猪链球菌SBP_BAC_5基因缺失株及其构建方法与应用.pdf

本发明公开了一种猪链球菌SBP_bac_5基因缺失株及其构建方法与应用。所述缺失株为不含抗性标记的SS△SBP_bac_5，保藏编号为：CGMCC No.10076。本发明是采用RecA同源重组系统，利用温敏自杀质粒pSET4s作为载体对猪链球菌7型菌株SBP_bac_5编码的基因进行敲除而得到的菌株，破坏了SBP_bac_5蛋白的表达。本发明得到的S.suis 7型SS△SBP_bac_5株比亲本株的毒力弱，对动物安全。用重组菌制成疫苗，免疫CD1小鼠，实验结果表明：该猪链球菌重组菌疫苗能有效诱导机体产生特异性的体液免疫应答，使免疫小鼠获得抗S.suis攻击的保护，并可有效阻止细菌在体内的增值。本发明得到的工程菌为猪链球菌疫苗的研制提供了重要依据。

1.  一种猪链球菌SBP_bac_5基因缺失株，其特征在于所述缺失株为不含抗性标记的SS△SBP_bac_5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.10076。

2.  一种权利要求1所述的猪链球菌SBP_bac_5基因缺失株的构建方法，其特征在于所述方法步骤如下：
将含有待敲除的目的基因的上、下游同源臂基因DNA片断的pSET4s质粒导入所述的猪链球菌血清7型菌株，经同源重组而实现的；所述的DNA片断从上游至下游依次是SBP_bac_5上游同源臂、SBP_bac_5下游同源臂，与所述的猪链球菌7型菌株的SBP_bac_5蛋白编码基因的上游序列和下游序列发生同源重组，得到的SBP_bac_5基因缺失株SS△SBP_bac_5。

3.  根据权利要求2所述的猪链球菌SBP_bac_5基因缺失株的构建方法，其特征在于所述SBP_bac_5蛋白编码基因的序列如SEQNO.1所示。

4.  根据权利要求2所述的猪链球菌SBP_bac_5基因缺失株的构建方法，其特征在于所述扩增上游同源臂序列的引物序列如下所示：
SBP_bac_5KOP1：GCCGTCGACAAAATGAGAAAATGATGA；
SBP_bac_5KOP2:TACACCTTTATCTTTACCTTTCACATCA。

5.  根据权利要求2所述的猪链球菌SBP_bac_5基因缺失株的构建方法，其特征在于所述扩增下游同源臂序列的引物序列如下所示：
SBP_bac_5KOP5:GTGAAAGGTAAAGATAAAGGTGTAGTGGCA；
SBP_bac_5KOP6：TTAGGATCCGATTCCCCTACAATTGCC。

6.  一种权利要求1所述的猪链球菌SBP_bac_5基因缺失株在试验中作为标准的猪链球菌7型菌株的应用。

7.  一种权利要求1所述的猪链球菌SBP_bac_5基因缺失株在制备预防猪链球菌疫苗中的应用。

8.  一种猪链球菌疫苗，其特征在于所述疫苗的主要活性成分为权利要求1所述猪链球菌SBP_bac_5基因缺失株。

猪链球菌SBP_bac_5基因缺失株及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于细菌基因工程技术领域，涉及一种不含抗性标记的猪链球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株及其构建方法与应用。
背景技术
猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)为革兰氏阳性球菌，是一种重要的人畜共患病病原菌。我国曾于1998年和2005年暴发了两次较大规模的猪及人感染S.suis病的事件，累计报告人感染S.suis病例达204例，其中死亡38例，严重影响公共卫生安全。至今为止，对此病的预防仍缺乏有效的疫苗。目前研究表明S.suis荚膜抗原血清型有35种以上，其中血清2型为世界范围内的主要致病菌型。然而，近几年在全世界病猪检测中频繁报导S.suis 7型，其所占的比例有增多趋势，在某些地区甚至超过了2型，特别是近几年湖北省境内就已有7型感染增多的报道。根据本实验室的流行病学调查结果，现地流行的血清型呈多样性存在，血清7型的比例有增高的趋势，基于上述现象，对S.suis 7型各方面特性的研究也就显得非常必要。
文献报道，SBP_bac_5蛋白具有类似分子伴侣的活性，在病毒感染过程中发挥重要作用。如分子伴侣蛋白具有促进病毒蛋白发生正确折叠和集合的功能，并且对腺病毒、痘苗病毒和乳头瘤病毒的生长具有重要作用，已有研究证实SBP_bac_5是一个假定的毒力相关因子，具有类似分子伴侣的活性，在感染过程中发挥重要的作用，而其在细菌中的作用至今仍无报道。我们通过比较蛋白质组学和荧光定量PCR检测表明SBP_bac_5在S.suis 7型强弱毒株的表达量显著差异，即SBP_bac_5蛋白在S.suis 7型强毒株WC-ss7中表达量比在弱毒株M13中表达量多。通过预测软件分析SBP_bac_5蛋白有转运蛋白活性，且为假定分泌蛋白，其分子功能是直接运输物质如大分子、小分子、离子等进出细胞；这更进一步提示SBP_bac_5基因与S.suis致病力的相关性。
目前商品化的全菌灭活疫苗和亚单位疫苗能够减轻同源血清型菌引起的临床症状并降低死亡率，但不能阻止组织病变、慢性感染，对异源血清型菌的感染 也不能提供完全的交叉保护。因此，采用灭活苗和亚单位疫苗免疫不是最好的选择，迫切需要更安全、更高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。而且弱毒活疫苗与传统疫苗相比有能够重复提呈抗原和持续性刺激免疫应答的优点。因此通过缺失毒力因子构建弱毒活疫苗已成为国内外疫苗研究的热点。
鉴于上述背景，为准确阐明SBP_bac_5在细菌中的生物活性及功能，采用RecA同源重组系统，利用温敏自杀质粒pSET4s作为敲除的载体构建我国流行的S.suis 7型菌株的SBP_bac_5基因缺失株，研究其对动物的致病性和免疫原性，为S.suis的防治及S.suis疫苗的研制奠定基础。
发明内容
本发明目的之一是提供一种不含抗性标记的猪链球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株，该缺失株是将猪链球菌菌株SBP_bac_5编码的基因进行敲除的菌株。
本发明的猪链球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株衍生于本试验室研究人员分离的S.suis血清7型WC-ss7流行株(保藏号为CGMCC No.3343)，将其基因组上的SBP_bac_5基因缺失，使SBP_bac_5蛋白不表达，获得了不含抗性标记的SBP_bac_5基因缺失突变株。
本发明的猪链球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株为不含抗性标记的SSΔSBP_bac_5，其分类命名为猪链球菌Streptococcus suis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.10076，保藏日期为2014年11月28日。
本发明目的之二是提供一种构建所述的不含抗性标记的猪链球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株的方法，其特征是将含有待敲除的目的基因的上、下游同源臂基因DNA片断的pSET4s质粒导入所述的猪链球菌血清7型菌株，经同源重组而实现的。其中，所述的DNA片断从上游至下游依次是SBP_bac_5上游同源臂、SBP_bac_5下游同源臂，与所述的猪链球菌7型菌株的SBP_bac_5蛋白编码基因的上游序列和下游序列发生同源重组，得到的SBP_bac_5基因缺失株SSΔSBP_bac_5。具体构建方法如下：
1、以S.suis血清7型WC-ss7株基因组为模板，以SBP_bac_5KOP1/2为 引物扩增上游同源臂，以SBP_bac_5KOP5/6为引物扩增下游同源臂，以2段PCR产物为模板，以SBP_bac_5KOP1/6为引物，通过融合PCR方法扩增上下游同源臂的融合片段。纯化该融合产物，克隆至PMD-18T载体，转化E.coli DH5α感受态细胞，经过PCR和酶切鉴定后测序。将测序正确的目的片段，连接到pSET4s载体上，转化E.coli DH5α感受态细胞，再经PCR和酶切鉴定，最终获得敲除载体。pSET4s载体图谱如图1所示。
2、取10μL基因敲除载体电转化100μLWC-ss7株感受态细胞，经30℃、CO₂孵箱内培养40h，在带壮观霉素抗性Spc^R的THB平板上长出几十个菌落，挑选正确的克隆先后经过30℃双交换和40℃质粒丢失，最后同时涂布在没有抗性和有Spc抗性的平板筛选突变体，如在有抗性的板上不生长、在无抗性的平板上生长，挑取在无抗性平板上单克隆进行PCR筛选，获得基因敲除突变体。以提取的突变株基因组为模板，分别用不同引物进行PCR鉴定，将鉴定正确的定义为SSΔSBP_bac_5。将SBP_bac_5基因缺失株接种动物，根据接种动物的临床表现和存活情况分析，SSΔSBP_bac_5的毒力弱于亲本株WC-ss7。
在本发明的具体实施方式中，所述的SBP_bac_5编码基因的序列如SEQNO.1所示，SBP_bac_5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的具体实施方式中，扩增上游同源臂序列的引物在5‘端引入了Sal I酶切位点，斜体部分是与下游同源臂序列相融合部分，序列如下所示：
SBP_bac_5KOP1：GCCGTCGACAAAATGAGAAAATGATGA
SBP_bac_5KOP2：TACACCTTTATCTTTACCTTTCACATCA
在本发明的具体实施方式中，扩增下游同源臂序列的引物在5‘端引入了BamH I酶切位点，斜体部分是与上游同源臂序列相融合部分，序列如下所示：
SBP_bac_5KOP5：GTGAAAGGTAAAGATAAAGGTGTAGTGGCA
SBP_bac_5KOP6：TTAGGATCCGATTCCCCTACAATTGCC
本发明的目的之三是提供所述的猪链球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株为科研工作者在试验中作为标准的猪链球菌7型菌株的应用。
本发明的目的之四是提供所述的猪链球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株在制备预防猪链球菌疫苗中的应用。
本发明的目的之五是提供一种猪链球菌疫苗，其主要活性成分是本发明不含 抗性基因的猪链球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株。
本发明是采用RecA同源重组系统，利用温敏自杀质粒pSET4s作为载体对猪链球菌7型菌株SBP_bac_5编码的基因进行敲除而得到的菌株，破坏了SBP_bac_5蛋白的表达。本发明的主要优点是：
1、本发明所用的材料是S.suis血清7型WC-ss7株，是本试验室研究人员从发病猪组织里分离到的S.suis血清7型流行株，是现地流行菌株的代表，因此，今后以该菌株构建的SBP_bac_5基因缺失株为研究对象更具有针对性。
2、本发明得到的猪链球菌血清7型SBP_bac_5基因缺失株比亲本株的毒力弱，比国际标准7型和2型菌株的毒力弱，可作为科研工作者使用的标准猪链球菌7型试验用弱毒菌株。
3、本发明提供所述的基因缺失重组菌，可用于改造和制备预防猪链球菌疫苗。因不含任何抗性标记，完全符合我国疫苗生产安全。用重组菌制成疫苗，免疫CD1小鼠，实验结果表明：该猪链球菌重组菌疫苗能有效诱导机体产生特异性的体液免疫应答，使免疫小鼠获得抗S.suis攻击的保护，并可有效阻止细菌在体内的增值。本发明得到的工程菌为猪链球菌疫苗的研制提供了重要依据。
保藏信息：
一、SSΔSBP_bac_5：
分类命名：猪链球菌Streptococcus suis；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所；
保藏编号：CGMCC No.10076；
保藏日期：2014年11月28日。
二、WC-ss7株：
分类命名：猪链球菌Streptococcus suis；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所；
保藏编号：CGMCC No.3343；
保藏日期：2009年10月19日。
附图说明
图1为pSET4s载体图谱；
图2为SBP_bac_5上下游同源臂、融合PCR产物，图中1：SBP_bac_5上游同源臂；2：SBP_bac_5下游同源臂；3：融合PCR产物；M：DL-2000DNA Maker；
图3为重组质粒pMD18T-SBP_bac_5的构建和鉴定，图中M：DL-2000DNAMaker；；1：pMD18T-SBP_bac_5双酶切鉴定；
图4为重组质粒pSET4s-SBP_bac_5的构建和鉴定，图中1：DL-2000DNAMaker；2，3：pSET4s-SBP_bac_5双酶切鉴定；4：DL-5000DNA Maker；
图5为突变株SSΔSBP_bac_5的PCR鉴定结果，图中M：DL-2000DNAMaker；1：引物GDH-F/R引物鉴定；2：SBP_bac_5KOP1/6引物鉴定；3：SPC1/2引物鉴定；4：SBP_bac_5KOP3/4引物鉴定；
图6为WC-ss7株和SSΔSBP_bac_5株的S.suis 7型鉴定，图中M：DL-2000DNA Maker；1：亲本株的S.suis 7鉴定；2：SSΔSBP_bac_5突变株S.suis 7鉴定；
图7为疫苗免疫后的抗体检测结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
1、本发明中所涉及的材料：
1.1菌株和质粒(表1)
表1所用菌株与质粒