说明书一种水相中专一识别二价铜离子的荧光探针及应用
技术领域
本发明涉及一种识别重金属铜离子的荧光探针及其应用，尤其涉及一种水相中专一识别 二价铜离子的菲醌类化合物荧光探针及其应用；属于有机小分子荧光探针领域。
背景技术
正常情况下人体内，除了铁和锌，铜离子是第三种最丰富的必需微量元素，成人体内总 铜含量一般是70～80毫克。
铜离子在各种生理过程发挥重要作用，然而，铜离子作为有毒的重金属元素，若水平异 常时，可引起氧化应激和神经系统疾病，包括阿尔茨海默氏症、帕金森、门克斯和威尔逊等 疾病。所以，对铜离子的检测引起人们的高度重视。
目前，铜离子的检测手段主要分为两类：直接法和间接法。直接法是一类直接利用铜离 子自身物理、化学性质对其进行分析检测的方法，包括原子吸收、发射光谱法和离子选择性 电极法；间接法是一类利用铜离子和指示剂(也可称为化学分子探针)之间的特异性化学反 应或超分子作用产生的信号变化对铜离子进行分析检测的方法，包括传统的铜离子指示剂和 近年来研究较热的铜离子荧光分子探针。但是，综合分析目前的铜离子荧光探针主要存在以 下不足：第一，为了提高选择性大多数铜离子探针在有机溶剂中或含有机溶剂的组分中检测， 对环境检测的实用性大大降低；第二，铜离子探针的识别机制多数在FRET、ICT、PET机 理下检测铜离子，选择性不高，专一性或特异性差；第三，多数铜离子探针的识别不存在可 逆性，生物实用性不高。基于此，开发新型铜离子探针，给出检测曲线判断铜离子水平高低， 有着重要的研究价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种水相中专一识别二价铜离子的菲 醌类化合物荧光探针及其应用。
本发明所述的适于水相中专一识别二价铜离子的荧光探针，其特征在于：它是3-羟基-4 -(1氢-菲醌[9,10-d]咪唑-2-乙基)苯基4-氧代戊酸脂，简称PI，其化学结构式如式(1)所示：
上述3-羟基-4-(1氢-菲醌[9,10-d]咪唑-2-乙基)苯基4-氧代戊酸脂(简称PI)的制备方法 是：将菲醌1与2,4-二羟基苯甲醛在冰醋酸做溶剂条件下生成化合物2，然后将化合物2与 乙酰丙酸发生缩合反应得到终产物：3-羟基-4-(1氢-菲醌[9,10-d]咪唑-2-乙基)苯基4-氧代戊 酸脂。
上述PI的制备反应式如下：
上述适于水相中专一识别二价铜离子的荧光探针在检测水中是否含有二价铜离子中的 应用。
上述的应用中：所述荧光探针是在水相中以荧光淬灭方式实现识别二价铜离子。
上述荧光探针在水相中能高选择性识别二价铜离子，该探针本身由于ESIPT荧光强度高， 当铜离子配位后，氢键断裂，荧光淬灭；当加入生物硫醇则恢复荧光。
实验证实：检测环境是水相时，本发明所述的铜离子荧光探针的溶剂化效应显示，在水 中探针的荧光强度相对较弱(图1)，其荧光量子产率为0.14(参见表1：3-羟基-4-(1氢-菲 醌[9,10-d]咪唑-2-乙基)苯基4-氧代戊酸脂的光物理性质)，虽然其小于在有机溶剂中的数值， 但是远大于其他生物染料在水相中的量子产率。在选择性方面(图2)，离子量为探针的250 倍，当用365nm光激发，只有铜离子发生15倍的淬灭；在铜离子滴定实验中(图3)，在铜 离子加入量ncu＝0～250当量PI的条件下，荧光发生淬灭，加入10当量的铜离子时，荧光已 经完全淬灭。总之，随着铜离子浓度的增加，荧光趋于减弱。在各种离子存在的情况下，铜 离子同样荧光强度趋于淬灭，表明本发明所述的铜离子荧光探针在水相中排除了其他例子的 干扰(图4)，当在淬灭的体系中加入生物硫醇时，荧光趋于逐渐增强5倍至平衡的趋势(图 5)。
基于上述实验结果，可以证明本发明所述的识别二价铜离子的菲醌类化合物荧光探针是 一类新型的高选择性铜离子荧光探针分子，通过铜离子与探针的配位作用使探针本身的 ESIPT机制受到破坏，使荧光淬灭；当加入生物硫醇时，EIIPT恢复使荧光增强。在水相中 检测是否含有铜时，只需取所检测体系于水中，加入探针后，通过荧光强度前后对比就可以 判断水中是否含有铜离子。其识别反应式如通式(II)所示：
本发明提供的识别二价铜离子的菲醌类化合物荧光探针与其功能相近的铜离子荧光探 针比具有显著优势，且本发明所述菲醌咪唑类化合物在水相中的选择性和合成手段也具有新 颖性和简便性。基于本发明提供的识别二价铜离子的菲醌类化合物荧光探针在溶剂中具有高 的荧光量子产率，并且当加入生物硫醇后荧光增强的结果及现象，为生物学成像应用奠定了 理论基础，预示其在激光激发荧光生物标记领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1：探针的溶剂化效应。激发波长365nm。
图2：探针在水相中的选择性。其中激发波长为365nm；探针PI母液的浓度：10-3M， 稀释5ml进行测试；选择性例子(图示离子)的浓度为4.5x10-5M。
图3：铜离子的滴定实验；其中激发波长为365nm；探针PI母液的浓度：10-3M，稀释 5ml进行测试。
图4：探针在各离子存在的情况下对铜离子的竞争实验。其中激发波长为365nm；探针 PI的浓度：10-3M；选择性例子(图示离子)的浓度为4.5x10-5M。
图5：生物硫醇的反滴定实验。其中激发波长为365nm；探针PI母液的浓度：10-3M， 稀释5ml进行测试；[Cys]＝[GSH]＝4.5x10-5M。
图6.探针PI的生物成像应用。激发波段：340-380nm，发射波段：435-485nm。
具体实施方式
实施例1
3-羟基-4-(1氢-菲醌[9,10-d]咪唑-2-乙基)苯基4-羟基(1)的合成：
将0.21g(1mmol)的菲醌，2,4-二羟基苯甲醛0.276g(2mmol),1.54g醋酸铵和10mL冰醋 酸混合在50mL的圆底烧瓶中，在氮气保护下加热回流1h，反应体系由棕色变为红褐色。反 应结束后冷却至室温，将液体倒入100mL的冰水中，将沉淀过滤，水洗三次烘干，乙醇重 结晶得到白色固体。产率：83％。
1H NMR(400MHz,d6-DMSO),δ(ppm):0.75-0.76(d,J＝8.0Hz,2H),6.37-6.47(m,6H), 6.162-6.159(t,J＝0.6Hz,2H),5.73(m,1H)。
3-羟基-4-(1氢-菲醌[9,10-d]咪唑-2-乙基)苯基4-氧代戊酸脂(2)的合成：
将0.20g(0.6mmol)化合物(1)0.17g(1.5mmol)乙酰丙酸，0.24(1.2mmol)DCC,0.007g (0.06mmol)的DAMP溶于30mL二氯甲烷中。在氮气保护下室温反应。反应结束后，将反 应物倒入冰水中析出沉淀，沉淀用少量二氯冲洗3-4次，乙醇重结晶得到白色固体。产率： 81％。：
1H NMR(400MHz,d6-DMSO),δ(ppm):13.75(s,1H),13.45(s,1H),8.52(s,1H),8.57(s,1H), 8.271-8.293(d,2H),7.79(d,J＝4.0Hz 2H,),2.90-2.87(m,2H),2.76-2.79(m,2H),2.18(s,3H).
实施例2
3-羟基-4-(1氢-菲醌[9,10-d]咪唑-2-乙基)苯基4-氧代戊酸脂(PI)的溶剂化效应
预先准备1份10mL的10-3M探针PI的N,N-二甲基甲酰胺溶液，然后分别取10μL加 入六个相同的5mL容量瓶中，分别用DMF、乙腈、PBS、甲醇、四氢呋喃、氯仿稀释到5mL， 然后进行荧光检测(λEx＝365nm,λEm＝450nm)，结果见图1；
实施例3
根据实施例2数据计算探针PI在各溶剂内的量子产率。
上述计算公式如下：
Φ s = Φ r ( A r ( λ r ) A s ( λ s ) ) ( I ( λ r ) I ( λ s ) ) ( n s 2 n r 2 ) ∫ F s ∫ F r ]]>
其中，Φs和Φr分别代表样品和参比的单光子荧光量子产率，As(λs)和Ar(λr)分别 代表样品I(λs)和I(λr)所选参比的吸光度数值，I(λs)和I(λr)分别代表样品和参比分子 的荧光强度，∫Fs和∫Fr分别代表探针分子和参比的单光子荧光积分面积。理想的参比一般是 与激发波长无关(见表1)。
表1：3-羟基-4-(1氢-菲醌[9,10-d]咪唑-2-乙基)苯基4-氧代戊酸脂(PI)的光物理性质
实施例4
3-羟基-4-(1氢-菲醌[9,10-d]咪唑-2-乙基)苯基4-氧代戊酸脂的选择性
配制45mL浓度为4.5x10-5M各种离子(如图2所示离子)的水溶液及探针PI母液的 浓度为10-3M作为备用。
加入10μL探针母液和250当量的各离子溶液，摇匀后进行荧光检测(λEx＝365nm,λEm＝ 450nm)，计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与离子的柱状图，结果见图2。
实施例5
铜离子的滴定
配制45mL浓度为4.5x10-5M铜离子的水溶液及探针PI母液的浓度为10-3M作为备用。 铜离子浓度从0当量滴定到500当量并进行荧光检测(λEx＝365nm,λEm＝450nm)，计算各体 系中荧光强度，建立荧光强度与铜离子浓度标准曲线，标准曲线(见图3)。
实施例6
竞争实验
配制45mL浓度为4.5x10-5M各种离子(如图4所示离子)的水溶液及探针PI母液的浓 度为10-3M作为备用。
取10μL探针和250当量的铜离子溶液，然后用其他各离子的水溶液稀释到5mL进行荧 光检测(λEx＝365nm,λEm＝450nm)，建立荧光强度与各种离子的柱状图(见图4)。
实施例7
生物硫醇的反滴定
配制45mL浓度为4.5x10-5M铜离子的水溶液及探针PI母液的浓度为10-3M作为备用。
取10μL探针母液加入和250当量的铜离子母液加入5mL容量瓶，然后加入用生物硫醇 从0-500当量反滴定上述体系建立荧光强度与生物硫醇浓度标准曲线(见图5)。
实施例8
生物成像：活细胞染色实验
将探针PI配成1mM DMSO母液，染色时用1mL培养基稀释。
将接种好的细胞在设定量浓度的探针分子溶液37℃孵育30min，用PBS洗3-5次，贴壁 生长的细胞置于载玻片上；然后用单双光子荧光显微镜进行荧光成像，结果见图6。
同样条件下，加入巯基阻断剂N-乙基马来酰亚胺(NEM)的样品组，荧光显微镜下阴性， 该试验证明了荧光来自巯基化合物(见图6)。