一种预示和鉴定西瓜果肉颜色的分子标记MBOII33及应用.pdf

本发明公开了一种预示和鉴定西瓜果肉颜色的分子标记MboII-33及应用，属于分子生物学技术领域。本发明所提供的分子标记扩增出的PCR产物片段大小为524bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所公开的CAPS分子标记在不同材料中具有通用性，在西瓜苗期即可对其进行鉴定，操作简便结果明确，可以用于今后西瓜高番茄红素的分子标记辅助选择，并加快育种工作效率。

权利要求书
1.  一种预示和鉴定西瓜果肉颜色的分子标记MboII-33，其特征在于，分子标记扩增出的PCR产物片段大小为524bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.  权利要求1所述分子标记MboII-33，其特征在于，位于西瓜番茄红素β-环化酶cds区段，该区段的GenBank登录号为ABM90917.1，与西瓜番茄红素β-环化酶基因紧密连锁。

3.  权利要求1所述分子标记MboII-33，其特征在于，所述分子标记的鉴别引物对正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.  权利要求1所述分子标记MboII-33，其特征在于，应用于鉴定和辅助筛选西瓜的果肉颜色。

5.  权利要求4所述应用，其特征在于，是提取待测样品的DNA后，利用鉴别引物对进行PCR扩增，再利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后利用电泳对酶切产物进行检测。

6.  权利要求4所述应用，其特征在于，步骤如下：
1)提取待测样品的DNA；
2)以待测样品的DNA为模板，利用鉴别引物对进行PCR扩增，获得扩增产物；
3)利用限制性内切酶对步骤2)所得的扩增产物进行酶切，获得酶切产物；
4)利用琼脂糖凝胶电泳对步骤3)所得的酶切产物进行检测。

7.  权利要求6所述应用，其特征在于，步骤2)所述鉴别引物对，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

8.  权利要求6所述应用，其特征在于，步骤2)所述PCR扩增，采用降落PCR，扩增程序为：94℃预变性7min，94℃变性30s，60℃退火30s，每循环降低0.5℃，72℃延伸40s，30个循环；94℃变性30s，45℃退火30s,72℃延伸40s,10个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

9.  权利要求6所述应用，其特征在于，步骤4)所述对酶切产物进行检测，是利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的产物中是否含有大小为524bp的条带，含有524bp条带的样品，不含有番茄红素，果肉颜色为非红色；不含有524bp条带的样品，含有番茄红素，果肉颜色为红色。

10.  一种权利要求1所述分子标记MboII-33的获得方法，其特征在于，步骤如下：
1)选择一个浅黄色西瓜品系和一个红色西瓜品系；
2)利用高通量测序技术对步骤1)所选的两个品系的西瓜进行测序，并将所得序列与西瓜番茄红素β-环化酶基因cds区段的序列进行比对，获得存在西瓜番茄红素β-环化酶基因cds区段的序列的染色体区间；
3)在步骤2)所得染色体区间内查找存在SNP突变的碱基区段，并分析SNP位点的酶切信息，获得存在CAPS突变的序列；
4)针对步骤3)所得的序列，设计引物；
5)利用步骤4)所得的引物以西瓜基因组DNA为模板进行TD-PCR扩增，获得扩增产物；
6)利用限制性内切酶对步骤5)所得的扩增产物进行酶切验证。

说明书一种预示和鉴定西瓜果肉颜色的分子标记MboII-33及应用
技术领域
本发明涉及一种预示和鉴定西瓜果肉颜色的分子标记MboII-33及应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
分子标记辅助选择是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。分子标记辅助选择成功的关键在于所获得的分子标记是否与待分析的性状相连锁以及是否在同一物种的不同材料间具有通用性。
西瓜的果肉颜色是西瓜品质构成的一项重要指标，西瓜果实中含有番茄红素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质等多种色素，不同色素的组成及含量的多少使西瓜果肉呈现出不同颜色。同时，西瓜果肉中的色素也具有对人体有益的生理功能，有研究表明，番茄红素具有高效的抗氧化活性，能有效的降低癌症和心脑血管的发病率，并可以作为一种功能性色素广泛的应用于功能食品、药品和化妆品中(Sahin K,Tuzcu M,Sahin N,et al.Nrf2/HO-1signaling pathway may be the prime target for chemoprevention of cisplatin-induced nephrotoxicity by lycopene.Food Chem Toxicol,2010,48(10):2670-2674；Mortensen A,Skibsted L H,Sampson J,et al.Comparative mechanisms and rates of free radical scavenging by carotenoid antioxidants.FEBS Lett,1997,418(12):91-97)。β-胡萝卜素可以减少脂质过氧化保护有机体不被破坏(Olson J A.Molecular actions of carotenoids.In:Canfield LM(ed).Carotenoids in Human Health,New Y ork.Academy of Sciences,1993.156-166)，叶黄素对维护视力有着重要的作用。因此通过分子标记辅助选择的方法高效的选育不同果肉颜色的西瓜品种是当前西瓜育种工作的主要部分。
随着DNA分子标记技术的快速发展，利用与植物相关基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，可以极大的加速主要性状的筛选和基因定位，从而大大提高育种选择效率。但是，西瓜的遗传距离较为狭窄，目前文献已公布的可用的分子标记数目较少且多态性较低，严重制约了西瓜主要农艺性状基因定位及相关分子标记的开发。
发明内容
为提供一个CAPS分子标记，用以对含有番茄红素和不含有番茄红素的西瓜植株进行分子标记辅助选择，本发明采取了以下技术方案：
本发明的一个目的在于提供一种预示和鉴定西瓜果肉颜色的分子标记MboII-33，该分子 标记扩增出的PCR产物片段大小为524bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。。
所述分子标记位于西瓜番茄红素β-环化酶cds区段，该区段的GenBank登录号为ABM90917.1，与西瓜番茄红素β-环化酶基因紧密连锁。
所述分子标记的鉴别引物对正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述分子标记MboII-33应用于鉴定和辅助筛选西瓜的果肉颜色。
所述应用是提取待测样品的DNA后，利用鉴别引物对进行PCR扩增，再利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后利用电泳对酶切产物进行检测。
所述应用的步骤如下：
1)提取待测样品的DNA；
2)以待测样品的DNA为模板，利用鉴别引物对进行PCR扩增，获得扩增产物；
3)利用限制性内切酶对步骤2)所得的扩增产物进行酶切，获得酶切产物；
4)利用琼脂糖凝胶电泳对步骤3)所得的酶切产物进行检测。
步骤2)所述鉴别引物对，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，步骤2)所述PCR扩增，采用降落PCR，扩增程序为：94℃预变性7min，94℃变性30s，60℃退火30s，每循环降低0.5℃，72℃延伸40s，30个循环；94℃变性30s，45℃退火30s,72℃延伸40s,10个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
优选地，步骤4)所述对酶切产物进行检测，是利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的产物中是否含有大小为524bp的条带，含有524bp条带的样品，不含有番茄红素，果肉颜色为非红色；不含有524bp条带的样品，含有番茄红素，果肉颜色为红色。
本发明的另一目的在于提供一种所述分子标记MboII-33的获得方法，该方法的步骤如下：
1)选择一个浅黄色西瓜品系和一个红色西瓜品系；
2)利用高通量测序技术对步骤1)所选的两个品系的西瓜进行测序，并将所得序列与西瓜番茄红素β-环化酶基因cds区段的序列进行比对，获得存在西瓜番茄红素β-环化酶基因cds区段的序列的染色体区间；
3)在步骤2)所得染色体区间内查找存在SNP突变的碱基区段，并分析SNP位点的酶切信息，获得存在CAPS突变的序列；
4)针对步骤3)所得的序列，设计引物；
5)利用步骤4)所得的引物以西瓜基因组DNA为模板进行TD-PCR扩增，获得扩增产物；
6)利用限制性内切酶对步骤5)所得的扩增产物进行酶切验证。
本发明利用CAPS分子标记引物通过PCR扩增获得与西瓜果肉颜色相关的DNA片段，再利用限制性内切酶对获得的片段进行酶切反应，由于两种不同颜色的西瓜材料在所获得的DNA片段中存在酶切位点的单碱基突变的差异。因此，存在单碱基突变的位点不会被限制性内切酶切开而获得一条大小为524bp的片段，不存在碱基突变位点的片段会被限制性内切酶切开，由于在该序列的166bp和510bp处均存在酶切位点，因此经两个位点酶切后，最终获得344bp(401-57)及123bp的两个片段，通过琼脂糖凝胶电泳可以清晰的将两中不同果肉颜色的西瓜材料进行区分。
本发明获得的CAPS分子标记，在不同的果肉颜色的西瓜材料中可以进行很好的区分，通过对分子标记所在染色体附近序列进行Blast比对的结果可知，该标记与西瓜番茄红素β-环化酶紧密连锁，因此，本发明获得了一个可以高效区分不同西瓜果肉番茄红色有无的分子标记，为今后西瓜番茄红素相关主效基因的定位奠定基础。
本发明获得的有益效果如下：
CAPS分子标记是以酶切位点单碱基突变产生多态性的分子标记，以其分布范围广泛、变异稳定成为基因定位及分子生物学研究的新一代标记，CAPS标记操作简便，结果易于观测且在相同物种间具有普遍适用性。
本发明根据高通量测序所得到的西瓜基因组数据，设计并开发与西瓜果肉颜色相关的CAPS分子标记。通过分子标记辅助选择的方法，在西瓜的幼苗期即可对西瓜果肉颜色进行辅助选择，大大提高了育种效率缩短育种年限。
此外，根据数据分析的结果，所开发CAPS分子标记与西瓜果实中番茄红素β-环化酶基因紧密连锁，因此，本发明获得了一个可用于鉴别西瓜果肉是否含有番茄红素的分子标记。
附图说明
图1为CAPS引物MboII-33在LSW-177、COS、F1及F2代群体中的酶切情况；
(1～3号泳道分别为LSW-177、COS及其杂交所获得的F1代植株的DNA通过CAPS标记MboII-33进行PCR反应所获得PCR产物片段(524bp)，4号泳道为D2000marker，5～6号泳道分别为LSW-177、COS及F1代PCR产物的酶切产物，5号泳道片段大小为344和123bp，6号泳道片段大小为524bp，7号泳道为524bp和344、123bp各一条，8～16号泳道为F2代中呈现红色果肉的西瓜单株的酶切产物，17～25泳道为F2代中呈现浅黄色果肉的西瓜单株的酶切产物，Marker为D2000marker，条带大小由上至下依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
实施例1引物设计及基因组DNA的提取
选用浅黄色西瓜品系Cream of Saskatchewan(简称“COS”)及红色西瓜品系LSW-177及其杂交获得的F1、F2代群体为实验材料验证CAPS标记鉴定西瓜果肉中是否存在番茄红素。结果如图1所示。
利用高通量测序技术对COS和LSW-177两个西瓜品系进行测序，并通过NCBI网站获取西瓜番茄红素β-环化酶基因的cds区序列，通过该序列与测序材料的比对，得到了存在西瓜番茄红素β-环化酶基因的cds区序列的染色体区间，在该区间内，挖掘测序数据存在SNP突变位点的碱基区段，分析SNP位点的酶切信息，获得存在CAPS突变的序列，在存在CAPS位点的序列上设计CAPS引物。引物长度在18～26bp，退火温度为56～60℃，GC含量为40％～60％。采集LSW-177，COS及其二者杂交获得的F1代、F2代植株的幼嫩真叶，利用改良的CTAB法提取基因组DNA。
实施例2PCR产物的获得
利用所获得的CAPS引物及基因组DNA进行PCR反应，PCR反应体系如表1所示(20μl)：
表1.PCR反应体系

采用降落PCR(touchdown PCR,TD-PCR)进行扩增，程序为：94℃预变性7min，94℃变性30s，60℃退火30s，每循环降低0.5℃，72℃延伸40s，30个循环；94℃变性30s，45℃ 退火30s,72℃延伸40s,10个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
利用1％琼脂糖凝胶电泳对所获得的PCR产物进行检测，检测结果如图1所示，LSW-177、COS、F1以及F2单株均扩增出一条大小为524bp的片段，与预期的片段大小一致。
实施例3对PCR产物进行酶切验证
按照Thermo的限制性内切酶操作指南用限制性核酸内切酶，对所获得的PCR产物进行酶切验证,酶切体系如表2所示：(15.3μl)
表2.酶切反应体系

37℃水浴酶切过夜，酶切产物采用1％琼脂糖电泳进行检测，检测结果如图1所示。LSW-177由于不存在酶切位点，没有被限制性内切酶切开仍为524bp，COS中由于存在酶切位点，被MboII切开并获得了344、123bp的片段。F1代表现出共显性特征既包含LSW-177的一条524bp长度的片段，又包含344及123bp长度的片段。在供试的18株F2代单株中，有9株田间表型表现为红色，并可以在果肉组织中检测到番茄红素，酶切产物条带为344、122bp，其余9株表现为非红色，并且在果肉组织中检测不到番茄红素，酶切产物条带为524bp。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。