中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1蛋白 一、技术领域
本发明属于基因工程技术领域。
二、背景技术
中华绒螯蟹(Eriocheir japonica sinensis)又名河蟹大闸蟹毛蟹，是我国重要的经济蟹类。蜕皮是河蟹生长的重要环节，外骨骼的周期性蜕皮是河蟹生长所必须的，但在养殖过程中有些二年生的河蟹因蜕皮未遂而成僵蟹，个体偏小，市场价格偏低，给生产者带来较大的经济损失。蜕皮抑制激素(molt-inhibiting hormone，MIH)的主要功能是通过抑制Y-器官蜕皮激素的合成而对甲壳动物的生长起关键性的调节作用。
三、发明内容
本发明人所述中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIH 1)基因的序列是发明人在南京师范大学生命科学学院遗传资源研究所通过一系列的实验获得的。实验步骤和结果为：
1、根据其他蟹类蜕皮抑制激素的氨基酸序列设计简并引物F1(5′-AGAGTWATHAAYGAYGARTGTCC-3′)和R48(5′-CACACACCACASGAAGTCYTC-3′)，运用RT-PCR技术从中华绒螯蟹成体的蜕皮间期眼柄中获得了1条约160bp的电泳条带(图1)，然后进行序列测定。
2 根据1获得的序列设计引物Ers FP(5′-AAACCTGATCGGGAA TCGTGAC-3′)，运用3′RACE技术，扩增出1条约1kb的cDNA条带(图2)测序后获得长度为1145bp的Ers-MIH1基因的cDNA序列(GenBank检索号：AY309062)，该序列由203bp地编码区(编码67个氨基酸)和942bp的3′端非翻译区组成，加尾信号AATAAA位于距离终止密码子(TAA)下游897bp处。
3 参照斑纹蟳(Charybdis feriatus)和食用黄道蟹(Cancer pagurus)MIH基因的内含子分布的位置，根据已获得的Ers-MIH 1基因的部分cDNA序列，设计用于扩增内含子2的引物ErsRP(5′-AGTTATTGCCCGAGGATG-3′)，然后以中华绒螯蟹基因组DNA为模板用引物ErsFP和ErsRP进行PCR，扩增获得内含子2(图3)。
4 根据已获得的Ers-MIH 1基因的部分cDNA序列，设计用于反向PCR扩增内含子1和5′端上游调控区的巢式引物IFP1(5′-CCAACATCTTCCGCATCGAC-3′)、IRP1(5′-TCACAGATCCAGTCCACCTTC-3′)和IRP2(5′-CTTGTAGATGTCACGATTCCC-3)用Pst I酶切中华绒螯蟹基因组DNA，然后进行自连反应以自连反应产物为模板进行反向PCR扩增，获得1个约2kb左右的片段(图4)该片段克隆测序后通过Blastx分析，结果表明获得了Ers-MIH 1基因的5′端上游调控区、外显子1、内含子1和外显子2的部分序列。
5 将3′RACE获得的序列内含子2的序列以及反向PCR产物的测序结果进行拼接，结果获得了3506bp的Ers-MIH 1基因序列美国国家生物技术情报中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)已正式接受该基因为GenBank的新成员，检索号为AY310313。
6 根据获得的Ers-MIH 1基因组DNA序列设计用于扩增Ers-MIH 1成熟肽cDNA序列的引物ErsM1(5′-ccggattcATGGGAATCATCAACGCCGAG-3′)和ErsM2(5′-cgctcgagTTATTGCCCGAGGATGCT-3′)，用该对引物扩增出Ers-MIH 1成熟肽的cDNA(图5)，测序结果表明获得的cDNA序列和Ers-MIH 1基因组DNA序列中相应部分的序列完全一致。
gcggagttct gtccaccgcc aagctaataa tatgtcgcta aagacgcatt ttccaaacct 60
tctcgaggag gaggaggtag aagaagagga gacggggagg aggaggagga ggaggaagag 120
ggtagcgcgc ggtcatagga acccccccct ccgccttccc cgcccccgcc gtgacgtaag 180
tggcaggcag gtttataagg gcggctcgtc agacagtcag ggcattcagc ctttggaatc 240
accagggact gttcccctgt tgaagcccct gagcaccaga gagacgcttc ctccggctcc 300
tgcgtccacc tcctactccc tccgcagcgc cgcccctcag tctcaccact cccactccgc 360
cctcactccc ttcttcggcg cctccgtcca cggctccgtc ctctaagcca ccatggtgtc 420
ccgcgctcaa tccagatttt cctctcaggt tagtttgagg acgcacgtgt tgggtagtca 480
gcgttatcgt gtaatatgta gggtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgg gttttcatct 540
tgtttcttgc tatttttttc gttttgccca tgtttttttt cttcgttggg gtacaaagaa 600
aatctcgctc attttttagg taaattatag aacttggctc tactatattt tgcaacgatt 660
tccgggcatg tcatctgagc cccaagtact gacagacaga agtagtgaga catttgtatt 720
gcggcgctgg ggatgaaatt ctagggtcac tgcaagacga tctccaggga aaacattgcc 780
cgggataaga tacaaaagtt acagcattga gtaaagacgc tttccaatac attcataagc 840
atcgtgtgcc attattcgaa cagcagggag cagcgagtag cgggcttttt ttattattgt 900
gttttttttg tgcccttgag ctgtcccctt tgttgtaaaa aaaaaaaacg ttacccagac 960
ctgtgactgg aagagcctgg tggatgcaga taacctttct ttctatatcc ttcctgacta 1020
cgacttgagc gtggtcgtat ttgtttcctc tgtatttctt cacccttgag ctgcttcctt 1080
gtgtgaaaga aagagggtgt gagaagggtt aagcgaggcc ctggaacact aaagaagctg 1140
aggctgatgt atggagagga atagaagggc gaagggcaag catgaaggac gctgtcaggt 1200
ctgtgaatgg cctagactcg tgcatttaga aggtaggaga gaaagagtta gctgagtccc 1260
tggcccatgt acgaagctgc catatctgtt gatgggagag gctggtgaac gcagagggta 1320
gagggaaaga gttagctgag gccctggcac atgtaggaag atgccgtatc tgttgatggg 1380
agaggctggt gaacgcagag ggtagaggga aagagttagc tgaggccctg gcacatgtag 1440
gaagctgcca tatctgttga tgggagaggc tggtgaacac agagggtaga gggaaagagt 1500
tagctgaggc cctggcccat gtaggaagct gccatatctg ttgatgggag aggctggtga 1560
acgcagagga taaagggaac ggctttgtta ggtgaggccc aggagcatgt atcacgccgg 1620
ctcacgacac ggtgctttac agaggacgtg gctggtggcg gcggtggtgc tggccgtcct 1680
gtgtagcttc ggtgtccagc gggccgcggc gggaatcatc aacgccgagt gtccaaacat 1740
gatcgggaat cgtgacatct acaagaaggt ggactggatc tgtgaggact gcgccaacat 1800
cttccgcatc gacggtctgg gcatgctctg caggtacgca agagagagag agagagagag 1860
agagagagag agagagagag agagagagag agagtaaaat gaataaaaaa ggaaaaaaag 1920
atctccttat actcttcctg ctcctccccc agcttctctt ctctctgctc atcctcttct 1980
tcctcctcct tctcctcctc ttccttcact tataccaatg ttccatgttc ataactgacc 2040
ctcatcatca tcatcttcct cctcctactc ctcctcctcc tcctcttcct gctcctcccc 2100
cagcttctct tctctctgct catcctcttc ttcctcctcc ttcacttata ccaatgttcc 2160
tttttcatat tcctcctcct cctcctcctc ttcctcctcc tactcctcct cctcctcctc 2220
ctcttgctcc tcccccagct tctcttctct ctgctcatcc tcttcttcct cttcctcctc 2280
ctcctccttc acacttatac caatgttcca tgttcataac cgaccctcct cttcctcctc 2340
ctcctcctcc tctccaccac cctcttcacc gatcacctaa accctcatga tccccctcca 2400
cctcttcatc gttgttacca ccaccaccat catcatcatc accagtttcc ccatgcctaa 2460
cgctcccaca cttcaccttt caggaagaac tgctttagga acatcgactt cctgtggtgt 2520
gtgtacgcct cggaacggca cgcacagaag gacgacctca cgcgttacgt cagcatcctc 2580
gggcaataac tcctgggtgc cccacctgcc gctccctccc tccctccccg gggtatctgc 2640
cgctgctgga gatgccccga gggtgaagcc gatgtccggg aagcgccttg aagtgaagag 2700
tgaagtgcgt ctctccagca gctgtccctc cctctctggc tgctcttcgt ccgtggtgta 2760
agaatccagc ggctaaagcc ttggttcagt ctctcgcgag gagctttgat tggcctccgt 2820
tcacctccat tcagtcgctt gtctctgttt agctccgttc acgccttcgt ctattgttca 2880
gccgttcacc ttccgttcac ctcgtttacc cacaaagctc cacttgtcag tgctttcctg 2940
ggtcctccag aaaggtcttg catatcaggg acactatttt agcattggga attggaggta 3000
acagagtata ggaaaagaca attacatttt tgtttgtgta catggacgag tattcgaatg 3060
tagaaggctg ctgtagtagt tgtaatagta gctgtagtat ataggaggag gaggaggagc 3120
agaaggagga gcaggagtgg aaaaggaaga agagaggagg aagaaggtat ttgaaagtag 3180
aaataagttg aaagacatct cactgaaaca gtattctcaa aactctagtc aactctaaag 3240
ctgtttgagg gttttctctt tatgaatgtg tatgtgtgat cgtactcttg tttatttgca 3300
ttcttggtta gtgttgaatc attcctttgt gtgtgagtgt gtgtatgtca acttcctttg 3360
ttattttgtt tcactttgtg ttatcctctc tcgttttgtc ctaatttatt gaggttgtag 3420
tatttattga aatctgagcc gctgtgttct tccacgtctt agaattaatt gtggctgata 3480
aaaaaaataa agagaaacga aagagc
中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1的基因组DNA序列
Met Val Ser Arg Ala Gln Ser Arg Phe Ser Ser Gln Arg Thr Trp Leu Val Ala Ala Val
1 6 11 16
Val Leu Ala Val Leu Cys Ser Phe Gly Val Gln Arg Ala Ala Ala Gly Ile Ile Asn Ala
21 26 31 36
Glu Cys Pro Asn Met Ile Gly Asn Arg Asp Ile Tyr Lys Lys Val Asp Trp Ile Cys Glu
41 46 51 56
Asp Cys Ala Asn Ile Phe Arg Ile Asp Gly Leu Gly Met Leu Cys Arg Lys Asn Cys Phe
61 66 71 76
Arg Asn Ile Asp Phe Leu Trp Cys Val Tyr Ala Ser Glu Arg His Ala Gln Lys Asp Asp
81 86 91 96
Leu Thr Arg Tyr Val Ser Ile Leu Gly Gln
101 106
中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因编码蛋白的氨基酸序列
本发明的目的：
鉴于中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIH 1)基因是本发明人首次在中华绒螯蟹克隆的能抑制其蜕皮的基因，即该基因具有潜在的调节中华绒螯蟹生长的功能，本发明拟通过对Ers-MIH 1基因表达调控机理及功能的研究，从基因工程技术角度寻找解决河蟹因蜕皮异常而导致个体偏小这一问题的方法，为发展河蟹养殖业服务。Ers-MIH 1基因的研究可用于：
1、制备该基因的融合蛋白：该融合蛋白可用于中华绒螯蟹蜕皮机理的研究。
2、制备抗体：Ers-MIH 1基因编码蛋白抗体的制备，可用于免疫组织化学染色、ELISA、免疫电镜、免疫共沉淀等根据免疫学原理设计的检测方法，也可用于该基因编码蛋白在组织细胞中的定位和定量研究。该抗体有可能用于降低中华绒螯蟹体内蜕皮抑制激素的活性，从而促进蜕皮及生长。
3、可通过分子生物学技术抑制或降低该基因的表达，从而促进中华绒螯蟹的蜕皮及生长。
本发明技术方案：
1、中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIH 1)融合蛋白的制备
(1)以提取的中华绒螯蟹眼柄总RNA为模板，用Superscript First-StrandSynthesis System for RT-PCR试剂盒反转录合成第1链cDNA。
(2)用引物ErsM1(5′-ccggattcATGGGAATCATCAACGCCGAG-3′)和ErsM2(5′-cgctcgagTTATTGCCCGAGGATGCT-3′)以上述第1链cDNA为模板扩增出Ers-MIH 1成熟肽的cDNA(图5)，反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。
(3)上述扩增产物割胶纯化后，连接于pMD18-T载体(大连宝生物)，构建重组质粒pMD18-T-MIH 1，转化DH5α感受态细胞将筛选出的阳性克隆进行插入片段的序列测定，然后将测序正确的阳性克隆的质粒与表达载体pGEX-4T-1(购自Amersham Parmaciaa公司)同时用Bam H I和Xho I在37℃双酶切数小时(图6)琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段及pGEX-4T-1载体后用T4 DNA连接酶连接将连接产物转化大肠杆菌DH5α，构建重组表达质粒pGEX-4T-MIH 1并进行双酶切鉴定(图6)。
(4)将重组质粒pGEX-4T-MIH 1转化BL21菌株后，以IPTG诱导若干小时，离心后加上样缓冲液煮沸破碎细胞，进行12％浓度的SDS-PAGE电泳(图7)。
(5)利用GST标签进行融合蛋白的亲和层析分离纯化。
2、中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIH 1)基因编码蛋白特异性多克隆抗体
将融合蛋白与载体蛋白KLH(Keyhole Limpet Hymocyanin)结合，经透析后再与完全/不完全佐剂(Complete/Incomplete Freund’s Adjuvant)等量混合，免疫新西兰兔(背部皮下注射)，每隔3～4周激发注射一次，共三次，于3个月后取血分离血清以免疫前动物血清作为对照做ELISA，测定各免疫兔血清中抗体滴度筛选高滴度血清，进一步用抗原作竞争抑制免疫试验确定抗体的特异性根据ELISA结果确定其用于免疫组织化学染色的稀释倍数1∶200～500。
3、通过抗原抗体反应降低蜕皮抑制激素的活性
通过注射法或浸泡法将中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIH 1)基因编码蛋白的特异性抗体送入中华绒螯蟹体内，抑制或降低蜕皮抑制激素的活性，达到促进中华绒螯蟹蜕皮及生长的目的，并通过实验确定抗体作用的合适剂量。
4、中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIH 1)基因表达的抑制
根据Ers-MIH 1的DNA序列合成Ers-MIH 1特异的双链RNA分子，通过摄食注射和浸泡的方法将双链RNA分子导入中华绒螯蟹体内即通过RNA干涉(RNA interference，RNAi)技术封闭Ers-MIH 1基因的表达或通过反义RNA技术及knock out等技术封闭或抑制或降低Ers-MIH 1基因的表达，从而促进中华绒螯蟹的蜕皮及生长。
四、附图说明
图1、简并引物扩增产物的电泳图(M：DNA标记；1～6：简并引物的扩增产物)
图2、3′RACE PCR结果(M：DNA标记；1：3′RACE PCR产物)
图3 Ers-MIH 1基因内含子2的PCR扩增结果(M：DNA标记；1：内含子2的PCR扩增产物)
图4、反向PCR扩增结果(M：DNA标记；1：反向PCR扩增产物)
图5 Ers-MIH 1基因成熟肽的cDNA扩增结果(M：DNA标记；1～3：Ers-MIH 1基因成熟肽的cDNA扩增结果)
图6重组质粒pMD18-T-MIH 1和pGEX-4T-MIH 1限制性酶切分析(M：DNA分子量标记；1-4：候选质粒pMD18-T-MIH 1经Bam H I和Xho I双酶切；5：候选质粒pGEX-4T-MIH 1经Bam H I和Xho I双酶切)
图7融合蛋白诱导表达过程中大肠杆菌总蛋白的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分析(M：蛋白质分子量标记；1-2：BL21/pGEX-4T-1经IPTG分别诱导1小时和6小时；3-7：BL21/pGEX-4T-MIH 1经IPTG分别诱导1小时，2小时，3小时，4小时，6小时，箭头所示为表达的融合蛋白rMIH)
中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因序列表
<110>南京师范大学
<120>中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因
<160>1
<210>1
<211>3506bp
<212>基因组DNA
<213>中华绒螯蟹(Eriocheir japonica sinensis)
<400>1
gcggagttct gtccaccgcc aagctaataa tatgtcgcta aagacgcatt ttccaaacct 60
tctcgaggag gaggaggtag aagaagagga gacggggagg aggaggagga ggaggaagag 120
ggtagcgcgc ggtcatagga acccccccct ccgccttccc cgcccccgcc gtgacgtaag 180
tggcaggcag gtttataagg gcggctcgtc agacagtcag ggcattcagc ctttggaatc 240
accagggact gttcccctgt tgaagcccct gagcaccaga gagacgcttc ctccggctcc 300
tgcgtccacc tcctactccc tccgcagcgc cgcccctcag tctcaccact cccactccgc 360
cctcactccc ttcttcggcg cctccgtcca cggctccgtc ctctaagcca ccatggtgtc 420
ccgcgctcaa tccagatttt cctctcaggt tagtttgagg acgcacgtgt tgggtagtca 480
gcgttatcgt gtaatatgta gggtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgg gttttcatct 540
tgtttcttgc tatttttttc gttttgccca tgtttttttt cttcgttggg gtacaaagaa 600
aatctcgctc attttttagg taaattatag aacttggctc tactatattt tgcaacgatt 660
tccgggcatg tcatctgagc cccaagtact gacagacaga agtagtgaga catttgtatt 720
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ctgtgaatgg cctagactcg tgcatttaga aggtaggaga gaaagagtta gctgagtccc 1260
tggcccatgt acgaagctgc catatctgtt gatgggagag gctggtgaac gcagagggta 1320
gagggaaaga gttagctgag gccctggcac atgtaggaag atgccgtatc tgttgatggg 1380
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ctcacgacac ggtgctttac agaggacgtg gctggtggcg gcggtggtgc tggccgtcct 1680
gtgtagcttc ggtgtccagc gggccgcggc gggaatcatc aacgccgagt gtccaaacat 1740
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cttccgcatc gacggtctgg gcatgctctg caggtacgca agagagagag agagagagag 1860
agagagagag agagagagag agagagagag agagtaaaat gaataaaaaa ggaaaaaaag 1920
atctccttat actcttcctg ctcctccccc agcttctctt ctctctgctc atcctcttct 1980
tcctcctcct tctcctcctc ttccttcact tataccaatg ttccatgttc ataactgacc 2040
ctcatcatca tcatcttcct cctcctactc ctcctcctcc tcctcttcct gctcctcccc 2100
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tttttcatat tcctcctcct cctcctcctc ttcctcctcc tactcctcct cctcctcctc 2220
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ctcctccttc acacttatac caatgttcca tgttcataac cgaccctcct cttcctcctc 2340
ctcctcctcc tctccaccac cctcttcacc gatcacctaa accctcatga tccccctcca 2400
cctcttcatc gttgttacca ccaccaccat catcatcatc accagtttcc ccatgcctaa 2460
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tatttattga aatctgagcc gctgtgttct tccacgtctt agaattaatt gtggctgata 3480
aaaaaaa taa agagaaacga aagagc
中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1的基因组DNA序列
Met Val Ser Arg Ala Gln Ser Arg Phe Ser Ser Gln Arg Thr Trp Leu Val Ala Ala V
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lu
41 46 51 56
Asp Cys Ala Asn Ile Phe Arg Ile Asp Gly Leu Gly Met Leu Cys Arg Lys Asn Cys P
he
61 66 71 76
Arg Asn Ile Asp Phe Leu Trp Cys Val Tyr Ala Ser Glu Arg His Ala Gln Lys Asp A
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81 86 91 96
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101 106
中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因编码蛋白的氨基酸序列