检测RS632793位点的方法及冠心病左心室收缩功能不全相关基因的检测试剂盒.pdf

检测rs632793位点的方法及冠心病左心室收缩功能不全相关基因的检测试剂盒，本发明涉及分子生物学和医学领域。本发明公开了一种检测NPPA/NPPB基因座启动子中rs632793位点的方法，它包括检测个体的心房钠肽（NPPA）/脑钠肽（NPPB）rs632793位点的基因型。本发明还公开了相应的检测试剂盒。本发明的检测方法简便易行，成本低廉，高效快速，结果明了。本发明可以大大减轻患者的负担，为左心室收缩功能不全患者的用药方案提供了参考。

权利要求书
1.  一种检测NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型的方法，其特征在于，该方法包括步骤：
（a）用NPPA/NPPB基因座启动子的特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；
和
（b）检测(a)所得的扩增产物中单核苷酸多态性位点rs632793的基因。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单核苷酸多态性的位点是rs632793；rs632793位于NPPA/NPPB基因座启动子中。

3.  如权利要求1或者2所述的方法，其特征在于，所述的NPPA/NPPB基因座启动子的特异性引物的序列如SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示。

4.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增中，退火延伸的温度为60℃。

5.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增产物的序列如SEQ ID NO6所示。

6.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括利用与位点rs632793结合的探针检测NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型。

7.  一种针对冠心病病人左心室收缩功能不全易感基因的检测试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增NPPA/NPPB基因座启动子的引物。

8.  如权利要求7所述的针对冠心病病人左心室收缩功能不全易感基因的检测试剂盒，其特征在于，所述的NPPA/NPPB基因座启动子的特异性引物的序列如SEQ ID NO2和SEQ IDNO3所示。

9.  如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，它还含有下列的试剂：与位点rs632793结合的探针。

10.  如权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的与位点rs632793结合的探针的序列如SEQ ID NO4或者SEQ ID NO5所示。

11.  权利要求7-10中任意一种的检测试剂盒的应用，其特征在于，用于检测NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型。

12.  如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述的NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型为A和/或G。

13.  如权利要求11所述的应用，其特征在于，预测左心室收缩功能不全的易感性。

14.  如权利要求11所述的应用，其特征在于，筛选治疗冠心病患者左心室收缩功能不全的药物。

说明书检测rs632793位点的方法及冠心病左心室收缩功能不全相关基因的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，涉及人心房钠肽/脑钠肽（NPPA/NPPB gene）的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs632793及其与左心室收缩功能相关性的检测。本发明还涉及检测这个SNP位点的方法和试剂盒。
背景技术
心力衰竭是危害全球人类健康的主要疾病之一，具有高死亡率，高发病率，高住院率和高住院费用的特点。左心室收缩功能不全（左心室射血分数＜45%）是充血性心力衰竭发生的早期阶段，对左心室收缩功能不全的风险预测和评估有助于延缓心力衰竭的进程，改善心力衰竭病人的生活质量和预后。冠心病是造成左心室收缩功能不全最主要的病因之一。在冠心病病人中，左心室收缩不全的临床表现尤为严重，可迅速进展为心力衰竭，预后极差。目前迫切需要发现冠心病病人发生左心室收缩功能不全的风险预测指标和预后评估靶点。
随着分子医学的发展，左心室收缩功能不全认为是遗传因子和环境共同作用的结果。对于环境因素的控制虽然在一定程度上可延缓左心室收缩不全的发病和预后，但对于固有的遗传因素的认识不足极大地妨碍了对左心室收缩功能不全的研究和判断。
目前研究表明左心室收缩功能不全及其随后心力衰竭的发生是由一系列神经-体液因素参与。其中，利钠肽家族扮演重要角色。利钠肽家族是一组由心肌细胞分泌的激素，具有相似的化学结构和生理学效应，主要包括调节血压，抗心肌肥厚，抗心力衰竭等作用。De Bold等通过电子显微镜首次发现心房肌细胞分泌的颗粒中包含心房利钠肽（ANP）[de Bold AJ,Borenstein HB,Veress AT,et al.A rapid and potent natriuretic response to intravenous injection of atrial myocardial extract in rats.Life Sci,1981,28(1):89-94.]。随后另一利钠肽家族成员-脑钠肽（BNP）在猪脑中发现。ANP和BNP的作用相似，基因位置毗邻，形成NPPA-NPPB基因座。NPPA基因（GeneID4878）缺失小鼠血压显著升高，心肌肥厚增加。NPPB基因（GeneID4879）缺失小鼠心肌广泛纤维化。BNP与其终末端结构（NT-proBNP）升高被公认为左心室功能障碍和心力衰竭的预测指标。
尽管如此，对于利钠肽家族是否对冠心病病人发生左心室收缩功能不全的风险评估目前 尚无定论，这正是当前研究左心室收缩功能不全的主要方向之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型的方法。
本发明的另一个目的是提供一种NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型的检测试剂盒。
本发明的再一个目的是提供一种NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型的检测试剂盒的应用。根据NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型的分型结果，可以用于辅助预测或者判断冠心病患者的左心室收缩功能不全的易感性。
本发明提供了一种检测NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型的方法，该方法包括步骤：
用NPPA/NPPB基因座启动子的特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；
和
检测(a)所得的扩增产物中单核苷酸多态性位点rs632793的基因。
所述的单核苷酸多态性的位点是rs632793。
rs632793位于NPPA/NPPB基因座启动子中，片段重叠群contig：NT_021937.18位置6448044A/G。
其中，脱氧核糖核酸（DNA）序列编号：rs632793位置基于SEQ ID NO：1/6；扩增产物基于SEQ ID NO：6/6。
所述的NPPA/NPPB基因座启动子的特异性引物的序列如SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示。
在本发明的一个实施例中，扩增反应时，退火/延伸的温度为60℃。更好的，在扩增反应的标准反应中，退火和延伸的步骤均为：60℃，30秒。
所述的扩增产物的序列如SEQ ID NO6所示。
所述的方法包括利用与位点rs632793结合的探针检测NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型。
第二方面，本发明还提供了一种针对冠心病病人左心室收缩功能不全易感基因的检测 试剂盒，它包括特异性扩增NPPA/NPPB基因座启动子的引物。
所述的NPPA/NPPB基因座启动子的特异性引物的序列如SEQ ID NO2和SEQ ID NO3所示。
所述的检测试剂盒还含有常规的检测基因型的试剂。例如，含有与位点rs632793结合的探针。
在本发明的一个优选例中，所述的与位点rs632793结合的探针的序列如SEQ ID NO4或者SEQ ID NO5所示。
本发明的检测试剂盒和检测方法可以用于检测NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型。具体而言，是对rs632793进行基因分型。
所述的NPPA/NPPB基因座启动子的单核苷酸多态性基因型为A和/或G。
利用对个体的左心室收缩功能不全易感性相关基因的基因型进行判断的方法，即检测该个体的NPPA/NPPB基因rs632793位点的基因型，可以辅助判断该个体患左心室收缩功能不全的发病风险。rs632793带有G等位基因的病人患左心室收缩功能不全的发病风险显著高于对照组。
本发明检测试剂盒和检测方法可以用于预测左心室收缩功能不全易感性，也可以在冠心病患者基因治疗后判断或者辅助判断患者的康复前景。
此外，本发明的检测试剂盒和检测方法还可以筛选治疗冠心病患者左心室收缩功能不全的药物，甚至用于作为相关药剂的靶标。
本发明公开了一种检测NPPA/NPPB基因座启动子中rs632793位点的方法，它包括检测个体的心房钠肽（NPPA）/脑钠肽（NPPB）rs632793位点的基因型。本发明还公开了相应的检测试剂盒。本发明的检测方法简便易行，成本低廉，高效快速，结果明了。可以大大减轻患者的负担，为左心室收缩功能不全患者的用药方案提供了参考。
附图说明
图1显示了第96号样本基因组DNA抽提的检测结果
图2显示了NPPA/NPPB rs632793位于NPPA/NPPB基因座启动子中（片段重叠群contig：NT_021937.18位置6448044A/G）的一种SNP基因型的测序结果。
具体实施方式
本发明人经过多年研究，发现利钠肽家族是当下寻找的左心室收缩功能不全的一个重要的候选基因座及靶点。以此为目标，开发检测左心室收缩功能不全相关易感基因的方法、试剂盒，以及治疗药物对揭示左心室收缩功能不全的病理生理途径有重要作用，有助于进一步发现遗传因素对心血管疾病的影响，同时为预测预防心力衰竭做出有益的尝试。
在冠心病病人中首次证明了NPPA/NPPB基因单核苷酸多态性位点rs632793（位于NPPA/NPPB基因座启动子中，片段重叠群contig：NT_021937.18位置6448044A/G）与左心室收缩功能不全密切相关，而且发现了它的新功能：NPPA/NPPB基因单核苷酸多态性位点rs632793位于NPPA/NPPB基因座启动子中（片段重叠群contig：NT_021937.18位置6448044A/G）基因型的改变将导致左心室收缩功能不全的发病风险升高，其中关联研究结果显示，在冠心病病人中，NPPA/NPPB基因rs632793A→G在病例和对照组中的分布存在显著性差异（p<0.05），该SNP多态性可参与改变启动子活性。在此基础上完成了本发明。
NPPA/NPPB基因的详细序列可参见登录号为rs632793的核苷酸序列（可参见网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
本发明对NPPA/NPPB基因座启动子中（片段重叠群contig：NT_021937.18位置6448044）区域进行了测序。
NPPA/NPPB基因rs632793位点的多态性可直接用于针对冠心病病人的左心室收缩功能不全的个性化治疗。在利用本发明NPPA/NPPB基因rs632793位点的多态性时，还可同时使用其他治疗左心室收缩功能不全的药剂。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效的本发明NPPA/NPPB多肽以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的NPPA/NPPA多肽或其拮抗剂、激动剂施用于普哺乳动物，其中该安全有效剂量通常至少约0.1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.1微克/千克体重-约100毫克/千克体重。当然， 具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内。
检测NPPA/NPPB基因的rs632793的基因型也可用于诊断左心室收缩功能不全。检测可以针对基因组DNA，也可针对NPPA/NPPB基因的扩增片段。NPPA/NPPB基因的rs632793的基因型可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。
本发明的检测NPPA/NPPB基因座启动子中rs632793位点的方法和试剂盒,其中涉及相关序列如下：
SEQ ID NO1
长度：50
DNA
智人（homo sapiens）
ACTGGGGACAGTTTCCCTAGAAAAC[A/G]AAGCCCAAGGCAAAAGGTCACTCGC
SEQ ID NO2
长度：21
DNA
人工序列
CATACTTMGGGATGATCGTTG
引物
SEQ ID NO3
长度：23
DNA
人工序列
CCGCCTCACTCTTGCTTCCTTTG
引物
SEQ ID NO4
长度：19
DNA
人工序列
CCTAGAAAACGAAGCCCAAG
探针
SEQ ID NO5
长度：19
DNA
人工序列
CCTAGAAAACAAAGCCCAAG
探针
SEQ ID NO6
长度：180
DNA
人工序列
CATACTTAGGGATGATCGTTGCTGACTTTGAAAATGATGTTTTGTTTCTTTGGTTTAATATGGAGGTCACTAAGGGCTGAAGACTGGGGACAGTTTCCCTAGAAAACGAAGCCCAAGGCAAAAGGTCACTCGCTAAAGTTTTGTGGGGGTTCCTATTCAAAGGAAGCAAGAGTGAGGCGG
扩增片段
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆；实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
荧光PCR检测
一、实验材料
7900HT荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，聚合酶链反应液（TaqMan EXPress Master Mix）由美国应用生物系统公司（ABI）定制合成。
二、引物及探针设计与合成：
以NPPA/NPPB基因座启动子的部分序列为模板，使用Primer ExpressTM2.0软件分析TaqMan引物和探针位点，并由美国应用生物系统公司（ABI）定制合成。
检测用引物：
NPPA/NPPB基因rs632793上游引物序列：
5＇-CATACTTMGGGATGATCGTTG-3＇（SEQ ID NO2）
NPPA/NPPB基因rs632793下游引物序列：
5＇-CCGCCTCACTCTTGCTTCCTTTG-3＇（SEQ ID NO3）
荧光探针：
NPPA/NPPB基因rs632793荧光探针1：
5＇-VIC-CCTAGAAAACGAAGCCCAAG-MGB-3＇（SEQ ID NO4）
NPPA/NPPB基因rs632793荧光探针2：
5＇-FAM-CCTAGAAAACAAAGCCCAAG-MGB-3＇（SEQ ID NO5）
三、样本检测：
实验共检测451例冠心病病人，其中左心室收缩功能不全病人109例，左心室收缩功能正常者（对照组）342例，每例收集血样标本约2ml，用酚/氯仿抽屉基因组DNA，抽提结果用微量紫外/可见光分光光度计（INFINIGEN公司）检测。
按如下体系进行荧光PCR扩增，最后用SDS2.3扫描并聚类分析。
表1荧光PCR扩增体系
 384孔板(ul)TaqMan GTXpress Master Mix（2X）2.520X working stock of SNP Genotyping Assay0.25gDNA(3ng/ul左右)2.75反应总体积5
                                                                           ；
表2PCR标准反应条件


                                                                             。
四、型检测结果：
基因组DNA抽提的检测结果：
所有样本的基因组DNA符合检测要求（260/280>1.8，浓度>10ng/ul），如图1所示样本96号的检测结果。
表3NPPA/NPPB基因rs632793位点基因型的检测结果

                                                                        。
实施例2
测序方法检测rs632793位点的基因型
用测序法检测左心室收缩功能不全易感基因NPPA/NPPB基因的rs632793位点。挑选上述左心室收缩功能不全病例-左心室收缩功能正常（对照组）样本各10例进行测序判断rs632793的基因型。
一、实验方法
PCR测序引物仍采用上述荧光PCR用引物，扩增的产物经纯化后直接测序。测序的仪器是ABI公司的3130xl遗传分析仪，用sequence analysis5.2分析软件进行分析，结果用chromas也可以查看。
二、实验结果
测序结果截图如图2所示。
最终，20例的测序结果与7900荧光PCR的基因型分析结果完全一致。
三、在冠心病病人中，NPPA/NPPB基因rs632793基因型和左室收缩功能不全易感的关联分析
NPPA/NPPB基因rs632793在病例和对照中分布的比较采用RxCχ2检验.用SPSS软件进行统计分析，检测结果及SPSS软件分析结果如表4所示：
表4样品rs632793基因型统计结果

                                                                         。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用做参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
  SEQUENCE LISTING
 
 
<110>  上海交通大学医学院附属瑞金医院
 
 
<120>  检测rs632793位点的方法及冠心病左心室收缩功能不全相关基因的检测试剂盒
 
 
<130>  20140120
 
 
<160>  6    
 
 
<170>  PatentIn version 3.1
 
 
<210>  1
<211>  51
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
 
 
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (26)..(26)
<223>  n=a or g
 
 
 
<400>  1
actggggaca gtttccctag aaaacnaagc ccaaggcaaa aggtcactcg c              51
 
 
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
 
<400>  2
catacttmgg gatgatcgtt g                                               21
 
 
<210>  3
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
 
<400>  3
ccgcctcact cttgcttcct ttg                                             23
 
 
<210>  4
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
 
<400>  4
cctagaaaac gaagcccaag                                                 20
 
 
<210>  5
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
 
<400>  5
cctagaaaac aaagcccaag                                                 20
 
 
<210>  6
<211>  180
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
 
<400>  6
catacttagg gatgatcgtt gctgactttg aaaatgatgt tttgtttctt tggtttaata     60
 
tggaggtcac taagggctga agactgggga cagtttccct agaaaacgaa gcccaaggca    120
 
aaaggtcact cgctaaagtt ttgtgggggt tcctattcaa aggaagcaag agtgaggcgg    180