一株弯曲乳酸杆菌（LACTOBACILLUSCRISPATUS）及其制药用途.pdf

本发明公开了一株弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus.crispatus)及其制药用途。本发明所提供的弯曲乳酸杆菌具体为弯曲乳酸杆菌IMC-105，本发明的弯曲乳酸杆菌IMC-105具有较强的产生H2O2的能力，可有效抑制外来的病原菌和其他条件致病菌的生长；同时又具有较强的对阴道上皮细胞的粘附作用，保证了菌株在阴道上皮的定植。本发明所提供的弯曲乳酸杆菌IMC-105在细菌性阴道病防治方面具有一定的应用前景。

权利要求书
1.  一株弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105(Lactobacillus.crispatus)，其保藏号为CGMCC No.9467。

2.  用于预防和/或治疗细菌性阴道病的制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括权利要求1所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105。

3.  用于预防和/或治疗细菌性阴道病的制品，其特征在于：所述制品的活性成分是权利要求1所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105。

4.  根据权利要求3或4所述的制品，其特征在于：还含有制备菌剂的常规辅料成分。

5.  用于抑制致病性细菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括权利要求1所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105。

6.  用于抑制致病性细菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分是权利要求1所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105。

7.  根据权利要求5或6所述的制品，其特征在于：还含有制备菌剂的常规辅料成分。

8.  权利要求1所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105在制备预防和/或治疗细菌性阴道病的制品中的用途，其特征在于，所述制品的活性成分包括权利要求1所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105。

9.  权利要求1所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105在制备预防和/或治疗细菌性阴道病的制品中的用途，其特征在于：所述制品的活性成分是权利要求1所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105。

10.  一种体外抑制致病性细菌的方法，其特征在于，使用以权利要求1所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105为活性成分的产品对体外存在的致病性细菌进行抑制。

说明书一株弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)及其制药用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一株分离自人体的可用于防治细菌性阴道病的弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)。
背景技术
微生物栖息在人体几乎每一个部位，如皮肤、口腔、肠道、生殖道等各部位都存在着大量的细菌，其中包括多种不同种类的细菌，可粗略分为“有益菌”和“条件致病菌”两大类，在健康人体这些细菌的数量和比例保持稳定的平衡状态。妇女阴道内可存在多种细菌，其中，乳酸杆菌是维持阴道健康微生态环境最常见和最重要的有益菌，乳酸杆菌占健康妇女阴道细菌总量的90％以上。它们主要通过产酸、过氧化氢来抑制病原菌和其他条件致病菌的生长。如果某些因素引起阴道内乳杆菌数量减少，甚至完全缺失，则可导致阴道内许多条件治病菌异常增殖，出现以明显的阴道微生态环境紊乱为主要特征的细菌性阴道病。
细菌性阴道病是育龄期妇女最为常见但又未受到重视的多发病，在健康妇女中的患病率约为20％，孕妇约为15％。细菌性阴道病是“小疾病，大麻烦”，患者生活质量明显下降，精神负担很重；而且感染艾滋病、淋病、非淋菌性尿道炎等性病的风险明显增加；患病孕妇可出现一系列妊娠并发症，如早产及绒毛膜羊膜炎等。目前，细菌性阴道病的治疗主要依靠甲硝唑或林可霉素等抗生素，但治疗效果不佳，治愈率不到50％，而且复发的比例高。一半患者即使大量应用抗生素亦不能治愈，临床症状持续存在，患者备受煎熬，医生苦无良策。如何控制复发、彻底根治细菌性阴道病是妇产科医生亟需解决的棘手问题。
为了提高细菌性阴道病的治疗效果，临床上急需新的治疗方案。由于抗生素治疗细菌性阴道病效果欠佳和抗生素治疗引起的肝、肾损害等毒副作用，国内外一直在努力探索基于益生菌乳杆菌制剂的微生态疗法。微生态治疗是将以杀灭微生物为主要的治疗方法变为增加益生菌、恢复阴道正常微生态环境为目的的新型治疗理念。即在利用抗生素清除致病菌后，直接补充自健康妇女阴道分离的乳杆菌活菌制剂，使其粘附定植下来，促进其天然的抵抗致病菌生长的能力。
健康妇女阴道内存在多种乳杆菌，具有个体差异性，且弯曲乳酸杆菌各株间抗致病菌能力差异明显。选择乳杆菌益生菌时，需要综合考虑乳杆菌的种类，其产酸、产H2O2能力，及与阴道上皮细胞粘附的能力，其中乳酸杆菌能否在阴道成功定植，是乳杆菌持续作用的基础，也是乳杆菌发挥疗效的关键因素。
由于不同的乳杆菌株对阴道上皮细胞有不同的粘附亲和力，亲和力强的菌株定植能力强，才能起到抑杀多种病原微生物的作用。如果乳杆菌活菌制剂不能定植在阴道上皮细胞，体外实验中再强的抑杀多种病原微生物的作用都无从谈起，变为空头支票。
一个完善而有效的益生菌菌种，其本身至少必须具备下述标准：(1)须为宿主应用位置正常定植菌；(2)能在宿主应用位置存活并生长；(3)可提供宿主有益的作用；(4)相关产品制成及储存期间须可维持活性及存活能力。
目前，国内阴道益生菌菌剂只有一种，其主要成分是德氏乳杆菌活菌。虽然它是从健康妇女阴道分离出来的一种乳杆菌，但不是我国妇女阴道菌群中的主要有益菌，我国健康妇女阴道细菌以弯曲乳酸杆菌为主。
发明内容
本发明人基于上述领域的空白，从我国健康妇女体内分离了一种弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)菌株。本发明还证明了该菌株对阴道上皮细胞具有较强的黏附作用，同时还证实该菌株具有较强的产生H2O2的能力，该菌制成的菌剂在存储期间能够维持较高的活性和存活能力，说明可以用于防治细菌性阴道病。
本发明请求保护的技术方案如下：
一株弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105(Lactobacillus crispatus)，其保藏号为CGMCC NO.9467。
用于预防和/或治疗细菌性阴道病的制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105。
用于预防和/或治疗细菌性阴道病的制品，其特征在于：所述制品的活性成分是所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105。
所述的制品还含有制备菌剂的常规辅料成分。
用于抑制致病性细菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分包括所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105。
用于抑制致病性细菌的制品，其特征在于：所述制品的活性成分是所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105。
所述制品还含有制备菌剂的常规辅料成分。
所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105在制备预防和/或治疗细菌性阴道病的制品中的用途，其特征在于，所述制品的活性成分包括所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105。
所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105在制备预防和/或治疗细菌性阴道病的制品中的用途，其特征在于：所述制品的活性成分是所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105。
所述的弯曲乳酸杆菌菌株IMC-105用于体外抑制环境中致病性细菌的用途。
本发明根据益生菌菌种的公认标准，从我国健康妇女体内分离了阴道内优势菌群—弯曲乳酸杆菌，并从中筛选出了一株具有较高的产H2O2能力和与阴道上皮细胞粘附定植能力强的益生菌株—弯曲乳酸杆菌IMC-105。实验证明，将所述弯曲乳酸杆菌IMC-105，按照106cfu/ml的密度接种于MRS液体培养基，于厌氧环境下，37℃静置培养21h后，转换为振荡培养3h，转速为220rpm，最终所得培养液上清中H2O2的浓度高达220.2μM。高效产生过氧化氢，可有效抑制外来的病原菌和其他条件致病菌的生长；同时，该弯曲乳酸杆菌对每个阴道上皮细胞平均粘附数量达到204，这也证实该菌株对阴道上皮细胞具有较强的粘附作用，保证了菌株在阴道上皮的定植。
该菌株已经送保藏，保藏名称为IMC-105，保藏号为CGMCC NO.9467。大小约1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，菌落边缘整齐、较湿润，大小形态稳定(如图1)。处于对数生长期的所述菌株IMC-105，经涂片、革兰染色，光学显微镜下观察菌体的形态为：革兰染色阳性，无芽胞杆菌，无鞭毛。弯曲乳酸杆菌IMC-105兼性厌氧，生长最适温度37-42℃，最适pH5.8-6.2；可发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖等多种糖。
根据实验证实的该菌株的产H2O2能力和对阴道上皮细胞的粘附能力，本发明还请求保护以该菌为活性的用于预防和/或治疗细菌性阴道病的制品。制备方法是本领域技术人员熟知的常规手段，例如但不限于如《一种稳定安全的微生态制剂及其制备方法和用途》(CN1663573B)，《灭活的乳酸菌微生态制剂及其制备方法》(CN101612169B)，《一种乳酸杆菌微生态制剂的制备方法》(CN101530160A)，《作为人体阴道中的益生微生物的乳酸产生细菌》(CN1308436)等现有技术中公开的制备方法或操作步骤，目前市场上公开销售使用的“乳酸菌阴道胶囊”、“阴道用乳杆菌活菌胶囊(定君生)”的制备工艺，以所述弯曲乳酸杆菌IMC-105为活性成分，通过所述常规手段和/或现有技术文献中公开的制备方法或操作步骤或目前市场上公开销售使用的产品的制备工艺，可以获得用于预防和/或治疗细菌性阴道病的制品，或者用于抑制致病性细菌的制品。
本发明请求保护的所述制品的剂型优选但不限于：胶囊剂。
根据本领域技术人员对乳杆菌的用途方面的常识，基于本发明请求保护的菌株在产过氧化氢方面的能力，该菌株可用于体外抑制环境中存在的致病性细菌。
保藏信息
菌种保藏名称：IMC-105
保藏号：CGMCC No.9467
分类命名：弯曲乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus crispatus
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2014年7月16日
附图说明
图1为从健康人引导分离的弯曲乳酸杆菌IMC-105菌落。
图2为弯曲乳酸杆菌IMC-105对阴道上皮细胞的粘附作用示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1弯曲乳酸杆菌菌株的分离和鉴定
一、弯曲乳酸杆菌菌株的分离
MRS培养基：蛋白胨10.0g；牛肉膏10.0g；酵母膏5.0g；柠檬酸氢二铵2.0g；葡萄糖20.0g；吐温80，1.0mL；乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g；磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)2.0g；硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58g；硫酸锰(MnSO4·H2O)0.25g；蒸馏水1000mL；调至pH 6.2～6.6。
收集了200余例临床检测无阴道炎症状体征的健康妇女阴道分泌物样品，将样本依次编号，接种于MRS液体培养基，37℃厌氧培养24h。每个样本随机挑选5个单菌落于2mL MRS液体培养基中培养增菌24h，并对菌落依次编号。扩增细菌用于细菌保种与DNA制备。将分离到的数百株细菌分别进行菌种鉴定、产过氧化氢及与阴道上皮细胞粘附作用的检测，把其中一株具有较强粘附作用且产过氧化氢的弯曲乳酸杆菌命名为IMC-105。
二、弯曲乳酸杆菌菌株的鉴定
1、形态学鉴定 
在MRS乳酸杆菌培养基平板上，上述步骤一分离得到的菌株IMC-105表现为大小约1-2毫米、不透明、突起的乳白色菌落，且菌落边缘整齐、较湿润，大小形态稳定(图1)。
2、生理生化特征分析
菌株IMC-105兼性厌氧，生长最适温度37-42℃，最适pH5.8-6.2。根据API细菌鉴定标准利用API 50 CHL培养基和API 50 CH试剂条(bioMe′rieux,Inc.,Marcy l’Etoile,France)对检测菌株IMJ-1进行糖发酵反应判读检测菌株IMC-105的生理生化特征。API 50 CHL是由49种可发酵碳水化合物的API 50 CH试验条组成的简易培养基。以测定菌制成悬液接种试验条的每一个小管。当培养时，由于发酵碳水化合物产酸，pH下降，使指示剂变色。
结果显示，菌株IMC-105可发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖等多种糖。
3、16s rDNA序列同源性分析
常规方法培养上述步骤一分离得到的菌株IMC-105，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，采用通用引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(如SEQ ID No.2)，1492r：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′(如SEQ ID No.3所示)扩增细菌16S rRNA基因保守区。25μL扩增体系包括：1×PCR反应缓冲液，200μmol/L dNTPs，上游及下游引物各0.2μmol/L，1U Taq DNA聚合酶，1μL模板DNA。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸30s，共25个循环；72℃延伸10min。PCR产物用1％凝胶电泳检测，阳性结果用27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(如SEQ ID No.2)，1492r：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′(如SEQ ID No.3)进行双向测序。序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在线完成。
菌株IMC-105的16S rDNA的序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2弯曲乳酸杆菌IMC-105产H2O2的检测
H2O2标准曲线制作：首先用浓度为100mmol/L的哌嗪-N,N'-二-乙磺酸(Piperazine-N,N_-Bis 2-ethanesulfonic acid，PIPES)将30％(v/v)H2O2(相当于9.128mol/L)储存液稀释成1mol/L，再用100mmol/L PIPES将1mol/L H2O2分别稀释成0μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L的工作液；然后分别取100μL上述H2O2工作液与100μL浓度为20mmol/L的TMB(四甲基联苯胺)、2μL辣根过氧化物酶(1mg/mL)混合，16℃孵育10min，测量OD630值。最终得到H2O2浓度标准曲线：y＝0.0033x-0.0496，R2＝0.992。
弯曲乳酸杆菌IMC-105液体培养H2O2浓度检测：挑取弯曲乳酸杆菌IMC-105菌落，接种1mL培养48h的菌液于10mL MRS液体培养基中，使培养液中菌株的浓度为105cfu/ml，于厌氧环境下，37℃静置培养21h后，转换为37℃振荡培养3h，转速为220r/min，旋转半径为2.54cm，培养结束后，收集发酵液，12000r/min离心2min，取100μL菌液上清测量 OD630值，根据标准曲线，计算菌液上清中H2O2浓度。实验重复三次，结果取平均值。
结果如表1所示，弯曲乳酸杆菌IMC-105在发酵培养液中能够产生大量的H2O2，其浓度高达220.3μM。根据文献Appl.Environ.Microbiol.2010,76(2):400-405；请见table1,产H2O2的浓度从小于0.3mM到大于-2mM不等，乳杆菌产H2O2的浓度大于0.3mM左右就算高。
表1弯曲乳酸杆菌IMC-105产生H2O2的能力检测单位：μM
  重复1 重复2 重复3 平均值 H2O2产量 216.3 196.5 248.1 220.3
实施例3弯曲乳酸杆菌IMC-105对阴道上皮细胞的粘附作用
阴道上皮脱落细胞取自于20余例健康(临床检测显示无生殖系统感染)育龄期妇女，各细胞样品标号后分别加入MEM培养基(pH 4.0)，120g离心10分钟，再重复离心2次，洗掉表面细菌，用MEM培养基调整阴道上皮脱落细胞浓度为105个/mL；活化过夜培养弯曲乳酸杆菌IMC-105使其浓度为(108CFU/mL)。所述阴道上皮脱落细胞与所述弯曲乳酸杆菌IMC-105各500μL等体积混合后置于37℃摇床(转速为100r/min，旋转半径为2.54cm)孵育1h，然后用0.8μm滤膜过滤，去掉游离弯曲乳酸杆菌IMC-105，并将滤膜轻压于盖玻片上，固定细胞进行革兰氏染色后油镜观察，分别计数三个细胞粘附细菌数，计算每个细胞平均粘附细菌数。同时将另外一株同样采用实施例1的方法分离鉴定得到的，但与阴道上皮细胞粘附定植力较弱的弯曲乳酸杆菌作为负对照。
结果显示，弯曲乳酸杆菌IMC-105对分离自20余例健康育龄期妇女的阴道上皮细胞均具有较强的粘附作用。图2为弯曲乳酸杆菌与阴道上皮细胞的粘附作用革兰氏染色后油镜观察图，图左半部为分离于健康育龄期妇女的阴道上皮细胞；图右半部为阴道上皮细胞与弯曲乳酸杆菌的粘附作用，表示较强的粘附(弯曲乳酸杆菌IMC-105)。从20余例中，随机选取4例，进行统计分析，计算得到每个阴道上皮细胞平均粘附弯曲乳酸杆菌IMC-105的数量达204个(见表2)。根据文献:The Journal of Infectious Diseases,Vol.171,No.5(May,1995),pp.1237-1243中的table 2，超过50就算粘附能力强。
表2阴道上皮细胞粘附弯曲乳酸杆菌IMC-105的数量统计


综合实施例1、实施例2的结果，本发明的弯曲乳酸杆菌IMC-105既具有较强的产生H2O2的能力(可有效抑制病原菌和其他条件致病菌的生长)，又具有较强的对阴道上皮细胞的粘附作用(保证了菌株在阴道上皮的定植)，这足以说明，本发明获得的弯曲乳酸杆菌IMC-105是有效防治细菌性阴道病的候选益生菌菌株。
另外，在抑菌实验中，以金黄色葡萄球菌为指示菌,IMC105培养上清液的抑菌环的直径平均为1.5毫米。