用于甘蓝OGURA胞质不育系育性恢复基因RFO筛选的PCR标记.pdf

本发明“用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo筛选的PCR标记”，涉及生物育种技术。用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo筛选的PCR标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，用于检测所述PCR标记的引物BnRFO-2F3/BnRFO-2R。本发明还提供用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo辅助筛选的方法，操作简便易行，特异性强，稳定性好，能够缩短育种周期，提高育种效率。

权利要求书
1.  用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo筛选的PCR标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.  用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo筛选的引物，其核苷酸序列为：
上游引物BnRFO-2F3：5’-GCAGGGATGGAGAGAGTTGCG-3’，
下游引物BnRFO-2R：5’-TACGACATTGGGCCTACATGTC-3’。

3.  用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo辅助筛选的方法，包括如下步骤：
(1)以待测甘蓝为材料，提取样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，采用权利要求2所述的引物进行PCR反应，获得PCR产物；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)获得的PCR产物，若PCR产物中出现458bp的特征条带，则所述样品中含有育性恢复基因Rfo；若PCR产物的大小不是458bp，则所述样品中不含有育性恢复基因Rfo。

4.  根据权利要求3所述的方法，所述PCR反应的体系为：PCR反应体积为15μL，其中包括含15mmol/L MgCl2的10×Buffer 1.5μL，2.5mmol/L dNTP各1.2μL，10μmol/L上下游引物各0.5μL，5U/μL Taq酶0.15μL，20ng/μL模板DNA 3μL，ddH2O 13.15μL。

5.  根据权利要求3或4所述的方法，所述PCR反应的条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min。

6.  用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo辅助筛选的试剂盒，其特征在于：包括液态的或粉状的用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo筛选的引物，其核苷酸序列为：
上游引物BnRFO-2F3：5’-GCAGGGATGGAGAGAGTTGCG-3’，
下游引物BnRFO-2R：5’-TACGACATTGGGCCTACATGTC-3’。

说明书用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo筛选的PCR标记
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo筛选的PCR标记。
背景技术
甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)在我国的蔬菜周年供应中起着十分重要的作用，据农业部统计，全国甘蓝种植面积达93.73万公顷(2006年《中国农业统计资料》)。甘蓝杂种优势明显，近年来生产上的杂交种比例占96％以上(王庆彪等，2012)。杂交种的配制主要有自交不亲和、雄性不育两条途径，而自交不亲和途径因为存在假杂种的缺陷，近年来越来越多的被雄性不育系的途径所替代(方智远等，2004)。目前，在甘蓝中，可实用的雄性不育源以显性核基因雄性不育、Ogura细胞质雄性不育为主。Ogura细胞质雄性不育具有不育彻底、低温不黄化、转育容易等优点，因此得到国内外很多甘蓝育种者的重视并加以利用，育成了中甘22、中甘96、中甘192、中甘101、绿球66等甘蓝品种(杨丽梅等，2006；庄木等，2010)，并在生产上进行推广。根据我们近年来引进国内外的甘蓝新品种情况，由雄性不育配制的品种占40％以上，且呈现逐年增加的趋势。
但Ogura细胞质雄性不育的所有后代均是不育，且不育性非常彻底，根本无法获得自交后代，因此这些种质资源无法进一步加以利用。以先甘336为例，该品种在湖北等地表现抗根肿病，但因为是Ogura雄性不育系配制的，很多学者无法加以利用，严重制约了种质资源的创新和抗病新品种培育。而要解决这一问题的有效途径就是引入育性恢复基因。萝卜中的Rfo基因已被证明可以恢复Ogura雄性不育的育性，经远缘杂交导入到油菜中也已证明其可以恢复育性(Primard-Brisset et al.2005)。因此，将Rfo基因经远缘杂交导入到甘蓝中，则可以解决Ogura雄性不育系配制的杂交种育性恢复问题，使得优异胞质不育种质资源能得到进一步利用。
前人已根据Rfo基因序列设计了特异引物(Hu et al.2008)，并成功用于油菜的恢复材料筛选。但将这些引物用于甘蓝材料的扩增时，我们发现存在非特异扩增，无法用于甘蓝恢复系的标记辅助选择，推测是在用于甘蓝中扩增时，由于基因组背景发生了变化，引物不再具有扩增育性恢复基因Rfo的特异性。因此有必要开发新的引物，用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因的筛选。
发明内容
本发明根据上述领域的需求，提供一个用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因筛选的PCR标记，其特异性强，稳定性好，能够有效解决上述领域存在的问题。本发明请求保护的技术方案如下：
用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo筛选的PCR标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo筛选的引物，其核苷酸序列为：
上游引物BnRFO-2F3：5’-GCAGGGATGGAGAGAGTTGCG-3’，
下游引物BnRFO-2R：5’-TACGACATTGGGCCTACATGTC-3’。
用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo辅助筛选的方法，包括如下步骤：
(1)以待测甘蓝为材料，提取样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，采用上述引物进行PCR反应，获得PCR产物；
(3)琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)获得的PCR产物，若PCR产物中出现458bp的特征条带，则所述样品中含有育性恢复基因Rfo；若PCR产物的大小不是458bp，则所述样品中不含有育性恢复基因Rfo。
所述PCR反应的体系为：PCR反应体积为15μL，其中包括含15mmol/L MgCl2的10×Buffer 1.5μL，2.5mmol/L dNTP各1.2μL，10μmol/L上下游引物各0.5μL，5U/μL Taq酶0.15μL，20ng/μL模板DNA 3μL，ddH2O 13.15μL。
所述PCR反应的条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min。
用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo辅助筛选的试剂盒，其特征在于：包括液态的或粉状的用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo筛选的引物，其核苷酸序列为：
上游引物BnRFO-2F3：5’-GCAGGGATGGAGAGAGTTGCG-3’，
下游引物BnRFO-2R：5’-TACGACATTGGGCCTACATGTC-3’。
本发明提供用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo筛选的PCR标记(SEQ ID NO：1)，以及用于检测所述PCR标记的引物BnRFO-2F3/BnRFO-2R，其核苷酸序列为：
BnRFO-2F3：5’-GCAGGGATGGAGAGAGTTGCG-3’，
BnRFO-2R：5’-TACGACATTGGGCCTACATGTC-3’。
所述引物特异性强，稳定性好，在52-62℃之间的任何一个退火温度下均不产生非特异扩增，能够十分准确地检测出待测甘蓝或芥蓝植株中是否含有育性恢复基因Rfo。在一般情况下， 含有育性恢复基因的植株要等到开花后才能知道育性恢复情况，而采用本发明的引物BnRFO-2F3/BnRFO-2R进行甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo的辅助筛选，在幼苗期就能够快速筛选出目标株系，而要看到表型结果，在苗期后还需要4-6个月的时间，因此，采用本发明的PCR标记进行甘蓝的育种辅助选择，大大缩短了育种周期、提高了育种效率。
本发明还提供一种用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo辅助筛选的方法，该方法操作简单易行，只需提取待测甘蓝的基因组DNA，采用引物BnRFO-2F3/BnRFO-2R进行PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物中是否含有458bp的特征条带，即可判断出待测植株中是否含有育性恢复基因Rfo。
综上所述，利用本发明提供的PCR标记和引物进行甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo筛选，操作简单易行，特异性强，稳定性好，能大大缩短育种周期，提高育种效率。
附图说明
图1.引物AS-2F/AS-2R(上)及BnRFO-2F3/BnRFO-2R(下)在甘蓝材料中的扩增情况，
其中，M：BM2000ladder；1，2：甘蓝自交系材料“金早生”，“北京早熟”；3，4：芥蓝自交系“日本绿”，“香港迟花”；5-8：油菜恢复材料RF1-4(阳性对照)；9：阴性对照。
图2.保守引物Con-F/Con-R在芥蓝中的扩增产物序列，
其中，下划线所标示的部分为引物BnRFO-2F3/BnRFO-2R所在位置。
图3.引物BnRFO-2F3/BnRFO-2R用于种间杂种(芥蓝+油菜恢复系)F1代鉴定，
其中，M：BM2000ladder；1，甘蓝自交系材料“金早生”；2：芥蓝自交系“日本绿”；3-6：油菜恢复材料RF1-4(阳性对照)；7-15：种间杂交不同F1单株。
图4.引物BnRFO-2F3/BnRFO-2R用于种间杂种(芥蓝+油菜恢复系)BC1代鉴定，
其中，M：BM2000ladder；1，甘蓝自交系材料“金早生”；2：芥蓝自交系“日本绿”；3-4：油菜恢复材料RF1-2(阳性对照)；5-16：BC1代不同单株。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步阐述本发明，需要说明的是，这些实施例仅用于解释本发明而不能限制本发明的范围。
生物材料
甘蓝：“金早生”、“北京早熟”，已知品种，可商购；
芥蓝：“日本绿”、“香港迟花”，已知品种，可商购；
油菜恢复系：RF1-4，已知品种(胡琼，李云昌，梅德圣，李英德，徐育松.油菜异源细 胞质雄性不育的三系配套(英文)，《第十二届国际油菜大会论文集》，2007)。
以上生物材料本实验室均有保存，可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，或采用本领域常规方法配制而得，可商购获得，规格为实验室纯级即可。
实施例1、用于甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo筛选的PCR标记的开发
1、提取基因组DNA
用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)法提取甘蓝“金早生”、“北京早熟”，芥蓝“日本绿”、“香港迟花”幼苗的基因组DNA，以4份油菜恢复系(RF1-4)为对照。DNA提取方法参见Murray MG,Thompson WF(1980)Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.Nucleic Acids Res 8:4321-4325。
2、鉴定现有的Rfo基因特异引物在甘蓝中的扩增情况
Hu等(Hu X,Sullivan-Gilbert M,Kubik T,Danielson J,Hnatiuk N,Marchione W,Greene T,Thompson S(2008)Mapping of the Ogura fertility restorer gene Rfo and development of Rfo allele-specific markers in canola(Brassica napus L.).Mol Breeding 22:663–674)设计了用于油菜恢复系的标记辅助筛选的Rfo基因的特异引物，
包括上游引物AS-2F：5’-CATGCTTCGATCTCGTCCTTTA-3’，和下游引物AS-2R：5’-GGTAACAACATCAGGGTGGAGT-3’。
为鉴定上述引物在甘蓝中的扩增情况，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物AS-2F和AS-2R。以步骤1得到的基因组DNA为模板，按照下列反应体系和反应程序进行PCR反应。
PCR反应体积为15μL，其中包括10×Buffer(含Mgcl215mmol/L)1.5μL，dNTP(每种2.5mmol/L)1.2μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.15μL，模板DNA(20ng/μL)3μL，ddH2O 13.15μL。
PCR反应程序为94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。
扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，140V恒压30min，利用紫外凝胶成像仪拍照。
结果表明，将引物AS-2F/AS-2R用于甘蓝、芥蓝自交系材料扩增时，所有甘蓝、芥蓝样品均发生非特异扩增(图1a)。进一步将该非特异扩增产物测序，分别采用引物AS-2F/AS-2R进行双向测序，测序反应委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行。
结果甘蓝、芥蓝的扩增产物与Rfo恢复基因的序列相似性达到88％，且片段大小与Rfo 基因片段一致(均为247bp)，证实了在甘蓝、芥蓝自交系材料中存在Rfo基因的同源序列，由于该引物能够将甘蓝、芥蓝中Rfo基因的同源序列扩增出来，所以无法区分甘蓝、芥蓝Ogura雄性不育恢复系材料和普通的甘蓝芥蓝材料。为了甘蓝、芥蓝Ogura雄性不育恢复系材料的辅助选择，需要设计新的引物。
3、开发位点特异的Rfo新引物
我们利用Primer Premier 5.0程序设计了一对保守引物Con-F/Con-R，用于扩增出更长的片段(586bp)，这样便于利用其中的差异设计出特异引物。
将保守引物Con-F/Con-R的扩增产物进行测序，结果如图2所示。通过与Rfo序列进行比较后，在差异明显的位置利用Primer Premier 5.0设计新的引物，即选取了两个插入/缺失区域设计引物，正向引物BnRFO-2F3位于第53-73bp处，反向引物BnRFO-2R位于第489-510bp处。将该引物用于甘蓝、芥蓝自交系材料扩增时(图1b)，两份材料均为阴性，而在4份油菜恢复系中是阳性，由此说明该引物可以将Rfo基因与Rfo同源基因明显区分开，推测其可用于甘蓝、芥蓝恢复系材料的标记辅助选择，可作为甘蓝Ogura胞质不育系育性恢复基因Rfo筛选的PCR标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2、引物BnRFO-2F3/BnRFO-2R的特异性验证
采用Hu等(2008)开发的引物AS-2F/AS-2R、本发明新开发的引物BnRFO-2F3/BnRFO-2R对甘蓝自交系“金早生”、“北京早熟”，芥蓝自交系“日本绿”、“香港迟花”进行扩增时(图1)，为了排除是退火温度设置不合理导致的非同源扩增，我们设计了不同温度梯度，按照下列反应体系和程序进行PCR，比较两对引物在甘蓝、芥蓝自交系材料中扩增时的特异性。
PCR反应体系：PCR反应体积为15μL，其中包括10×Buffer(含MgCl215mmol/L)1.5μL，dNTP(每种2.5mmol/L)1.2μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.15μL，模板DNA(20ng/μL)3μL，ddH2O 13.15μL。
PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，52-62℃(52℃，55℃，58℃，60℃，62℃)退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。
结果如表1所示，引物AS-2F/AS-2R在52-62℃之间的任一个退火温度，均存在非特异扩增；而新设计的引物BnRFO-2F3/BnRFO-2R则在任一个退火温度，均不存在非特异扩增。上述对比试验进一步表明，新设计的引物BnRFO-2F3/BnRFO-2R具有Rfo位点特异性，PCR扩增时不受甘蓝、芥蓝自交系材料同源序列的干扰。
表1.不同温度梯度对引物AS-2F/AS-2R、BnRFO-2F3/BnRFO-2R在甘蓝、芥蓝自交系材料 中扩增特异性的影响
            
‘+’存在非特异扩增，‘—’不存在非特异扩增。
实施例3、利用新引物BnRFO-2F3/BnRFO-2R进行种间杂种(芥蓝+油菜恢复系)后代的标记辅助选择
利用Ogura CMS日本绿为母本，油菜恢复系为父本，远缘杂交后获得杂种植株9棵，提取幼苗的基因组DNA。采用引物BnRFO-2F3/BnRFO-2R，分别以9棵杂种植株的基因组DNA为模板，按照下列体系和程序进行PCR反应：
PCR体系：PCR反应体积为15μL，其中包括10×Buffer(含MgCl215mmol/L)1.5μL，dNTP(每种2.5mmol/L)1.2μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.15μL，模板DNA(20ng/μL)3μL，ddH2O 13.15μL。
PCR程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。
扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶中电泳检测，140V恒压30min，利用紫外凝胶成像仪拍照。
结果表明，9棵杂种植株中有7棵含有恢复基因Rfo，其余2棵不含有Rfo(图3)，这与翌年开花后的表型(育性恢复)吻合。
接着以含有恢复基因的种间杂种为父本，Ogura CMS日本绿为母本进行回交，在回交一代总共获得44棵植株，利用引物BnRFO-2F3/BnRFO-2R，按照上述方法进行标记辅助筛选，在苗期鉴定出29棵植株含有Rfo基因(图4示出了部分植株的鉴定结果)，这与后期的表型吻合率达到100％。