普罗威登斯菌PROVIDENCIASP．2D在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用.pdf

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体公开了普罗威登斯菌（Providencia sp.）2D在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用，所述普罗威登斯菌Providencia sp.2D于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M2015057。该菌株在72h对高浓度的DBP（1000mg/L）降解效率超过80%，对低浓度的DBP（200mg/L）几乎完全降解；该菌株还能够降解DBP的中间产物邻苯二甲酸；该菌还可降解污染土壤中的DBP，因此可用于改良修复DBP污染土壤，本发明所述应用对环境中DBP的治理具有实际的意义。

1.  普罗威登斯菌(Providencia sp. )2D在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用，其特征在于，该菌于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2015057。

2.   普罗威登斯菌Providencia sp. 2D在降解邻苯二甲酸中的应用，其特征在于，该菌于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2015057。

3.   普罗威登斯菌Providencia sp. 2D在制备降解邻苯二甲酸二丁酯或/和邻苯二甲酸的制剂中的应用，其特征在于，该菌于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2015057。

4.   根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，将普罗威登斯菌Providencia sp. 2D活化后制得的菌悬液接入受邻苯二甲酸二丁酯污染的介质中。

5.   根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述介质为水、土壤。

6.   一种降解邻苯二甲酸二丁酯的生物菌剂，其特征在于，包括普罗威登斯菌Providencia sp. 2D，该菌于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2015057。

7.   根据权利要求6所述的生物菌剂，其特征在于，还包括动物粪堆肥。

普罗威登斯菌(Providencia sp.)2D在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用
技术领域
 本发明涉及环境污染物生物处理技术领域，更具体地，涉及普罗威登斯菌(Providencia sp. )2D在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用。
背景技术
邻苯二甲酸二丁酯（di-n-butylphthalate，DBP）属于邻苯二甲酸酯类化合物（Phthalic acidester，PAEs），是塑料工业最主要的增塑剂之一，也是农药、染料去污剂的载体以及诸多化妆品、纺织品的生产原料，广泛用于食品包装材料、容器、医疗器械以及儿童玩具等领域。由于上述制品的大量应用，DBP已经成为全球性的有机污染物，广泛存在于大气、水体、土壤以及生物体中。特别是在农业生产中，由于塑料薄膜和塑料大棚的广泛应用，残留在农业土壤中DBP极易通过食物链在人体中富集。DBP 及其代谢物能够对机体造成生殖毒性、发育毒性、神经毒性、多器官癌变等多种损伤，因此美国环保署（EPA）和中国国家环境监测中心（CNEMC）都已将它列为优先控制污染物。
研究表明，DBP的水解和光解速率都非常缓慢，生物降解是其在环境中分解的主要途径。因此，获得DBP高效降解菌是提高其生物降解效率的重要环节。利用微生物降解作用，将DBP转化为无害物质或完全矿化，是公认的去除环境中DBP污染的最佳手段。由于环境中DBP的普遍存在，DBP降解菌的出现频率也很高，目前对DBP有降解作用的微生物大多数为戈登氏菌属、农杆菌属、不动杆菌属和赤红球菌属等，但已报道的这些细菌对于DBP的生物降解不完全，会产生毒性更高的中间代谢产物，或者其降解速率还不能满足实际污染控制的要求，因此仍需筛选更加高效的专性或兼性降解菌。
在农业生产中，土壤的DBP污染已经得到人们广泛关注。DBP污染土壤的微生物修复技术中需要解决的首要问题是高效降解菌株的筛选与构建。普罗威登斯菌属（Providencia）是堆肥中广泛存在的一类细菌，目前尚无关于其降解PAEs的报道。另外，堆肥在改善土壤结构和保护农业生态环境方面具有高效、环保和低成本等优势，结合筛选获得的高效降解菌，对降低农业土壤环境中DBP污染具有十分广泛的应用前景。
发明内容
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供普罗威登斯菌（Providencia sp.）2D在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用。
本发明的第二个目的是提供普罗威登斯菌（Providencia sp.）2D在制备降解邻苯二甲酸二丁酯的制剂中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种降解邻苯二甲酸二丁酯的生物菌剂。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
普罗威登斯菌(Providencia sp. )2D在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用，该菌于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2015057，保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学。
本发明从动物粪堆肥中分离筛选获得一株对DBP具有高效、完全降解性能的普罗威登斯菌，命名为Providencia sp. 2D，所述菌株Providencia sp. 2D通过富集培养法从农场动物粪堆肥样品中富集获得，该菌的最适生长条件为：温度30～40℃，pH为7.0～8.5。
所述菌株Providencia sp. 2D在牛肉膏蛋白胨培养基（LB）上（酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，pH= 7.0）划线培养7天，菌落呈橘黄色，质地膏状，丰厚湿润，易被挑起，边缘较薄；扫描电子显微镜下呈长杆状，长约1.5～3.0 μm，宽约0.5～0.8μm；经革兰氏染色鉴定该菌为革兰氏阴性菌。
所述菌株Providencia sp. 2D的生理生化鉴定实验结果如下：甲基红试验（阳性）、V-P试验（阴性）、吲哚反应（阳性）、柠檬酸盐利用（阳性）、肌醇产酸试验（阳性）、葡萄糖产酸试验（阳性）、淀粉水解试验（阴性）、尿酶试验（阳性）、明胶液化试验（阴性）、硝酸盐还原（阳性）、氧化酶试验（阴性）和葡萄糖产气试验（阴性）。
所述菌株Providencia sp. 2D的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO：1所示，通过NCBI官方网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BLAST程序与其他已登录细菌菌株16S rDNA序列进行比对，结果表明该菌株与Providencia sp.相似性最高，同源率达99%。
所述菌株Providencia sp. 2D能够利用DBP作为唯一碳源和能源生长繁殖，不仅能够降解DBP，还能够降解DBP的中间产物邻苯二甲酸，最终将DBP完全矿化。
本发明还提供普罗威登斯菌Providencia sp. 2D在降解邻苯二甲酸中的应用。
同时还提供普罗威登斯菌Providencia sp. 2D在制备降解邻苯二甲酸二丁酯或/和邻苯二甲酸的制剂中的应用。
上述普罗威登斯菌Providencia sp. 2D降解邻苯二甲酸二丁酯的应用具体为：将普罗威登斯菌Providencia sp. 2D活化后制得的菌悬液接入受邻苯二甲酸二丁酯污染的介质中。
作为一种更优选的技术方案，上述应用是将普罗威登斯菌Providencia sp. 2D经过过夜活化、震荡培养至对数期，收集菌体，根据实际需要调节菌体含量并制成菌悬液，将制得的菌悬液接入受邻苯二甲酸二丁酯污染的水或土壤中。
本发明还提供一种降解邻苯二甲酸二丁酯的生物菌剂，包括普罗威登斯菌Providencia sp. 2D。
本发明同时研究了普罗威登斯菌Providencia sp. 2D在DBP污染土壤中的修复效应，结果表明该菌可有效降低土壤中的DBP污染，是理想的土壤环境污染修复微生物。
因此，可以将上述生物菌剂制成DBP污染土壤改良修复剂，包括普罗威登斯菌Providencia sp. 2D。
优选地，可以根据实际DBP污染土壤的情况调节普罗威登斯菌Providencia sp. 2D的用量。
另外，发明人研究还发现在DBP污染土壤中同时添加动物粪堆肥可进一步增强土壤中DBP的降解，因此，进一步地，本发明所述土壤改良修复剂还包括动物粪堆肥。
更优选地，所述动物粪堆肥与DBP污染土壤的质量比为1：15。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 
本发明提供了普罗威登斯菌Providencia sp. 2D在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用。该菌在72 h对高浓度的DBP（1000 mg/L）降解效率超过80%，对低浓度的DBP（200 mg/L）几乎完全降解；该菌株还能够降解DBP的中间产物邻苯二甲酸。
本发明还提供了一种DBP污染土壤改良修复剂，包括普罗威登斯菌Providencia sp. 2D，接2D菌的DBP污染土壤在第10天，土壤中DBP的降解率达到了65%，相比对照提高了46%；另外，在添加了动物堆肥并接菌的DBP污染土壤中，其第十天的DBP降解率达到了88%，Providenciasp. 2D菌与堆肥结合使用，可高效修复DBP污染的土壤，对降低农业土壤环境中DBP污染具有十分广泛的应用前景。                                                                                                               
附图说明
图1为Providencia sp. 2D在LB培养基上培养7天的生长形态。
图2为Providencia sp. 2D的扫描电镜图。
图3为Providencia sp. 2D的16SrDNA的系统发育树。
图4为Providencia sp. 2D对DBP和邻苯二甲酸的降解动力学曲线。
图5为Providencia sp. 2D对不同土壤处理中DBP的降解效果。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1邻苯二甲酸二丁酯降解菌的分离与鉴定
1、培养基配方
无机盐培养液（MSM，g/L）：K₂HPO₄：5.8；KH₂PO₄：4.5；(NH₄)₂SO₄：2.0；MgCl₂：0.16；CaCl₂：0.02；Na₂MoO₄·2H₂O：0.0024；FeCl₃：0.0018；MnCl₂·2H₂O：0.0015；调节无机盐培养液的最终pH为7.5。添加DBP，使其在无机盐培养液中的浓度为50 mg/L，DBP作为唯一碳源。
牛肉膏蛋白胨培养基（LB）：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，加超纯水至1L，调节pH= 7.0。121℃灭菌20分钟。固体平板则添加1.5%（W/V）琼脂粉。
2、分离与鉴定
分离方法采用样品悬液摇瓶法：称取5 g堆肥样品（取自农场动物堆肥）于含有50 mL无菌水的150 mL三角瓶中，在30℃，140 rpm条件下培养3天后取5 mL堆肥悬液加入100 mL 含DBP（50 mg/L）的上述MSM培养基中。经30℃，140 rpm下培养7天后，每次按取1 mL的接种量连续富集、转接10次，并相应提高MSM培养基中DBP含量至1000 mg/L（第二次转接，MSM培养基中DBP的含量为100mg/L，之后每转接一次，MSM培养基中DBP的含量提高100mg/L）。然后将转接10次的培养液稀释10³～10⁵涂布于LB固体平板上，30℃倒置培养1～3天。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线纯化，分离获得一株细菌，编号为2D。然后将菌株接种于LB固体平板上30℃倒置培养7天，观察其菌落形态。LB平板培养7天的菌落呈橘黄色，质地膏状，丰厚湿润，易被挑起，边缘较薄（见图1）。
扫描电镜样品制备与观察：将菌种2D的单菌落接入含有10 mL的LB液体培养基过夜活化。吸取800 μL菌液经8000 rpm离心3～5 min，去上清液，加入500 μL PBS 洗菌3次。在收获的菌体沉淀中加入1 mL 2.5%（v/v）戊二醛充分混匀，4℃静置过夜。然后再次经8000 rpm离心3～5 min，去上清液，加入500 μL PBS 洗菌3次。随后将菌体分别在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脱水2次，每个梯度约浸泡15 min，然后8000 rpm离心去上清液，最后用乙酸异戊酯置换乙醇2次，每次20 min，方法同乙醇脱水。菌体经过CO₂干燥后制片观察。扫描电镜下可以观察到该菌呈长杆状，长约1.5～3.0 μm，宽约0.5～0.8 μm（见图2）。
菌株的生理生化鉴定指标包括12项：甲基红试验、V-P试验、吲哚反应、柠檬酸盐利用、肌醇产酸试验、葡萄糖产酸试验、淀粉水解试验、尿酶试验、明胶液化试验、硝酸盐还原、氧化酶试验和葡萄糖产气试验。具体实验结果见表1。

菌株的16S rDNA鉴定：提取细菌总DNA，用细菌16S rDNA通用引物对该菌基因组进行PCR扩增。PCR产物经测序（由上海生工完成）后，将测序结果与GenBank中已报道的16S rDNA序列进行同源性比对，并选取若干菌种做进化树分析。如图3所示，本发明分离纯化得到的菌株2D的16S rDNA序列与普罗威登斯菌（Providencia stuartii，菌种保藏号为NBRC 12930）同源率达99%，进化距离最近。与该菌属其他菌种也有较高同源性。因此，本发明筛选获得的菌株鉴定为普罗威登斯菌属，命名为Providenciasp. 2D。
实施例2Providenciasp. 2D对DBP及其中间产物邻苯二甲酸的降解实验
1、菌悬液制备
将纯化后的菌种Providenciasp. 2D接入含有10 mL的LB液体培养基过夜活化培养至对数期，经5000 rpm离心10 min收集菌体，用PBS洗菌3次后重悬，调节OD_600 nm = 0.8作为菌种悬液。
2、降解能力测定
分别向含有不同浓度DBP（50、100、200、500、1000 mg/L）和邻苯二甲酸（25、50、100、200、500 mg/L）的MSM培养液（无机盐培养液g/L：K₂HPO₄：5.8；KH₂PO₄：4.5；(NH₄)₂SO₄：2.0；MgCl₂：0.16；CaCl₂：0.02；Na₂MoO₄·2H₂O：0.0024；FeCl₃：0.0018；MnCl₂·2H₂O：0.0015）中接菌1 mL，以不接菌作为对照，并调节pH为8.0，每组三个重复。在30℃，140 rpm恒温摇床培养6天，定期取样，经GC/MS测定DBP及邻苯二甲酸的降解情况。
色谱条件：采用岛津公司QP2010 Plus型GC/MS串联质谱仪。色谱柱为安捷伦HP-5 柱子(0.25 μm × 0.25 mm × 30 m)，进样温度为250℃，离子源（EI）温度为220℃，采用不分流进样 1 μL，载气为高纯氦气。升温程序为：初始温度为100℃，保持2 min，15℃/min梯度上升至129℃，然后以40℃/min升温至280℃，保持5min。
质量控制：采用外标法和六点校正标准物质制作标准曲线。6种PAEs混标的基质加标平均回收率为92.5～110.2%，相对偏差低于10.5%，仪器检测限为0.12～0.45 ug/g。该方法满足痕量有机物定量分析要求。
结果如图4所示： Providenciasp. 2D菌在72 h对高浓度的DBP（1000 mg/L）降解效率超过80%，在DBP浓度低于200 mg/L时，72 h内DBP几乎完全降解，表明该菌对DBP具有高效的降解能力。对DBP中间产物的降解能力分析，可以看出该菌的对高浓度邻苯二甲酸的降解能力显著低于DBP，但对低浓度邻苯二甲酸（≤100 mg/L）降解能力较强（在144 h几乎完全降解）；邻苯二甲酸浓度为200 mg/L时，在144 h的降解率超过90%。说明该菌对DBP的主要代谢产物邻苯二甲酸也有较强的降解能力，最终将DBP完全矿化。
实施例3 Providenciasp. 2D对污染土壤中DBP的降解研究
1、供试土壤制备
土壤为华南农业大学农场水稻土，pH为6.7，C/N为5.98，风干后过60目筛。动物粪堆肥采自该农场，pH为8.8，C/N为17.49。按照农场常用添加比例（堆肥：土壤 = 1：15，w/w）在水稻土中添加堆肥，混匀获得pH = 7.54，C/N为10.8的改良土。将上述未添加堆肥土（常规土）和改良土分别添加DBP，使其浓度均达到100 mg/kg。
1、土壤中DBP降解效果分析
实验设置以下处理：接菌的常规土和改良土作为实验组；不接菌的常规土和改良土作为对照组一；灭过菌的改良土和先灭菌再接2D菌的改良土作为对照组二，每组三个重复。分别称取上述含100 mg/kg DBP的土壤200 g于三角瓶中，向土壤中添加菌悬液（OD_600 nm = 0.8）50 mL，充分混匀。将土壤调至田间持水量（约30%的含水量），在30℃恒温箱中避光培养，定期取样并经GC/MS测定土壤中DBP残留量。
经过10天的Providenciasp. 2D的生物强化修复处理，各处理中污染土壤DBP残留量动态变化见图5。接2D菌的常规土中DBP降解效果显著增强，在第0、2、4、6、8、10天，土壤中DBP残留量分别为98.41 mg/kg、88.13 mg/kg、75.40 mg/kg、61.25 mg/kg、44.85 mg/kg和34.46 mg/kg，在第10天的降解率达到了65%，而未接菌的对照土壤DBP降解率仅为19%，说明Providenciasp. 2D菌能够显著增强土壤中DBP的降解。另外，在添加了堆肥并接菌的改良土中，相对于未添加堆肥的接菌土，DBP的降解效果进一步增强，其第十天的DBP降解率达到了88%，表明堆肥可增强土壤中DBP的降解，将Providenciasp. 2D菌与堆肥结合使用，可高效修复DBP污染的土壤。
另外，未灭菌且接种2D菌的改良土中DBP的降解效率显著高于灭过菌且接种2D菌的改良土，说明2D菌与改良土中的土著微生物形成协同作用，促进了土壤中的DBP的降解。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  暨南大学
 
<120>  普罗威登斯菌(Providencia sp．)2D在降解邻苯二甲酸二丁酯中的应用
 
<130> 
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  1445
<212>  DNA
<213>  16S rDNA序列
 
<400>  1
gagcatggcg gcagctacac atgcaagtcg agcggtaaca ggagaagctt gcttctcgct     60
 
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