5-羟基色氨酸提纯方法及所获得的5-羟基色氨酸药物技术领域
本发明属于药物提纯领域，尤其是涉及5-羟基色氨酸提纯方法及所获得的5-羟基色氨酸药物。
背景技术
加纳籽为豆科灌木植物Griffonia simplicifolia的种子，Griffonia simplicifolia 是一种生长在加纳、象牙海岸和多哥等西非国家的药用植物。该植物种籽中5-羟基色氨酸活性物质含量最高达13％，是提取5-羟基色氨酸的天然原料。
5-羟基色氨酸，化合物名为5-Hydroxy-L-tryptophan，分子式为C11H12N2O3，是5-羟色氨的前身，在脱羧酶的作用下生成5-羟色氨，增加脑细胞的血清素制造量，进而提升5-羟色氨的含量。其合成及发生变化的机理如下：
5-羟色氨像多巴胺和去甲肾上腺素一样是中枢神经系统中重要的神经递质和自身调节物质，在神经组织中有重要的功能。5-羟基色氨酸通过在体内转化为5-羟色氨发生生理作用，目前已知5-羟基色氨酸具有改善睡眠、抗忧郁、减肥、缓和经前综合症（PMS）等作用。
1989年美国发生了一种患者外周血嗜酸粒细胞增多，病期全身肌肉疼痛以致不能从事日常活动的怪病，后来美国疾病控制与预防中心确认此病为：嗜酸粒细胞增多-肌痛综合征(EMS)，并且证实此病的发生是由于患者服用的产品中含有4,5-色氨酸-二酮有害物质引起的。此后4,5-色氨酸-二酮被公认为一种神经毒素物质，需要从所有色氨酸和5-羟基色氨酸产品排除4,5-色氨酸-二酮。4,5-色氨酸-二酮化合物名为4,5-tryptophan-dione，分子式为C11H11N2O4。
在现有技术制备5-羟基色氨酸的分离提纯过程中，如果条件控制不当的话，在高温下料液中的氧化物会与5-羟基色氨酸发生反应产生4,5-色氨酸-二酮有害物质，因此开发一种不产生4,5-色氨酸-二酮有害物质的5-羟基色氨酸提纯方法具有重要意义。
目前，已有多项关于加纳籽中5-羟基色氨酸提纯方法的发明专利，如发明专利号为200410067198.1的中国发明专利《一种高纯度5-羟基色氨酸的制备方法》中以超临界萃取脱油方法和膜分离技术分离提纯5-羟基色氨酸，产品纯度在99%以上，最终产品的回收率达60～70%。如中国发明专利申请号为200910306408.0关于《一种从加纳籽中提取并制备高纯度五羟基色氨酸的生产工艺》中以非洲产加纳籽为原料，超临界萃取除油，除油后物料再用水或醇类溶剂或水与醇类溶剂的混合溶液提取3-5次，合并渗滤液，微滤、超滤，经离子交换树脂吸附，洗脱，真空浓缩，低温结晶，离心分离，微波干燥后得到高纯度五羟基色氨酸干粉。上述两种方法仅考虑产品的收率和5-羟基色氨酸的纯度，对其所含有害物质4,5-色氨酸-二酮基本没有考虑。
中国发明专利申请号为201110120632.8的《一种控制色氨酸中4,5-色氨酸-二酮产生的工艺》在浓缩、结晶过程中采用充入氮气和冷冻干燥的方法来抑制4,5-色氨酸-二酮的产生。此方法采用充入氮气和冷冻干燥具有生产成本高，不适宜规模化生产的特点，而且对4,5-色氨酸-二酮有害物质产生的主要阶段——提取工序阶段没有考虑，仅通过浓缩和结晶手段控制有害物质的产生，没有全过程控制4,5-色氨酸-二酮的产生，具有控制不严格和存在漏洞的缺陷，给有害物质的产生留下了机会。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于：提供5-羟基色氨酸的提纯方法，以克服现有技术提纯方法不能彻底控制有害物质4,5-色氨酸-二酮的产生，提纯方法成本高等问题，而提供一种常温提纯、能耗低，全程控制有害物质4,5-色氨酸-二酮的产生的提纯方法。
本发明要解决的另一技术问题在于：提供一种5-羟基色氨酸药物，其按当前检测技术方式，未检测到有害物质4,5-色氨酸-二酮。
为解决上述技术问题，本发明的采取的技术方案是：提供5-羟基色氨酸提纯方法，主要包括以下步骤：
步骤1：加纳籽原料脱皮，脱皮后加入去离子水在常温下进行渗漏提取，获得加纳籽提取液；
步骤2：提取液用酸调剂pH值，用脱色剂进行脱色，获得加纳籽脱色液；
步骤3：脱色后的脱色液用有机膜在常温下进行浓缩，获得浓缩液；
步骤4：浓缩液结晶，结晶体离心分离；
步骤5：结晶体干燥获得5-羟基色氨酸药物。
所述步骤1中，脱皮后的原料移入渗滤器中，并确定加纳籽原料装填在渗滤器中所占的体积BV，加入去离子水，在20~25℃，进行渗漏提取。
进一步地，所述步骤1中，渗漏提取的渗漏速度为0.5BV~0.625BV /小时，渗漏时间为20~25小时。所述BV是指加纳籽原料装填在渗滤器中所占的体积，下述含义相同。
所述步骤2中调至pH值小于5。
进一步地，所述步骤2中，所述酸为选自盐酸或醋酸中的一种或二种；所述加纳籽提取液用酸调至pH值为3~5；所述脱色剂选自大孔吸附树脂、活性炭、白土、碱性氧化铝中的一种或多种。
所述步骤3中，是先将步骤2所得加纳籽脱色液用板框过滤后，再用膜设备进行浓缩。
进一步地，步骤3中，所述有机膜设备为纳滤膜或反渗透膜进行膜浓缩；膜浓缩的截留相对分子量为100~500；浓缩至相对密度为1.1~1.4g/cm3之间。
所述步骤4中，是将步骤3所得浓缩液置于5~10℃下静置结晶；所得结晶体用三足式离心机离心分离获得5-羟基色氨酸湿晶体。
所述步骤5中，优选地，所述干燥为真空干燥。所述干燥的条件为：温度40~50℃，压强为10~50mmHg；干燥时间为12~16小时。
为解决上述技术问题，本发明采取的另一技术方案是：提供一种5-羟基色氨酸药物，其中所含5-羟基色氨酸药物质量百分含量大于99%，5-色氨酸-二酮质量百分含量低于5×10-5%。
本发明的有益效果：本发明的提纯方法为常温提纯，具有操作简单，能耗低，不使用有机溶剂，适合工业化生产。
通过此提纯方法获得的5-羟基色氨酸药物产品，其5-羟基色氨酸纯度大于99%，灰分含量小于0.1%，干燥失重低于0.5%，未检测到4,5-色氨酸-二酮有害物质。灰分是指不含4,5-色氨酸-二酮的固体无机物的含量。本发明提纯方法获得的5-羟基色氨酸活性物质的回收率为70~80%。
附图说明
图1为本发明提纯方法的工艺流程图。
具体实施方式
请同时参照图1，本发明提供一种控制不产生4,5-色氨酸-二酮有害物质的5-羟基色氨酸提纯方法，所述提纯方法主要包括以下步骤：加纳籽原料用脱皮机脱皮，脱皮后的原料装入渗滤器中，加入去离子水在常温下进行渗漏提取；提取液用酸调剂pH值，用适当的脱色剂进行脱色；脱色后的脱色液用有机膜在常温下进行浓缩；浓缩液结晶，结晶体离心分离；结晶体干燥获得5-羟基色氨酸药物。所述提纯方法控制4,5-色氨酸-二酮产生的关键在于原料脱皮，降低提取液中与5-羟基色氨酸反应的氧化物；提取、浓缩的过程为常温，通过控制温度抑制料液的氧化物与5-羟基色氨酸发生氧化反应产生4,5-色氨酸-二酮；提取溶剂为去离子水，因为溶剂中的离子会加速氧化反应。通过这些手段可以达到在5-羟基色氨酸分离纯化过程中控制4,5-色氨酸-二酮有害物质的产生。
进一步地，本发明的5-羟基色氨酸提纯方法，包括下列步骤：
步骤1：将加纳籽原料用脱皮机脱皮，脱皮后的原料移入渗滤器中并确定加纳籽原料装填在渗滤器中所占的体积BV，加入去离子水在常温下，如20~25℃，进行渗漏提取，获得加纳籽提取液。
步骤2：将步骤1所得加纳籽提取液用酸调至pH值小于5，加入脱色剂，获得加纳籽脱色液。
步骤3：将步骤2所得加纳籽脱色液用板框过滤后，用膜设备在常温下，如20~25℃，进行浓缩，浓缩至相对密度为1.1~1.4g/cm3之间（常温（20~25℃）下测定），获得浓缩液。
步骤4：将步骤3所得浓缩液置于5~10℃下静置结晶，结晶体离心分离获得5-羟基色氨酸湿晶体。
步骤5：将步骤4所得5-羟基色氨酸湿晶体干燥获得5-羟基色氨酸产品，所述干燥优选为真空干燥。
其中，在步骤1中，原料脱皮非常关键，皮中虽然不含有5-羟基色氨酸活性物质，但是含有大量的氧化物质，这些物质可以被水、有机溶剂提取出来，在一定的温度条件下与5-羟基色氨酸发生氧化反应，产生有害物质4,5-色氨酸-二酮。通过对原料进行脱皮，去掉其所含氧化物质，从而可以避免或者大大减少提取液中与5-羟基色氨酸反应的氧化物。所述的去离子水是经离子交换树脂处理、反渗透膜过滤和紫外杀菌处理后获得的水。因为溶剂中的离子会加速氧化反应，因此采取去离子水以避免5-羟基色氨酸被氧化生成有害物质4,5-色氨酸-二酮。所述的渗漏提取的渗漏速度为0.5BV~0.625BV/小时，渗漏提取的温度为常温，如20~25℃，渗漏时间为20~25小时。本步骤在常温下操作，也是控制5-羟基色氨酸氧化生成有害物质4,5-色氨酸-二酮。
步骤2中，所述酸可以为盐酸或醋酸，也可为其它酸或多种酸复用。所述加纳籽提取液用酸调至pH值优选为3~5。所述脱色剂为大孔吸附树脂、活性炭、白土、碱性氧化铝等。
步骤3中，所述有机膜设备为纳滤膜或反渗透膜，膜浓缩的温度为常温，如20~25℃，纳滤膜的截留相对分子量为100~500。本步骤先通过板框过滤后再进行膜过滤，具有较高的过滤精度。浓缩的过程为常温，通过控制温度抑制料液的氧化物与5-羟基色氨酸发生氧化反应产生4,5-色氨酸-二酮。
步骤5中，所述真空干燥的条件为：温度40~50℃，压强为10~50mmHg，干燥时间为12~16小时。
实施本发明所获得产品经检测分析5-羟基色氨酸质量含量大于99%，灰分质量含量低于0.1%，干燥失重低于0.5%wt，4,5-色氨酸-二酮未检测到，这里所指灰分是指不含4,5-色氨酸-二酮的固体无机物的含量。4,5-色氨酸-二酮检测方法的所用仪器检测下限为5×10-5%。
由以上检测结果可知，本发明提纯方法获得的5-羟基色氨酸药物，其中所含5-羟基色氨酸质量百分含量大于99%，所含4,5-色氨酸-二酮有害物质的质量百分含量低于5×10-5%。进一步地，本发明提纯方法获得的5-羟基色氨酸药物，灰分含量低于0.1%，干燥失重低于0.5%。
本技术方案通过先对原料脱皮，去掉皮中所含能在提取液中与5-羟基色氨酸反应的氧化物；提取、浓缩的过程为常温（如20~25℃），为实现常温提取，采用在不加热条件下，用去离子水进行渗漏提取的方式进行提取；同时采用有机膜的方式对料液进行浓缩，这样可以保证浓缩时料液的温度控制在常温的条件下。通过上述手段，可以确保，提取、浓缩工序的温度为常温，这样确保通过控制温度来抑制料液中的氧化物与5-羟基色氨酸发生氧化反应产生4,5-色氨酸-二酮有害物质；同时所使用的提取溶剂为去离子水，消除溶剂中的离子促进5-羟基色氨酸的氧化反应，通过这些手段可以达到在5-羟基色氨酸分离纯化全过程中控制4,5-色氨酸-二酮有害物质的产生。
以下通过具体操作实例来进一步阐述本发明的提纯方法以及所获得的药物产品，但并不作为本发明要求保护的范围的限定。
实例1
本实例涉及的一种抑制4,5-色氨酸-二酮有害物质产生的5-羟基色氨酸提纯方法，其步骤为：
1、将加纳籽原料（5-羟基色氨酸活性物质含量为11.75%）用脱皮机脱皮，脱皮后的加纳籽颗粒大小为0.2厘米左右，将脱皮的500公斤加纳籽原料移入2立方米的渗滤器中，此时加纳籽原料的装填体积为600L，装完原料后，上面盖上纱布，并压上一层洗净的石子；以免加入去离子水后使原料浮起。加入适量的去离子水，使去离子水的液面高度高出原料5厘米左右，去离子水加到合适的液面后浸润2~4小时，使加纳籽原料吸水充分膨胀，然后打开渗滤器下口的开关，使渗漉液缓缓流出，保持渗漏液体流出的速度和去离子水流入渗漏器的速度一致，渗漏液流出的速度为0.5BV/小时，保持此速度收集渗漏液，渗漏时间为25小时，最后收集的渗漏提取液体积为7500L。
2、将步骤1所得加纳籽提取液用盐酸调至pH值为3.5，加入3kg活性炭搅拌均匀后进行脱色，获得加纳籽脱色液。
3、将步骤2所得加纳籽脱色液用板框过滤后，用截留相对分子量为100的有机膜设备进行浓缩，浓缩至相对密度为1.1g/cm3（常温下测定），获得浓缩液。
4、将步骤3所得浓缩液置于10℃下静置结晶，静置时间为16小时，结晶体用三足式离心机离心分离获得5-羟基色氨酸湿晶体。
5、5-羟基色氨酸湿晶体于40℃，10mmHg压力条件下干燥16小时获得45.5 kg 5-羟基色氨酸产品。
本发明获得的产品通过高效液相色谱仪检测分析5-羟基色氨酸和4,5-色氨酸-二酮的含量。灰分检测采用2010 年版《中华人民共和国药典》( 1部) 附录Ⅸ K灰分测定法中规定依法测定。干燥失重检测采用2010年版《中国人民共和国药典》（2部）附录Ⅷ L 干燥失重测定法中规定依法测定。
其中，5-羟基色氨酸含量检测方法具体为：
1 仪器与试剂
1.1 仪器
Waters1525 高效液相色谱仪，Waters2487双波长紫外检测器，Waters515二元泵，Sartoriμs BS110S电子天平。
1.2 药品与试剂
甲醇：HPLC级（中国医药集团上海化学试剂公司）
乙酸：分析纯（广东汕头市西陇化工厂）
超纯水：Millipore公司
5-羟基色氨酸对照品：sigma公司（纯度99.5％）
2.色谱条件
流动相：甲醇/水＝10/90（内含0.1%的乙酸）等梯度洗脱
色谱柱：Symmetry，C18，5μm，150*4.6mm
检测波长：入＝254nm
流速：1.0ml/min
进样量：10μl
运行时间：10分钟
保留时间：约4.5分钟
3. 标准溶液的配制
3.1 精确称取50mg标准品于100ml干燥的容量瓶中，加入90ml水，超声溶解30分钟，冷却至室温，用水定容；
3.2 取标准品溶液2ml，过0.45μm滤膜，备用（C0）；
3.3 用微量进样器吸取10μl过滤液注入HPLC，记录峰面积（Ａ0）；
4 样品溶液的配制
4.1 精确称取20mg待测样品于100ml容量瓶中，加90ml水，超声30分钟使完全溶解，冷却至室温，加水定容；
4.2 取原料提取液或配制的样品溶液2ml，过0.45μm滤膜，备用（C1）；
4.3 用微量进样器吸取10μl过滤液注入HPLC，记录峰面积（A1）；
按下列公式计算待测样品5-羟基色氨酸的含量：
5-羟基色氨酸%=(A1*C0/A0*C1)*99.5%*100%
C0：对照品的称样浓度 C1：待测样品的称样浓度
A0：对照品的峰面积 A1：待测样品的峰面积。
4,5-色氨酸-二酮含量具体检测方法如参考文献：Klaμs Klarskov, Kenneth L Johnson, Linda M Benson, Jennifer D Cragμn, Gerald J Gleich, Monika Wrona, Xiang-Rong Jiang, Glenn Dryhμrst, and Stephen Naylor. Strμctμral characterization of a case-implicated contaminant, "Peak X," in commercial preparations of 5-hydroxytryptophan. [J]The Joμrnal of Rheμmatology Janμary 1, 2003;30(1):89-95。该方法的检测下限为5×10-5%。
本提纯方法具有操作简单，能耗低，不使用有机溶剂，适合工业化生产。通过此提纯方法获得的5-羟基色氨酸药物，其中5-羟基色氨酸质量百分含量为99.2%，灰分含量为0.07%，干燥失重为0.35%，未检测到4,5-色氨酸-二酮有害物质。根据4,5-色氨酸-二酮检测方法的仪器检测下限为5×10-5%，可以确定本发明的提纯方法获得的5-羟基色氨酸药物中所含4,5-色氨酸-二酮低于5×10-5%。其中，所述灰分是指不含4,5-色氨酸-二酮的固体无机物的含量。本实例提纯的5-羟基色氨酸活性物质的回收率为76.8%。
实例2
本实例涉及的一种抑制4,5-色氨酸-二酮有害物质的5-羟基色氨酸提纯方法，其步骤为：
1、将加纳籽原料（5-羟基色氨酸活性物质含量为11.75%）用用脱皮机脱皮，脱皮后的加纳籽颗粒大小为0.2厘米左右，将脱皮的300公斤加纳籽原料移入1立方米的渗滤器中，此时加纳籽原料的装填体积为360L，装完原料后，上面盖上纱布，并压上一层洗净的石子；以免加入去离子水后使原料浮起。加入适量的去离子水，使去离子水的液面高度高出原料5厘米左右，去离子水加到合适的液面后浸润2~4小时，使加纳籽原料吸水充分膨胀，然后打开渗滤器下口的开关，使渗漉液缓缓流出，保持渗漏液体流出的速度和去离子水流入渗漏器的速度一致，渗漏液流出的速度为0.625BV/小时，保持此速度收集渗漏液，渗漏时间为20小时，最后收集的渗漏提取液体积为4500L。
2、将步骤1所得加纳籽提取液用醋酸调至pH值为4.5，将该液体以3.0BV/小时的流速通过以D101大孔吸附树脂为填料的层析柱（层析柱直径35cm，高度350cm），然后用500L去离子水洗涤树脂，收集所有的流出液体，获得加纳籽脱色液。
3、将步骤2所得加纳籽脱色液先用板框过滤，再用反渗透膜设备进行浓缩，浓缩至相对密度为1.3g/cm3（常温下测定），获得浓缩液。
4、将步骤3所得浓缩液置于5℃下静置结晶，静置时间为12小时，晶体用三足式离心机离心分离获得5-羟基色氨酸湿晶体。
5、5-羟基色氨酸湿晶体于50℃，40mmHg压力条件下干燥12小时获得25.6公斤5-羟基色氨酸产品。
按实例1的检测方法对获得的药物产品检测分析，结果为：5-羟基色氨酸质量含量为99.1%，灰分含量为0.08%，干燥失重为0.39%，4,5-色氨酸-二酮未检测到。本实例提纯的5-羟基色氨酸活性物质的回收率为72.0%。