一种鉴别肉或肉制品中动物源性成分的方法.pdf

本发明提供了一种鉴别肉或肉制品中动物源性成分的方法，属于动物源性成分检测技术领域。本发明方法采用5对特异性引物，基于多重实时荧光PCR(RT-PCR)熔解曲线鉴别肉或肉制品中是否含有猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐或貉9种动物源性成分，所述5对特异性引物的序列分别如SEQ ID NO.1-10所示。本发明方法具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，能满足大批量、快速鉴别肉或肉制品中是否含有猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐或貉源性成分要求，并能有效抵御肉制品掺假，加大对消费者利益的保护力度，具有较好的社会效益。

权利要求书
1.  鉴别肉或肉制品中动物源性成分的引物组合，其特征在于， 含有5对特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-10所示。

2.  含有权利要求1所述引物组合的试剂盒或检测试剂。

3.  权利要求1所述引物组合在鉴别肉或肉制品中动物源性成分 中的用途，所述动物为猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐和貉。

4.  权利要求1所述的引物组合在保障肉类食品安全中的应用。

5.  一种鉴别肉或肉制品中动物源性成分的方法，其特征在于， 应用权利要求1所述的引物组合，以待测肉或肉制品的DNA为模板， 使用RT-PCR方法进行检测，根据熔解峰值图中峰的个数和位置判定 结果。

6.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，RT-PCR方法中20μL  PCR反应体系为：


7.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，RT-PCR反应条件 为：预变性：95℃5min；95℃10～15s，55～60℃45～60s，30 个循环。

8.  如权利要求5所述的方法，其特征在于，熔解曲线制作条件 为：95℃1min，65～70℃1min，以0.02～0.05℃/s速率升温至 95℃，同时连续检测荧光强度；降温：40℃60s，以荧光信号对温 度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解峰值图。

9.  如权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于，每一种特异 性扩增产物Tm值的熔解峰代表一种特定的动物源性成分，
其中，Tm值在71.1～72.4℃范围内出现熔解峰为绵羊源性成分 检出；Tm值在72.9～73.7℃范围内出现熔解峰为山羊源性成分检出； Tm值在74.0～75.4℃范围内出现熔解峰为牛源性成分检出；Tm值在 76.2～78.1℃范围内出现熔解峰为狗或狐狸或貉源性成分检出；Tm值 在80.3～81.2℃范围内出现熔解峰为猪源性成分检出；Tm值在 84.7～85.5℃范围内出现熔解峰为鸡源性成分检出；Tm值在 87.2～87.5℃范围内出现熔解峰为鸭源性成分检出。

10.  权利要求5-9任一所述的方法在肉或肉制品动物源性成分鉴 别中的应用。

说明书一种鉴别肉或肉制品中动物源性成分的方法
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，具体地说涉及鉴别肉或肉制品中 9种动物源性成分的引物组合及方法。
背景技术
近年来国内外肉类掺假事件频发，巨大的价格差异驱动着一些不 法经营者以低价肉替代高价肉而未在标签上注明来降低成本。这不仅 严重侵害了消费者利益，而且更严重的是造成恶劣的社会影响，对整 个肉类产业也会造成巨大伤害。同时，严重的国际肉类食品掺假情况 给我国带来了极大的安全隐患，如果没有可靠的快速真伪鉴别技术， 将会使我国肉类进口企业蒙受巨大的经济损失。
目前，实时荧光PCR技术(real-time fluorescent polymerase chain  reaction，RT-PCR)已经成为动物源性成分检测的主流技术和研究趋 势，尤其是多重PCR技术的开发是提高掺假鉴别检测效率与通量、 简化检测流程的最有效途径之一。
当前基于多重PCR技术的动物源性成分检测主要依靠PCR后利 用琼脂糖凝胶电泳分辨出不同长度的扩增片段来实现，而利用多重 RT-PCR的熔解曲线分析技术来达到肉及肉制品中多种源性成分的快 速鉴别尚未见报道。与电泳检测相比，多重RT-PCR的熔解曲线分析 技术简化了检测流程、缩短检测周期、提高检测效率和通量，同时避 免了实验室环境污染、降低了检测的成本。
因此，建立广泛物种的动物源性成分检测，对提高突发事件应急 处理能力，提升肉类食品安全风险监测水平和监管能力具有重要意 义。
发明内容
本发明的目的是为了弥补现有技术的不足，提供一种基于多重 RT-PCR熔解曲线分析的鉴别肉或肉制品中动物源性成分的方法，特 别是一种用于快速鉴别肉或肉制品中猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、 狗、狐、貉9种源性成分的多重RT-PCR熔解曲线分析方法。
本发明的另一目的在于提供一种鉴别肉或肉制品中动物源性成 分的特异性引物组合。
为了实现本发明的目的，本发明以绵羊、山羊、黄牛、猪、鸡、 鸭、狗、狐狸、貉子线粒体DNA为靶序列分别设计5对特异性引物： 羊F/羊R、牛F/牛R、猪F/猪R、鸡鸭F/鸡鸭R、狗狐貉F/狗狐貉R， 其中，羊F/羊R可同时扩增绵羊和山羊源性成分；鸡鸭F/鸡鸭R可 同时扩增鸡源性和鸭源性成分；狗狐貉F/狗狐貉R可同时扩增狗源 性、狐源性和貉源性成分。各特异性引物扩增产物Tm值具有显著性 差异，可通过熔解峰值图谱分析进行鉴别。各特异性引物序列如下：
对羊(绵羊和山羊)源性成分扩增时所需的正向特异性引物为： 羊F：5'-AACAAAGCGCCTTAAACCAATT-3'(SEQ ID NO.1)
对羊(绵羊和山羊)成分扩增时所需的反向特异性引物为：
羊R：5'-CCTTTTCTAGGGCAGGTTTTGT-3'(SEQ ID NO.2)
对牛(黄牛+瘤牛+爪哇野牛+原始牛)源性成分扩增时所需的正 向特异性引物为：
牛F：5'-GTTCTTCACGACACATACTACGTT-3'(SEQ ID NO.3)
对牛(黄牛+瘤牛+爪哇野牛+原始牛)源性成分扩增时所需的反 向特异性引物为：
牛R：5'-GCAAATACAGCTCCTATTGATAAA-3'(SEQ ID NO.4)
对猪源性成分扩增时所需的正向特异性引物为：
猪F：5'-TACTTCTACTATCCCTGCCAGTTC-3'(SEQ ID NO.5)
对猪源性成分扩增时所需的反向特异性引物为：
猪R：5'-TGATAAAGGATAGGGTCTCCACCA-3'(SEQ ID NO.6)
对鸡和鸭源性成分扩增时所需的正向特异性引物为：
鸡鸭F：5'-GAGAACTACGAGCACAAACGCTT-3'(SEQ ID NO.7)
对鸡和鸭源性成分扩增时所需的反向特异性引物为：
鸡鸭R：5'-CCCATAGGCTATACCTTGACCTGT-3'(SEQ ID NO.8)
对狗、狐和貉源性成分扩增时所需的正向特异性引物为：
狗狐貉F：5'-AAGGGAATGATGAAAGACAT-3'(SEQ ID NO.9)
对狗、狐和貉源性成分扩增时所需的反向特异性引物为：
狗狐貉R：5'-GAGTTGATCCTTTTAGATTGTT-3'(SEQ ID  NO.10)。
本发明首先提供了含有上述5对特异性引物对的引物组合，其核 苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-10所示。
本发明提供了含有上述引物组合的试剂盒或检测试剂。
本发明提供了上述引物组合在鉴别肉或肉制品中动物源性成分 中的用途，所述动物为猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐和貉。
本发明提供了含有上述引物组合的试剂盒或检测试剂在鉴别肉 或肉制品中动物源性成分中的用途，所述动物为猪、牛、绵羊、山羊、 鸡、鸭、狗、狐和貉。
本发明还提供了上述引物组合在保障肉类食品安全中的应用。
本发明提供一种鉴别肉或肉制品中动物源性成分的方法，应用本 发明提供的含有核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-10所示的引物组 合，以待测肉或肉制品的DNA为模板，使用RT-PCR方法进行检测， 根据熔解峰值图中峰的个数和位置判定结果。
模板的制备方法为：将肉或肉制品与灭菌去离子双蒸水以1:3～ 1:5比例混合，用组织匀浆机11000～12500r/min均质6～10min，制 成组织匀浆液。使用组织DNA提取试剂盒提取样品基因组总DNA。
进一步地，RT-PCR方法中，20μL PCR反应体系为：


RT-PCR反应条件为：预变性：95℃5min；95℃10～15s，55～60 ℃45～60s，30个循环。
熔解曲线制作条件为：95℃1min，65～70℃1min，以 0.02～0.05℃/s速率升温至95℃，同时连续检测荧光强度；降温： 40℃60s，以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐 标，得到熔解峰值图。
每一种特异性扩增产物Tm值的熔解峰代表一种特定的动物源性 成分，其中，Tm值在71.1～72.4℃范围内出现熔解峰为绵羊源性成 分检出；Tm值在72.9～73.7℃范围内出现熔解峰为山羊源性成分检 出；Tm值在74.0～75.4℃范围内出现熔解峰为牛源性成分检出；Tm 值在76.2～78.1℃范围内出现熔解峰为狗或狐狸或貉源性成分检出； Tm值在80.3～81.2℃范围内出现熔解峰为猪源性成分检出；Tm值在 84.7～85.5℃范围内出现熔解峰为鸡源性成分检出；Tm值在 87.2～87.5℃范围内出现熔解峰为鸭源性成分检出。
本发明提供了上述方法在肉或肉制品动物源性成分鉴别中的应 用。
本发明中特异性引物设计中，采用大类特异小类保守的线粒体 DNA序列作为扩增把序列，这使得在不增加引物对数的情况下增加 了同步检测物种数量，大幅提高检测效率，例如狗狐貉引物对能扩增 狗狐貉三种犬科动物源性成分，无法扩增其他源性成分。
本发明的多重RT-PCR熔解曲线分析方法采用全密闭反应管检测 与结果分析，无需进行后续PCR产物电泳检测与分析，简化操作流 程、降低实验检测成本，提高检测效率、避免样品和环境的交叉污染。 本发明的多重RT-PCR反应具有良好的特异性，保证该方法能够特异 性的检出动物源性成分，避免了假阳性。本发明的多重RT-PCR熔解 曲线分析方法还具有较高的灵敏度，对猪、牛、绵羊、山羊、狗、狐 狸、貉源性成分检测灵敏度可达皮克级，对鸡、鸭源性成分检测灵敏 度可达纳克级。本发明提供的多重PCR肉类检测方法具有较低的检 出限，待检肉或肉制品中，牛源性成分检出限为1％，绵羊、山羊源 性成分检出限为0.5％，猪源性成分检出限为0.1％、鸡源性、鸭源性、 狗源性、狐源性、貉源性成分检出限为0.5％。该发明使低成本实现 高通量多物种同步检测成为现实，大幅提降低了检测成本，提高了检 测效率和准确率，对加强肉类市场监管、有效抵御肉制品掺假，保护 消费者和相关肉制品企业利益是十分重要的，具有巨大市场需求和广 阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明鉴别肉或肉制品中9种动物源性成分的熔解峰值图 谱，其中，1为绵羊、山羊源性成分熔解峰；2为牛源性成分熔解峰； 3为狗、狐、貉源性成分熔解峰；4为猪源性成分熔解峰；5为鸡源 性成分熔解峰；6为鸭源性成分熔解峰。
图2为本发明鉴别方法对猪肉或猪肉制品的灵敏度检验结果图。
图3为本发明鉴别方法对牛肉或牛肉制品的灵敏度检验结果图。
图4为本发明鉴别方法对绵羊肉或绵羊肉制品的灵敏度检验结果 图。
图5为本发明鉴别方法对山羊肉或山羊肉制品的灵敏度检验结果 图。
图6为本发明鉴别方法对鸡肉或鸡肉制品的灵敏度检验结果图。
图7为本发明鉴别方法对鸭肉或鸭肉制品的灵敏度检验结果图。
图8为本发明鉴别方法对狗肉或狗肉制品的灵敏度检验结果图。
图9为本发明鉴别方法对狐狸肉或狐狸肉制品的灵敏度检验结果 图。
图10为本发明鉴别方法对貉子肉或貉子肉制品的灵敏度检验结 果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不 背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的 修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实 施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
主要仪器设备：荧光PCR仪(Roche480II，瑞士)、高速台式离 心机(Eppendorf5417R，德国)、微量移液器(10μL、100μL、1000μL)、 均质仪(Omni Prep，美国)、荧光酶标仪(Bio tek Synergy H4，美国) 等。主要试剂：血液和动物组织的DNA提取试剂盒购于Qiagen公司； SYBR Green I Master预混液购于Roche公司；引物由英潍捷基(上海) 贸易有限公司合成。
实施例1鉴定本发明5重RT-PCR的5对引物体系的特异性
1、引物序列
对羊(绵羊和山羊)源性成分扩增时所需的正向特异性引物为： 羊F：5'-AACAAAGCGCCTTAAACCAATT-3'
对羊(绵羊和山羊)源性成分扩增时所需的反向特异性引物为： 羊R：5'-CCTTTTCTAGGGCAGGTTTTGT-3'
对牛(黄牛+瘤牛+爪哇野牛+原始牛)源性成分扩增时所需的正 向特异性引物为：
牛F：5'-GTTCTTCACGACACATACTACGTT-3'
对牛(黄牛+瘤牛+爪哇野牛+原始牛)源性成分扩增时所需的反 向特异性引物为：
牛R：5'-GCAAATACAGCTCCTATTGATAAA-3'
对猪源性成分扩增时所需的正向特异性引物为：
猪F：5'-TACTTCTACTATCCCTGCCAGTTC-3'
对猪源性成分扩增时所需的反向特异性引物为：
猪R：5'-TGATAAAGGATAGGGTCTCCACCA-3'
对鸡和鸭源性成分扩增时所需的正向特异性引物为：
鸡鸭F：5'-GAGAACTACGAGCACAAACGCTT-3'
对鸡和鸭源性成分扩增时所需的反向特异性引物为：
鸡鸭R：5'-CCCATAGGCTATACCTTGACCTGT-3'
对狗、狐和貉源性成分扩增时所需的正向特异性引物为：
狗狐貉F：5'-AAGGGAATGATGAAAGACAT-3'
对狗、狐和貉源性成分扩增时所需的反向特异性引物为：
狗狐貉R：5'-GAGTTGATCCTTTTAGATTGTT-3'
2、样品处理方法
分别称取25mg猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐狸、貉子、 鹿、鱼、猫、鼠、马、驴15种常见肉种样品至离心管。
3、DNA提取方法
使用DNeasy动物组织的DNA提取试剂盒提取各物种DNA，按照 试剂盒说明书进行操作。提取出的DNA采用荧光酶标仪测定260nm 和280nm处的吸光值，计算DNA浓度和纯度。
4、多重RT-PCR反应
1)多重RT-PCR反应体系(总体积为20μL)，见表1。
表1多重RT-PCR反应体系组分及配比(总体积20μL)
组分 添加量(μL) SYBR Green I Master预混液 10.0 羊F(5μmol/L) 0.6 羊R(5μmol/L) 0.6 牛F(5μmol/L) 1.4 牛R(5μmol/L) 1.4 猪F(5μmol/L) 0.4 猪R(5μmol/L) 0.4 鸡鸭F(5μmol/L) 0.2 鸡鸭R(5μmol/L) 0.2 狗狐貉F(5μmol/L) 1.4 狗狐貉R(5μmol/L) 1.4 模板DNA 2.0
2)多重RT-PCR扩增反应及熔解曲线制作条件为：预变性：95℃ 5min；变性：95℃10s，退火+延伸：57℃45s，30个循环；
熔解曲线制作：95℃1min，70℃1min，以0.02℃/s速率 升温至95℃，同时连续检测荧光强度；降温：40℃60s。
5对引物混合体系的5重RT-PCR特异性检测结果如表2所示，反应 体系含有模板DNA 10ng。从表2中可以看出，利用本发明提供的5对 特异性引物可特异性扩增出猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐狸、 貉源性成分，而对其他肉种成分在30个循环内无典型扩增曲线出现。 制作熔解曲线峰值图的结果见图1。
表2 5对引物混合体系的特异性检测结果
物种名称 扩增曲线Ct值 猪 19.46
牛 17.37 绵羊 17.60 山羊 17.78 鸡 24.31 鸭 22.03 狗 15.04 狐狸 15.25 貉 15.35 鹿 / 鱼 / 马 / 猫 / 驴 / 鼠 / NC /
注：NC为阴性对照。阳性样品填入Ct值，阴性样品填入“/”。
由图1及表3的结果可知，每一种特异性扩增产物Tm值的熔解 峰代表一种特定的动物源性成分，Tm值在71.1～72.4℃范围内出现 熔解峰为绵羊源性成分检出；Tm值在72.9～73.7℃范围内出现熔解 峰为山羊源性成分检出；Tm值在74.0～75.4℃范围内出现熔解峰为 牛源性成分检出；Tm值在76.2～78.1℃范围内出现熔解峰为狗或狐 狸或貉源性成分检出；Tm值在80.3～81.2℃范围内出现熔解峰为猪 源性成分检出；Tm值在84.7～85.5℃范围内出现熔解峰为鸡源性成 分检出；Tm值在87.2～87.5℃范围内出现熔解峰为鸭源性成分。
按照表3制作不同源性成分组合的混合样品(每种混合样品中各 肉种成分比例相同)，采用上述方法进行检测，结果如表3所示，样品 熔解峰的出峰位置与混合样品中肉种成分均一致，也说明本发明的多 重RT-PCR体系具有良好的特异性。
表3不同源性成分组合的混合样品熔解峰图谱分析结果



注：“+”表示在相应温度范围内出现熔解峰，“/”表示在未出现熔解峰。
实施例2本发明鉴别肉中动物源性成分方法的灵敏度检验
分别提取猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭、狗、狐狸、貉子9种肉 种DNA，计算DNA浓度和纯度。将9个肉种DNA样品浓度均稀释至5 ng/μL，然后再10倍梯度稀释至104，备用。参照实施例1的RT-PCR进 行检测，并制备熔解曲线。结果见图2-图10。
由图2-图10可以看出，采用本发明的多重RT-PCR扩增方法并对 熔解峰值图进行分析，狗、狐狸、貉子DNA稀释104倍后，猪、牛、 绵羊、山羊DNA稀释103倍后，鸡、鸭DNA稀释10倍后，仍可出现熔 解峰，因此，本方法对猪、牛、绵羊、山羊、狗、狐狸、貉源性成分 检测灵敏度可达皮克级，对鸡、鸭源性成分检测灵敏度可达纳克级。
实施例3本发明鉴别肉中动物源性成分方法检出限检验
将猪、牛、绵羊、鸭、狐狸肉用绞肉机分别绞成肉馅，按照表4 所示比例称取各肉种，制成30g混合肉样，加入120g灭菌去离子双蒸 水，用均质仪12000r/min均质8min，制成混合肉样组织匀浆液。用 100μL微量移液器吸取100μL匀浆液至1.5mL离心管中。
表4混合肉样中各肉种成分含量表(％为质量百分比)
样品编号 羊 牛 猪 鸭 狐狸 1 48.50％ 48.50％ 1.00％ 1.00％ 1.00％ 2 49.25％ 49.25％ 0.50％ 0.50％ 0.50％ 3 49.85％ 49.85％ 0.10％ 0.10％ 0.10％ 4 1.00％ 1.00％ 32.67％ 32.67％ 32.67％ 5 0.50％ 0.50％ 33.00％ 33.00％ 33.00％ 6 0.10％ 0.10％ 33.27％ 33.27％ 33.27％
参照实施例1的RT-PCR进行检测，并制备熔解曲线。结果如表4 所示，采用本发明提供的方法检测混合肉制品中动物源性成分时，牛 源性成分检出限为1％，绵羊、山羊源性成分检出限为0.5％，猪源性 成分检出限为0.1％、鸡、鸭、狗、狐、貉源性成分检出限为0.5％。
实施例4本发明方法对市售肉类样品的鉴定
采用本发明的方法，对市售的100份肉类样品进行了动物源性鉴 定，具体操作参见实施例1。检测结果表明，Tm值在71.1～72.4℃范 围内出现熔解峰(绵羊源性成分)的有18份样品；Tm值在72.9～73.7 ℃范围内出现熔解峰(山羊源性成分)的有3份样品；Tm值在74.0～75.4 ℃范围内出现熔解峰(牛源性成分)的有50份样品；Tm值在80.3～81.2 ℃范围内出现熔解峰(猪源性成分)的有28份样品；Tm值在84.7～85.5 ℃范围内出现熔解峰(鸡源性成分)的有10份样品；Tm值在87.2～87.5 ℃范围内出现熔解峰(鸭源性成分)的有10份样品。
表5为样品分类及结果的统计分析。从结果可以看出，生肉片肉 卷、酱卤肉制品、肉串、干制品、香肠和火腿制品等各类肉制品中均 存在掺假情况，掺假率达27.0％，其中肉串类食品掺假最为严重，掺 假率高达40.7％，大多采用鸡、鸭等低价肉种替代或掺假。
表5市售肉类样品分类及检测结果


虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。