说明书一种水稻抗旱蛋白OsWS1及其编码基因和用途
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻抗旱蛋白OsWS1及其编码基因和用途。
背景技术
水稻(Oryza sativa L)是世界和中国最重要的粮食作物之一，是世界一半以上人口的主食，同时水稻也是耗水量最大的农作物，中国水稻生产用水量占农业用水总量的65％以上[Mayra Rodriguez，Eduardo Canales，Carlos J.Borroto，et a1.Identification ofgenes induced upon water·deficit stress in a drought-tolerant rice cultivar.Journal of Plant Physiology，2006，163：577-584.Sasaki T，Burr B.International rice genome sequencing projoct：theefort to completely sequence the rice genome.Cur Opin PlantBiol，2000，3(2)：138-141.]。随着全球变暖趋势的加剧，中国作为水资源相对匮乏的国家，水短缺问题日趋严重。据统计，干旱造成水稻的减产可超过其它因素所造成减产的总和，严重影响水稻的产量和品质[胡标林，李名迪，万勇，等.我国水稻抗早鉴定方法与指标研究进展.江西农业学报，2005，l7(2)：56-60]。大量的事实也揭示我国地区干旱化正在加剧，且增暖显著。中国每年因缺水造成的粮食减产达50多亿公斤，年均干旱受灾面积达2637万hm2，因缺水造成的经济损失达1200亿元。研究水稻的抗旱机制，并筛选出抗旱的水稻品种，不但对保障水稻生产具有重要意义，而且对提高水资源利用率具有重要的指导意义。
干旱胁迫在世界很多地区都有发生，损害生长并严重制约作物产量，干旱影响作物水分吸收、矿质营养运输和代谢、光合作用以及光合产物的分配。自然界的所有植物都受到干旱影响，从经济作物到大田作物、水生作物到旱种作物，从低等生物到高等生物都不同程度的受到干旱影响。干旱能从种子萌芽开始，影响植物的一生。
水稻作为重要的大田作物，其生理生态、开花结实、籽粒品质都答受到干旱胁迫的损害。干旱几乎影响植物的所有生命活动，然而植物已经进化出了一系列的抗旱机制，保证在水分胁迫条件下，通过多种途径提高其抗旱能力。例如：通过调节气孔大小减少水分的散失，产生渗透调节物质增加根系水分吸收，通过平衡细胞中的过氧化物维持植物的新陈代谢，维持细胞膜的选择透性，通过减少细胞生长激素，增加抗逆激素使其抗旱能力增加。另外，植物也能产生抗逆蛋白，增加植物的抗旱能力。植物一般通过三个相互作用的形式来响应干旱胁迫：一：引起一些基因表达的改变；二、产生或者降低一些蛋白的表达以直接响应干旱胁迫以减少对植株的损害；三、通过生理生化的变化以增强植株对干旱的耐受性。
目前，水稻抗旱相关基因的克隆及转基因已经初见成效。最早与水稻抗旱相关的转基因植株由Xu等(XuD.P.DuanX.L.,WangB.Y.,eta1.Expression of a late embryogenesis abountant protein gene,HAV from bayler confers tolerance to water efficient and salt in transgenic rice.PlantPhysiology,1996,l10(1):249-257.)获得，他们把HVAI基因导入水稻，获得大量转基因植株。在干早胁迫下这些转基因株系能保持高的叶片相对含水量，生长量降低小，且HVAI蛋白能保护细胞膜免受伤害，使其生长速率明显优于野生型对照,抗旱性增强。
DREB可以特异地与DRE顺式作用元件结合,在植株遭受干旱逆境时,可以激活胁迫诱导基因表达,使植株能够耐受干旱胁迫的影响。目前研究已证实DREB转录因子家族中的OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1D和OsDREB2A能在干旱胁迫时调控与植株生长和光合能力有关基因的表达，从而提高植株的耐旱能力(Mao Donghai,Chen Caiyan,Colinearity and Similar.Expression Pattern of Rice DREB1s Reveal Their Functional Conservation in the Cold-Responsive Pathway.PLoS ONE,2012,7(10):e47275)。sNAcl则是属于NAM，ATAF和CUC困AC)家族的一个转录因，在水稻中超量表达sNAcl，可以显著提高植株在干旱逆境下的结实率和产量(Honghong Hu,Mingqiu Dai,Jialing Yao,Benze Xiao,Xianghua Li,Qifa Zhang,Lizhong Xiong.Overexpressing a NAM,ATAF,and CUC(NAC)transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice.P NAS,2006,103(35):12987-12992.)
干旱胁迫过程中，调控基因编码DREB、MYB/MYC、bZIP蛋白等转录因子,与其相应的干旱响应靶基因启动子区域的顺式作用元件结合，激活基因的表达，从而调节植株对千旱逆境的适应。功能性相关基因包括LEA蛋白(胚胎发育晚期丰富蛋白)基因、通道蛋白基因、渗透调节物质(如脯氨酸、海藻糖、甜菜碱、多胺等)催化酶等。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种可用于提高植物抗旱的O-酰基转移酶OsWS1及其编码基因-抗旱基因OsWS1。
本发明专利以水稻的一个新脂肪酸合成酶基因OsWS1为研究对象，构建OsWS1基因超表达载体OsWS1-OE，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11，最后获得OsWS1基因超表达的组培苗42株，作为对照的由正常粳稻品种中花11愈伤分化的组培苗16株，都种于试验田。得到的T2，T3代OsWS1基因转基因植株较对照中花11，叶片中超长链脂肪酸的含量增加，外表皮表面的蜡质厚度增加，疣状突起变多，变厚，叶绿素流动性和失水速率降低，植株对干旱的抗性显著增加，说明OsWS1基因通过影响蜡质的含量和结构提高了植株抗旱的功能。通过RNAi技术构建OsWS1基因干涉表达载体 pTCK303-OsWS1-RNAi，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将干涉载体pTCK303-OsWS1-RNAi导入正常粳稻品种中花11，最后获得含有OsWS1基因干涉表达载体的组培苗24株，PCR鉴定出11个株系为转基因株系。在转录水平上检测OsWS1基因的表达量，发现T2，T3代转基因植株中的RNAi植株中OsWS1基因的表达均显著下降。且转基因植株叶片中的超长链脂肪酸含量降低，外表皮表面的蜡质变薄，疣状突起变小，变少，叶绿素流动性和失水速率增加，植株对干旱的抗性显著降低。
本发明的O-酰基转移酶OsWS1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种抗旱基因OsWS1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
含有上述抗旱基因OsWS1的表达载体。
含有上述表达载体的工程菌。
所述的工程菌优选为大肠杆菌或农杆菌。
本发明的第三个目的是提供上述抗旱基因OsWS1在控制植物对干旱耐受性中的应用。
优选，上述抗旱基因OsWS1在培育植物耐旱品种中的应用。
优选，所述的植物包括单子叶植物和双子叶植物。
进一步优选，所述的植物为水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜蓿。
本发明的第四个目的是提供针对抗旱基因OsWS1的干涉片段，其特征在于，其核苷酸序列如下：5’-TGATGTTCTACTACATCACGCTGCGGCCGCCGACGGGGGAGGCGACCGCGTTCTTCACGCTGCACGGGGCGCTCGCCGTGGCGGAGGGGTGGTGGGCGGCGCGCGAGGGGTGGCCGCGGCCGCCGCGCCCCGTCGCGACCGCGCTGACGCTGGCGCTCGTCATGTCCACGGGGT-3’。
本发明的第五个目的是提供上述干涉片段在调控抗旱基因OsWS1的表达中的应用。
本发明首次发现OsWS1基因是水稻超长链脂肪酸合成酶基因家族成员中的一员，超表达OsWS1基因能够提高水稻叶片内超长链脂肪酸的含量，增加叶片表面的蜡质层厚度，从而增加植株对干旱的抗性。因此可以将OsWS1基因应用于控制植物对干旱耐受性，培育植物如水稻耐旱品种中应用。
附图说明
图1是构建的超表达载体OsWS1-OE载体图。
图2是基因OsWS1的cDNA连入pGEM T-easy载体后用EcoRI酶切的结果图，M为Marker，1为含有基因OsWS1的pGEM T-easy。
图3是超表达载体OsWS1-OE用HindIII和BamHI双酶切后的结果图，M为Marker，1为酶 切后的超表达载体OsWS1-OE。
图4是超表达载体OsWS1-OE农杆菌的PCR鉴定结果图。M：marker；1,2,3,4分别代表是个不同的克隆。
图5是干扰载体实验所用的pTCK303载体图，a：PTCK303母载体示意图；b：OsWS1RNAi干涉片段插入示意图。
图6是干扰载体反向片段插入后用SpeI和SacI酶切鉴定结果图，M为marker，1为样品。
图7是干扰载体的终载体分别用SpeI和SacI(1)及BamHI和KpnI(2)酶切鉴定结果图。
图8是干扰载体农杆菌PCR鉴定结果。M：marker；1,2,3,4分别代表四个不同的单克隆。
图9是T2转基因植株中OsWS1的相对定量表达示意图，WT：对照中花11；OsWS1-ox：OsWS1基因超表达植株；OsWS1-RNAi：OsWS1干涉表达植株，4-1，6-4，8-4，11-7，14-4，1-1，4-14，7-7，8-1，11-2均代表不同的转基因株系。从这个结果可以看出在超表达OsWS1基因的转基因植株中OsWS1基因的表达显著提高，而OsWS1RNAi转基因植株中，OsWS1基因的表达显著下降。
图10是OsWS1:EGFP融合蛋白的共定位结果图，EGFP：对照；ER-rk：ER标记蛋白，EGFP：EGFP荧光；OsWS1:EGFP：OsWS1融合EGFP载体；merged：二者融合；从这个结果可以看出OsWS1基因表达定位在内质网，它所合成的蜡质合成酶是在内质网合成的，。
图11是ABA和干旱处理过程中OsWS1基因的相对定量表达结果。从结果可以看出OsWS1基因受到ABA和干旱的诱导表达，且OsWS1基因在干旱诱导复水后其相对表达又逐步恢复到正常水平。A：不同浓度ABA处理不同时间后OsWS1基因的相对表达；B：干旱和复水过程中OsWS1基因的相对表达。
图12是不同转基因植株和对照植株叶片中蜡质成分总含量、脂肪酸及长链脂肪酸含量的比较。A：蜡质总含量的比较。OsWS1超表达植株中的总蜡质含量比对照略有增加，而干涉表达植株中的总蜡质含量较对照略有下降。B：长链脂肪酸的比较。对叶片中C20到C34的长链用GC-MS方法进行测量发现，超表达OsWS1转基因植株中的长链脂肪酸含量显著高于对照，而干涉表达OsWS1转基因植株中的长链脂肪酸含量显著低于对照。C：植物叶片中脂肪酸含量比较结果。从结果看出C16和C18脂肪酸的含量在OsWS1超表达植株中显著下降而在RNAi转基因植株中显著增加。C20-C34的长链脂肪酸含量则相反，在超表达OsWS1的转基因植株中的含量显著增加，而在RNAi植株中的含量显著降低。WT：对照中花11；OsWS1-ox：OsWS1基因超表达植株；OsWS1-RNAi：OsWS1干涉表达植株。
图13是不同植株中正构烷烃类物质和醛类物质的GC-MS测量结果。A：正构烷烃类物质 GC-MS结果。测试结果发现C23到C32的正构烷烃类物质含量在转基因植株中的含量没有变化。B：醛类物质GC-MS结果。测试发现提取到的C26到C34醛类物质的含量在转基因植株和对照中没有显著差异。结果表明OsWS1基因只有参与了长链脂肪酸的延长。WT：对照中花11；OsWS1-ox：OsWS1基因超表达植株；OsWS1-RNAi：OsWS1干涉表达植株。
图14是植株叶片和茎表面蜡质结构扫描电镜观察结果。WT：对照中花11；OsWS1-ox：OsWS1基因超表达植株；OsWS1-RNAi：OsWS1干涉表达植株；Leaf：叶；Stem：茎。从结果可以看出。OsWS1超表达转基因植株叶片和茎表面的疣粒状蜡质突起明显较对照大且密度增加(白色箭头所示)，而RNAi植株叶片和茎表面的疣粒状蜡质突起明显较对照少，且小。
图15是植株叶片上表皮、叶肉细胞及花粉外壁表面的透射电子显微观察结果。Adaxial surface：上表皮；Mesophyll cell：叶肉细胞；Pollen：花粉，CW：细胞壁(cell wall)，WT：对照中花11；OsWS1-ox：OsWS1基因超表达植株；OsWS1-RNAi：OsWS1干涉表达植株。从研究结果我们可以看出：超表达OsWS1转基因植株叶片上表皮外层的蜡质层较对照厚且致密(黑色三角形所示)，叶肉细胞和花粉细胞壁的厚度交对照薄，在细胞壁上还含有很多没有被完全利用的油脂在壁上(白色星形位置)。RNAi转基因植株中细胞壁的厚度变薄，质地酥松，花粉外壁和内壁有很多不连续的细小断层(缺角的黑色三角形所示)。
图16是OsWS1超表达转基因植株与对照的叶绿色抽提率和失水速率比较。A：叶绿素抽提率。从结果可以看出OsWS1超表达转基因植株叶片中叶绿素的抽提率明显较对照慢，而RNAi植株中则与之相反。证明：OsWS1基因的表达通过影响植株细胞壁表面的蜡质分布影响了细胞中叶绿色的流动性。B：失水速率比较。从结果可以看出超表达OsWS1转基因植株叶片的失水速率明显较对照慢，而RNAi植株中则与之相反。证明：OsWS1基因的表达通过影响植株细胞壁表面的蜡质分布影响了失水速率。
图17是转基因植株与对照的干旱耐受性比较实验。种子萌发后取长势几本一致的幼苗正常生长于培养盆中，4周后(A)停止浇水2周(B)后复水，复水3天后(C)统计植株的存活率(D)。每次做三个对照，一共进行了2次重复。从统计结果可以看出超表达OsWS1植株表现出对干旱的耐受性显示高于对照，而RNAi植株对干旱的耐受性较对照现在下降，WT：对照中花11；OsWS1-ox：OsWS1基因超表达植株；OsWS1-RNAi：OsWS1干涉表达植株。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产品生产 厂商的使用说明。
实施例1：OsWS1基因的功能验证和应用
一、遗传转化载体的构建
超表达载体所用载体是本实验室构建的OsWS1-OE。OsWS1-OE是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA3301(Sun et al.Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice,encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal.2004，37:517-527)基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米Ubiquitin启动子的农杆菌介导的遗传转化载体(图1)。pCAMBIA3301载体购买自澳大利亚CAMBIA实验室(center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)，用玉米ubiquitin启动子替换掉35S启动子后，命名为pXU3301，替换启动子的技术属于常规知识，本领域技术人员可以按照常规知识实现。
提取水稻中花11的RNA，反转录成cDNA，用加酶切位点的引物(481900-cDNA3/F：AAGCTTATGGCCGGCGGCGACCT，HindIII；481900-cDNA3/R：AGATCTCAAAGAAGACTCAAAGCCGAGTG，BglII)扩增抗旱基因OsWS1(如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，然后经TA克隆与pGEMT-easy载体连接，连接反应：PCR产物5μl，载体0.5μl，2U T4ligase，10×buffer 1μl，总10μl体积，16℃连接3h。取10μl连接产物，用氯化钙冻融法转到大肠杆菌top10，加800ml LB，复苏1h，6000rpm 5min离心富集菌后涂于氨苄抗生素的LB平板，37℃过夜。挑单克隆，扩大培养抽提质粒，酶切鉴定，酶切电泳图如图2所示。然后进行测序，经测序发现，抗旱基因OsWS1(如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列)插入到pGEMT-easy载体中。待测序正确无误后，把构建后的载体用HindIII和BglII双酶切后连接到pXu3301已酶切(用HindIII和BamHI双酶切)好的大片段上，连接产物转化到农杆菌感受态EHA105，抽提质粒，酶切(酶切电泳图如图3所示)和PCR验证(PCR产物电泳图如图4所示)，然后进行测序，经测序发现，抗旱基因OsWS1插入到载体pXu3301中，由此得到构建好的载体，命名为OsWS1-OE，取700μl含构建好载体的农杆菌菌液加300μl 50％甘油混匀，-70℃保存。
干涉载体所用载体是本实验室构建的pTCK303-R1R2。pTCK303-R1R2是在国际上常用的植物遗传转化载体pTCK303(ZHEN WANG et al.A Practical Vector for Efficient Knock down of Gene Expression in Rice.Plant Molecular Biology Reporter.2004,22:409-417)基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的Ubi启动子的农杆菌介导的遗传转化载体 (图5)。pTCK303载体由中科院植物所分子和发育生物学研究中心(Research Center for M olecular and Developmental Biology)惠赠，该pTCK303载体也可以从试剂公司购买，其属于现有技术中常规的载体。选择抗旱基因OsWS1(如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列)的cDNA干涉片段的区间，用481900-RNAi/F(GGGGTACCACTAGTCACTACATCACGCTGCGGC，KpnI和SpeI)和481900-RNAi/R(GGATCCGAGCTCACCCCGTGGACATGACGAG，BamHI和SacI)引物扩增后(PCR反应体系：cDNA 1μl，10mM dNTPs 2μl；481900-RNAi/F 2.0μl；481900-RNAi/R 2.0μl；10x E-Taq buffer 5.0μl；E-Taq 5U；总50μl体积；PCR扩增程序：94℃3min，94℃30‘，56℃30’，72℃90‘，35cycles，72℃10min)，将获得的cDNA片段(OsWS1 RNAi cDNA)(GGGGTACCACTAGTC TGATGTTCTACTACATCACGCTGCGGCCGCCGACGGGGGAGGCGACCGCGTTCTTCACGCTGCACGGGGCGCTCGCCGTGGCGGAGGGGTGGTGGGCGGCGCGCGAGGGGTGGCCGCGGCCGCCGCGCCCCGTCGCGACCGCGCTGACGCTGGCGCTCGTCATGTCCACGGGGTTCTGGCTCTTCT)连接pGEM T-easy载体，连接反应：PCR产物5μl，载体0.5μl，2U T4ligase，10x buffer 1μl，总10μl体积，16℃连接3h。取10μl连接产物，用氯化钙冻融法转到大肠杆菌top 10，加800ml LB，复苏1h，6000rpm 5min离心富集菌后涂于氨苄抗生素的LB平板，37℃过夜。挑单克隆，扩大培养抽提质粒，测序鉴定。待测序正确无误后，首先用SpeI和SacI双酶切，将酶切好的第一个cDNA片段连在用SpeI和SacI切好的pTCK303载体大片段上，转化大肠杆菌，提取质粒，酶切鉴定(酶切电泳图如图6所示)。选择正确的质粒用BamHI和KpnI双酶切获得的大载体及连入pGEM T-easy的OsWS1RNAi cDNA(同时用BamHI和KpnI双酶切)片段，连接，并转化大肠杆菌，提取质粒酶切鉴定。将正确的质粒转化农杆菌感受态EHA105，提质粒，酶切(其酶切电泳图如图7所示)和PCR验证(PCR产物电泳图如图8所示)，得到构建好的干涉载体，命名为：OsWS1-RNAi。取700μl含构建好载体的农杆菌菌液加等300μl 50％甘油混匀，-70℃保存。
二、遗传转化
采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant Journal,1994,6：271-282)将超表达载体OsWS1-OE和干涉载体OsWS1-RNAi分别导入正常中花11水稻品种。农杆菌介导的遗传转化步骤如下：
1、愈伤诱导：成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1min，5％的次氯酸钠溶液消毒50min；灭菌水洗种子4-5次；将种子放在诱导培养基上；置于黑暗处培养5周， 温度25-27℃。
2、愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25-27℃。
3、预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4d，温度25-27℃。
4、农杆菌培养：在带有卡那霉素和链霉素的YEB培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA1052d，温度28℃；将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-4h。
5、农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子里；调节农杆菌的悬浮液至OD600＝0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡20min；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3d，温度19-20℃。
6、愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含含400mg/L头孢霉素的灭菌水中30min；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。
7、分化及生根：将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7d；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(2000lx)下培养，温度26℃，5-7周。
8、移栽：待愈伤分化成苗并生根后，洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。
9、转基因植株的分子生物学检测：待转基因植株长大后，剪取叶子提DNA，并设计引物首先对其进行PCR检测，最后获得超表达的组培苗42株，单株收种并种植，直至T2代检测出纯合植株，由此得到OsWS1超表达转基因植株(OsWS1-OX)。同样，设计引物对OsWS1干涉表达转基因植株(OsWS1-RNAi)进行PCR检测，最后获得OsWS1干涉表达转基因植株(OsWS1-RNAi)24株。OsWS1超表达转基因植株检测的引物为bar-t/F：CACCATCGTCAACCACTAC；bar-t/R：GCTGCCAGAAACCCAC，PCR产物片段长度431bp。OsWS1干涉表达转基因植株检测的引物为hpt-t/F：GATGTTGGCGACCTCGTATT；hpt-t/R：TCGTTATGTTTATCGGCACTTT，PCR产物片段长度517bp。单株收种并种植，得到纯合的T2和T3代植株后，用定量PCR技术对转基因植株中OsWS1基因的相对表达进行分析。定量PCR引物为，内参基因为eEF-1a，引物序列为eEF-1a qRT/F：GCACGCTCTTCTTGCTTTC；eEF-1a qRT/R：AGGGAATCTTGTCAGGGTTG，PCR产物片段长度为164bp；OsWS1的引物序列为40590-qRT/F：TCTGGGGACGGAGGTGGAA；40590-qRT/R：AACATCAGCTCGTGCATGACG，PCR产物片段长度154bp。经过两代植株的定量PCR结 果分析发现，OsWS1在OsWS1基因超表达转基因植株中的表达稳定显著增加，而在RNAi植株(OsWS1干涉表达转基因植株(OsWS1-RNAi))中稳定显著下降表达(图9)。
三、OsWS1转基因植株中蜡质合成相关实验验证
首先采用EGFP融合蛋白表达结合激光共聚焦观察实验分析发现OsWS1与EGFP共定位在内质网，证明OsWS1合成的长链脂肪酸合成酶是在内质网合成的(图10)。用0.5μM和5μM的ABA处理4周大小的水稻幼苗后1，2，4，8，12，24小时后用定量PCR技术分析OsWS1基因的表达，分析发现OsWS1受到ABA的诱导表达(图11-A)。在水稻水培营养液中正常条件下生长4周的幼苗取出用吸水纸吸干水分后至于吸水纸中，并于0，0.5，1，2，4小时取样，然后重新将幼苗至于水培液中于0.5，1，2，4，8，12小时取样，用定量PCR技术分析OsWS1对干旱的响应，发现OsWS1受到干旱的诱导，复水后其相对表达逐步恢复到正常生长水平(图11-B)。
根据网上对OsWS1同源基因的分析表明，它是一个长链脂肪酸合成酶相关基因。为了验证OsWS1基因的功能，用GC-MS方法对四叶期水稻叶片中的各种蜡质成分进行了分析。发现OsWS1基因超表达转基因植株材料中的总蜡质含量略高于对照，而OsWS1干涉表达转基因植株中的总蜡质含量略低于对照(图12-A)。长链脂肪酸(≥C20)的总含量在OsWS1基因超表达植株中则现在高于对照，在OsWS1干涉表达转基因植株中相反少于对照(图12-B)。对C16-C34的长链脂肪酸含量进行比较发现，非超长链脂肪酸C16和C18的含量在超表达OsWS1基因的转基因材料中的含量较对照低，而大于C18的超长链脂肪酸的含量在OsWS1基因转基因材料中的含量均显著高于对照。OsWS1干涉表达转基因植株中则相反，C16和C18的含量高于对照，大于C18超长链脂肪酸的含量低于对照(图12-C)。叶片中C23到C32正构烷烃类物质及C26到C34醛类物质的含量在OsWS1转基因材料中的表达没有差异。(图13-A，B)从GC-MS的结果可以看出OsWS1主要是影响了植物体内超长链脂肪酸的延长，不参与正构烷烃和醛类物质的碳链的延长。
为了进一步验证OsWS1基因参与植物体内参与超长链脂肪酸的延长对细胞壁成分和结构的影响，我们用透射电子显微技术(TEM)和扫描电子显微技术(SEM)对叶片、茎及花粉表面的蜡质进行了观察。结果发现超表达OsWS1基因导致植物叶片和茎表面覆盖的疣状蜡质突起增加，变大，变厚(图14)，叶肉细胞的细胞壁增厚，皮层和叶肉细胞的细胞壁上均有未多余的脂质颗粒(图15，白色星形所示)，花粉及叶肉细胞的细胞壁增厚(图15)。而RNAi干涉OsWS1表达植株叶片和茎表面的疣状蜡质突起减少，变小，细胞壁酥松，变薄。花粉外壁 和内壁均有不连续的细小裂痕(图14，15)。通过植物生理学实验对材料中的叶绿色流动性和失水速率进行了比较发现，超表达OsWS1基因的转基因材料叶绿素流动性和失水速率较对照显著慢，而OsWS1干涉表达转基因植株中的叶绿素流动性和失水速率较对照显著快(图16A,B)。
以上实验均证明OsWS1基因是一个超长链脂肪酸合成酶相关基因，它能影响植物体内超长链脂肪酸的延长。从而影响了植物细胞壁和皮层蜡质成分的结构和成分，通过影响表皮的蜡质结构影响了植物的叶绿色流动性和失水速率。
进一步我们将植株种植于实验盆中对材料进行了干旱耐受性实验，本实验一共进行了2次生物学重复实验，每次实验有3个重复，具体结果如图17所示。从实验结果我们发现，超表达OsWS1基因能显著提高植株对干旱的耐受性，而RNAi干涉OsWS1基因表达则显著降低了其对干旱的耐受性。干旱复水后的存活率为对照ZH11:54％；OsWS1-OE:86％；OsWS1-RNAi:29％。
附农杆菌介导的遗传转化试剂和配方
试剂和溶液缩写
6-BA(6-BenzylaminoPurine,6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin,激动素)；NAA(Napthaleneacetic acid,萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid,吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone,乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B,潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide,二甲基亚砜)；N6大量元素；N6微量元素；MS大量元素；MS微量元素
组织培养的溶液配方
1)N6大量母液[10倍浓缩液(10×)]
逐一溶解，然后在20–25℃下定容至1000ml。
2)N6微量元素母液[100倍浓缩液(100×)]
在20–25℃下溶解并定容至1000ml。
3)Fe2EDTA储存液(100×)
在一个大三角烧瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO4·7H2O)2.78g
在另一个大三角烧瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)3.73g
在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2h，定容至1000ml，4℃保存备用。
4)维生素储存液(100×)
加水定容至1000ml，4℃保存备用。
5)MS大量元素母液(10×)
在20-25℃下溶解并定容至1000ml。
6)MS微量元素母液(100×)
在20-25℃下溶解并定容至1000ml。
7)2,4-D储存液(1mg/ml)
2,4-D 100mg
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃下保存。
8)6-BA储存液(1mg/ml)
6-BA 100mg
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃下保存。
9)NAA储存液(1mg/ml)
NAA 100mg
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在4℃下保存备用。
10)IAA储存液(1mg/ml)
IAA 100mg
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在4℃下保存备用。
11)葡萄糖储存液(0.5mg/ml)
葡萄糖125g
蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。
12)AS储存液
AS 0.392g
DMSO 10ml
分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。
13)1N氢氧化钾储存液
氢氧化钾 5.6g
蒸馏水溶解定容至100ml，在20-25℃下保存备用。
14)KT储存液(1mg/ml)
KT 100mg
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在20-25℃下保存。
培养基配方
1)诱导培养基
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8，煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
2)预培养基
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8，封口灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖储存液和250μl AS储存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)
3)悬浮培养基
加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。
使用前加入1ml葡萄糖储存液和100ul AS储存液。
4)选择培养基
加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和500mg/L头孢霉素，分别倒入培养皿中(25ml/皿)。
5)预分化培养基
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和500mg/L头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
6)分化培养基
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0，封口灭菌。