与小麦株高相关的TAGS2基因的分子标记、获取方法及其应用.pdf

本发明公开了一种与小麦株高相关的TaGS2基因的分子标记IN10，以及利用该分子标记在筛选小麦品种或品系株高中的应用，具体是以分子标记IN10的标记引物对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增，将扩增产物电泳分离，以获得对应的扩增产物含有分子量分别为555bp、466bp和426bp 中的条带数来判断该品种的株高的变化，并以此作为选育不同株高类型小麦新品种的理论指导。本发明所提供的筛选方法快速精准，不受环境影响，选择目标明确，可以加快塑造合理的株高群体，从而大大提高了高产小麦品种或品系的选择效率和质量。

权利要求书
1.  一种与小麦株高相关的TaGS2基因的分子标记，其特征在于，该分子标记为IN10，所述分子标记IN10的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO : 2所示，以所述分子标记IN10的标记引物对小麦基因组DNA进行PCR扩增，将扩增产物电泳分离，获得对应的扩增产物分子量分别为555bp、466bp和426bp，即为与小麦株高相关的TaGS2基因的分子标记。

2.  根据权利要求1所述的与小麦株高相关的TaGS2基因的分子标记，其特征在于，所述PCR扩增的体系为20 μl，包括：2×Taq PCR MasterMix 10μl，上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，其余为ddH2O。

3.  根据权利要求1或2所述的与小麦株高相关的TaGS2基因的分子标记，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min/kb，30个循环；72℃后延伸7 min；20℃保存。

4.  一种权利要求1所述的分子标记在小麦株高相关的TaGS2基因定位或检测中的用途。

5.  与小麦株高相关的TaGS2基因的分子标记的获取方法，包括以下步骤：
（a）提取六倍体小麦科农9204三叶期幼苗总RNA，设计扩增引物为：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO : 4所示，采用RT-PCR方法扩增分别得到TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D编码基因的1284bp全长cDNA；
（b）构建科农9204的突变群体，利用离子束辐射品种科农9204的种子，获得包含1881个家系的后代M2群体；每个系随机选取3个挂牌标记的单株，取其叶片，提取DNA，得突变群体的DNA池；
（c）根据TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D保守序列设计引物，筛选其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO : 2所示，用筛选到的所述引物对小麦科农9204的基因组DNA进行PCR扩增，将扩增产物电泳分离，获得对应的扩增产物分子量分别为555bp、466bp和426bp；
（d）应用步骤（c）所述分子标记的上、下引物扩增步骤（b）所述的突变群体的基因组DNA，PCR扩增后，将电泳分离条带与科农9204的扩增条带进行比较，筛选出其中缺失分子量为555bp、466bp或426bp中任意一条带的突变体，即分别得到TaGS2-A、TaGS2-B或TaGS2-D的单基因缺失突变体植株；
（e）通过将TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D的单基因缺失突变体进行杂交，获得TaGS2-A/B、TaGS2-B/D和TaGS2-A/D双重基因缺失突变体植株；
（f）将步骤（d）和步骤（e）所筛选到的单基因和双重基因缺失的突变体植株进行田间种植，采收，统计其株高数，以科农9204为对照，得知单基因缺失的突变体植株其株高较对照降低，双重基因缺失的突变体植株较对照显著降低，即获得分子标记IN10为与小麦株高相关TaGS2基因的分子标记。

6.  一种筛选小麦品种或品系植株高矮类型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用分子标记IN10的标记引物对待测小麦品种或品系的DNA分别进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20 μl，包括：2×Taq PCR MasterMix 10μl，上、下游引物各1μl，待测小麦的DNA模板1μl，其余用ddH2O补足；PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min/kb，30个循环；72℃后延伸7 min；20℃保存；得扩增产物；
（2）将所述扩增产物电泳分离后，如获得的扩增产物中仅出现分子量为555bp、466bp和426bp中的任意一条带，以科农9204为对照植株，则该小麦为株高显著矮于对照植株的品种或品系；如获得的扩增产物中同时出现分子量分别为555bp、466bp和426bp中的任意两条带，则该小麦为株高矮于对照植株的品种或品系；如获得的扩增产物中同时出现分子量为555bp、466bp和426bp的三条带，则该小麦为株高与对照植株株高基本一致的品种或品系。

7.  根据权利要求6所述的筛选小麦品种或品系植株高矮类型的方法，其特征在于，步骤（1）所述分子标记IN10的标记引物的上游核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示、下游核苷酸序列如SEQ ID NO : 2所示。

8.  根据权利要求7所述的筛选小麦品种或品系植株高矮类型的方法，其特征在于，步骤（2）所述电泳分离是指在2%琼脂糖凝胶上稳压100V电泳分离或6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压120 V电泳分离；所述2%琼脂糖凝胶是指100 ml的TAE缓冲液中含有2 g琼脂糖粉；所述6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶是指100ml聚丙烯酰胺凝胶溶液中含有5.85 g丙烯酰胺和0.15 g甲叉丙烯酰胺。

说明书与小麦株高相关的TaGS2基因的分子标记、获取方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物基因工程技术领域，具体地说是一种与小麦株高相关的TaGS2基因的分子标记、获取方法及其应用。
背景技术
小麦是世界上最重要的粮食作物，也是我国三大粮食作物之一。株高是影响小麦高产的重要因素，植株过高的品种在高肥水条件下容易发生倒伏，导致产量下降；植株过矮易使叶片拥挤，中下部通风透光不良，导致光合效率及产量降低。20世纪60-80年代，矮杆和半矮杆小麦品种的推广，对全世界小麦产量的提高起到了关键作用。除受主效矮秆基因控制外，小麦株高性状还表现为受其他多个基因控制的性状特征。
植物合成氨基酸时，谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸合酶(GOGAT)催化合成谷氨酰胺和谷氨酸，这两种氨基酸是所有含氮化合物的主要氮素供体，在氨基酸合成途径中居于重要的位置，而GS的催化能力能够影响作物的产量潜力(Habash et al., 2007)。
分子标记辅助育种是一种采用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行育种的有效方法，具有不受环境条件限制、在植物发育的各个组织和生育时期均可检测、选择效率高等优势。随着基因组学的研究进入功能基因组学时代，突变体的作用受到了越来越多学者的关注。构建突变体库是分析基因功能的方法之一，利用合适的诱变方法构建突变体库，丰富种质资源，鉴定基因功能是得知该基因功能最直接和有效的方法。因此，研究调控株高的基因，获得与株高基因相关联的分子标记，利用该分子标记对小麦株高相关基因进行定位和检测，有效调控小麦的株高类型，选育预期株高类型的小麦新品种，塑造合理的株高发生群体，对提高小麦群体质量和产量具有极其重大的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种与小麦株高相关的TaGS2基因的分子标记、获取方法及其应用，以利用该分子标记对小麦株高基因TaGS2进行定位和检测，在小麦选育中对其亲本进行有目的地选择，为选育目标株高类型的小麦新品种提供了指导依据。
本发明是通过以下方法实现的：一种与小麦株高相关的TaGS2基因的分子标记，该分子标记为IN10，所述分子标记IN10的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO : 2所示，以所述分子标记IN10的标记引物对小麦基因组DNA进行PCR扩增，将扩增产物电泳分离，获得对应的扩增产物分子量分别为555bp、466bp和426bp，即为与小麦株高相关的TaGS2基因的分子标记。
所述PCR扩增的体系为20 μl，包括：2×Taq PCR MasterMix 10μl，上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，其余为ddH2O。
所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min/kb，30个循环；72℃后延伸7 min；20℃保存。
本发明与小麦株高相关的TaGS2基因的分子标记的获得方法，包括以下步骤：
（a）提取六倍体小麦科农9204三叶期幼苗总RNA，设计扩增引物为：上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO : 4所示，采用RT-PCR方法扩增分别得到TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D编码基因的1284bp全长cDNA；
（b）构建科农9204的突变群体，利用离子束辐射品种科农9204的种子，获得包含1881个家系的后代M2群体；每个系随机选取3个挂牌标记的单株，取其叶片，提取DNA，得突变群体的DNA池；
（c）根据TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D保守序列设计引物，筛选其上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO : 2所示，用筛选到的所述引物对小麦科农9204的基因组DNA进行PCR扩增，将扩增产物电泳分离，获得对应的扩增产物分子量分别为555bp、466bp和426bp；
（d）应用步骤（c）所述分子标记的上、下引物扩增步骤（b）所述的突变群体的基因组DNA，PCR扩增后，将电泳分离条带与科农9204的扩增条带进行比较，筛选出其中缺失分子量为555bp、466bp或426bp中任意一条带的突变体，即分别得到TaGS2-A、TaGS2-B或TaGS2-D的单基因缺失突变体植株；
（e）通过将TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D的单基因缺失突变体进行杂交，获得TaGS2-A/B、TaGS2-B/D和TaGS2-A/D双重基因缺失突变体植株；
（f）将步骤（d）和步骤（e）所筛选到的单基因和双重基因缺失的突变体植株进行田间种植，采收，统计其株高数，以科农9204为对照，得知单基因缺失的突变体植株其株高较对照降低，双重基因缺失的突变体植株较对照显著降低，即获得分子标记IN10为与小麦株高相关TaGS2基因的分子标记。
本发明提供的分子标记能够在小麦株高相关的TaGS2基因进行定位或检测，为选育目标株高的小麦品种提供指导依据。
本发明还公开了一种筛选小麦品种或品系植株高矮类型的方法，包括以下步骤：
（1）用分子标记IN10的标记引物对待测小麦品种或品系的DNA分别进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20 μl，包括：2×Taq PCR MasterMix 10μl，上、下游引物各1μl，待测小麦的DNA模板1μl，其余用ddH2O补足；PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min/kb，30个循环；72℃后延伸7 min；20℃保存；得扩增产物；
（2）将所述扩增产物电泳分离后，如获得的扩增产物中仅出现分子量为555bp、466bp和426bp中的任意一条带，以科农9204为对照植株，则该小麦为株高显著矮于对照植株的品种或品系；如获得的扩增产物中同时出现分子量分别为555bp、466bp和426bp中的任意两条带，则该小麦为株高矮于对照植株的品种或品系；如获得的扩增产物中同时出现分子量为555bp、466bp和426bp的三条带，则该小麦为株高与对照植株株高基本一致的品种或品系。
本发明步骤（2）中所述电泳分离是指在2%琼脂糖凝胶上稳压100V电泳分离或6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压120 V电泳分离；所述2%琼脂糖凝胶是指100 ml的TAE缓冲液中含有2 g琼脂糖粉；所述6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶是指100ml聚丙烯酰胺凝胶溶液中含有5.85 g丙烯酰胺和0.15 g甲叉丙烯酰胺。
本发明所用科农9204为审定品种，于2002年通过河北省农作物品种审定委员会审定；2003年通过全国品种审定，品种审定编号为国审麦2003037。
本发明构建了小麦科农9204的突变群体，通过设计并筛选了分子标记引物成功筛选到不同TaGS2基因缺失的突变体，并通过不同TaGS2基因缺失的突变体的株高性状表型鉴定，得到了与小麦株高相关TaGS2基因的分子标记，该标记可有效筛选待测小麦是否含有控制小麦株高相关的TaGS2基因，同时，本发明还公开了一种利用该分子标记来筛选小麦植株高矮的方法，采用这种筛选方法可以有目的地选择杂交亲本，为选育不同植株高矮类型的小麦新品种做科学的指导，从而可以加快塑造合理的小麦株高发生群体，这对提高小麦群体质量和产量具有很大的贡献作用。
本发明提供了与小麦株高相关的分子标记应用于小麦育种中，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了高产小麦品种或品系的选择效率和质量。
附图说明
图1为在科农9204中克隆的位于不同染色体上的TaGS2基因的编码核苷酸序列。
图2为用于鉴定TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D基因缺失突变体的扩增产物的核苷酸序列。
图3为TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D的单基因缺失突变体，以及通过两两杂交获得TaGS2-A/B、TaGS2-B/D和TaGS2-A/D双重基因缺失突变体电泳图谱。
图4为TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D的单基因缺失突变体，以及通过两两杂交获得TaGS2-A/B、TaGS2-B/D和TaGS2-A/D双重基因缺失突变体植株中GS酶活性测定图。
图5为TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D的单基因缺失突变体，以及通过两两杂交获得TaGS2-A/B、TaGS2-B/D和TaGS2-A/D双重基因缺失突变体植物株高的表型图。
图6为TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D的单基因缺失突变体，以及通过两两杂交获得TaGS2-A/B、TaGS2-B/D和TaGS2-A/D双重基因缺失突变体植物株高的表型统计图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1 与小麦株高相关的TaGS2基因的分子标记的获得
1、小麦科农9204的TaGS2基因的克隆
根据数据库分析的结果设计引物：
上游引物核苷酸序列：5’-TCCTCCCTCGTCTCGTCCGCGT-3’（SEQ ID NO : 3）
下游引物核苷酸序列：5’-AGTGCCCCGACGGAACCACAGG-3’（SEQ ID NO : 4）
提取六倍体小麦科农9204三叶期幼苗总RNA，采用RT-PCR方法扩增得到TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D编码基因的1284bp全长cDNA。
具体操作过程如下：
1）植物总RNA提取：液氮研磨100 mg小麦科农9204的幼苗，研碎后转移到含1 mL Trizol试剂的EP管中，充分混匀，室温静置5 min；加入0.2 mL氯仿，充分混匀，室温静置 2-3 min；12000g，4℃，离心15 min；把上层无色的水相转移到一个新的1.5 mL EP管中，加入0.5 mL异丙醇，混匀后室温放置10 min；12000g，4℃，离心10 min；去上清，将RNA沉淀用1 mL 75%乙醇清洗，7500g，4℃，离心5min，之后风干；将沉淀溶于适量RNase-free的去离子水中，60℃促溶10 min；微量分光光度计（NanoDrop ND-2000 Spectrotometer）定量，电泳分析RNA完整性；
2）RT-PCR：按照RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0 (TaKaRa,DRR019A)试剂盒的说明书进行。首先进行第一步反转录反应，以500 ng RNA为模板进行反转录，在反应体系中依次加入MgCl2 2μl、10×反转录缓冲液 1μl、无RNA酶水 3.75μl、dNTP 1μl、RNA酶抑制剂 0.25μl、AMV 反转录酶 0.5μl、Oligo Dt 0.5μl、总RNA 1μl，反应体系共10 μL。反应程序为：42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min，得到含有第一链cDNA的混合物；从样品中取出等量的cDNA（1 μL）作为第二步PCR的模板，进行PCR扩增，PCR反应体系：10 μL 2×Taq PCR MasterMix, 1μL上游引物，1μL下游引物，1 μL 模板，ddH2O补足终体积为20 μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 sec，58℃延伸30 sec，72℃退火1 min/kb，30个循环；72℃延伸7 min； 20℃保存；通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，产物条带大小约为1284bp。
将得到目的条带切胶回收后连入pEASY-Blunt cloning vector；对两次独立的反转录和PCR及连接所得到的19个克隆进行测序，根据与中国春(CS)和小偃54(XY54)中已知的TaGS2 A组、B组和D组序列进行比对，得到了科农9204中TaGS2 A组、B组和D组序列，ORF均为1284 bp，其序列见图1，分别命名为TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D。
2、构建小麦科农9204的突变群体及突变群体的DNA池
1）实验材料为小麦品种科农9204（Kn9204）。科农9204是由冀麦38作母本，SA502（八倍体小偃麦×普通小麦杂交后代）作父本杂交选育而成，2003年通过国家品种审定。该品种是一个综合农艺性状好、高产和稳产性突出、适应性广的小麦品种，生产上已大面积推广应用。选取均匀一致的科农9204种子，利用氮离子能量30kev，剂量8×1017离子/ cm2，辐射小麦品种科农9204的种子，获得包含1881个家系的后代M2群体；
诱变材料在中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心栾城农业实验站（N 37°53'，E 114°41'，海拔50.1 m）田间种植。设计行长4m，行距25cm，株距10cm，正常供氮区域种植。以野生型科农9204作为对照，以每20行/系一行/系对照组的频率种植。试验区四周设保护行，田间统一管理。
2）M2代诱变群体返青后，选取1881个系，每个系随机选取3个挂牌标记的单株，取其约2cm长度的叶片；用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取DNA。超微量紫外可见分光光度法（Nanodrop 2000C）检测样品浓度与纯度，-70℃冰箱保存。
3、筛选小麦TaGS2基因缺失突变体的分子标记
基因组DNA的PCR扩增：根据TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D保守序列设计引物，用筛选到的标记引物：
上游引物核苷酸序列：5’- TGGCTGCCACACAAATTACAG -3’（如SEQ ID NO: 1），
下游引物核苷酸序列：5’- CCTTCTTGATCACGTCGAAAC -3’（如SEQ ID NO: 2）；
扩增科农9204基因组DNA，其PCR反应体系：10μL 2×Taq PCR MasterMix，1μL上游引物，1μL下游引物，1μL科农9204小麦基因组DNA模板，加ddH2O至终体积为20μL，PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min/kb，30个循环；72℃延伸7 min；20℃保存；通过2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，同时扩增出三个不同大小分别为466bp、426bp和555bp的属于A、B和D组的片段产物条带，即作为筛选小麦TaGS2基因缺失突变体的分子标记；其引物扩增序列差异比较见图2。
4、TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D单基因缺失突变体的筛选及鉴定
由于离子束诱变会造成了TaGS2的基因组DNA缺失，那么相较于野生型科农9204可以同时扩增出三条带，而发生缺失变异的突变体只能扩增出两条或更少的条带，所以本发明采用标记引物对TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D单基因缺失突变体进行筛选。具体采用步骤（3）所述设计的标记记引物对科农9204离子束诱变群体M2代5643个单株进行扩增，扩增体系及扩增层序同本实施例步骤1，PCR扩增后，将其条带与野生型Kn9204的扩增条带进行比较，筛选到分属于2、8和2个不同家系的突变体，得到TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D的单基因缺失突变体，分别命名为gs2-a，gs2-b和gs2-d，序列差异比较见图2；并对筛选的突变体进行了三次重复取材验证，其突变体筛选电泳鉴定结果如图3。
5、TaGS2-A/B、TaGS2-B/D和TaGS2-A/D双重基因缺失突变体植物的获得及鉴定
通过将TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D单基因缺失突变体进行杂交，获得TaGS2-A/B、TaGS2-B/D和TaGS2-A/D双重基因缺失突变体植株，分别命名为gs2-a gs2-b，gs2-b gs2-d和gs2-a gs2-d。
对双重突变体gs2-a gs2-b，gs2-b gs2-d和gs2-a gs2-d进行如步骤1的PCR体系及程序进行扩增，其扩增电泳分离结果见图3。
突变体的酶活性分析过程：选长势一致的植株，取第二片展开叶作为材料，用谷氨酰胺合成酶试剂盒（建成科技有限公司，南京）进行GS酶活性测定。谷氨酰胺和羟胺在谷氨酰胺合成酶的作用下可以生产γ–谷氨酰氧肟酸，通过显色反应可测定谷氨酰氧肟酸的含量。实验三次重复，取平均值。结果显示，gs2-a、gs2-b和gs2-d以及gs2-a gs2-b，gs2-b gs2-d和gs2-a gs2-d的谷氨酰胺合成酶活性均低于野生型Kn9204，见图4，其中双重突变体gs2-a gs2-b，gs2-b gs2-d和gs2-a gs2-d的酶活性较单突变体gs2-a、gs2-b和gs2-d更低，表明TaGS2基因的缺失突变对GS的酶活性有很大影响。
所取每株系20个单株测定GS活性，从图4中株系间平均结果显示，单基因缺失突变体酶活略有下降，而双重突变体较野生型下降51.6-59.2%。
6、TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D单基因和双重基因缺失突变体的表型观察
将筛选获得的TaGS2突变体材料在中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心栾城农业实验站（N 37°53'，E 114°41'，海拔50.1 m）田间种植；设计行长4m，行距25cm，株距10cm，正常供氮区域种植；以野生型科农9204作为对照，设三组实验重复；试验区四周设保护行，田间统一管理；实验重复两年，6月15-20日成熟期收获，调查表型，结果取平均值。
对植株株高进行观察结果见图6。如图6所示，与野生型（WT）科农9204相比，TaGS2-A、TaGS2-B和TaGS2-D基因缺失突变体gs2-a、gs2-b和gs2-d株高较低，TaGS2-A/B、TaGS2-B/D和TaGS2-A/D双重基因缺失突变体gs2-a gs2-b、gs2-b gs2-d和gs2-a gs2-d株高最低。
野生型及单/双突变体每系20株收获后考种，结果如图6所示：TaGS2单基因突变体的株高降低，其TaGS2双基因突变体的植株株高降低减少21.2-14.4%。
由此可以得到分子标记IN10为与小麦株高相关TaGS2基因的分子标记。
实施例2 分子标记IN10在检测筛选小麦品种或品系株高中的应用
（1）用IN10的标记引物（上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1、下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2）对小麦品种科农9204为亲本的F6代RIL群体的188个衍生品系的DNA分别进行PCR扩增，其PCR扩增体系为20 μl，包括：2×Taq PCR MasterMix 10μl，上、下游引物各1μl，待测小麦的DNA模板1μl，其余用ddH2O补足；PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min/kb，30个循环；72℃后延伸7 min；20℃保存；
（2）将上述扩增产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶是指100ml聚丙烯酰胺凝胶溶液中含有5.85 g丙烯酰胺和0.15 g甲叉丙烯酰胺）上120V稳压电泳分离后，如获得的扩增产物中仅出现分子量为555bp、466bp和426bp中任意一条带，则该小麦与科农9204相比，为显著矮于kn9204株高的品种或品系，如获得的扩增产物中同时出现分子量分别为555bp、466bp和426bp中的任意两条带，则该小麦为较矮于kn9204株高的品种或品系；如获得的扩增产物中同时出现分子量为555bp、466bp和426bp的三条带，则该小麦为与对照品种科农9204株高基本一致的品种或品系。
本发明提供的与小麦株高相关的分子标记在科农9204为母本的F6代RIL群体的188个衍生品系中的应用，它包括以下步骤：
（ⅰ）以IN10的分子标记引物扩增得到的电泳产物出现分子量466bp、426bp和555bp三条带的小麦品种科农9204为母本、以IN10的分子标记引物扩增得到的电泳扩增产物出现分子量466bp、426bp和590bp三条带的小麦品种京411为父本进行杂交得到杂种F1，F1自交产生的F2，采用单粒传法获得含有188个家系的F6代RIL群体；
  （ⅱ）用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取上述RIL群体各株系的DNA，采用与小麦株高相关的IN10的标记引物将获得的DNA进行PCR扩增，扩增产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压120 V电泳分离，银染法检测其扩增片段大小，获得所述RIL群体的基因型值材料。
（ⅲ）根据群体的基因型值，将群体所含品系分成两类：分类A含92个系，其扩增产物与科农9204的扩增产物完全一致，即IN10的扩增产物出现分子量466bp、426bp和555bp三条带；分类B含96个系，其扩增产物与科农9204的扩增产物不完全一致，即IN10的扩增产物出现分子量466bp、426bp和590bp三条带。
（ⅳ）将RIL群体进行了两年共8个试验环境的田间种植及表型鉴定，分别考察不同年份、不同地点及不同氮水平处理条件下的各个株系的株高，其中8个环境即：2011–2012、2012–2013连续2年在中国科学院栾城农业生态系统试验站（T1及T2：37°53’N，114°41’E）、2012–2013年在中国科学院遗传与发育生物学研究所北京平西府农场（T3：40°06’N，116°24’E）及河南省新乡市业科学研究院辉县试验基地（T4：35°27’N，113°48’E）种植，每试验环境分高氮（High nitrogen，HN）和低氮（Low nitrogen，LN）两个处理。
其中LN处理，全年不施肥；而HN处理，每年播种前施300 kg·hm-2磷酸二胺和225 kg·hm-2尿素作为底肥，拔节期施150 kg·hm-2尿素追肥。
其中小麦种植方法：每个系种植2行，每行播40粒；行长3m，株距7.5 cm，行距25 cm，正常生长及收获；株高测定方法：测量植株地上部底端到穗部顶端的长度（不包括芒长），以厘米（cm）为单位。
具体结果如下：
采用与小麦株高相关的IN10的标记引物对科农9204为母本的F6代RIL群体的188个衍生品种（系）的基因型和株高进行分析，结果如表1所示。
表1 科农9204为亲本的F6代RIL群体的188个衍生品系的表型结果

注：* 表明A类和B类表型在P <0.5有显著差异； ** 表明表型在P <0.1有显著差异；*** 表明表型在P <0.01有显著差异。
从表1可以看出，所有环境中，在IN10位点与科农 9204基因型完全一致的分类A（即用IN10的标记引物扩增，得到扩增产物出现分子量466bp、426bp和555bp三条带）所含系的株高均显著高于与科农9204基因型不一致的分类B（即用IN10的标记引物扩增，得到扩增产物出现分子量466bp和426bp两条带）所含系的株高；上述结果表明分子标记IN10为与小麦株高紧密相关的分子标记，该分子标记可以用于小麦株高分子标记辅助选择育种程序之中。该标记用于小麦株高分子标记辅助选择育种可大大提高了目标株高类型小麦品种选育的选择效率和质量。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  中国科学院遗传与发育生物学研究所
 
<120>  与小麦株高相关的TaGS2基因的分子标记、获取方法及其应用
 
<130> 
 
<160>  4    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  21
<212>  DNA
<213>  分子标记IN10上游引物
 
<400>  1
tggctgccac acaaattaca g                                               21
 
 
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  分子标记IN10下游引物
 
<400>  2
ccttcttgat cacgtcgaaa c                                               21
 
 
<210>  3
<211>  22
<212>  DNA
<213>  扩增TaGS2的cDNA的上游引物
 
<400>  3
tcctccctcg tctcgtccgc gt                                              22
 
 
<210>  4
<211>  22
<212>  DNA
<213>  扩增TaGS2的cDNA的下游引物
 
<400>  4
agtgccccga cggaaccaca gg                                              22