取单个细胞
的微孔膜，及采用该微孔膜获取单个细胞的方法，还涉及一种单细胞自动化获
取装置。
背景技术
单细胞分析已成为生物医学研究的热点领域，它能够揭示异质性较大细胞
群体的分子特征，特别是一些数量极其稀少，却具有重要生物学功能或临床检
测意义的细胞，如人外周血中的循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、被病毒感染的
细胞，孕妇外周血中来自胎儿的有核红细胞，以及少量实体肿瘤样本中的肿瘤
干细胞等，对其的捕获和检测分析意义就更为重大了。但是如何可靠获取单个
细胞进行分析，尤其针对数目极少的稀有细胞，无疑是目前技术上的瓶颈。
这些稀有细胞在进一步分析之前往往需要加以富集，但即使在富集之后，
这些稀有细胞的数目仍然极少且存在一定量其他的干扰细胞，需要一种可靠且
自动化程度较高方法能够将这些珍贵的细胞一一取出并进行分析。
对单个细胞的操纵是属于对单细胞分析前的样本准备过程，要求将目标细
胞从背景样本中分离出来然后运送至指定位置或处于指定环境中以便于下一步
的单细胞分析。一个典型的应用场景是经过富集的循环肿瘤细胞样本中含有80
个循环肿瘤细胞，500个白细胞，其中循环肿瘤细胞与白细胞可以通过针对细胞
膜表面蛋白的免疫荧光染色来区分，为了从单细胞尺度上研究循环肿瘤细胞的
分子特征，需要将80个循环肿瘤细胞一一取出并分别进行细胞裂解、基因组扩
增以及靶基因的测序。
目前已有多种单细胞操纵的方法，常见的是通过显微操作仪、激光显微切
割或光镊来获取靶细胞，能够对少量细胞样本进行处理，但自动化程度低、操
作时间长，需要训练有素的操作人员且操作过程中细胞存在一定的损失率。流
式细胞仪是另一种常见的细胞分选设备，能够将细胞逐个分到比如96孔板中的
各个孔内，但这一技术的不足之处是其无法处理较少数目的细胞，难以对只含
有几百甚至几十个细胞的样本进行可靠的分选。
微流控芯片是一种操控微量液体流动的芯片技术，非常适用于微量液体生
物样本、少量细胞的操作与分析，且易于自动化并能够实现多项功能或模块的
整合。比如Fluidigm公司的C1TM单细胞自动前处理系统(Single-CellAutoPrep
System)，通过微流控芯片上设计精巧的几何结构将单个细胞滞留在指定位置从
而实现单细胞的捕获。每块芯片有96个捕获单元，当单个细胞被捕获后可以随
即进行芯片上的细胞裂解，核酸扩增等步骤，完成整个单细胞操纵与处理过程，
所获得的来自单细胞的核酸可转移至该公司的另一款设备进行分析以实现单细
胞的基因分析。但是，这一系统仍然不太适合极少数目细胞的操纵，原因在于
其操纵准确率低，从而靶细胞损失率较高，且无法处理混有除靶细胞以外其他
细胞的样本，同时用于分选单个细胞的微流控芯片价格昂贵。另一种对单个细
胞进行操纵的方式是在芯片外施加不均一的电场，从而将不同细胞移动至特定
位置，比如SiliconBiosystems公司的DEPArrayTM系统可以操纵可移动的介电泳
阱从细胞群体取出特定的单个细胞，虽然操纵准确，细胞损失率低，但其操作
时间较长，通量很低，且该系统价格极其昂贵，难以装备一般实验室，更加无
法应用于临床，普及性差。
综述所述，现有技术中用于单细胞操纵装置的优缺点汇总于表1。
表1
方法
稀有细胞样本
混有其他细胞
损失率
操作时间
自动化程度
价格
显微操作仪
是
可以
中等
长
低
中等
激光显微切割
是
可以
中等
长
低
高
Fluidigm C1TM
是
不可以
较高
短
高
高
DEPArrayTM
是
可以
低
长
较高
非常高
流式细胞仪
否
可以
高
短
高
高
发明内容
本发明提供了一种从细胞悬液中获取单个细胞的微孔膜，及采用该微孔膜
获取单个细胞的方法，用以解决传统稀有细胞检测中的单细胞提取准确度低，
损失率高，周期长的问题。
本发明还提供了一种单细胞自动化获取装置，用以解决目前获取装置自动
化程度低或设备成本过高，不利于普及的问题。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：所述单细胞定位微孔膜，
包括开设有若干通孔的多孔膜和覆盖所述通孔的滤膜，所述通孔内滤膜上设有
至少一个微孔，所述微孔直径为3-8μm，优选5μm，所述滤膜的厚度为0.5-2μm，
优选1μm。5微米的孔径小于绝大部分的稀有细胞，如血液中的循环肿瘤细胞、
循环内皮细胞，孕妇血液中的胎儿有核红细胞，以及胸腔积液、脑脊液等体液
中的游离肿瘤细胞，因此5微米的微孔可以截留细胞悬液中以上这些稀有细胞，
另外0.5-2μm厚度的滤膜一方面可以保证成功截留，另一方面在定位回收时可以
较容易戳破。
优选的是，所述多孔膜的材质为硅，所述滤膜的材质为氮化硅。氮化硅材
质较脆，既能保证细胞的承载，又容易被利器打破。
优选的是，所述多孔膜上通孔呈阵列分布，数量为10000-100000个。如果
细胞悬液中细胞的数目远小于滤膜上通孔的数目(超过10000个)，根据泊松分
布可知，在每个微孔上的基本都是单个细胞，阵列分布的通孔，坐标容易确定，
从而使落入通孔内的单细胞坐标确定，实现单细胞快速准确定位。
优选的是，所述多孔膜上的通孔直径为20-100μm，优选70μm。多孔膜的
直径，一方面要能够在单位面积中容纳尽量多的孔，另一方面要保证后续破除
滤膜时，机械器件可以戳破膜的通知不会碰到其中的细胞。
本发明还提供了采用上述单细胞定位微孔膜进行单细胞定性并获取的方
法，其包括如下步骤：
1)将样品施于所述单细胞定位微孔膜上，样品中细胞落入所述通孔内，被
所述滤膜截留，至此各个细胞坐标通过通孔位置得以确定；
2)通过显微镜明场成像或荧光素标记细胞并成像确定各通孔内细胞类别，
从而确定了目标细胞位置；
3)将容器置于所述单细胞定位微孔膜下方，排除目标细胞所处通孔内滤膜
的阻挡，使其落入所述容器内，完成目标细胞的收集。
细胞悬液中截留的稀有细胞，可以通过显微镜的明场成像观察到，如果细
胞悬液中还存在其他种类的细胞，可以在滤膜上直接通过针对细胞膜表面特异
性蛋白的免疫荧光染色将不同种类区分开。比如，细胞悬液中同时存在非小细
胞肺癌的肿瘤细胞和白细胞，这些细胞在被滤膜截留后，可以用FITC荧光素标
记的白细胞抗原CD45的抗体(显微镜下为绿色)，以及APC荧光素标记的上皮
标志物EpCAM和EGFR的抗体(显微镜下为红色)来对细胞进行染色，然后
在显微镜下将显示较强红色荧光、不显示绿色荧光的细胞认定为肿瘤细胞，将
显示较强绿色荧光、不显示红色荧光的细胞认定为白细胞。
优选的是，所述目标细胞为血液中的循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、胎儿
有核红细胞、体液中的游离肿瘤细胞和/或白细胞。
优选的是，所述容器收集到目标细胞后进一步在其中进行细胞裂解和单细
胞全基因组放大。经过简单处理后可用于后续的目的基因扩增，进行一系列检
测。
本发明还提供了一种单细胞自动化获取装置，包括支架、设置在支架上的
破膜机构、位于所述破膜机构下方的第一平台和设置在所述破膜机构和所述第
一平台之间的第二平台，所述第一平台和第二平台在XY向平面平移，所述破
膜机构在Z向竖直运动，所述第一平台上设置容器，所述第二平台上设置上述
单细胞定位微孔膜。
优选的是，所述容器为微孔板。比如96孔板或384孔板。
优选的是，所述破膜机构的运动精度为0.1-10μm，优选5μm，所述第二平
台的运动精度为0.1-5μm，优选1μm，所述第一平台的运动精度为0.1-10μm，优
选5μm。
优选的是，所述单细胞自动化获取装置还包括显微镜。
优选的是，所述破膜机构包括第三平台和固定在第三平台上破膜针，所述
第三平台沿Z向运动。
本发明提供的技术方案中细胞悬液中的单细胞落入单细胞定位微孔膜中的
各通孔中，而又被滤膜截获，对各通孔中单细胞进行鉴别，其中目标细胞因通
孔可寻址从而完成定位，然后将目标细胞所处通孔移至收纳容器上方，将滤膜
刺破，目标细胞落入容器内。该微孔膜、方法和装置可准确、可靠、自动完成
目标单细胞获取，能够处理极少数目细胞的样本，能够实现极低的靶细胞损失
率，能够实现自动化操作，同时装置的成本明显低于其他现有设备。
附图说明
图1是本发明所述单细胞自动化获取装置一具体实施方式的结构示意图；
图2是本发明所述单细胞定位微孔膜一具体实施方式的结构示意图；
图3是本发明所述多孔膜和滤膜一具体实施方式的结构示意图；
图4a和图4b是本发明所述单细胞定位微孔膜工作过程显微镜图；
图5a和图5b是本发明所述单细胞定位微孔膜获取目标细胞的过程示意图。
图中所示：1-支架，21-第三平台，22-破膜针，31-第一平台，32-384孔板，
41-第二平台，42-单细胞定位微孔膜，421-多孔膜，422-滤膜，423-通孔，424-
微孔，5-显微镜，6-目标细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说
明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方
法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1单细胞自动化获取装置
如图1所示，所述单细胞自动化获取装置包括支架1、设置在支架1上的破
膜机构、位于所述破膜机构2下方的第一平台31和设置在所述破膜机构、所述
第一平台31之间的第二平台41和显微镜5，所述破膜机构2包括第三平台21
和固定在第三平台21上破膜针22，所述第一平台31上设置容器-384孔板32，
所述第二平台41上设置单细胞定位微孔膜42。
所述第一平台31在电机驱动下可沿X向和Y向运动，行程为10cm，精度
为5μm，所述第二平台41在电机驱动下可沿X向和Y向运动，行程为10cm，
精度为1μm，所述第三平台21在电机驱动下可沿Z向运动，行程为5cm，精度
为5μm。
如图2和3所示，上述单细胞定位微孔膜42包括两层，一层为多孔膜421，
另一层为滤膜422，所述孔膜421上开设有阵列分布的约10000个通孔423，所
述通孔423内滤膜422设有一个微孔424，所述通孔423直径为70μm，深度为
50μm，所述滤膜422的厚度为1μm，所述微孔424直径为5μm。
所述多孔膜421的材质为硅，所述滤膜422的材质为氮化硅。
实施例2应用试验-单细胞回收与测序实验
将100个非小细胞肺癌细胞H1975用染料VybrantDiI(LifeTehnologies)
染色后与1000个未染色的白细胞混合并用磷酸盐缓冲液稀释至1毫升，制成样
品细胞悬液，采用实施例1的单细胞自动化获取装置捕获其中目标细胞6即
H1975细胞，以此样品阐述其工作原理和过程。
将样品细胞悬液施于所述单细胞定位微孔膜42上，由于重力液体流出而细
胞被截留在微孔424上。由于细胞悬液中细胞的数目远小于通孔423的数目，
根据泊松分布可知，如图4a所示，在每个通孔423内的基本都是单个细胞，细
胞位于微孔424上，用荧光显微镜可以识别并记录H1975细胞的位置。如图5a
所示，电机驱动所述第二平台41做水平运动，将H1975细胞所处的通孔423置
于所述破膜针22的正下方，其中破膜针22对准了靠近通孔423边缘的位置，
同时电机驱动所述第一平台31，将希望获取目标细胞6的孔移至破膜针22正下
方，对准单细胞定位微孔膜42上H1975细胞所在的通孔423处。然后，如图
5b所示，电机驱动所述第三平台21沿Z向向下运动，固定在第三平台21上的
破膜针22冲击多孔膜421底部的具有机械脆性的滤膜422，使其碎裂，滤膜422
和其上的目标细胞6一起落入下方的384孔板32的孔中，从而实现单细胞回收，
此时如图4b所示，单细胞定位微孔膜42的通孔423处已无滤膜422和目标细
胞6。
循环操作以上步骤，可将单细胞定位微孔膜42上截获的各种类型单细胞回
收人384孔板的各个可寻址的孔内，然后分别进行后续处理检测和分析。
为证实该方法的可行性，对回收的目标细胞6进行如下后续处理。
384孔板的孔中事先添加了4微升磷酸缓冲液。然后采用REPLI-gSingleCell
Kit(Qiagen，USA)试剂盒将目标细胞6裂解与全基因组进行放大。具体步骤
为，在含有目标细胞6的孔中加入3微升变性液65℃高温孵育10分钟后，加入
3微升终止缓冲液终止变性。然后，依次加入29微升反应液、2微升phi29DNA
聚合酶，并补水至体积50微升，30度反应8小时，最后65℃高温继续反应3
分钟使酶失活，终止整个放大过程。酚氯仿乙醇沉淀进行提纯后用于后续的目
的基因扩增。
我们检测EGFR基因20外显子中的L858R突变以及21外显子中的T790M
突变，使用的引物为：
EGFR20F(CTTTATCCAATGTGCTCCTC)
EGFR20R(TCTCCCTTCCCTGATTACCT)
EGFR21F(TTCGCCAGCCATAAGTCCT)
EGFR21R(TCATTCACTGTCCCAGCAAG)；
选择退火温度59℃，30个循环。实验结果显示，所回收的目标细胞6成功
扩增出EGFR基因的20、21外显子，并通过Sanger测序检测到目标细胞6具有
L858R和T790M突变，从而证明了该技术的可行性。