西红花特异性鉴别引物及PCR方法.pdf

本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种能够快速鉴定西红花的PCR扩增方法及其特异引物。使用此方法鉴别西红花，只通过简单的DNA提取、PCR特异性扩增、电泳检测即可完成对样品的鉴别。具有操作简单、特异性强、重复性好等优点。

权利要求书
1.  一种鉴定西红花的特异性引物，其特征在于所述引物为P421F、P421R，471QCF、471QCR、 121CsR、386AdR，其序列为：P421F，5’-TCGTTTCTCGCATGTCTC-3’；P421R， 5’-CTTGATCCACTTGGCTACA-3’；471QCF，5’-TCTTGGCAGCATTCCGAGTA-3’；471QCR， 5’-GACATTCATAAACCGCTCTACC-3’；121CsR，5’-CTGGTAAGTCCATCAGTCCACATT-3’；386AdR， 5’-CTTGTTCAATTTATCTCTCTCAAGT-3’。

2.  一种西红花的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤：
a)从待鉴定样品中提取到DNA样品；
b)用权利要求1所述的引物P421F+P421R进行PCR反应，扩增反应体系包括：总体积25 μL，其中10×buffer缓冲液2.5μL，dNTP20nmol，P421F、P421R引物各5pmol，rTap酶1U， BSA0.5μL，DNA20ng，灭菌蒸馏水16.8μL；反应条件：94℃预变性4min后，94℃变性 30S，56℃退火45S，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸8min，获得PCR产物，通 过2.5％的琼脂糖凝胶电泳，并用核酸染色试剂进行染色观察；
c)用权利要求1所述的引物471QCF+471QCR+121CsR+386AdR进行PCR反应：总体积 25μL，其中10×buffer缓冲液2.5μL，dNTP20nmol，471QCF引物用量为10pmol，471QCR 的用量为1.25pmol，121CsR用量3.75pmol，386AdR用量5pmol，rTap酶1U，BSA0.5μL， DNA20ng，灭菌蒸馏水14.8μL；反应条件：94℃预变性4min后，94℃变性30S，56℃ 退火45S，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸8min，获得PCR产物，通过2.5％的琼 脂糖凝胶电泳，并用核酸染色试剂进行染色观察；
d)PCR扩增产物电泳后，如果b)产物存在分子量约为421bp的单一条带，则初步证明所检 材料含西红花；b)产物不存在分子量约为421bp的单一条带，则证明所检材料不含西红花；如 果b)产物存在分子量约为421bp的单一带，且c)产物只存在分子量约为121、471bp的两条带， 则确定所检材料含西红花；如果b)产物存在分子量约为421bp的单一带，且c)产物存在121、 471、386bp三条带，则确定材料中含有西红花，且可能存在胡萝卜、红花或莲须；如果b)产物 不存在分子量约为421bp的单一条带，c)产物不存在分子量约为121bp的条带，则确定所检材 料无西红花。

3.  一种西红花的PCR鉴定方法，其特征在于，待测定样品为西红花饮片、西红花粉碎后 的粉末、或含有粉碎后西红花粉末的复方。

说明书西红花特异性鉴别引物及PCR方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种能够快速鉴定中药材西红花的特异性引物及PCR扩增方法。 
背景技术
西红花为鸢尾科植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头。又名藏红花、番红花等，西红花以柱头入药，产量极低，价格高，由于经济利益驱动，市场偶见使用其他植物的花柱或花丝等组织染色后冒充西红花销售。掺伪品包括菊科植物菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的舌状花冠，红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花，睡莲科植物莲(Nelum bonucifera Gaertn.)的干燥雄蕊，伞形科胡萝卜属胡萝卜(Daucus carota)的干燥细丝等。因此建立快速、准确鉴别西红花的方法，对于市场监管、保证临床用药安全是十分重要的。 
性状、显微、理化、化学和生物鉴定构成了现代中药材鉴别方法的五大领域，其中以DNA分子标记为代表的生物鉴定方法已广泛应用于中药材分子真伪鉴别。目前使用的DNA分子标记(Dodgson JB，Cheng HH，Okimoto R.DNA marker technology：a revolution in animal genetics.Poult Sci，1997，76(8)：1108～1114.)主要包括随机扩增多态性DNA(RAPD)、聚合酶链式反应-限制性酶切长度多态性(PCR-RFLP)、简单重复序列间区多态性(ISSR)、ITS序列分析、DNA条形码技术等。与传统鉴别方法相比，DNA分子标记不受环境的影响，也不受基因表达与否的限制，其数量丰富、遗传稳定(Shah MM，Hassan SW，Maqbool K，et a1.Comparisons of DNA marker～based genetic diversity with phenotypic estimates in maize grown in Pakistan..Genet Mol Res，2010，9(3)：1936～1945.)，对生物体的影响表现“中性”，即可以对各发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作检测；具有快速、微量、特异性强以及操作简便的特点。 
本研究针对西红花和其掺伪品的核酸序列差异设计特异引物，进行西红花的分子鉴别，通过PCR扩增和电泳等基本操作，不需要进行测序，可更快速、简便、高效的鉴别西红花真伪。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的PCR特异性鉴别引物和鉴别体系。 
发明内容
本发明的目的是提供一种贵细药材西红花的鉴定方法，该PCR鉴定方法操作简单、样品量少，能快速、准确的鉴定西红花的样品，并能检测西红花是否有掺杂，具有非常强的实用 性。 
1、一种鉴定西红花的特异引物P421F、P421R，471QCF、471QCR、121CsR、386AdR，其序列为： 

2、一种西红花的PCR鉴定方法，其特征在于，包括下列步骤： 
a)从待鉴定样品中提取到DNA样品； 
b)用权利要求1所述的引物P421F+P421R进行PCR反应，扩增反应体系包括：总体积25μL，其中10×buffer缓冲液2.5μL，dNTP20nmol，P421F、P421R引物各5pmol，rTap酶1U，BSA0.5μL，DNA20ng，灭菌蒸馏水16.8μL；反应条件：94℃预变性4min后，94℃变性30S，56℃退火45S，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸8min，获得PCR产物，通过2.5％的琼脂糖凝胶电泳，并用核酸染色试剂进行染色观察； 
c)用权利要求1所述的引物471QCF+471QCR+121CsR+386AdR进行PCR反应：总体积25μL，其中10×buffer缓冲液2.5μL，dNTP20nmol，471QCF引物用量为10pmol，471QCR的用量为1.25pmol，121CsR用量3.75pmol，386AdR用量5pmol，rTap酶1U，BSA0.5μL，DNA20ng，灭菌蒸馏水14.8μL；反应条件：94℃预变性4min后，94℃变性30S，56℃退火45S，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸8min，获得PCR产物，通过2.5％的琼脂糖凝胶电泳，并用核酸染色试剂进行染色观察； 
d)PCR扩增产物电泳后，如果b)产物存在分子量约为421bp的单一条带，则初步证明所检材料含西红花；b)产物不存在分子量约为421bp的单一条带，则证明所检材料不含西红花；如果b)产物存在分子量约为421bp的单一带，且c)产物只存在分子量约为121、471bp的两条带，则确定所检材料含西红花；如果b)产物存在分子量约为421bp的单一带，且c)产物存在121、471、386bp三条带，则确定材料中含有西红花，且可能存在胡萝卜、红花或莲须；如果b)产物不存在分子量约为421bp的单一条带，c)产物不存在分子量约为121bp的 条带，则确定所检材料无西红花。 
3、一种西红花的PCR鉴定方法，其特征在于，待测定样品为西红花饮片、西红花粉碎后的粉末、或含有粉碎后西红花粉末的复方。 
附图说明
图1：P421F+P421R特异引物鉴别，该引物能扩增获得西红花样品(Cs)和西红花psbA片段克隆质粒(CspsbApMD19)421bp的鉴别条带，而对其它混淆品和伪品没有扩增产物。P421F+P421R鉴别效果：“+”CspsbApMD19，“-”negative control，M100bp ladder.Cs：西红花，Dm菊花，Dc胡萝卜，Nm莲，Ct红花(以下缩写同) 
图2：471QCF+471QCR+121CsR+386AdR多重PCR鉴别体系，对样品的鉴别结果显示，使用多重PCR鉴别体系，西红花样品(Cs)和西红花rbcL片段克隆质粒(CsrbcLpMD19)能扩增出471bp的通用条带和121bp鉴别条带。胡萝卜、莲、红花能扩增出471bp的通用条带和386bp的伪品条带，而菊花仅能扩增出471bp的通用条带。471QCF+471QCR+121CsR+386AdR多重PCR鉴别效果：“+”CsrbcLpMD19，“-”negative control，M：DL2000ladder. 
图3：西红花与胡萝卜或莲混合，混合品胡萝卜或莲含量从1％-50％都能扩出471、386、121bp的条带，且随浓度增加，各条带亮度有所变化，特别是伪品386bp条带亮度增加。471QCF+471QCR+121CsR+386AdR多重PCR鉴别混合样品的效果：1-6Cs+Dc，Dc的含量从1到6为：1％，2.5％，5％，10％，20％，50％。7-12Cs+Nm：Nm的含量从7到12为：1％，2.5％，5％，10％，20％，50％，M：DL2000ladder。 
具体实施方式
1材料 
西红花和混杂品药材的实验材料取自药材市场或药店，经中国中医科学院中药研究所金燕鉴定。具体见表1。 
表1西红花及掺杂品 


2特异性鉴别引物设计 
选择通用引物psbA-trnH，rbcL1R-rbcL824R扩增获得西红花及掺杂品的序列，通过Genebank上查询已登录序列，使用Bio-edit软件进行比对，获得差异位点信息，使用primer5软件进行引物设计，分别设计针对psbA-tmH和rbcL的特异性引物，见表2。 
表2鉴别引物 

3DNA提取 
将材料用球磨仪研磨成粉，取约0.02g粉末置于2.0mL的微量离心管中，加入900μL已灭菌的CTAB提取液(2％CTAB，100mmo1.L-1Tris-HCl，20mmol.L-1EDTA，1.4mol.L-1NaCl)、0.01g PVP40000、10μLβ-巯基乙醇充分振荡混匀，65℃水浴1.0-1.5h，期间轻摇2-3次。水浴结束后取出，冷却至室温，加入900μL氯仿-异戊醇(24：1)，充分振荡混匀，12000×g离心10min。取上清，加入等体积氯仿-异戊醇(24：1)，充分振荡混匀，12000×g离心10min。取上清，加入2／3体积预冷的异丙醇溶液，-20℃放置0.5h以上。取 出，12000×g离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，无水乙醇洗涤一次，37℃挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，然后-20℃保存。 
4扩增检测及鉴定 
a)将从待鉴定样品中提取到DNA样品，稀释到20ng·μL-1； 
b)用权利要求1所述的引物P421F+P421R进行PCR反应，扩增反应体系包括：总体积25μL，其中10×buffer缓冲液2.5μL，dNTP20nmol，P421F、P421R引物各5pmol，rTap酶1U，BSA0.5μL，DNA20ng，灭菌蒸馏水16.8μL；可加入阳性质粒CspsbApMDl9做对照，反应条件：94℃预变性4min后，94℃变性30S，56℃退火45S，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸8min，获得PCR产物，通过2.5％的琼脂糖凝胶电泳，并用核酸染色试剂进行染色观察； 
c)用权利要求1所述的引物471QCF+471QCR+121CsR+386AdR进行PCR反应：总体积25μL，其中10×buffer缓冲液2.5μL，dNTP20nmol，471QCF引物用量为10pmol，471QCR的用量为1.25pmol，121CsR用量3.75pmol，386AdR用量5pmol，rTap酶1U，BSA0.5μL，DNA20ng，灭菌蒸馏水14.8μL；可加入阳性质粒CsrbcLpMD19做对照，反应条件：94℃预变性4min后，94℃变性30S，56℃退火45S，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸8min，获得PCR产物，通过2.5％的琼脂糖凝胶电泳，并用核酸染色试剂进行染色观察； 
d)取5μL扩增产物，采用2.5％的琼脂糖凝胶，用100ladder DN Amarker做参照，在电压100-150V下电泳15-20分钟，凝胶成像系统下观察并拍照。PCR扩增产物电泳成像后，如果b)产物存在分子量约为421bp的单一条带，则初步证明所检材料含西红花；b)产物不存在分子量约为421bp的单一条带，则证明所检材料不含西红花；如果b)产物存在分子量约为421bp的单一带，且c)产物只存在分子量约为121、471bp的两条带，则确定所检材料含西红花；如果b)产物存在分子量约为421bp的单一带，且c)产物存在121、471、386bp三条带，则确定材料中含有西红花，且可能存在胡萝卜、红花或莲须；如果b)产物不存在分子量约为421bp的单一条带，c)产物不存在分子量约为121bp的条带，则确定所检材料无西红花。通过以上描述做出鉴定结论。