一种用于骨质疏松的诊断的血液检测试剂盒.pdf

本发明用于骨质疏松的诊断的血液检测试剂盒，其包括用于扩增miR-214的引物。此外，本发明还涉及用于扩增miR-214的引物在制备可用于骨质疏松的诊断的血液检测试剂盒中的用途。

权利要求书
1.  一种血液检测试剂盒，其包括：
用于扩增miR-214的引物，以及
用于从血液中提取miRNA的试剂；
其中，所述用于扩增miR-214的引物是miR-214的反转录引物和miR-214 的cDNA的扩增引物。

2.  根据权利要求1所述的血液检测试剂盒，其用于骨质疏松的诊断。

3.  根据权利要求1所述的血液检测试剂盒，其中，所述miR-214的反 转录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.  根据权利要求1所述的血液检测试剂盒，其中，所述miR-214的cDNA 的扩增引物是：
上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或
下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.  根据权利要求1所述的血液检测试剂盒，其中，所述血液为血清。

6.  用于扩增miR-214的引物在制备血液检测试剂盒中的用途，其中， 所述血液检测试剂盒包括：
用于扩增miR-214的引物，以及
用于从血液中提取miRNA的试剂；
其中，所述用于扩增miR-214的引物是miR-214的反转录引物和miR-214 的cDNA的扩增引物。

7.  根据权利要求6所述的用途，其中，所述血液检测试剂盒用于骨质疏 松的诊断。

8.  根据权利要求6所述的用途，其中，所述miR-214的反转录引物的 核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

9.  根据权利要求6所述的用途，其中，所述miR-214的cDNA的扩增 引物是：
上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或
下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

10.  根据权利要求6所述的用途，其中，所述血液为血清。

说明书一种用于骨质疏松的诊断的血液检测试剂盒
本申请要求中国发明专利申请201410050513.3的优先权(申请日：2014年02 月14日，发明名称：一种用于骨质疏松的辅助诊断的血液检测试剂盒)。
技术领域
本发明属于分子诊断领域，尤其涉及可用于骨质疏松的诊断的血液检测 试剂盒。此外，本发明还涉及用于扩增miR-214的引物在制备可用于骨质疏 松的诊断的血液检测试剂盒中的用途。
背景技术
骨质疏松症是指以单位体积内骨量低于正常为特征的骨胳疾病，骨质有 机成分生成不足、继发性钙盐减少及骨组织微隙结构破坏是其主要表现。骨 质疏松症目前已经成为世界性问题，是继肿瘤、心血管疾病之后又一严重危 害人类健康的一种疾病。有研究显示，骨质疏松症其发病率居常见病、多发 病的第7位。
骨质疏松发病现状
我国是世界上老年人口数量最多的国家，预测到2050年我国60岁以上 的老年人将占全国总人口的20％。随着人口的日益老龄化，老年性疾病，特 别是骨质疏松的发病率也在同步增长。目前我国有骨质疏松病人约9000万。 到2050年将增至2亿多人，占人口的13.2％，但目前医学上还未有安全而 有效的根治方法帮助已疏松的骨胳恢复原状。因此，正确认识、早期预防、 早期干预、早期诊断显得尤为重要。
骨质疏松的现行诊断方法
骨质疏松症是一种发病隐匿、常见但又诊断不足的疾病，其早期准确诊 治将有助于为更好的防治骨质疏松提供依据。目前骨质疏松的诊断仍沿用 1994年WHO颁布的以骨矿含量(BMC)和骨密度(BMD)为基础的骨质 疏松诊断标准，即以双能X线吸收法(DEXA)为基本测量方法。BMC或BMD 在青年成人平均值的1个标准差(s)以内者为正常；若以T评分(T值) 表示，即≥-1.0为正常，-2.5<T值<-1.0为骨量减少，≤-2.5为骨质疏松。但 目前集中于-2.5的T评分阈值正在发生改变。利用该标准进行判断时，骨质 疏松组和正常组有一定程度上的重叠，该标准有待进一步完善。除此之外， 临床上还结合血、尿生化检测、内分泌功能测定、骨形成和骨吸收指标、骨 骼X射线、双能X线骨密度吸收法(DEXA)及定量CT(QCT)以及定量超 声(QUS)等检测指标，上述检查指标花费高，步骤繁琐，结果不准确，等诊 断为骨质疏松时，病人已经发生了骨量和结构的改变，加之目前又缺乏真正 有效的治疗药物，因而亟需发现更加灵敏、特异、易于检测、明确而有效的 生物标志物，对骨质疏松作出准确、及时的诊断。
另一方面，近来，人们越来越认识到miRNA是在发育、病理与生理条 件下发挥重要作用的调控因子，参与肿瘤的发生、病毒的感染、细胞的分化 与功能的发挥等一系列的生命过程中。miRNA是单链的小RNA分子，大约 21或22个核苷酸长。这些小RNA分子不编码蛋白，但是它们通过降低mRNA 的水平或与mRNA 3’UTR相结合抑制翻译，从而降低体内的蛋白水平。令 人意想不到的是非编码RNA分子占人类基因组总量的98％，非编码RNA 与蛋白编码RNA的比例与发育的复杂性密切相关。因此，如果筛选出在骨 质疏松发生过程中血液中异常表达的miRNA作为生物标志物，并研制相应 的诊断试剂盒，对骨质疏松的诊断现状必将是一次有力的推动。
关于miR-214
miR-214最早发现在斑马鱼的慢肌发育过程中发挥着重要的作用。后来 证实，miR-214可以与Ezh2的3’UTR相结合，降低细胞内Ezh2的水平，从 而促进骨骼肌细胞的分化和胚胎干细胞中发育调控因子的转录。在未分化的 骨胳肌细胞中，PcG蛋白抑制miR-214的转录，随着发育的进行，伴随着 PcG的解离和MyoD以及myogenin的募集，从而激活miR-214的转录。
已有研究表明，骨质疏松病人骨组织中的miR-214的表达水平明显升高， 因此，骨组织中的miR-214可作为骨质疏松早期诊断及预防的生物标志物(中 国专利申请公开号CN102335189A)。
但是，骨组织中的miR-214来源于成骨细胞，而成骨细胞成分不能进入 到血液中，因此，骨组织中的miR-214与血液中的miR-214并无关联。
发明内容
本发明人长期从事miRNA相关的研究工作，在深入的研究中，我们通 过大量的实验发现：
血液中的miR-214(5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3’)是骨质疏 松发病的特异性生物标志物，从而完成了本发明。
即，本发明包括：
1.一种血液检测试剂盒，其包括：
用于扩增miR-214的引物，以及
用于从血液中提取miRNA的试剂；
其中，所述用于扩增miR-214的引物是miR-214的反转录引物和miR-214 的cDNA的扩增引物。
2.根据项1所述的血液检测试剂盒，其用于骨质疏松的诊断。
3.根据项1或2所述的血液检测试剂盒，其中，所述miR-214的反转 录引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据项1～3中任一项所述的血液检测试剂盒，其中，所述miR-214 的cDNA的扩增引物是：
上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或
下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.用于扩增miR-214的引物在制备血液检测试剂盒中的用途，其中， 所述血液检测试剂盒包括：
用于扩增miR-214的引物，以及
用于从血液中提取miRNA的试剂；
其中，所述用于扩增miR-214的引物是miR-214的反转录引物和miR-214 的cDNA的扩增引物。
6.根据项5所述的用途，其中，所述血液检测试剂盒用于骨质疏松的诊 断。
7.根据项5或6所述的用途，其中，所述miR-214的反转录引物的核 苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
8.根据项5～7中任一项所述的用途，其中，所述miR-214的cDNA的 扩增引物是：
上游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；和/或
下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
需要说明的是，在本说明书中，血液包括血浆、血清和全血，优选为血 浆、血清，更优选为血清。
本发明通过控制年龄等对骨质疏松发展的影响因素，研究血液miRNA 在骨质疏松诊断中的应用前景，阐述异常表达的miRNAs对骨质疏松进展的 影响，揭示其筛查和早期诊断的价值。因此，本发明获得了骨质疏松发病特 异性的血液miRNAs表达的特异性标志物。通过对血液生物标志物和诊断试 剂盒的研制与应用，仅仅需要病人的血清或血浆而不需要任何其他组织，通 过最精简的引物库来检测血清miRNA水平能扩展骨质疏松的检测指标，提 高检测的灵敏度，可使得骨质疏松的诊断和治疗更加方便易行，为临床医生 快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果的评价奠定基础。
附图说明
图1显示骨组织中miR-214水平与血清中miR-214水平之间的关系的图。
图2显示临床骨质疏松病人血清中miR-214的水平与腰椎T值相关性的图。
图3显示临床骨质疏松病人血清中miR-214的水平与血清中骨吸收速率的 敏感指标I型胶原羧基端肽(CTX)的相关性的图。
具体实施方式
在一个方面中，本发明提供一种血液检测试剂盒(本发明的血液检测试 剂盒)，其包括：
用于扩增miR-214的引物，以及
用于从血液中提取miRNA的试剂；
其中，所述用于扩增miR-214的引物是miR-214的反转录引物和miR-214 的cDNA的扩增引物。
本发明的血液检测试剂盒可用于骨质疏松的诊断。本说明书中，“诊断” 可以是确诊，也可以是为确诊提供参考信息。
miR-214的核苷酸序列为5’-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3’，针 对已知核苷酸序列的miRNA设计其扩增引物(包括反转录引物和cDNA扩 增引物)是本领域技术人员熟知的，例如可以按照《分子克隆实验指南》(J. 萨姆布鲁克(Sambrook.J.)等著，黄培堂等译，第3版，2005)的教导来进行 设计，或者利用计算机软件(例如Premier公司开发的Premier 6.0)来进行 设计。
特别是，在使用SEQ ID NO:1所示的miR-214的反转录引物、SEQ ID  NO:2所示扩增miR-214的cDNA的上游引物、以及SEQ ID NO:3所示扩 增miR-214的cDNA的下游引物时，本发明的血液检测试剂盒的检出率(灵 敏度)可达(94.7)％，完全满足医疗器械法规中作为诊断试剂盒的要求。本 说明书中，检出率是指：用“金标准”方法确认的阳性样本中，被其他方法测 定为阳性样本的比例。本技术领域确认骨质疏松的“金标准”是双能X线骨 密度吸收法(DEXA)。
因此，所述miR-214的反转录引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1 所示。所述miR-214的cDNA的扩增引物优选是如SEQ ID NO:2所示的上 游引物和/或如SEQ ID NO:3所示的下游引物。
其中：
SEQ ID NO:1
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTG CC
SEQ ID NO:2
GACAGCAGGCACAGACA
SEQ ID NO:3
GTGCAGGGTCCGAGG
上述用于扩增miR-214的引物是本发明的血液检测试剂盒实现高检出 率的关键。因此，本发明还提供上述用于扩增miR-214的引物在制备血液检 测试剂盒中的用途。其中，所述血液检测试剂盒可以是例如本发明的血液检 测试剂盒。
用于从血液中提取miRNA的试剂及方法是本领域技术人员已知的，例 如可以参照Qiagen血清microRNA检测试剂盒产品说明书。作为用于从血 液中提取miRNA的试剂可以列举出例如：氯仿、RNAase抑制剂、DEPC 水、乙醇等。
本发明的血液检测试剂盒适用于利用实时定量PCR对血液中的 miR-214进行检测的方法，因此，其还可以包含实时定量PCR反应所使用的 酶和/或试剂，例如：逆转录酶、缓冲液、dNTPS、MgC12、去核酸酶水、荧 光染料或探针、Taq酶等。这些酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的，可根 据具体采用的检测方法适当选择。此外，本发明的血液检测试剂盒还可以包 含标准品和对照(如定量标化的线虫miR-39样本等)及正常参考值(1-3*105拷贝/ul)。采用本发明的血液检测试剂盒，只需要血液而不需要其它组织样 品，通过最精简的荧光或探针法检测miR-214，检测方便，且定量精确，大 大提高疾病诊断的敏感性和特异性。
实施例
实施例1.血清中miR-214的水平与骨组织中miR-214的水平相关性
构建了成骨细胞特异的转基因小鼠，提取骨组织及血清中的microRNA， 通过Q-PCR对miR-214的含量进行测定。结果表明，血清中miR-214水平 与骨组织中miR-214水平无相关性。具体方法如下：
成骨细胞特异转基因小鼠的构建：
利用成骨细胞特异表达的OCN启动子驱动miRNA-214表达的载体，将载体 将外源基因直接注入受精卵，使外源基因整合到DNA中，形成成骨特异转 基因动物，即miR-214在成骨细胞特异高表达。
骨组织miRNA的提取：
鉴定成骨特异转基因阳性及同窝对照野生型小鼠，麻醉，处死，取胫骨 和股骨，取液氮研磨，骨组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨， 待组织变碎，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol 加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。
匀浆：骨组织样品按50-100mg/ml加入Trizol。另外，组织体积不能超 过Trizol体积的10％，否则匀浆效果欠佳，用超声裂解器或电动匀浆器充分 匀浆。.4℃12000rpm离心10min，弃沉淀。.按200ul氯仿/ml Trizol加 入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。4℃12000g离心15min。吸取上层水 相，至另一离心管中。注：尽量不要吸取中间界面。按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。4℃12000g离心10min，弃上清，RNA 沉于管底。按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮 沉淀。4℃7000g离心5min，尽量弃上清。室温晾干或真空干燥10-15min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。可用50ul H2O，TE buffer或 0.5％SDS溶解RNA样品，55-60℃，5-10min。测O.D值定量RNA浓度。 注：此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间；产率估计：组织标本： (ug RNA/mg组织)1-10ug。
血清中miRNA提取方法：
小鼠血清样本的制备
采集小鼠血液，室温或4度保存，一小时内进行下一步处理。1900g(3000rpm) 4度离心10min；取上层黄色液体为血清；16000g离心10min
血清中miRNA的提取
使用美国QIAGEN公司miRNeasy Serum/Plasma kit(217184)，miRNeasy  Serum/Plasma Spike-in-control(219610).
具体方法如下：.将-80℃保存的血清融化，各取200ul；加入1ml的QIAzol  Lysis Reagent(随试剂盒提供)，充分混匀；室温(15-25度)下放置5min。 加入3.5ul miRNeays Serum/Plasma Spike-in Control(1.6×108copies/ul)，充 分混匀；加入200ul氯仿，充分混匀15秒；室温(15-25度)下放置2-3min； 4度12000g离心15min；上清转至新的离心管中，加入900ul的100％乙醇， 混匀；吸取700ul转至RNeasy MinElute spin(随试剂盒提供)，室温下8000g 离心15秒；剩余的样品重复步骤9操作，去掉离心下来的液体；在RNeasy  MinElute Spin中加入700ul试剂RWT(随试剂盒提供)，8000g离心15秒， 弃掉离心的液体；在RNeasy MinElute Spin中加入500ul试剂RPE(随试剂 盒提供)，8000g离心15秒，弃掉离心的液体；在RNeasy MinElute Spin中 加入500ul 80％的乙醇，8000g离心2min，弃掉液体；RNeasy MinElute Spin 放入新的离心管中，13000g离心5min，以去掉酒精；RNeasy MinElute Spin 放入新的离心管中，加入14ul的去RNA酶的水，离心机最大转速离心2min， 收集得到血清中获得的RNA。
血清中成熟miRNA的颈环法反转录反应：
使用Takara公司RT kit
具体方法如下：
反转录反应如下：

混匀，37度反应60min；95度，5min，放置冰上；将得到的20微升反转录 反应后的cDNA稀释25倍，到500微升，-20度保存以备下一步实时定量 PCR检测。
实时定量PCR检测血浆中miRNA的表达
使用美国Takara公司SYBR Premic ex Taq进行实时定量PCR检测。
具体步骤如下：
构建PCR反应体系如下：

混匀，反应程序如下：

血清中目的miRNA的表达以cel-39的表达为对照，以2Ct(cel-miR-39–目 的miRNA)的数值为每个血清中成熟miRNA的表达情况。
结果分析
以PCR反应后溶解曲线为标准，验证PCR反应的特异性。血清中miRNA 的表达表示，以GraphPad prism5做统计 分析
结果：骨组织中miR-214的水平升高了15倍，而血清中miR-214的水平保 持不变(如图1所示)。
实施例2.血清中miR-214的水平与腰椎骨密度的T值相关性研究
病人血清中miR-214的提取与检测：
同实施例1
病人腰椎骨密度的检测：
应用双能X线骨密度仪,对病人腰椎(Ll一14)骨密度测量,将所得结果 标准化处理并经骨密度仪计算出T值后分组并进行相应统计学分。
统计分析：
使用GraphPad Prim5.1中相关性分析方法可以用来验证血清中miR-214的水 平与腰椎骨密度的T值的线性关系，从相关系数r我们可以知道两个变量是 否呈线性关系、线性关系的强弱，以及是正相关还是负相关。
结果：血清中miR-214的水平与腰椎骨密度的T值呈现明显的负相关 (R2＝0.5221)(如图2所示)。
实施例3.血清中miR-214的水平与骨吸收速率的敏感指标I型胶原羧基端 (CTX)的量的相关性研究
病人血清中miR-214的提取与检测：
同实施例1
病人血清中骨吸收速率的敏感指标I型胶原羧基端(CTX)的检测：
使用Elisa方法检测血清中I型胶原羧基端(CTX)的含量。
统计分析：
使用GraphPad Prim5.1中相关性分析方法可以用来验证血清中miR-214的水 平与CTX值的线性关系，从相关系数r我们可以知道两个变量是否呈线性 关系、线性关系的强弱，以及是正相关还是负相关
结果：
血清中miR-214的水平与骨吸收速率的敏感指标I型胶原羧基端(CTX)的量 呈现显著的正相关(R2＝0.4864)(如图3所示)。
实施例4检出率验证
临床骨质疏松病人的收集标准
女性骨质疏松病人：绝经5年以上(建议大于60岁)；无肿瘤、糖尿病、 甲状腺功能亢奋、严重肝脏疾病、严重肾脏疾病、严重胃肠道疾病、严重感 染性疾病、严重妇科疾病、吸烟史；无影响骨代谢的药物使用史(双膦酸盐 类、降钙素类、骨化三醇类、雌激素类等)。
男性骨质疏松病人：年龄60岁以上，无肿瘤、糖尿病、甲状腺功能亢 奋、严重肝脏疾病、严重肾脏疾病、严重胃肠道疾病、严重感染性疾病、严 重妇科疾病、吸烟史；无影响骨代谢的药物使用史(双膦酸盐类、降钙素类、 骨化三醇类、雌激素类等)。
对照遴选标准：
无肿瘤、糖尿病、甲状腺功能亢奋、严重肝脏疾病、严重肾脏疾病、严重胃 肠道疾病、严重感染性疾病、严重妇科疾病、吸烟史；无影响骨代谢的药物 使用史(双膦酸盐类、降钙素类、骨化三醇类、雌激素类等)。
临床检测指标：
(1)骨密度的检测：双能X线骨密度仪测定腰椎骨密度；
(2)生化指标的检测:建议测定TRACP5b(骨吸收)和Bone ALP(骨形成)作为 比对和初步分类标准。
(3)病人血清中miR－214的检测。
受试者血清中miR-214的提取与检测、结果分析同实施例1。
实验结果：
根据目前临床骨质疏松检测标准，通过DEXA检测，T值小于-2.5的 骨质疏松病人。在本研究中收集了200个受试者的血清，按照上述实施例1 进行了检测，以microRNA拷贝数大于3*105拷贝/ul为阳性指标(即确定 为骨质疏松)，共有90人，同时对该批人用DEXA的方法进行了骨质疏松 检测，共有95人T值小于-2.5，包含前述90人中的全部，因此，检出率为 94.7％(90/95)。