一种植物甾醇转化为雄烯二酮转化效率的提高方法.pdf

一种由植物甾醇组合物为底物制备雄甾-4烯-3，17二酮和/或雄甾-1，4-双烯-3，17-二酮的方法，其特征在于在具有诺卡氏菌属或分支杆菌属微生物和发酵需要培养基的反应器加入植物甾醇组合物，调节pH值大于7，在20-37℃之间进行发酵，使植物甾醇组合物转变为雄甾-4烯-3，17二酮和/或雄甾-1，4-二烯-3，17二酮，在转变过程中处于电场中。

权利要求书
1.  一种由植物甾醇组合物为底物制备雄甾-4烯-3，17二酮和/或雄甾-1，4-双 烯-3，17-二酮的的方法，其特征在于在具有诺卡氏菌属或分支杆菌属微生 物和发酵需要培养基的反应器加入植物甾醇组合物，调节PH值大于7，在 20-37℃之间进行发酵，使植物甾醇组合物转变为雄甾-4烯-3，17二酮和/ 或雄甾-1，4-二烯-3，17二酮，在转变过程中处于电场中。

2.  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于植物甾醇组合物在发酵液中的浓 度为10-100g/L。

3.  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于电场强度为10-500伏特/米。

4.  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于雄甾-4烯-3，17二酮与雄甾-1， 4-二烯-3，17二酮的重量比大于等于17。

5.  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于发酵温度为20-30℃。

6.  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于发酵反应时间为20-50小时。

7.  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于反应中PH在7.0-9之间。

8.  权利要求1所述的制备方法，其特征在于培养基含有琼脂、碳源、氮源、PH 调节剂、酶诱导剂、酶促进剂、水中的一种或几种。

9.  权利要求1所述的制备方法，其特征在于反应器加入植物甾醇组合物前加入 乳化剂。

10.  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于分支杆菌属微生物为 Mycobacterium NRRL B-3805、Mycobacterium NRRL B-3683、Mycobacterium  VKMA c-1815D、Mycobacterium fortuitum.NRRL B-8153。

说明书一种植物甾醇转化为雄烯二酮转化效率的提高方法
发明领域
本发明涉及一种以弱电场促进植物甾醇转化为雄甾化合物的发酵方法，特别是制备雄甾 -4-烯-3，17-双酮的方法。
背景技术：
雄甾4-烯-3，17-双酮(androst-4-ene-3，17-dione，简称：雄烯二酮或AD)是甾体激素类药 物不可替代的中间体，对机体起着非常重要的调节作用。可以说几乎所有甾体激素药物都是 以AD作为起始原料进行生产的。如用于生产性激素、孕激素、蛋白同化激素及皮质激素，又 可用于合成氢化可的松，氧化泼尼松，黄体酮、雌烯醇、地塞米松等100余种药物，也是直接 用于生产抗早孕药米非司酮和各类计划生育用药的必不可少的基本原料。如今AD不断被一些 发达国家用于开发和生产新的医药主品，如福美司坦(Formestane或Lentaron)，等及类固醇类 激素免疫抗原等，目前全世界范围内，AD的应用领域日益拓宽，用AD做原材料生产的医药 品种不断增加。
由于化学全合成雄烯二酮成本较高，国内外很多科学家一直研究如何通过生物发酵方法 得到雄烯二酮。50年代，美国Upjohn公司首先利用侧链上有双链的大豆甾醇和麦角甾醇为原 料生产出雄甾-4-烯-3，17二酮(AD)及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)并以此作为合成甾体 药物的原料。近年来，由于甾体药物应用量逐年增加，人们的目光又转到在动植物界中含量 较多的胆甾醇，谷甾醇，菜油甾醇等，并被认为是具有巨大潜能的甾体激素类药物的起始原 料。20世纪60年代中期，由Sih等首先发现有些微生物可以选择性降解切除甾醇的饱和侧链而 得到AD和ADD，70年代初，日本的有马启利用微生物降解胆甾醇生产ADD获得成功，受到 许多制药公司的高度重视。为了大量生产类固醇激素，研究者试图使用甾醇为唯一碳源分离 微生物和改变甾醇结构用作发酵的底物，并用能防止甾醇核降解的化学添加剂来提高类固醇 的收得率，这一努力己获得很大进展(Marsheck等，Aplied Microobiology，23(1)：72～77，1972)。 此外，埃及国家研究中心生物与天然产品化学系的和Sallam等研究发现，利用磷酸盐缓冲液 调节底物培养基pH值5.5～7.38可提高生物降解AD、ADD的转化率。Upjohn公司在美国专利 No.4,293,644中描述了一种通过分枝杆菌(ATCC29472)的突变株从多种类固醇中得到以 高产量的雄-4-烯-3，17-二酮(AD)为主，并有少量雄-1，4-二烯-3，l7-二酮(ADD)的产物的方 法。以后的研究发现节杆菌，诺卡氏菌和分枝杆菌等微生物均可用于直接切除甾醇的饱和侧 链，在一定条件下得到AD和ADD，这使得微生物转化工业化生产成为可能。
由于生物发酵方法研究较多的是菌种，但发酵效果除了与菌种本身密切相关外，菌种在 发酵过程中所使用的方法也十分重要。杨英在文章中指出（微生物降解甾醇侧链转化雄甾-4- 烯-3，17-二酮的研究进展，微生物学通报，2006年33(6)，142-145）甾醇底物在水溶液培养 基中溶解度差和存在严重的产物(底物)抑制的问题一直困扰了整个甾类工业，甾醇是一种疏 水性化合物,在水中溶解度极低,这就导致底物与微生物细胞不能很好的接触,使转化率偏 低及转化时间延长。采用超声破碎、表面活性剂及有机溶剂来溶解底物虽然取得了一定成果, 但表面活性剂和有机溶剂对细胞的活性有一定的抑制从而制约了它的应用。
分支杆菌(Mycobacterium sp.)是一种可以使植物甾醇发酵而得到雄甾-4-烯-3，17二酮(AD) 及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的重要菌种，其发酵过程也存在上述问题。
同时利用分支杆菌进行发酵，时间较长，往往长达72小时，多篇文献对此均进行了可介 绍，例如CN03804973，而长时间发酵的问题在于首先是容易造成微生物过分发酵，将得到的 AD/ADD转化为9α-羟基睾酮甚至将甾环降解，其次是反应时间过长会使杂菌增加，而培养菌 的转化专一性下降，从而增加杂质，第三长时间反应还会造成生产周期、制造成本、人工成 本等上升，不利于工业化。
弱电场在植物甾醇发酵过程方面的应用研究目前还未发现。
发明内容：
本发明提供了一种由植物甾醇组合物为底物制备雄甾-4烯-3，17二酮和/或雄甾-1，4-双 烯-3，17-二酮的的方法，在具有诺卡氏菌属或分支杆菌属微生物的反应器加入植物甾醇组合 物，调节PH值大于7，在20-37℃之间进行发酵，使植物甾醇组合物转变为雄甾-4烯-3，17 二酮和/或雄甾-1，4-二烯-3，17二酮，在发酵过程中通过弱电场可以促进植物甾醇转化，转 化时间缩短1/3以上，还可以通过控制弱电场强度，更好的控制雄甾-4烯-3，17二酮与雄甾 -1，4-双烯-3，17-二酮的比例，提高雄甾-4烯-3，17二酮的含量。
一种由植物甾醇组合物为底物制备雄甾-4烯-3，17二酮和/或雄甾-1，4-双烯-3，17-二酮 的的方法，其特征在于在具有诺卡氏菌属或分支杆菌属微生物和发酵需要培养基的反应器加 入植物甾醇组合物，调节PH值大于7，在20-37℃之间进行发酵，使植物甾醇组合物转变为 雄甾-4烯-3，17二酮和/或雄甾-1，4-二烯-3，17二酮，在转变过程中处于电场中。
上所述的制备方法，其特征在于植物甾醇组合物在发酵液中的浓度为10-100g/L。
上述的制备方法，其特征在于植物甾醇组合物在发酵液中的浓度为25-70g/L。
上述的制备方法，其特征在于植物甾醇组合物在发酵液中的浓度为60-100g/L。
上述的制备方法，其特征在于电场强度为10-500伏特/米，优选场强度为30-100伏特/米， 更优选电场强度为50-100伏特/米。
上所述的制备方法，其特征在于雄甾-4烯-3，17二酮与雄甾-1，4-二烯-3，17二酮的重 量比大于等于17，优选大于等于18。
上述的制备方法，其特征在于采用分支杆菌属微生物。
所述制备方法，发酵温度为20-30℃。
所述制备方法，发酵反应时间为20-50小时，优选为20-40小时。
所述制备方法，反应中PH在7.0-9之间，优选在7.5-8之间。
所述制备方法，分支杆菌属微生物发酵需要培养基培养。所述培养基含有琼脂、碳源、 氮源、PH调节剂、酶诱导剂、酶促进剂、水中的一种或几种。
所述氮源为大豆粉、棉籽粉、酪蛋白的胰酶消化物、鱼粉、玉米浆、肉膏、蛋白质、带 有奶固形物的自溶啤酒酵母、蛋白胨、酵母膏、水解酪蛋白、硝酸盐和/或铵类、乳清中的一 种或几种。
所述碳源为碳水化合物，优选为甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、肌醇、糊 精、蜜糖、淀粉、乳清中的一种或几种。
所述PH调节剂为碳酸钙、碳酸氢钠、磷酸盐中的一种或几种。
所述于酶诱导剂为植物甾醇组合物。
所述酶促进剂含有Mn2+、Fe2+、Co2+、Mg2+、PO43-、Ni2+、2，2’-联吡啶，8-羟基喹 啉中的一种或几种，优选为硫酸锰、硫酸镁、硫酸铜、氯化钙、氯化钴、磷酸氢二钾、磷酸 二氢钾中的一种或几种。
上述的制备方法，其特征在于反应器加入植物甾醇组合物前加入乳化剂。
上述的制备方法，其特征在于反应器加入植物甾醇组合物前加入乳化剂，乳化剂为合成 乳化剂、植物油类乳化剂中的一种或几种。上述的制备方法，其特征在于合成乳化剂为聚二 醇的脂肪酸酯、乙烯氧基加成化合物或商品名为Tegin，Tween和Span的乳化剂中的一种或 几种。上述的制备方法，其特征在于植物油类乳化剂为葵花籽油、玉米油、花生油、大豆油、 棉籽油中一种或几种。
所述分支杆菌属微生物为Mycobacterium NRRL B-3805、Mycobacterium NRRL B-3683、 Mycobacterium VKMA c-1815D、Mycobacterium fortuitum.NRRL B-8153。
所述诺卡氏菌属微生物是Nocardia.aliena MCI-0710。
所述植物甾醇组合物来自加工植物油的副产物，所述植物油选自大豆油、菜籽油、玉米 油、棉籽油、葵花籽油、橄榄油、亚麻籽油、米糠油中的一种或多种。
所述植物甾醇组合物是植物油和植物甾醇组合物的混合物，所述植物油来自大豆油、菜 籽油、玉米油、棉籽油、葵花籽油、橄榄油、亚麻籽油、米糠油中的一种或多种。优选大豆 油。
以下的详细说明帮助本领域技术人员实施本发明。然而，此详细说明并不解释为对本发 明范围的过度限制。本领域普通技术人员可以对在此讨论的实施例进行修饰和变化而不背离 本发明范围的精神。在本发明中，该营养培养基适用于植物甾醇生物转化为AD和ADD所涉及 各种微生物，包括分枝杆菌和诺卡氏菌。本领域中还有许多已知和可用微生物，本发明并不 限制于其中的任何一个。
细菌发酵培养按其用途可分为孢子培养、种子培养、发酵培养三个过程，但这三个过程 可以再同一个反应器中完成，也可以在不同的反应器中完成，甚至三个过程可以合并。
孢子培养是供菌种繁殖孢子的过程，是能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要 求不易引起菌种发生变异。所以对孢子培养基的基本配制要求是：第一，营养不要太丰富（特 别是有机氮源），否则不易产孢子。如灰色链霉在葡萄糖－硝酸盐－其它盐类的培养基上都 能很好地生长和产孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只长菌丝而不长孢子。第二， 所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子量和孢子颜色。第三，要注意孢子培养基的pH 和湿度。生产上常用的孢子培养基有：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培 养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制成的琼脂斜面培养基。大米和小米常用作霉 菌孢子培养基，因为它们含氮量少，疏松、表面积大，所以是较好孢子培养基。大米培养基 的水分需控制在21%－50%，而曲房空气湿度需控制在90%－100%。一般该类培养基主要是 在实验室内进行菌种传代使用，不参与工业化发酵过程。
种子培养是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种 子”为目的。所以种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些， 但总浓度以略稀薄为好，这样可达到较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖。种子培养基的成 分要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的pH，其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。 一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。但 无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机及无机氮源。种 子培养基的成分最好能较接近发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快 速生长。
发酵培养是供菌种生长、繁殖和合成产物的过程。它既要使种子接种后能迅速生长，达 到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌 体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但若因生 长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的 最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。发酵培养基也可以叫做生物 转化培养基或发酵转化培养基。
如果需要，可以加入磷酸盐，镁和/或亚铁离子作为促生长因子；还可加入缓冲液以确 保生长在基本中性的pH。开始时，消泡剂可能是有益的。当用于诱导发酵的是分离的细胞或 酶而不是完整和生长的微生物时，不需要营养物质的存在；但是无论是何种情形，培养基通 常主要为含水的。
在此使用的术语“植物甾醇”包括所有的甾醇并且没有限制，例如：谷甾醇，莱油甾醇， 豆甾醇，菜籽甾醇（包括二氢菜籽甾醇）,链甾醇，chalinosterol，多孔甾醇，穿贝海绵甾醇， 麦角甾醇，粪甾醇，科迪甾醇（codisterol)，异岩藻甾醇（isorucosterol)，岩藻甾醇，桐甾醇， 神经甾醇（nervisterol),7-烯胆甾烷醇，星鱼甾醇，菠菜甾醇，chondrillasterol，peposterol，燕 麦甾醇，异燕麦甾醇，fecosterol，Pollinastasterol，胆甾醇以及它们的所有天然或合成形式和 衍生物，包括异构体.并且包括它们所有的氢化对应物（“植物甾烷醇(Phytostanols)”）。植 物甾烷醇包括所有饱和或氢化的植物甾醇以及它们的所有天然或合成形式和衍生物，包括异 构体。当在说明书全文中存在疑问时，需要了解的是术语“植物甾醇”可包含植物甾醇和植物 甾烷醇两者。
用于本发明生物转化的甾醇和甾烷醇（stanols）可以通过许多种天然来源获得。例如， 它们可以从植物油（包括水生植物）的加工中获得，所述植物油如玉米油和其它植物油，麦 胚芽油，大豆提取物，大米提取物，米糠，菜籽油，葵花籽油，芝麻油。它们也可以衍生自 真菌，例如麦角甾醇。因此，本发明并不限于甾醇的任何一个来源.美国专利4,420,427中公 开了使用溶剂如甲醇从植物油渣中制备甾醇。或者，植物甾醇和植物甾烷醇可以来自林业加 工副产品妥尔油树脂（tall oil pitch）或制浆皂（pulping soap)，如美国专利5,770,749中所述， 在此引入作为参考。
本专利中AD（D）的意思是AD和/或ADD。
在本发明中的发酵过程，可以将溶解于适宜溶剂中的或乳化形式的底物(植物甾醇组合物) 和微生物培养物一起加入生物反应器中。进行发酵直到达到最大底物转化，即植物甾醇转化 为AD(D)。
上述发酵方法尤其适用于分枝杆菌属（Mycobacterium）的微生物。
只要能促进植物甾醇底物在溶剂中混合，从而最优化微生物培养物对底物的利用率，可 以使用任何乳化剂。例如包括但并不局限于聚二醇的脂肪酸酯或乙烯氧基加成化合物和商品 名为Tegin，Tween和Span的乳化剂。
或者，可以使用增溶剂溶解植物甾醇组合物以形成澄清溶液，从而提供与在生物转化中 所用微生物良好的接触。所选的适宜的增溶剂包括二醇(glycol)类和硅氧烷类增溶剂，它们能 使高浓度的植物甾醇被溶解于营养培养基中。这将使其与微生物良好接触，减少发酵时间， 并得到最终产物的相对高收率。优选先前已知的增溶剂例如葵花籽油、大豆油。
这种适用于植物甾醇生物转化为AD和ADD所涉及细菌的培养基，其包含玉米浆和无机 盐。而无机盐为优选硝酸钠和磷酸铵，更优选磷酸铵：硝酸钠为10:40-99。
上述培养基优选含有葡萄糖的种子培养基。
上述所有培养基可以加入磷酸盐、镁和/或亚铁离子、缓冲液，其中的一种或多种。
上述所有培养基，其每升培养基含有玉米浆5-50ml。
上述培养基，其每升培养基含有无机盐4-10g。
上述所有培养基，其每升发酵培养基含有葡萄糖5-15g。
上述所有培养基，其每升培养基含有玉米浆5-50ml，无机盐4-10g，葡萄糖5-15g。
上述培养基如是种子培养基，则含有葡萄糖；上述培养基如是发酵培养基，则可以不含 葡萄糖。
在发酵方法中，优选温度维持在大约20-37℃的范围内，更优选25-35℃。发酵或转化 过程一旦完成，即用本领域已知和常规的方法回收AD(D)。
具体实施方式
以下的实施例代表实验室试验.然而，每个都能使用已知的工业技术扩展用于工业规模 的应用以实施本发明。
以下的实施例中菌种中提到的NRRL是美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research  Service Culture Collection)的缩写，该中心是国际菌种保藏机构之一。
下述实施例中的植物甾醇是从市场上购买的含量大于95%的产品。
AD和ADD的总含量（%）是指使用该玉米浆作为培养基发酵植物甾醇得到的AD和ADD 的总含量。
本发明中电场强度单位伏特/米，简称为V/M。
实施例1
实施例1-1-a
菌种：分枝杆菌:Mycobacterium fortuitum.NRRL B-8153。
取10个不同批号的玉米浆按照本实施例中的数量和工艺分别进行发酵。除玉米浆外其他的物 料均为同一批物料。
种子培养阶段：
种子培养基(每升)：
40ml 玉米浆
5.2g NaNO3，
0.8g NH4H2PO4
5.3g 葡萄糖
其余为无菌水
培养基量：200ml/烧瓶
接种物量：每200m1新培养基接种来自琼脂斜面的3ml细胞悬液
容器：1000ml锥形瓶
搅拌：振荡器(1”throw)200rpm
温度：30℃
生长时间：72小时培养
注解：如果在底部有黄色细胞沉淀形成则表示为良好的培养物生物
方法：
在培养基中制备用于生物转化的接种物。从琼脂料面（在玻璃试管中培养）接种锥形瓶， 在无菌条件下进行接种，移取无菌水（5mL）到琼脂抖面上.用移液管末端轻轻刮下细菌培 养物.然后移取该混悬培养物并放入锥形瓶中.在旋转振荡器上进行细菌增殖 （200rpm,l″throw,30度）。在培养72小时后，此种子培养物即可转移至生物反应器中。在接种 前对种子培养物长期储存是不可取的。在操作中，还可以针对种子进行二级乃至三级培养， 将种子培养好，当进入发酵培养基后发酵的时间可以适当延长，以获得更好的生物转化率。 甾体发酵培养基(每升)：
40ml 玉米浆
5.2g NaNO3，
0.8g NH4H2PO4
其余为无菌水
底物：30.0g植物甾醇(3.0％)
乳化剂：葵花籽油150ml
在使用前一天，必需量的玉米浆与水(100ml)混合并在锥形瓶中灭菌(121℃持续20分钟)。
在烧瓶或烧杯中混合水(500ml)和培养基组分(除植物甾醇和葵花籽油以外)。用1M NaOH 溶液(40g/L NaOH)调培养基的pH值至8.0，将培养基转移至生物反应器中，随后加热至 60-70℃。
在烧杯中称重植物甾醇(30g)，加入葵花籽油，加热边搅拌混合物，将上述葵花籽油倒入 生物反应器中已加热的液体培养基中(60-70℃)，补无菌水至1L，无需搅拌。
将发酵罐灭菌(121℃持续30分钟)，然后冷却至30℃。使用上述培养基3L。
在发酵罐中使用分枝杆菌进行的生物转化：
在带有有效底部搅拌的不锈钢发酵罐中进行生物转化实验。所用发酵罐的主要参数为： 发酵罐总体积10升，工作体积3升，接种物量以0.4L，通气量0.3L/L/min，搅拌300rpm。
将发酵罐中培养基的温度调至30℃，在无菌条件下加入接种物。接种完成后进行在发酵 罐中施加电场，电场功率见下表，整个过程在30±2℃进行。从此阶段开始到最后都监测该过 程的pH值和无菌度。10小时以后开始监测底物(植物甾醇)和产物AD(D)。此过程中生物转 化混合物的pH值通常在1pH单位内变化并未校正。通过分析(HPLC)2小时内当泡沫层中的 产物AD和ADD的总含量达到不变时，被认为已经完成生物转化，此是AD和ADD的总含 量，具体发酵时间见下表。
HPLC测定AD（D）与植物甾醇的比例：
发酵液用1，2-二氯乙烷抽提，减压浓缩后稀释适当倍数，10000r/min离心除去可能的不 溶物，然后高压液相层析色谱柱：Alltima(4.6mm(内径)×250mm)5μm。流动相：石油醚：乙 酸乙酯＝6：4，流速：1.0mL/min，温度：室温，检测波长：240nm。
结果见下表

实施例2
实施例2-1-a
取10个不同批号的玉米浆按照本实施例中的数量和工艺分别进行发酵。除玉米浆外其他的物 料均为同一批物料。
本实施例工艺与实施例1-1-a的方法相同，检测方法相同，但菌种改为分枝杆菌:Mycobacterium  sp NRRL—B3683，培养基改为如下：
种子培养阶段：
种子培养基(每升)：
10ml 玉米浆
8.7g NaNO3，
0.3g NH4H2PO4
15g 葡萄糖
Na2HPO4和NaH2PO4的缓冲液调pH至7.0
其余为无菌水
培养基量：200ml/烧瓶
接种物量：每200m1新培养基接种来自琼脂斜面的3ml细胞悬液
容器：1000ml锥形瓶
搅拌：振荡器(1”throw)200rpm
温度：30℃
生长时间：72小时培养
甾体发酵培养基(每升)：
10ml 玉米浆
8.7g NaNO3，
0.6g NH4H2PO4
Na2HPO4和NaH2PO4的缓冲液调pH至7.0
其余为无菌水
底物：20.0g植物甾醇(2.0％)
乳化剂：大豆油200ml
实验结果见下表

实施例3
实施例3-1-a
取10个不同批号的玉米浆按照本实施例中的数量和工艺分别进行发酵。除玉米浆外其他的物 料均为同一批物料。
本实施例工艺与实施例1-1-a的方法相同，检测方法相同，但菌种改为分枝杆菌:Mycobacterium  sp NRRL—B3805，培养基改为如下：
种子培养阶段：
种子培养基(每升)：
25ml 玉米浆
4g NaNO3，
1g NH4H2PO4
1g FeCl2
15g 葡萄糖
Na2HPO4和NaH2PO4的缓冲液调pH至7.0
其余为无菌水
培养基量：200ml/烧瓶
接种物量：每200m1新培养基接种来自琼脂斜面的3ml细胞悬液
容器：1000ml锥形瓶
搅拌：振荡器(1”throw)200rpm
温度：30℃
生长时间：72小时培养
甾体发酵培养基(每升)：
25ml 玉米浆
4g NaNO3，
1g NH4H2PO4
1g FeCl2
Na2HPO4和NaH2PO4的缓冲液调pH至7.0
其余为无菌水
底物：植物甾醇重量见下表
乳化剂：150ml玉米油
实验结果见下表


实施例4
实施例4-1-a
取10个不同批号的玉米浆按照本实施例中的数量和工艺分别进行发酵。除玉米浆外其他的物 料均为同一批物料。
本实施例工艺与实施例1-1-a的方法相同，检测方法相同，但菌种改为诺卡氏菌:Nocardia. aliena MCI-0710(JP54067098,JP54067099中介绍)，培养基改为如下：
种子培养阶段：
种子培养基(每升)：
50ml 玉米浆
9.9g NaNO3，
1g NH4H2PO4
0.3g MgCl2
12g 葡萄糖
Na2HPO4和NaH2PO4的缓冲液调pH至7.0
其余为无菌水
培养基量：200ml/烧瓶
接种物量：每200m1新培养基接种来自琼脂斜面的3ml细胞悬液
容器：1000ml锥形瓶
搅拌：振荡器(1”throw)200rpm
温度：30℃
生长时间：72小时培养
甾体发酵培养基(每升)：
50ml 玉米浆
9.9g NaN03，
1g NH4H2PO4
0.3g MgCl2
Na2HPO4和NaH2PO4的缓冲液调pH至7.0
其余为无菌水
底物：20.0g植物甾醇(2.0％)
乳化剂：葵花籽油150ml
实验结果见下表


通过上述实施例证明，在发酵过程中使用电场刺激，可以促进发酵的效果，当注 入电场极微弱时，发酵效果下降的主要原因是能量沉积效应和动量传递效应综合作用的结果。 因为小剂量下低能离子的直接作用可导致DNA的损伤，能量沉积所产生的大量自由基亦会 导致DNA和生物膜等其他生物大分子的损伤，从而都造成细菌存活率、发酵效果下降。在 较高强度下，大量连续注入电荷的堆积会产生很强的库仑斥力，这种库仑斥力能对被注入细 胞形成一个“保护屏障”，阻碍离子对细胞的损伤，从而达到对细胞的保护作用；而且大量 堆积的电荷可形成一个弱电场，这种电场的刺激效应可以激活菌体内的各种酶，尤其是修复 酶，从而提高了损伤修复的效率，存活率又有所回升。当剂量继续增大时，能量沉积和动量 传递所造成的DNA和生物膜等其他生物大分子的严重损伤已超出了其所具有的修复能力， 聚集于细胞表面的电荷产生库仑爆炸，使细胞失去了电荷屏蔽而使存活率急剧下降。