检测EGFR基因突变的双脱氧修饰引物、试剂盒及应用.pdf

本发明涉及一种检测EGFR基因突变的试剂盒、方法及其应用。本发明以人类EGFR基因18-21号外显子突变为检测对象，针对突变位点分别设计特异性检测引物对，通过PCR反应，然后对PCR产物进行电泳分离，根据扩增目的产物条带的有无来判断EGFR基因是否存在突变。本发明的方法操作简便，成本低、灵敏度高。

权利要求书
1.  一种检测EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：
(a)引物对SEQ ID NO:1和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:2，或引物对SEQ ID NO:1和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:25；
(b)引物对SEQ ID NO:3和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:4，或引物对SEQ ID NO:3和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:26；
(c)引物对3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，或引物对3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:6；
(d)引物对SEQ ID NO:7和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:8，或引物对SEQ ID NO:7和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:28；
(e)引物对3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，或引物对3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:10。

2.  如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，
(a)引物对用于检测EGFR基因外显子18上G719A或G719S突变；
(b)引物对用于检测EGFR基因外显子19上E746_A750del突变或E746_T751del突变或L747_T751del突变；
(c)引物对用于检测EGFR基因外显子20上T790M突变；
(d)引物对用于检测EGFR基因外显子21上L858R突变；
(e)引物对用于检测EGFR基因外显子21上L861Q突变。

3.  如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有：
适配子，其序列如SEQ ID NO:24；
PCR扩增试剂；
核酸提取试剂；
核酸电泳试剂；和/或
使用说明书。

4.  如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增试剂中，包括Taq DNA聚合酶和具有3’到5’核酸外切酶活性的高保真酶。

5.  如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的3’到5’核酸外切酶活性的高保真酶是PrimeSTAR HS DNA聚合酶。

6.  权利要求1-5任一所述的试剂盒的用途，用于检测EGFR基因突变的方法。

7.  一种检测EGFR基因突变的方法，其特征在于，所述的方法包括：
(1)以核酸样品为模板，利用选自权利要求1的试剂盒的引物对进行PCR扩增，获得扩增产物；
(2)将(1)的扩增产物进行电泳鉴定，通过是否存在目的条带来确定是否存在EGFR基因突变；较佳地，利用一对引物对进行扩增后，产生目的条带鉴定为突变型，没有目的条带鉴定为野生型。

8.  如权利要求7所述的方法，其特征在于，在进行PCR扩增时，对应于20μl体系，PCR反应体系如下：


9.  如权利要求7所述的方法，其特征在于，在进行PCR扩增时，PCR反应条件如下：


10.  如权利要求7所述的方法，其特征在于，分5个平行体系，每一体系对应权利要求1的试剂盒中(a)-(e)的一对引物对进行检测，最终获得EGFR基因外显子的突变情况。

说明书检测EGFR基因突变的双脱氧修饰引物、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及分子技术和医学领域，具体涉及检测EGFR基因突变位点的引物、试剂盒及方法。
背景技术
肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，故亦称支气管肺癌。每年全世界大约有138万人死于肺癌。非小细胞型肺癌是肺癌最常见的形式，患有非小细胞型肺癌的病人在表皮生长因子受体的酪氨酸激酶域隐藏有突变，靶治疗常用EGFR酪氨酸激酶抑制剂的形式，如吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼(Erlotinib)。
自2004年第一次报道EGFR基因的突变对于EGFR酪氨酸抑制剂有敏感性以来，第一批吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼(Erlotinib)在含有EGFR突变的非小细胞型肺癌的病人体内已经用于一系列的三期试验。研究显示，EGFR突变的肿瘤病人用吉非替尼(Gefitinib)治疗可获得比铂类/紫杉醇治疗更长的存活时间。对于体内只含有野生型EGFR的病人，铂类/紫杉醇治疗比吉非替尼(Gefitinib)治疗使得病人存活时间较长。EGFR突变使得酪氨酸激酶域构象发生改变，增加了该域的活性、改变了与ATP结合的亲和力，进而促进了与酪氨酸激酶抑制剂的结合，阻止了信号转导途径，使癌细胞增殖和生存受到抑制。因此，准确鉴定EGFR是否发生突变，对于非小细胞型肺癌有着重要的临床意义。
EGFR是受体Erb-B家族的一员，由细胞外结合域一个跨膜片段和胞内酪氨酸激酶域组成。主要作用是调节细胞增殖、入侵、转移、血管生成和抑制细胞的凋亡。EGFR的活化主要通过两种细胞信号转导通路，一种是MAP激酶路径，它在细胞周期中调节G1期临界点和调控细胞增殖。EGFR被激活后，MAPK路径通过活化RAS、RAF和MEK基因的形式将信号传递到核内。RAS原癌基因包括H-ras，K-ras和N-ras，位于胞浆膜层内，并以活化形式(GTP)或者非活化形式(GDP)呈现。突变的EGFR结合TKI能力高于野生型EGFR。
和EGFR酪氨酸激酶抑制剂敏感性相关的突变主要发生在EGFR酪氨酸激 酶域的18-21外显子处。19外显子处的缺失(E746-A750处)和21外显子点突变L858R占所有EGFR突变的90%左右。
目前对于EGFR突变的检测有一系列的检测平台，广泛应用的是直接测序，其他方法包括实时定量PCR，高分辨率溶解曲线分析、变性高效液相色谱分析技术和免疫组化技术等。直接测序的主要缺点就是灵敏度较低，耗时，而且在提交PCR产物的过程中污染的可能性很大。一些商业化实时定量PCR试剂盒检测基因突变灵敏度高，特异性好，但是需要特异性探针，因此检测成本高，操作相对复杂，此外对所检样品的DNA质量也有较高的要求。免疫组化有较高的特异性，但是灵敏度不高，对样品的处理要求较高，此外，需要大量抗体，不经济。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。本发明基于该方法，检测EGFR外显子中常见的位点突变。
与普通PCR反应不同的是，该反应体系中除了PCR反应液中的Taq酶外，加入了高保真酶，而高保真酶具有3’到5’核酸外切酶的活性，PCR扩增过程中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供检测EGFR基因突变位点的引物、试剂盒及方法。
在本发明的第一方面，提供一种检测EGFR基因突变的试剂盒，所述的试剂盒中包括：
(a)引物对SEQ ID NO:1和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:2，或引物对SEQ ID NO:1和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:25；
(b)引物对SEQ ID NO:3和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:4，或引物对SEQ ID NO:3和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:26；
(c)引物对3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，或引物对3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:6；
(d)引物对SEQ ID NO:7和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:8，或引物对SEQ ID NO:7和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:28；
(e)引物对3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，或引物对3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:10。
在一个优选例中，所述的试剂盒中，(a)引物对用于检测EGFR基因外显子18上G719A或G719S突变；
(b)引物对用于检测EGFR基因外显子19上E746_A750del突变(即第746-750aa缺失)或E746_T751del突变(即第746-751aa缺失)或L747_T751del突变(即第747-751aa缺失)；
(c)引物对用于检测EGFR基因外显子20上T790M突变；
(d)引物对用于检测EGFR基因外显子21上L858R突变；
(e)引物对用于检测EGFR基因外显子21上L861Q突变。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：
适配子，其序列如SEQ ID NO:24；
PCR扩增试剂(包括但不限于：反应缓冲液，dNTP，Taq酶，高保真酶，ddH2O)；
核酸提取试剂；
核酸电泳试剂(如琼脂糖凝胶)；和/或
使用说明书。
在另一优选例中，所述的PCR扩增试剂中，包括Taq DNA聚合酶和具有3’到5’核酸外切酶活性的高保真酶。
在另一优选例中，所述的3’到5’核酸外切酶活性的高保真酶是PrimeSTARHS DNA聚合酶。
在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的用途，用于检测(较佳地，为非诊断性的检测)EGFR基因突变的方法。
在本发明的另一方面，提供一种检测EGFR基因突变的方法(较佳地，所述的方法为非诊断方法)，所述的方法包括：
(1)以核酸样品为模板，利用选自所述的试剂盒的引物对进行PCR扩增，获得扩增产物；
(2)将(1)的扩增产物进行电泳鉴定，通过是否存在目的条带来确定是否存在EGFR基因突变；较佳地，利用一对引物对进行扩增后，产生目的条带鉴定为突变型，没有目的条带鉴定为野生型。
在另一优选例中，在进行PCR扩增时，对应于20μl体系，PCR反应体系 如下：

在另一优选例中，在进行PCR扩增时，PCR反应条件如下：

在另一优选例中，所述的方法中，分5个平行体系，每一体系对应所述的试剂盒中(a)-(e)的一对引物对进行检测，最终获得EGFR基因外显子的突变(9种基因突变)情况。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、实施例3中19外显子E746_A750del15突变检测正交试验的电泳图。
图2、实施例3中19号外显子E746_A750del15突变灵敏度检测的电泳图。
图3、实施例4中20号外显子T790M突变检测正交试验电泳图。
图4、实施例4中20号外显子T790M突变灵敏度检测的电泳图。
图5、实施例5中21号外显子L858R突变检测正交试验电泳图。
图6、实施例5中21号外显子L858R突变灵敏度检测的电泳图。
图7、实施例6中21号外显子L861Q突变检测正交试验电泳图。
图8、实施例6中21号外显子L861Q突变灵敏度检测的电泳图。
图9、实施例7中EGFR基因20外显子缺失的检测的电泳图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，找到了一类特别适合于鉴定EGFR基因突变的引物，所述引物经过合理的设计、优选而获得，用于PCR扩增及突变鉴定时扩增效率高，且特异性和灵敏度俱佳。本发明人还优化了PCR扩增反应体系，进一步提高了扩增效率。
本发明人在研究中发现，检测EGFR基因突变时，利用一般的引物进行PCR扩增时特异性较差，扩增效率不高。因此，需要一些优化设计和改进。
本发明人经过深入的研究，开发了本发明的技术方案。基于的原理是：普通Taq酶掺入核苷酸的错误率为10-5，而高保真酶具有3’到5’核酸外切酶的活性，PCR扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。对野生型(或突变型)引物对中的一条引物3’末端最后一个核苷戊糖上3号羟基进行双脱氧修饰，从而达到封闭3’末端核苷戊糖3号羟基的目的，同时保证其3’末端1-8位内存在有一个或多个与突变型(或野生型)基因错配的碱基；如果引物与模板(野生型或突变型)完全互补配对，则高保真DNA聚合酶将不对引物进行3’-5’的核酸校正，封闭的引物3’羟基不能形成磷酸二酯键，因此聚合反应不能继续进行；当引物与模板(突变型或野生型)不完全匹配，高保真DNA聚合酶启动其3’-5’外切酶的校对作用，切除3’羟基被封闭的核苷，暴露出正常3’羟基，可以在聚合酶作用下形成磷酸二酯键，从而聚合反应得以继续进行下去，可扩增出相应的目的产物。
因此，本发明提供了一种检测EGFR基因突变的试剂盒，所述的试剂盒中包括：
(a)引物对SEQ ID NO:1和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:2，或引物对SEQ ID NO:1和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:25；
(b)引物对SEQ ID NO:3和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:4，或引物对SEQ ID NO:3和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:26；
(c)引物对3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，或引物对3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:6；
(d)引物对SEQ ID NO:7和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:8，或引物对 SEQ ID NO:7和3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:28；
(e)引物对3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，或引物对3’端双脱氧修饰的SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:10。
3’双脱氧修饰(ddC)表示该引物3’末端的C进行双脱氧修饰(目前技术限制，引物双脱氧修饰，只能修饰胞嘧啶)。本发明所提供的引物序列以外、采用与本发明的总体方案类似的方法设计的引物也包含在本发明中，只要在引物对中，非修饰的引物为该外显子突变型(或野生型)基因错配碱基上(下)游约150bp-300bp处的寡核苷酸序列，该非修饰的引物设计时的Tm值应与修饰引物的Tm值保持一致。对于3’双脱氧修饰引物，只要保证该引物3’末端1-8位内存在一个或者多个突变型(或野生型)基因错配碱基即可。所述引物的长度优选17-25bp，引物3’端的末位碱基尽量避免使用碱基A，引物之间尽量避免形成稳定的二级结构或者发卡结构。
作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还含有但不限于以下试剂：适配子、PCR扩增试剂、核酸提取试剂、核酸电泳试剂和/或使用说明书。
本发明人提供了一种优化的从核酸样品中获得EGFR基因扩增产物的方法，所述的方法包括：以核酸样品为模板，利用选自表1的引物对进行PCR扩增，获得扩增产物。通过采用PCR引物对待测样本进行扩增，检测是否产生扩增产物条带来区分EGFR为野生型或者突变型，使得EGFR基因突变的检测更快速、准确、简便、经济。
为了进一步提高灵敏度，可以在体系中加入适配子，与此同时封闭引物变成适配子引物。将3’端双脱氧修饰的引物的5’端加上适配子即为适配子引物。较佳地，适配子序列如SEQ ID NO:24。
作为本发明的优选方式，在PCR扩增时，同时应用Taq DNA聚合酶和3’到5’核酸外切酶活性的高保真酶作为DNA聚合酶。
利用所述的引物和聚合酶，采用常规的PCR扩增方法即可获得较为理想的扩增结果。较佳的方法为：

采用本发明获得EGFR基因突变检测方法，扩增效率和特异性均非常理想，且特别适合于复杂体系的PCR扩增，例如以细胞基因组或血液基因组DNA作为PCR模板的扩增。
利用本发明所述的引物及试剂盒进行检测，与现有检测方法和试剂盒相比，优点在于：可以快速检测出突变，1个小时内即可检测出1-7种突变位点，大大的缩短了检测时间；此外，该发明方法操作简便，成本低、灵敏度高。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、检测EGFR突变的引物
本发明检测的突变(9种基因突变)位点如表1。
表1


本发明人经过反复筛选和优化，获得的用于检测EGFR突变的引物的核苷酸序列如表2。
表2(下划线标示突变位点相应碱基)

其中，双脱氧修饰(ddC)的引物为修饰引物。
适配子引物
为了进一步提高灵敏度，可以在体系中加入适配子，与此同时封闭引物变成适配子引物(如果该反应体系中加入适配子，则对应加入的是适配子引物)。将表1中的修饰引物的5’端加上适配子即为适配子引物，下划线代表适配子序列。
所述的适配子序列为：
SPZ：5’-GACGTCCCTCCGCGATG-3’(SEQ ID NO:24)。
用于检测第18外显子突变的适配子引物，所述的核苷酸序列引物：
SPZ-18R(SEQ ID NO:25)：
5’-GACGTCCCTCCGCGATGTGCCGAACGCACCGGAGCC-3’(ddC)。
用于检测第19外显子突变的适配子引物，所述的核苷酸序列引物：
SPZ-19R(SEQ ID NO:26)：
5’-GACGTCCCTCCGCGATGCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTTGC-3’(ddC)。
用于检测第20外显子突变的适配子引物，所述的核苷酸序列引物(SEQ ID NO:27)：
SPZ-20F：5’-GACGTCCCTCCGCGATGCTCCACCGTGCAGCTCATCAC-3’(ddC)。
用于检测第21外显子突变的适配子引物，所述的核苷酸序列引物：
SPZ-21-1R(SEQ ID NO:28)：
5’-GACGTCCCTCCGCGATGACCCAGCAGTTTGGCCAGC-3’(ddC)；
SPZ-21-2F(SEQ ID NO:29)：
5’-GACGTCCCTCCGCGATGGATTTTGGGCTGGCCAAACTGC-3’(ddC)。
适配子修饰引物，在双脱氧修饰引物的基础上，在该引物的5’端加上适配子序列，在检测过程中起到放大信号的作用。
实施例2、构建野生型质粒和突变型质粒
以野生型细胞系A549(ATCC)的基因组DNA为基准，通过基因工程构建野生型质粒和突变型质粒。具体方法如下：
以W18(F)SEQ ID NO:30和W18(R)SEQ ID NO:31为引物，以野生型细胞系A549(ATCC)的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得775bp的产物。然后用胶回收试剂盒切胶回收，将回收产物TA克隆到PMD-18T载体(购自TaKaRa公司)上，该重组质粒即为18外显子野生型质粒，简称W18。
以W19(F)SEQ ID NO:32和W19(R)SEQ ID NO:33为引物，以野生型细胞系A549(ATCC)的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得的产物为970bp。然后用胶回收试剂盒切胶回收，将回收产物TA克隆到PMD-18T载体(购自TaKaRa公司)上，该重组质粒即为19外显子野生型质粒，简称W19。
以W20(F)SEQ ID NO:34和W20(R)SEQ ID NO:35为引物，以野生型细胞系A549(ATCC)的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得的产物为915bp。然后用胶回收试剂盒切胶回收，将回收产物TA克隆到PMD-18T载体(购自TaKaRa公司)上，该重组质粒即为20外显子野生型质粒，简称W20。
以W21(F)SEQ ID NO:36和W21(R)SEQ ID NO:37为引物，以野生型细胞系A549(ATCC)的基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得的产物为899bp。然后用胶回收试剂盒切胶回收，将回收产物TA克隆到PMD-18T载体(购自TaKaRa公司)上，该重组质粒即为21外显子野生型质粒，简称W21。
分别以野生型质粒W18，W19，W20，W21为模板，通过定点突变的方法将EGFR基因第2155位(外显子18上G719S)G突变为A、第2156位(外显子18上G719A)G突变为C、第2235-2249缺失15个碱基(外显子19上E746_A750del(1))、第2236-2250缺失15个碱基(外显子19上E746_A750del(2))、第2236-2253缺失18个碱基(外显子19上E746_T751del)、第2239-2253缺失15个碱基(外显子19上L747_T751del)、第2369位(外显子20上的T790M)C突变为T、第2573位(外显子21上L858R)T突变为G、第2582位(外显子21上L861Q)T突变为A，分别获得突变型质粒M18-1、M18-2、M19-1、M19-2、M19-3、M19-4、M20、M21-1、M21-2。
实施例3、外显子19上的E746_A750del15突变检测
本实施例中，以EGFR基因热点突变外显子19上的E746_A750del15突变为例来分析本发明的检测方法。以野生型细胞系A549(ATCC)的基因组DNA为基准，以基因工程构建的野生型质粒和E746_A750del15的突变型质粒作为模板，建立单管检测EGFR突变的PCR反应体系。
每20μl的PCR体系包括：2μL10×PCR Buffer(Mg+Plus)，1.6μL dNTP(2.5mM)，1μL PrimeSTAR，1μL模板(105拷贝/μL)，表3量的rTaq酶、SPZ(SEQ ID NO:24)、正常引物(SEQ ID NO:3)、适配子修饰引物(SEQ ID NO:26)，加水补足20μL。
对单管体系进行PCR优化，调整各个因素的浓度，如表3。
表2
试验号正常引物SPZ适配子修饰引物rTaq酶PrimeSTAR10.2μM0.2μM0.2μM0.5U0.025U20.2μM0.2μM0.3μM1.0U0.05U30.2μM0.2μM0.4μM1.5U0.1U40.3μM0.3μM0.2μM1.0U0.1U50.3μM0.3μM0.3μM1.5U0.025U60.3μM0.3μM0.4μM0.5U0.05U70.4μM0.4μM0.2μM1.5U0.05U80.4μM0.4μM0.3μM0.5U0.1U90.4μM0.4μM0.4μM1.0U0.025U
PCR反应条件为：

按上述反应体系、反应条件进行PCR反应，PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，所用凝胶为1.5%琼脂糖凝胶，分子量标记为购自TaKaRa公司的 DL2,000DNA Marker(D501A)。电泳结果如图1所示，原则上野生型无目的亮带条带，突变型有目的亮带(230bp)。从图可看出，第3组为最优体系，没有非特异性条带、没有假阴性或假阳性情况。
将野生型和突变型质粒等比稀释成105、104、103、102、10拷贝数/μL浓度梯度作为PCR扩增模板，按照表3中第3组的反应体系进行PCR扩增，同理，PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定。正常引物SEQ ID NO:3和适配子修饰引物SEQ ID NO:26检测外显子19上的E746_A750del15突变质粒模板梯度稀释的PCR结果如图2。结果显示，该试剂盒在PCR中最低可检测到突变质粒模板的起始模板数为103拷贝。
实施例4、EGFR基因20号外显子T790M突变检测
本实施例中，以EGFR基因20号外显子T790M突变为例来分析本发明的检测方法。以野生型细胞系A549的基因组DNA为基准，以基因工程构建的野生型质粒和针对T790M的突变型质粒作为模板，建立单管检测EGFR突变的PCR反应体系。
20μl的PCR体系包括：2μL10×PCR Buffer(Mg+Plus)，1.6μL dNTP(2.5mM)，1μL PrimeSTAR，1μL模板(浓度105拷贝/μL)，表4量的rTaq酶、SPZ(SEQ ID NO:24)、正常引物(SEQ ID NO:6)、适配子修饰引物(SEQ ID NO:27)，剩下加水补足。
对单管体系进行PCR优化，调整各个因素的浓度，如表4。
表4
试验号正常引物SPZ适配子修饰引物rTaq酶PrimeSTAR10.2μM0.2μM0.2μM0.5U0.025U20.2μM0.2μM0.3μM1.0U0.05U30.2μM0.2μM0.4μM1.5U0.1U40.3μM0.3μM0.2μM1.0U0.1U50.3μM0.3μM0.3μM1.5U0.025U60.3μM0.3μM0.4μM0.5U0.05U70.4μM0.4μM0.2μM1.5U0.05U
80.4μM0.4μM0.3μM0.5U0.1U90.4μM0.4μM0.4μM1.0U0.025U
PCR反应条件为：

按上述PCR反应体系，反应条件进行PCR反应，PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，所用凝胶为1.5%琼脂糖凝胶，分子量标记为购自TaKaRa公司的DL2,000DNA Marker(D501A)。电泳结果如图3所示，原则上野生型无目的亮带，突变型有目的亮带(229bp)。从图可看出，第3组为最优体系，没有非特异性条带、没有假阴性或假阳性情况。
将野生型和突变型质粒等比稀释成105、104、103、102、10拷贝数/μL浓度梯度作为PCR扩增模板，按照表4中第3组的反应体系进行PCR扩增，同理，PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，正常引物SEQ ID NO:6和适配子修饰引物SEQ ID NO:27检测外显子20号外显子T790M突变质粒模板梯度稀释的PCR结果如图4。结果显示，该试剂盒在PCR中最低可检测到突变质粒模板的起始模板数为103拷贝。
实施例5、EGFR基因21外显子L858R突变检测
本实施例中，以EGFR基因21外显子L858R突变为例来分析本发明的检测方法。以野生型细胞系A549的基因组DNA为基准，以基因工程构建的野生型质粒和针对L858R的突变型质粒作为模板，建立单管检测EGFR突变的PCR反应体系。
每20μL的PCR体系包括：2μL10×PCR Buffer(Mg+Plus)，1.6μL dNTP(2.5mM)，1μL PrimeSTAR，1μL模板(105拷贝/μL)，表5量的rTaq酶、SPZ(SEQ ID NO:24)、正常引物(SEQ ID NO:7)、适配子修饰引物(SEQ ID NO:28)，剩下加水补足。
对单管体系进行PCR优化，调整各个因素的浓度，如表5。
表5
因素试验号正常引物SPZ适配子修饰引物rTaq酶PrimeSTAR10.2μM0.2μM0.2μM0.5U0.025U20.2μM0.2μM0.3μM1.0U0.05U30.2μM0.2μM0.4μM1.5U0.1U40.3μM0.3μM0.2μM1.0U0.1U50.3μM0.3μM0.3μM1.5U0.025U60.3μM0.3μM0.4μM0.5U0.05U70.4μM0.4μM0.2μM1.5U0.05U80.4μM0.4μM0.3μM0.5U0.1U90.4μM0.4μM0.4μM1.0U0.025U
PCR反应条件为：

按上述PCR反应体系，反应条件进行PCR反应，PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，所用凝胶为1.5%琼脂糖凝胶，分子量标记为购自TaKaRa公司的DL2,000DNA Marker(D501A)。电泳结果如图5所示，原则上野生型无目的亮带，突变型有目的亮带(207bp)。故从图可看出，第5组为最优体系，没有非特异性条带、没有假阴性或假阳性情况。
将野生型和突变型质粒等比稀释成105、104、103、102、10拷贝数/μL浓度梯度作为PCR扩增模板，按照表4中第5组的反应体系进行PCR扩增，同理，PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，正常引物SEQ ID NO:7和适配子修饰引物SEQ ID NO:28检测21上的外显子L858R突变质粒模板梯度稀释的PCR 结果如图6。结果显示，该试剂盒在PCR中最低可检测到突变质粒模板的起始模板数为10拷贝。
实施例6、EGFR基因21外显子L861Q突变检测
本实施例中，以EGFR基因21外显子L861Q突变为例来分析本发明的检测方法。以野生型细胞系A549的基因组DNA为基准，以基因工程构建的野生型质粒和针对L861Q的突变型质粒作为模板，建立单管检测EGFR突变的PCR反应体系。
每20μl的PCR体系包括：2μL10×PCR Buffer(Mg+Plus)，1.6μL dNTP(2.5mM)，1μL PrimeSTAR，1μL模板(105拷贝/μL)，表6量的rTaq酶、SPZ(SEQ ID NO:24)、正常引物(SEQ ID NO:10)、适配子修饰引物(SEQ ID NO:29)，剩下加水补足。
对单管体系进行PCR优化，调整各个因素的浓度，如表6。
表6
因素试验号正常引物SPZ适配子修饰引物rTaq酶PrimeSTAR10.2μM0.2μM0.2μM0.5U0.025U20.2μM0.2μM0.3μM1.0U0.05U30.2μM0.2μM0.4μM1.5U0.1U40.3μM0.3μM0.2μM1.0U0.1U50.3μM0.3μM0.3μM1.5U0.025U60.3μM0.3μM0.4μM0.5U0.05U70.4μM0.4μM0.2μM1.5U0.05U80.4μM0.4μM0.3μM0.5U0.1U90.4μM0.4μM0.4μM1.0U0.025U
PCR反应条件为：

按上述PCR反应体系，反应条件进行PCR反应，PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，所用凝胶为1.5%琼脂糖凝胶，分子量标记为购自TaKaRa公司的DL2,000DNA Marker(D501A)。电泳结果如图7所示，原则上野生型无目的亮带，突变型有目的亮带(234bp)。故从图可看出，第2组为最优体系，没有非特异性条带、没有假阴性或假阳性情况。
将野生型和突变型质粒等比稀释成105、104、103、102、10拷贝数/μL浓度梯度作为PCR扩增模板，按照正交体系中第2组的反应体系进行PCR扩增，同理，PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，正常引物SEQ ID NO:10和适配子修饰引物SEQ ID NO:29检测21上的外显子L861Q突变质粒模板梯度稀释的PCR结果如图8。结果显示，该试剂盒在PCR中最低可检测到突变质粒模板的起始模板数为103拷贝。
实施例7、EGFR基因20外显子缺失的检测
本发实施例中，以人类EGFR基因20外显子的缺失为检测对象，通过特异引物及适配子最优组合，从而实现快速、准确检测20外显子T790M。以野生型细胞系A549的基因组DNA为野生型模板，以突变细胞系H1975(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)的基因组DNA为突变型模板，利用实施例4表3中第3组反应体系进行检测。
该样品的处理及提取使用Takara公司MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0(Code:D824A)提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。
选择性能力分析：固定每次PCR反应总DNA用量，10ng/反应。先将突变型细胞系(H1975)的DNA和野生型细胞系(A549)的DNA浓度都调至2ng/μL。这样每个反应加5μL模板即为10ng/反应。按照下述方法配制模拟DNA模板。
A：50%即为50μL H1975细胞DNA混入50μL A549细胞DNA。震荡混匀。
B：20%取A液40μL后混入60μL A549细胞DNA，震荡混匀。
C：10%取B液50μL后混入50μL A549细胞DNA，震荡混匀。
D：5%取C液50μL后混入50μL A549细胞DNA，震荡混匀。
E：1%取D液20μL后混入80μL A549细胞DNA，震荡混匀。
F：0.5%取E液50μL后混入50μL A549细胞DNA，震荡混匀。
G：0.1%取F液20μL后混入80μL A549细胞DNA，震荡混匀。
20μL PCR反应体系：2μL10×PCR Buffer(Mg+Plus)，1.6μL dNTP(2.5mM)，PrimeSTAR，1μL模板，SPZ(SEQ ID NO:24)，正常引物(SEQ ID NO:6)，适配子修饰引物(SEQ ID NO:27)，rTaq酶，剩下加水补足。用量同实施例4表3中第3组反应体系。
PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，图9为选择性能力分析的电泳图。结果显示，本发明的PCR方法的选择性检测能力为在10ng总DNA中可检测25拷贝，检测能力为0.5%，可见在复杂体系中，所设计的检测试剂特异性和敏感性俱佳。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。