用于诊断和治疗炎性肠病的方法.pdf

提供预测对整联蛋白β7拮抗剂的应答性的生物标志物，包括抗β7整联蛋白亚基抗体和使用该生物标志物的方法。此外，提供治疗胃肠炎性病症(如包括溃疡性结肠炎和克罗恩病的炎性肠病)的方法。还提供的是使用此类预测生物标志物治疗包括溃疡性结肠炎和克罗恩病的炎性肠病的方法。

权利要求书
1.  一种预测患有胃肠道炎性病症的患者对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法的应答的方法，所述方法包括：
从患者获得生物样品，
测量样品中至少一个基因的mRNA表达水平，其中所述基因选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε，
将在所述样品中检测的mRNA表达水平与参考水平进行比较，
和
当与参考水平相比已经测量的mRNA表达水平升高时，预测患者将对疗法应答并且当与参考水平相比已经测量的mRNA表达水平低时，预测患者将不对疗法应答。

2.  一种预测胃肠炎性病症患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的应答性的方法，所述方法包括在来自患者的生物样品中确定选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε的至少一个基因的mRNA表达水平，其中与参考水平相比升高的mRNA表达水平鉴定所述患者是可能对整联蛋白β7拮抗剂治疗应答的患者。

3.  一种鉴定患有胃肠道炎性病症的患者可能对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答的方法，所述方法包括：
(a)测量来自患者的生物样品中至少一个基因的mRNA表达水平，其中至少一个基因选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε，
(b)将(a)中测量的mRNA表达水平与参考水平进行比较；和
(c)当(a)中测量的mRNA表达水平高于参考水平时，鉴定所述患者更可能对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答。

4.  一种治疗患有胃肠炎性病症的患者的方法，所述方法包括：
(a)测量来自患者的生物样品中至少一个基因的mRNA表达水平，其中至少一个基因选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε，
(b)将(a)中测量的mRNA表达水平与参考水平进行比较；
(c)当(a)中测量的mRNA表达水平高于参考水平时，鉴定所述患者更可能对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答；和
(d)当在(a)中测量的mRNA表达水平高于参考水平时，施用该疗法，由此治疗所述胃肠炎性病症。

5.  权利要求4的方法，其中每四周一次皮下施用100mg整联蛋白β7拮抗剂。

6.  权利要求1-5中任一项的方法，其中所述患者是人。

7.  权利要求6的方法，其中所述患者是TNF不充分应答者(TNF-IR)。

8.  权利要求6的方法，其中所述胃肠道炎性病症是炎性肠病。

9.  权利要求8的方法，其中所述炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩病。

10.  权利要求9的方法，其中所述炎性肠病是溃疡性结肠炎并且应答选自临床应答、粘膜愈合和缓解。

11.  权利要求6的方法，其中所述生物样品选自肠组织和外周全血。

12.  权利要求6的方法，其中通过PCR方法测量所述mRNA表达水平。

13.  权利要求12的方法，其中所述PCR方法包括qPCR。

14.  权利要求6的方法，其中所述测量包括扩增一个或多个整联蛋白β7mRNA、整联蛋白αEmRNA或CD3εmRNA并检测所扩增的mRNA，由此测量扩增的mRNA的水平。

15.  权利要求6的方法，其中所述参考水平是中值。

16.  一种在患者中治疗胃肠炎性病症的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的抗β7整联蛋白拮抗剂，其中
已经确定从患者获得的生物样品表达升高的mRNA表达水平的选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε的至少一个基因。
或
其中基于从患者获得的生物样品中选自整联蛋白β7、整联蛋白αE 和CD3ε的至少一个基因的升高的mRNA表达水平已经选择患者用于治疗。

17.  权利要求16的方法，其中每四周一次皮下施用100mg整联蛋白β7拮抗剂。

18.  权利要求17的方法，其中所述患者是人。

19.  权利要求18的方法，其中所述患者是TNF不充分应答者(TNF-IR)。

20.  权利要求18的方法，其中所述胃肠道炎性病症是炎性肠病。

21.  权利要求20的方法，其中所述炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩病。

22.  权利要求18的方法，其中所述生物样品选自活检和外周全血。

23.  权利要求22的方法，其中通过PCR方法测量所述mRNA表达水平。

24.  权利要求23的方法，其中所述PCR方法包括qPCR。

25.  一种预测患有胃肠道炎性病症的患者对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法的应答的方法，所述方法包括：
从患者获得生物样品，
测量表达选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε的至少一种蛋白质的细胞的数量，
将在所述样品中测量的表达细胞的数量与参考水平进行比较，
和
当与参考水平相比已经测量的表达蛋白质的细胞数量升高时，预测所述患者对疗法的应答，并且当与参考水平相比已经测量的表达蛋白质的细胞数量低时，预测所述患者对疗法无应答。

26.  一种预测胃肠炎性病症患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的应答性的方法，所述方法包括在来自患者的生物样品中确定表达选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε的至少一种蛋白质的细胞数量，其中与参考水平相比表达细胞的升高数量鉴定所述患者是可能对整联蛋白β7拮抗 剂治疗应答的患者。

27.  一种鉴定患有胃肠道炎性病症的患者可能对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答的方法，所述方法包括：
(a)测量来自患者的生物样品中表达至少一种蛋白质的细胞数量，其中至少一种蛋白质选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε，
(b)将(a)中测量的细胞数量与参考水平进行比较；和
(c)当(a)中测量的细胞数量高于参考水平时，鉴定所述患者更可能对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答。

28.  一种治疗患有胃肠炎性病症的患者的方法，所述方法包括：
(a)测量来自患者的生物样品中表达至少一种蛋白质的细胞数量，其中至少一种蛋白质选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε，
(b)将(a)中测量的表达细胞数量与参考水平进行比较；
(c)当(a)中测量的表达蛋白质的细胞数量高于参考水平时，鉴定所述患者更可能对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答；和
(d)当在(a)中测量的表达蛋白质的细胞数量高于参考水平时，施用该疗法，由此治疗所述胃肠炎性病症。

29.  权利要求28的方法，其中每四周一次皮下施用100mg整联蛋白β7拮抗剂。

30.  权利要求25-29中任一项的方法，其中所述患者是人。

31.  权利要求30的方法，其中所述患者是TNF不充分应答者(TNFIR)。

32.  权利要求30的方法，其中所述胃肠道炎性病症是炎性肠病。

33.  权利要求32的方法，其中所述炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩病。

34.  权利要求33的方法，其中所述炎性肠病是溃疡性结肠炎并且应答选自临床应答、粘膜愈合和缓解。

35.  权利要求30的方法，其中所述生物样品是肠组织。

36.  权利要求30的方法，其中所述方法包括通过免疫组织化学方法 测量表达细胞的数量。

37.  权利要求30的方法，其中所述测量包括使样品与特异性结合整联蛋白β7蛋白、整联蛋白αE蛋白或CD3ε蛋白的试剂接触并检测所形成的复合体的量，并由此测量表达蛋白质的细胞的数量。

38.  权利要求30的方法，其中所述样品中表达细胞的数量除以样品中细胞的总数量。

39.  权利要求30的方法，其中确定光学显微镜下高倍视野中表达细胞的数量。

40.  权利要求30的方法，其中所述参考水平是中值。

41.  权利要求10或权利要求34的方法，其中施用整联蛋白β7拮抗剂导致以下中的一种或多种：(1)在MCS中3点降低和从基线30％减少并且在直肠出血子分数中>1点降低或0或1的绝对直肠出血得分，(2)0或1的内窥镜检查子分数，(3)MCS<2，无各子分数>1。

42.  权利要求1-41中任一项的方法，其中所述整联蛋白β7拮抗剂是单克隆抗β7抗体。

43.  权利要求42的方法，其中所述抗β7抗体选自嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。

44.  权利要求43的方法，其中所述抗β7抗体是抗体片段。

45.  权利要求43的方法，其中所述抗β7抗体包含六个高变区(HVRs)，其中：
(i)HVR-L1包含氨基酸序列A1-A11,其中A1-A11是RASESVDTYLH(SEQ ID NO：1)；RASESVDSLLH(SEQ ID NO：7)，RASESVDTLLH(SEQ ID NO:8)或RASESVDDLLH(SEQ ID NO：9)或SEQ ID NOs:1、7、8或9的变体(SEQ ID NO:26)，其中氨基酸A2选自A、G、S、T和V，和/或氨基酸A3选自S、G、I、K、N、P、Q、R和T，和/或A4选自E、V、Q、A、D、G、H、I、K、L、N和R，和/或氨基酸A5选自S、Y、A、D、G、H、I、K、N、P、R、T和V，和/或氨基酸A6选自V、R、I、A、G、K、L、M和Q，和/或氨基酸A7选自D、V、S、A、E、 G、H、I、K、L、N、P、S和T，和/或氨基酸A8选自D、G、N、E、T、P和S，和/或氨基酸A9选自L、Y、I和M，和/或氨基酸A10选自L、A、I、M和V和/或氨基酸A11选自H、Y、F和S；
(ii)HVR-L2包含氨基酸序列B1-B8，其中B1-B8是KYASQSIS(SEQ ID NO：2)，RYASQSIS(SEQ ID NO：20)或XaaYASQSIS(SEQ ID NO:21、其中Xaa代表任何氨基酸)或SEQ ID NOs:2、20或21的变体(SEQ ID NO:27)，其中氨基酸B1选自K、R、N、V、A、F、Q、H、P、I、L、Y和Xaa(其中Xaa代表任何氨基酸)，和/或氨基酸B4选自S和D，和/或氨基酸B5选自Q和S，和/或氨基酸B6选自S、D、L、和R，和/或氨基酸B7选自I、V、E、和K；
(iii)HVR-L3包含氨基酸序列C1-C9，其中C1-C9是QQGNSLPNT(SEQ ID NO：3)或SEQ ID NO:3的变体(SEQ ID NO:28)，其中氨基酸C8选自N、V、W、Y、R、S、T、A、F、H、I L和M；
(iv)HVR-H1包含氨基酸序列D1-D10，其中D1-D10是GFFITNNYWG(SEQ ID NO：4)；
(v)HVR-H2包含氨基酸序列E1-E17，其中E1-E17是GYISYSGSTSYNPSLKS(SEQ ID NO：5)，或SEQ ID NO:5的变体(SEQ ID NO:29)，其中氨基酸E2选自Y、F、V和D，和/或氨基酸E6选自S和G，和/或氨基酸E10选自S和Y，和/或氨基酸E12选自N、T、A和D，和/或氨基酸13选自P、H、D和A，和/或氨基酸E15选自L和V，和/或氨基酸E17选自S和G；和
(vi)HVR-H3包含氨基酸序列F2-F11，其中F2-F11是MTGSSGYFDF(SEQ ID NO：6)或RTGSSGYFDF(SEQ ID NO：19)；或包含氨基酸序列F1-F11，其中F1-F11是AMTGSSGYFDF(SEQ ID NO：16)、ARTGSSGYFDF(SEQ ID NO：17)
或AQTGSSGYFDF(SEQ ID NO：18)或SEQ ID NOs:6、16、17、18或19的变体(SEQ ID NO:30)，其中氨基酸F2是R、M、A、E、G、Q、S，和/或氨基酸F11选自F和Y。

46.  权利要求45的方法，其中所述抗β7抗体包含三个重链高变区(HVR-H1-H3)序列和三个轻链高变区(HVR-L1-L3)序列，其中:
(i)HVR-L1包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9；
(ii)HVR-L2包含SEQ ID NO:2；
iii)HVR-L3包含SEQ ID NO:3；
(iv)HVR-H1包含SEQ ID NO:4；
(v)HVR-H2包含SEQ ID NO:5；并且
(vi)HVR-H3包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19。

47.  权利要求46的方法，其中所述抗β7抗体包含可变轻链，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和可变重链，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。

48.  权利要求47的方法，其中所述抗β7抗体是etrolizumab。

49.  权利要求1-41中任一项的方法，其中所述整联蛋白β7拮抗剂是单克隆抗α4/β7抗体。

50.  权利要求49的方法，其中所述抗α4/β7抗体选自vedolizumab和AMG 181。

说明书用于诊断和治疗炎性肠病的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求保护2013年7月31日提交的美国临时申请号61/860,422和2012年10月5日提交的美国临时申请号61/710,656的优先权的权益，两者均因此以其整体通过参考并入。
序列表
本申请含有已经通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表并因此以其整体通过参考并入。在2013年9月23日产生的所述ASCII拷贝命名为P4989R1WO_SL.txt并且大小是19,125字节。
发明领域
提供预测对整联蛋白β7拮抗剂(包括抗β7整联蛋白亚基抗体)的应答性的生物标志物，和使用该生物标志物的方法。此外，提供治疗胃肠炎性病症的方法，如炎性肠病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。还提供的是使用此类预测性生物标志物治疗炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)的方法。
发明背景
炎性肠病(IBD)是胃肠(GI)道的慢性炎性自身免疫状况，其在临床上表现为溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩病(CD)。CD是可能影响整个GI道的任何部分的慢性透壁炎性疾病，UC是结肠的粘膜炎症。两种状况在临床上的特征在于频繁的肠运动、营养不良和脱水，破坏日常生活活动。CD经常与吸收不良、狭窄和瘘管的发生并发，并且可能需要反复手术。较不常见地，UC与严重的血性腹泻和中毒性巨结肠并发，也需要手术。两种IBD状况均与GI道的恶性肿瘤风险增加相关。IBD的病因学是复杂的，并且发病机理的许多方面仍然不清楚。
对中等到严重IBD的治疗给治疗医师提出了巨大的挑战，因为利用皮质类固醇的常规疗法和免疫调节剂疗法(例如，硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤和氨甲喋呤)伴随着副作用和不耐受，并且在维持疗法(类固醇)中还没有显示出已经证明的益处。靶向肿瘤坏死因子α(TNF-α)的单克隆抗体，如英夫利昔单抗(嵌合抗体)和阿达木单抗(完全人抗体)目前用于CD的处理。英夫利昔单抗也已经显示效力并且已经被批准用于UC。然而，患有CD的约10％-20％患者是对抗TNF疗法的初期无应答者，而另外20％-30％的CD患者随时间流逝而丢失应答(Schnitzler等,Gut58:492-500(2009))。与抗TNF相关的其他不利事件(AEs)包括升高的细菌感染率，包括结核病，并且更稀有的是淋巴瘤和脱髓鞘(Chang等,Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatology 3:220(2006)；Hoentjen等,World J.Gastroenterol.15(17):2067(2009))。目前没有可用的疗法在多于20％-30％的慢性病IBD患者中实现持续缓解(Hanauer等,Lancet359:1541-49(2002)；Sandborn等,N Engl J Med 353:1912-25(2005))。此外，大多数患者不能实现持续的无类固醇缓解和粘膜愈合、与真正的疾病改善相关的临床结果。因而，需要在IBD中开发更多的靶向疗法，优化其用于长期使用：具有持续缓解的改善安全谱，特别是在更大患者群体，包括从来不响应抗TNF治疗剂或随时间流逝丢失应答的那些患者(TNF不充分应答者患者或TNF-IR患者)中无类固醇的缓解和长期并发症的预防。
整联蛋白是α/β异源二聚体细胞表面糖蛋白受体，其在许多细胞过程，包括白细胞粘着、信号传递、增殖和迁移以及基因调节中起作用(Hynes,R.O.,Cell,1992,69:11-25；和Hemler,M.E.,Annu.Rev.Immunol.,1990,8:365-368)。它们由两个异源二聚体的非共价相互作用α和β跨膜亚基组成，所述亚基特异地结合内皮、上皮上的不同细胞粘着分子(CAMs)和细胞外基质蛋白质。整联蛋白可以以这种方式充当组织特异性细胞粘着受体，帮助白细胞以高度调节的方式从血液募集到几乎所有的组织位点中，在白细胞归巢到正常组织和炎症位点中起作用(von  Andrian等,N Engl J Med 343:1020–34(2000))。在免疫系统中，整联蛋白在炎性过程中参与白细胞运输、粘着和浸润(Nakajima,H.等,J.Exp.Med.,1994,179:1145-1154)。整联蛋白的差异表达调节细胞的粘着性质并且不同的整联蛋白参与不同的炎性应答。(Butcher,E.C.等,Science,1996,272:60-66)。含有β7的整联蛋白(即α4β7和αEβ7)主要在单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和巨噬细胞上表达，但不在中性粒细胞上表达(Elices,M.J.等,Cell,1990,60:577-584)。
α4β7整联蛋白是白细胞归巢受体，其在细胞迁移到肠粘膜和相关的淋巴样组织中重要，如小肠中的Peyer’s斑、大肠中的淋巴样滤泡和肠系膜淋巴结。在消化道中，白细胞滚动并牢固附着到粘膜内皮上由来自趋化因子的信号起始并通过粘膜地址素细胞附着分子(MAdCAM)-1-结合的sialyl Lewis X介导。趋化因子信号传递诱导α4β7整联蛋白经历MAdCAM-1结合亲和力从低到高的改变。白细胞然后停止并开始通过血管内皮外渗到下面组织的过程。相信该外渗过程在正常的免疫细胞再循环状态和炎性状况中发生(von Andrian等,上文)。浸润物中α4β7+细胞的数量和配体MAdCAM-1的表达在慢性炎症的位点，如在患有UC或DC的患者的肠道中较高(Briskin等,Am J Pathol 151:97–110(1997)；Souza等,Gut 45:856-63(1999))。α4β7优先结合表达MAdCAM-1的高内皮小静脉和血管细胞粘着分子(VCAM)-1，以及细胞外基质分子纤连蛋白片段CS-1(Chan等,J Biol Chem 267:8366–70(1992)；Ruegg等,J Cell Biol 17:179–89(1992)；Berlin等,Cell 74:185–95(1993))。与消化道粘膜管中组成型表达的MAdCAM-1一起，α4β7整联蛋白在白细胞消化道趋向性中起选择性作用，但看起来并不促进白细胞归巢到外周组织或CNS。相反，外周淋巴样运输已经与α4β1和VCAM-1的相互作用相关(Yednock等,Nature 356:63–6(1992)；Rice等,Neurology64:1336–42(2005))。
仅在T淋巴细胞上表达并与粘膜组织相关的β7整联蛋白家族的另一成员是αEβ7整联蛋白，另外称为CD103。αEβ7整联蛋白选择性地 结合上皮细胞上的钙黏蛋白并且已经提出在上皮内淋巴细胞区室中的粘膜组织的T细胞保留中起作用(Cepek等,J Immunol 150:3459-70(1993)；Karecla等Eur J Immunol 25:852–6(1995))。已经报道粘膜固有层中的αEβ7+细胞对应激的或感染的上皮细胞展示细胞毒性(Hadley等,J Immunol 159:3748–56(1997)；Buri等,J Pathol 206:178–85(2005))。αEβ7的表达在CD中增加(Elewaut等,Acta Gastroenterol Belg61:288–94(1998)；Oshitani等,Int J Mol Med 12:715–9(2003))，并且已经报道抗-αEβ7抗体治疗在小鼠中减弱实验性结肠炎，暗示αEβ7+淋巴细胞在IBD的实验模型中的作用(Ludviksson等,J Immunol162:4975–82(1999))。
据报道施用针对αEβ7的单克隆抗体防止并改善IL-2-/-小鼠中的免疫诱导的结肠炎，提示炎性肠病的开始和维持依赖于表达αEβ7的固有层CD4+淋巴细胞的结肠定位(Ludviksson等,J Immunol.1999,162(8):4975-82)。据报道抗α4抗体(那他珠单抗)在治疗患有CD的患者中有效力(Sandborn等,N Engl J Med 2005；353:1912-25)并且据报道抗α4β7抗体(MLN-02、MLN0002、vedolizumab)在患有UC的患者中有效(Feagan等,N Engl J Med 2005；352:2499-507)。第二种抗α4/β7抗体(AMG 181)也在开发中并且近期已经开始临床试验(临床试验(dot)gov identifier,NCT01164904,2012年9月)。这些研究和发现确认α4β7是治疗靶标并且支持这样的想法，即α4β7与MAdCAM-1之间的相互作用介导IBD的发病。因此，β7整联蛋白的拮抗剂在治疗IBD中作为治疗剂具有巨大潜能。
先前已经描述了靶向β7整联蛋白亚基的人源化单克隆抗体。参见例如，国际专利公开号WO2006/026759。一种该抗体rhuMAbβ7(etrolizumab)来源于大鼠抗小鼠/人单克隆抗体FIB504(Andrew等1994)。其被改造以包括人IgG1-重链和κ1-轻链构架。国际专利公开号WO2006/026759。先前已经描述了根据某些剂量方案向人患者施用etrolizumab。参见例如，国际专利公开号WO/2012/135589。
RhuMAbβ7(etrolizumab)结合α4β7(Holzmann等,Cell 56:37-46(1989)；Hu等,Proc Natl Acad Sci USA 89:8254-8(1992))和αEβ7(Cepek等,J Immunol 150:3459-70(1993))，其在肠粘膜中分别调节淋巴细胞亚型的运输和保留。临床研究已经证明了抗α4抗体(那他珠单抗)用于治疗CD的效力(Sandborn等,N Engl J Med 353:1912-25(2005))，并且已经报道了抗α4β7抗体(LDP02/MLN02/MLN0002/vedolizumab)在治疗UC(Feagan等,N Engl J Med 352:2499-507(2005),Feagan等,N Engl J Med 369(8):699-710(2013))，还有CD(Sandborn等,N Engl J Med369(8):711-721(2013))中的鼓舞人心的结果。这些发现帮助确认α4β7作为可能的治疗靶标并且支持这样的假设，即α4β7与粘膜地址素细胞附着分子1(MAdCAM 1)之间的相互作用促进炎性肠病(IBD)的发病。
不像结合α4并因此结合α4β1和α4β7的那他珠单抗，rhuMAbβ7特异性结合α4β7和αEβ7的β7亚基并且不结合α4或β1整联蛋白各亚基。这由抗体在高达100nM的浓度下不能抑制α4β7+α4β7-Ramos细胞粘着血管细胞粘着分子1(VCAM 1)来证明。重要的是，rhuMAbβ7的该特征表明了选择性：表达α4β1而非β7的T细胞亚组不应该直接被rhuMAbβ7直接影响。
对rhuMAbβ7在白细胞归巢的消化道特异性影响的支持来自若干体内非临床研究。在利用CD45RB高CD4+T细胞再生的严重组合免疫缺陷(SCID)小鼠(结肠炎的动物模型)中，rhuMAbβ7阻断放射标记的淋巴细胞归巢到炎症结肠中，但不阻断归巢到外周淋巴样器官脾中。参见例如，国际专利公开号WO2006/026759。此外，大鼠-小鼠嵌合抗鼠类β7(抗β7，muFIB504)不能够减少中枢神经系统(CNS)炎症的组织学程度并在患有实验性自身免疫性脑炎(EAE)的髓磷脂碱性蛋白T细胞受体(MBP-TCR)转基因小鼠(多发性硬化的动物模型)中提高疾病存活。Id.此外，在猕猴中的两项安全性研究中，rhuMAbβ7诱导外周血淋巴细胞数量的适度增加，这主要是由于CD45RA-β7高外周血T细胞(在表型上与人的消化道归巢记忆/效应T细胞相似的亚组)的显著(大约 3-6倍)增加。参见例如，国际专利公开号WO2009/140684；Stefanich等,Br.J.Pharmacol.162:1855-1870(2011)。相反的，rhuMAbβ7对CD45RA+β7中间外周血T细胞(在表型上与人的天然T细胞相似的亚组)的数量具有最小至没有影响，并且对CD45RA-β7low外周血T细胞(在表型上与人的外周归巢记忆/效应T细胞相似的亚组)的数量没有影响，证实了rhuMAbβ7对消化道归巢淋巴细胞亚群的特异性。国际专利公开号WO2009/140684；Stefanich等,Br.J.Pharmacol.162:1855-1870(2011)。
尽管临床研究已经证明了抗α4抗体(那他珠单抗)用于治疗CD的效力(Sandborn等,N Engl J Med 353:1912-25(2005))，并且已经报道了抗α4β7抗体(LDP02/MLN02/MLN0002/vedolizumab)在治疗UC中的鼓舞人心的结果，但是仍然需要在治疗这些病症中进一步的改善。例如，在患有克罗恩病(个别地多发性硬化)的患者(其接受那他珠单抗和免疫抑制剂的共同治疗)中，那他珠单抗治疗已经与进行性多灶性白质脑病(PML)的证实情况相关。PML是与脑中的多瘤病毒(JC病毒)再激活和活跃病毒复制关联的潜在的致死神经学状况。如果其发生，没有任何已知的介入可以可靠地防止PML或适当地治疗PML。vedolizumab治疗的一个限制是其经静脉施用，这对患者不方便，并且还与不想要的或不利事件，例如输注位点反应相关。因此，需要改善的治疗方法，以治疗胃肠道炎性病症，如IBD，例如溃疡性结肠炎和克罗恩病，以及更想要的剂量方案。
在治疗之前经常不知道患者是否将应答特定的治疗剂还是一类治疗剂。因此，随着大体上IBD患者，和特定的UC和CD患者寻求治疗，在寻找对特定患者有效的治疗剂中涉及大量的反复试验。该反复试验经常涉及大量的风险和患者不舒适，以找到最有效的疗法。因此，需要更有效的手段用于确定哪个患者将对哪种治疗作出应答并且用于将该决定整合到用于IBD患者的更有效治疗方案中。
因而具有额外的诊断方法是高度有利的，包括预测诊断方法，其可以用于客观地鉴定最可能对利用多种IBD治疗剂，包括抗β7整联蛋白亚基抗体的治疗作出应答的患者。因此，持续需要鉴定与溃疡性结肠炎、克罗恩病以及其他炎性肠病症相关的并且预测抗对β7整联蛋白亚基抗体作出应答的新生物标志物。此外，关于该关联的统计学和生物学显著的和重复的信息可以用作完整组分，努力鉴定UC或CD患者，如TNF-IR患者的特定亚组，期望所述患者将明显地受益于利用抗β7整联蛋白亚基抗体的治疗，例如其中所述治疗剂在临床研究中是或已经显示在该特定UC或CD患者亚群中具有治疗益处。
本文描述的发明满足某些上述需求并且提供其他益处。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物以其整体为任何目的通过参考并入。
发明概述
本发明的方法至少部分依赖于下述发现：小肠活检和外周全血中的某些基因的mRNA表达水平，以及小肠活检中某些基因的细胞蛋白表达水平预测患有胃肠道炎性病症的患者对利用整联蛋白β7拮抗剂的治疗的应答性。
因此，一方面，提供预测患有胃肠道炎性病症的患者对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法的应答的方法。在某些实施方案中，从患者获得生物样品并测量mRNA表达水平。在一个实施方案中，测量整联蛋白β7mRNA的表达。在一个实施方案中，测量整联蛋白αE mRNA的表达。在一个实施方案中，测量CD3ε的表达。在一个实施方案中，测量选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε的两个或三个mRNA的组合的表达。在一个实施方案中，生物样品是组织活检样品。在一个实施方案中，从肠组织获得活检。在一个实施方案中，生物样品是外周全血。在一个实施方案中，在PAX基因管中收集外周全血。在某些实施方案中，通过PCR方法测量mRNA表达水平。在一个实施方案中，PCR方法是qPCR。在某些实施方案中，将mRNA表达水平与中值比较。在一个实施方案中， 如果整联蛋白β7、整联蛋白αE或CD3ε的一个或多个的mRNA表达水平与参考值(其在某些实施方案中是中值)相比升高，预测患者对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答。在一个实施方案中，如果整联蛋白β7、整联蛋白αE或CD3ε的一个或多个的mRNA表达水平与参考值(其在某些实施方案中是中值)相比低，预测患者不对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答。在一个实施方案中，应答是临床缓解。在一个实施方案中，应答是粘膜愈合。在一个实施方案中，应答是临床应答。在某些实施方案中，当绝对Mayo临床得分≤2并且没有个体子分数>1时，确定患者中的缓解被诱导，其也称为临床缓解。在某些实施方案中，当通过可弯曲乙状结肠镜检查评估确定患者具有0或1的内窥镜检查子分数时，确定已经发生了粘膜愈合。在某些此类实施方案中，确定经历粘膜愈合的患者具有0的内窥镜检查子分数。
另一方面，提供预测胃肠道炎性病症患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的应答性的方法。在一个实施方案中，确定来自患者的生物样品中整联蛋白β7的mRNA表达水平。在一个实施方案中，确定来自患者的生物样品中整联蛋白αE的mRNA表达水平。在一个实施方案中，确定来自患者的生物样品中CD3ε的mRNA表达水平。在一个实施方案中，确定来自患者的生物样品中选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε的两个或三个mRNA的mRNA表达水平。在某些实施方案中，在生物样品中检测到的与参考值，例如中值相比升高的整联蛋白β7mRNA表达，或与参考值，例如中值相比升高的整联蛋白αE mRNA表达，或与参考值，例如中值相比升高的CD3εmRNA表达鉴定患者是可能对整联蛋白β7拮抗剂治疗应答的患者。
在仍另一方面，从患者获得生物样品并且测量表达一种蛋白质或某些蛋白的组合的细胞数量并与总细胞数量进行比较，或在光学显微镜下高倍视野内确定表达蛋白的细胞数量。在一个实施方案中，测量表达整联蛋白β7的细胞数量。在一个实施方案中，测量表达整联蛋白αE的细胞数量。在一个实施方案中，测量表达CD3ε的细胞数量。在一个实施 方案中，测量表达选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε的两种或三种蛋白的组合的细胞数量。在一个实施方案中，生物样品是组织活检样品。在一个实施方案中，从肠组织获得活检。在一个实施方案中，将生物样品放置到福尔马林中并任选地包埋在石蜡块中。在某些实施方案中，通过免疫组织化学方法测量表达整联蛋白β7、整联蛋白αE或CD3ε的一种或组合的细胞数量。在某些实施方案中，表达整联蛋白β7、整联蛋白αE或CD3ε的一种或组合的细胞数量与给定区域中总的细胞数量进行比较。在一个实施方案中，如果表达整联蛋白β7、整联蛋白αE或CD3ε的一种或多种的细胞数量与参考值(例如中值)相比升高，预测患者对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答。在一个实施方案中，如果表达整联蛋白β7、整联蛋白αE或CD3ε的一种或多种的细胞数量与参考值(例如中值)相比低，预测患者不对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答。在一个实施方案中，应答是临床缓解。在一个实施方案中，应答是粘膜愈合。在一个实施方案中，应答是临床应答。在某些实施方案中，当绝对Mayo临床得分≤2并且没有个体子分数>1时，确定患者中的缓解被诱导，其也称为临床缓解。在某些实施方案中，当通过可弯曲乙状结肠镜检查评估确定患者具有0或1的内窥镜检查子分数时，确定已经发生了粘膜愈合。在某些此类实施方案中，确定经历粘膜愈合的患者具有0的内窥镜检查子分数。
在仍然另一方面，提供鉴定患有胃肠道炎性病症的患者可能对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：(a)测量来自患者的生物样品中至少一个基因的mRNA表达水平，其中至少一个基因选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε；(b)将(a)中测量的mRNA表达水平与参考水平进行比较；和(c)当(a)中测量的mRNA表达水平高于参考水平时，鉴定患者更可能对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答。在一个实施方案中，患者是人。在一个实施方案中，患者是TNF不充分应答者(TNF-IR)。在一个实施方案中，胃肠道炎性病症是炎性肠病。在一个实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗 恩病。在一个实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎并且应答选自临床应答、粘膜愈合和缓解。
在其他方面，提供治疗患有胃肠道炎性病症的患者的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：(a)测量来自患者的生物样品中至少一个基因的mRNA表达水平，其中至少一个基因选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε；(b)将(a)中测量的mRNA表达水平与参考水平进行比较；(c)当(a)中测量的mRNA表达水平高于参考水平时，鉴定患者更可能对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答；和(d)当(a)中测量的mRNA表达水平高于参考水平时，施用疗法，由此治疗所述胃肠道炎性病症。在一个实施方案中，每四周一次皮下施用100mg整联蛋白β7拮抗剂。在一个实施方案中，皮下施用420mg整联蛋白β7拮抗剂的平负荷剂量(flat loading dose)，施用负荷剂量后两周接着第二次皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂，第二次施用后两周接着第三次皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂，第三次施用后四周接着皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂，然后每四周一次皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂。在一个实施方案中，患者是人。在一个实施方案中，患者是TNF不充分应答者(TNF-IR)。在一个实施方案中，胃肠道炎性病症是炎性肠病。在一个实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩病。在一个实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎并且应答选自临床应答、粘膜愈合和缓解。在一个实施方案中，施用整联蛋白β7拮抗剂导致以下的一种或多种：(1)在MCS中3点降低和从基线30％减少并且在直肠出血子分数中≥1点降低或0或1的绝对直肠出血得分，(2)0或1的内窥镜检查子分数，(3)MCS≤2，无各子分数>1。
在仍另一方面，提供预测患有胃肠道炎性病症的患者对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法的应答的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：从患者获得生物样品，测量表达选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε的至少一种蛋白质的细胞的数量，将在样品中测量的表达细胞的数量与参考水平进行比较，并预测所述患者对疗法的应答，其中与参考水平相 比升高的表达细胞数量表示对疗法的应答，而与参考水平相比低的表达细胞数量表示对疗法无应答。在一个实施方案中，患者是人。在一个实施方案中，患者是TNF不充分应答者(TNF-IR)。在一个实施方案中，胃肠道炎性病症是炎性肠病。在一个实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩病。在一个实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎并且应答选自临床应答、粘膜愈合和缓解。在一个实施方案中，生物样品是肠组织。在一个实施方案中，所述方法包括通过免疫组织化学方法测量表达细胞的数量。在一个实施方案中，测量包括使样品与特异性结合整联蛋白β7蛋白、整联蛋白αE蛋白或CD3ε蛋白的试剂接触并检测所形成的复合体的量，并由此测量表达细胞的数量。在一个实施方案中，样品中表达细胞的数量除以样品中细胞的总数量。在一个实施方案中，确定光学显微镜下高倍视野中表达细胞的数量。在一个实施方案中，参考水平是中值。
另一方面，提供预测胃肠道炎性病症患者对整联蛋白β7拮抗剂治疗的应答性的方法。在某些实施方案中，方法包括在来自患者的生物样品中确定表达选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε的至少一种蛋白质的细胞的数量，其中与参考水平相比升高的表达细胞数量鉴定所述患者是可能对整联蛋白β7拮抗剂治疗应答的患者。在一个实施方案中，患者是人。在一个实施方案中，患者是TNF不充分应答者(TNF-IR)。在一个实施方案中，胃肠道炎性病症是炎性肠病。在一个实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩病。在一个实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎并且应答选自临床应答、粘膜愈合和缓解。在一个实施方案中，生物样品是肠组织。在一个实施方案中，所述方法包括通过免疫组织化学方法测量表达细胞的数量。在一个实施方案中，测量包括使样品与特异性结合整联蛋白β7蛋白、整联蛋白αE蛋白或CD3ε蛋白的试剂接触并检测所形成的复合体的量，并由此测量表达细胞的数量。在一个实施方案中，样品中表达细胞的数量除以样品中细胞的总数量。在一个实施 方案中，确定光学显微镜下高倍视野中表达细胞的数量。在一个实施方案中，参考水平是中值。
在仍然另一方面，提供鉴定患有胃肠道炎性病症的患者可能对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：(a)测量来自患者的生物样品中表达至少一种蛋白质的细胞的数量，其中至少一种蛋白质选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε；(b)将(a)中测量的细胞数量与参考水平进行比较；和(c)当(a)中测量的细胞数量高于参考水平时，鉴定患者更可能对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答。在一个实施方案中，患者是人。在一个实施方案中，患者是TNF不充分应答者(TNF-IR)。在一个实施方案中，胃肠道炎性病症是炎性肠病。在一个实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩病。在一个实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎并且应答选自临床应答、粘膜愈合和缓解。在一个实施方案中，生物样品是肠组织。在一个实施方案中，所述方法包括通过免疫组织化学方法测量表达细胞的数量。在一个实施方案中，测量包括使样品与特异性结合整联蛋白β7蛋白、整联蛋白αE蛋白或CD3ε蛋白的试剂接触并检测所形成的复合体的量，并由此测量表达细胞的数量。在一个实施方案中，样品中表达细胞的数量除以样品中细胞的总数量。在一个实施方案中，确定光学显微镜下高倍视野中表达细胞的数量。在一个实施方案中，参考水平是中值。
在仍然另一方面，提供治疗患有胃肠道炎性病症的患者的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：(a)测量来自患者的生物样品中表达至少一种蛋白质的细胞的数量，其中至少一种蛋白质选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε；(b)将(a)中测量的表达细胞的数量与参考水平进行比较；(c)当(a)中测量的表达细胞的数量高于参考水平时，鉴定患者更可能对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答；和(d)当(a)中测量的表达细胞的数量高于参考水平时，施用疗法，由此治疗所述胃肠道炎性病症。在一个实施方案中，每四周一次皮下施用100mg整联蛋白β7拮抗剂。在一个实施方案中，皮下施用420mg整联蛋白β7拮抗剂的平负荷剂量， 施用负荷剂量后两周接着第二次皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂，第二次施用后两周接着第三次皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂，第三次施用后四周接着皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂，然后每四周一次皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂。在一个实施方案中，患者是人。在一个实施方案中，患者是TNF不充分应答者(TNF-IR)。在一个实施方案中，胃肠道炎性病症是炎性肠病。在一个实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩病。在一个实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎并且应答选自临床应答、粘膜愈合和缓解。在一个实施方案中，施用整联蛋白β7拮抗剂导致以下的一种或多种：(1)在MCS中3点降低和从基线30％减少并且在直肠出血子分数中≥1点降低或0或1的绝对直肠出血得分，(2)0或1的内窥镜检查子分数，(3)MCS≤2，无各子分数>1。在一个实施方案中，生物样品是肠组织。在一个实施方案中，所述方法包括通过免疫组织化学方法测量表达细胞的数量。在一个实施方案中，测量包括使样品与特异性结合整联蛋白β7蛋白、整联蛋白αE蛋白或CD3ε蛋白的试剂接触并检测所形成的复合体的量，并由此测量表达细胞的数量。在一个实施方案中，样品中表达细胞的数量除以样品中细胞的总数量。在一个实施方案中，确定光学显微镜下高倍视野中表达细胞的数量。在一个实施方案中，参考水平是中值。
在仍然另一方面，提供用于治疗患有胃肠道炎性病症的患者的整联蛋白β7拮抗剂。在某些实施方案中，当选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε的至少一个基因的mRNA表达水平高于参考水平时，治疗患者或选择患者用于治疗。在某些实施方案中，当表达选自整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε的至少一种蛋白质的细胞的数量升高或与参考水平相比高时，治疗患者或选择患者用于治疗。在一个实施方案中，参考水平是中值。在一个实施方案中，整联蛋白β7拮抗剂用于治疗患者，其中每四周一次皮下施用100mg。在一个实施方案中，整联蛋白β7拮抗剂用于治疗患者，其中皮下施用420mg整联蛋白β7拮抗剂的平负荷剂量，施用负荷剂量后两周接着第二次皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂， 第二次施用后两周接着第三次皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂，第三次施用后四周接着皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂，然后每四周一次皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂。
在其他方面，提供特异性结合选自整联蛋白β7mRNA、整联蛋白αE mRNA、CD3εmRNA、整联蛋白β7蛋白、整联蛋白αE蛋白和CD3ε蛋白的生物标志物的至少一种试剂的体外用途。在某些实施方案中，所述至少一种试剂用于鉴定或选择患有胃肠道病症的患者，其可能对包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法应答，其中整联蛋白β7、整联蛋白αE和/或CD3εmRNA表达的水平或表达整联蛋白β7、整联蛋白αE和/或CD3ε的细胞的数量高于参考水平鉴定或选择更可能对疗法应答的患者。在一个实施方案中，参考水平是中值。
在仍然另一方面，提供在患者中治疗胃肠道炎性病症的方法。在某些实施方案中，当已经确定从患者获得的生物样品表达的一个或多个某些基因的mRNA表达水平升高时，向患者施用治疗有效量的整联蛋白β7拮抗剂。在一个实施方案中，已经确定样品表达与中值相比升高的整联蛋白β7mRNA。在一个实施方案中，已经确定样品表达与中值相比升高的整联蛋白αE mRNA。在一个实施方案中，已经确定样品表达与中值相比升高的CDεmRNA。在一个实施方案中，已经确定样品表达与相同mRNA的中值水平相比升高mRNA水平的整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε的两个或三个。在某些实施方案中，已经基于生物样品中某些基因相比于同一基因或多个基因的中值升高的mRNA表达水平选择患者用于治疗。在一个实施方案中，已经基于相比于中值升高的整联蛋白β7mRNA表达选择患者用于治疗。在一个实施方案中，已经基于相比于中值升高的整联蛋白αE mRNA表达选择患者用于治疗。在一个实施方案中，已经基于相比于中值升高的CD3εmRNA表达选择患者用于治疗。在一个实施方案中，已经基于整联蛋白β7、整联蛋白αE和CD3ε的两个或三个相比于相同mRNA的中值提高的mRNA表达选择患者用于治疗。在一个实施方案中，生物样品是组织活检样品。在一个实施方案中， 生物样品是外周全血。在一个实施方案中，在PAX基因管中收集外周全血。在某些实施方案中，通过PCR方法测量mRNA表达水平。在一个实施方案中，PCR方法是qPCR。在某些实施方案中，施用整联蛋白β7拮抗剂导致以下的一种或多种：(1)在MCS中3点降低和从基线30％减少并且在直肠出血子分数中≥1点降低或0或1的绝对直肠出血得分，(2)0或1的内窥镜检查子分数，(3)MCS≤2，无各子分数>1。在一个实施方案中，每四周一次皮下施用100mg整联蛋白β7拮抗剂。在一个实施方案中，皮下施用420mg整联蛋白β7拮抗剂的平负荷剂量，施用负荷剂量后两周接着第二次皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂，第二次施用后两周接着第三次皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂，第三次施用后四周接着皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂，然后每四周一次皮下施用300mg整联蛋白β7拮抗剂。
在某些上述实施方案中，胃肠道炎性病症是炎性肠病，并且在某些此类实施方案中，所述炎性肠病是溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩病(CD)，并且在某些此类实施方案中，整联蛋白β7拮抗剂是单克隆抗β7抗体。在某些此类实施方案中，抗β7抗体选自嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。在某些实施方案中，抗β7抗体是抗体片段。在某些实施方案中，抗β7抗体包含六个高变区(HVRs)，其中：
(i)HVR-L1包含氨基酸序列A1-A11,其中A1-A11是RASESVDTYH(SEQ ID NO：1)；RASESVDDLLH(SEQ ID NO：7)，RASESVDTLLH(SEQ ID NO:8)或RASESVDDLLH(SEQ ID NO：9)或SEQ ID NOs:1、7、8或9的变体(SEQ ID NO:26)，其中氨基酸A2选自A、G、S、T和V，和/或氨基酸A3选自S、G、I、K、N、P、Q、R和T，和/或A4选自E、V、Q、A、D、G、H、I、K、L、N和R，和/或氨基酸A5选自S、Y、A、D、G、H、I、K、N、P、R、T和V，和/或氨基酸A6选自V、R、I、A、G、K、L、M和Q，和/或氨基酸A7选自D、V、S、A、E、G、H、I、K、L、N、P、S和T，和/或氨基酸A8选自D、G、N、E、T、P和S，和/或氨基酸A9选自L、Y、I和M，和/或氨基酸A10选自 L、A、I、M和V和/或氨基酸A11选自H、Y、F和S；
(ii)HVR-L2包含氨基酸序列B1-B8，其中B1-B8是KYASQSIS(SEQ ID NO：2)，RYASQSIS(SEQ ID NO：20)或XaaYASQSIS(SEQ ID NO:21、其中Xaa代表任何氨基酸)或SEQ ID NOs:2、20或21的变体(SEQ ID NO:27)，其中氨基酸B1选自K、R、N、V、A、F、Q、H、P、I、L、Y和Xaa(其中Xaa代表任何氨基酸)，和/或氨基酸B4选自S和D，和/或氨基酸B5选自Q和S，和/或氨基酸B6选自S、D、L、和R，和/或氨基酸B7选自I、V、E、和K；
(iii)HVR-L3包含氨基酸序列C1-C9，其中C1-C9是QQGNSLPNT(SEQ ID NO:3)或SEQ ID NO:3的变体(SEQ ID NO:28)，其中氨基酸C8选自N、V、W、Y、R、S、T、A、F、H、I、L和M；
(iv)HVR-H1包含氨基酸序列D1-D10，其中D1-D10是GFFITNNYWG(SEQ ID NO:4)；
(v)HVR-H2包含氨基酸序列E1-E17，其中E1-E17是GYISYSGSTSYNPSLKS(SEQ ID NO:5)，或SEQ ID NO:5的变体(SEQ ID NO:29)，其中氨基酸E2选自Y、F、V和D，和/或氨基酸E6选自S和G，和/或氨基酸E10选自S和Y，和/或氨基酸E12选自N、T、A和D，和/或氨基酸13选自P、H、D和A，和/或氨基酸E15选自L和V，和/或氨基酸E17选自S和G；和
(vi)HVR-H3包含氨基酸序列F2-F11，其中F2-F11是MTGSSGYFDF(SEQ ID NO:6)或RTGSSGYFDF(SEQ ID NO:19)；或包含氨基酸序列F1-F11，其中F1-F11是AMTGSSGYFDF(SEQ ID NO:16)、ARTGSSGYFDF(SEQ ID NO:17)或AQTGSSGYFDF(SEQ ID NO:18)或SEQ ID NOs:6、16、17、18或9的变体(SEQ ID NO:30)，其中氨基酸F2是R、M、A、E、G、Q、S，和/或氨基酸F11选自F和Y。在某些实施方案中，抗β7抗体包含三个重链高变区(HVR-H1-H3)序列和三个轻链高变区(HVR-L1-L3)序列，其中:
(i)HVR-L1包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9；
(ii)HVR-L2包含SEQ ID NO:2；
iii)HVR-L3包含SEQ ID NO:3；
(iv)HVR-H1包含SEQ ID NO:4；
(v)HVR-H2包含SEQ ID NO:5；并且
(vi)HVR-H3包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19。
在某些实施方案中，抗β7抗体包含可变轻链，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗β7抗体包含可变重链，其包含SEQ ID NO:31(SEQ ID NO:31对应于SEQ ID NO:25，除了SEQ ID NO:25(MTGSSGYFDF(SEQ ID NO:6)或AMTGSSGYFDF(SEQ ID NO:16))的HVR-H3的氨基酸序列分别被RTGSSGYFDF(SEQ ID NO:19)或ARTGSSGYFDF(SEQ ID NO:17)取代)的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗β7抗体包含可变轻链，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，和可变重链，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗β7抗体是rhuMAbβ7，本文中也称为etrolizumab。
在另一方面，整联蛋白β7拮抗剂是单克隆抗α4/β7抗体。在某些实施方案中，抗α4/β7抗体是vedolizumab。在某些实施方案中，抗α4/β7抗体是AMG 181。
附图简述
图1A和1B显示了以下共有序列和抗β7亚基抗体序列的可变轻链和重链的序列比对：轻链人亚组kappa I共有序列(图1A，SEQ ID NO:12)，重链人亚组III共有序列(图1B，SEQ ID NO:13)，大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变轻链(图1A，SEQ ID NO:10)，大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变重链(图1B，SEQ ID NO:11)，和人源化抗体变体：人源化hu504K移植可变轻链(图1A，SEQ ID NO:14)，人源化hu504K移植可变重链(图1B，SEQ ID NO:15)，变体hu504-5、hu504-16和hu504-32(来自人源化hu504K移植的氨基酸变异示于图 1A)(轻链)(以出现顺序分别是SEQ ID NOS:22-24)中和图1B(重链)，用于变体hu504-5、hu504-16和hu504-32(SEQ ID NO:25)。
图2显示了如实施例1中描述的II期临床研究的研究方案。
图3显示了如实施例2中描述，利用安慰剂(斑点棒)、100mg/剂量的etrolizumab(阴影棒)，或300mg/剂量etrolizumab(开放棒)治疗的患者在第10周缓解的百分比(A)，在第10周显示粘膜愈合的百分比(B)，或在第10周显示临床应答的百分比(C)，在肠活检中通过基线β7基因表达水平(低，低于中值vs.高，高于中值)分层。
图4显示了如实施例2中描述，利用安慰剂(斑点棒)、100mg/剂量的etrolizumab(阴影棒)，或300mg/剂量etrolizumab(开放棒)治疗的患者在第10周缓解的百分比(A)，在第10周显示粘膜愈合的百分比(B)，或在第10周显示临床应答的百分比(C)，在肠活检中通过基线CD3ε基因表达水平(低，低于中值vs.高，高于中值)分层。
图5显示了如实施例2中描述在IBD患者(空点)和健康对照(实点)中，在CD45+细胞、CD3+细胞和CD19+细胞中通过FACS分析检测的β7表达水平与如通过qPCR检测的外周血中β7基因表达水平之间的相关性。
图6显示了如实施例2中描述，利用安慰剂(斑点棒)、100mg/剂量的etrolizumab(阴影棒)，或300mg/剂量etrolizumab(开放棒)治疗的患者在第10周缓解时的百分比(A)，在第10周显示粘膜愈合的百分比(B)，或在第10周显示临床应答的百分比(C)，在外周血中通过基线β7基因表达水平(低，低于中值vs.高，高于中值)分层。
图7显示了如实施例2中描述，通过免疫组织化学或通过qPCR确定的肠活检中的整联蛋白αE表达。(A)从非IBD患者(上图)、克罗恩病患者(中间的图)或UC患者(下图)获得的结肠(左图)或回肠(右图)组织中的αE免疫组织化学；在每种情况下，阳性染色的区域最深)；(B)如所示来自非IBD患者、UC患者和CD患者的结肠、回肠或空肠组织中αE+细胞作为总细胞的百分比的计算机化自动计数；(C) 相对于来自结肠非IBD、UC和如所示经历肠切除的克罗恩病患者的结肠、回肠或空肠的全部厚活检中的GAPDH的αE基因表达，；(D)αE+细胞作为从筛选期加入II期etrolizumab试验并鉴定为TNF未经处理的(图的左侧)或TNF-IR(图的右侧)的患者获得的活检组织中总细胞的百分比的计算机化自动计数，斑点状点：etrolizumab赦免者，空点：etrolizumab非赦免者，黑点：安慰剂，虚线表示中值；(E)来自加入II期etrolizumab试验的患者的筛选活检中的示例性αE染色，左图：αE高患者，右图：αE低患者；在每种情况下，阳性染色区是最深的；(F)相对于从筛选期加入II期etrolizumab试验并鉴定为TNF未经处理的(图的左侧)或TNF-IR(图的右侧)的患者获得的活检组织中GAPDH表达的αE基因表达，斑点状点：etrolizumab赦免者，空点：etrolizumab非赦免者，黑点：安慰剂，虚线表示中值；(G)显示通过qPCR测量的αE基因表达(垂直轴)与通过IHC测量的αE蛋白表达(水平轴)的关系的图；斑点状点：etrolizumab赦免者，空点：etrolizumab非赦免者，虚线表示中值。
图8显示了如实施例2中描述，通过肠活检中基线αE基因表达水平(低，低于中值vs.高，高于中值)分层并且在第10周缓解时(A)，在第10周显示粘膜愈合(B)，或在第10周显示临床应答(C)利用安慰剂(斑点棒)、100mg/剂量的etrolizumab(阴影棒)，或300mg/剂量etrolizumab(开放棒)治疗的患者的比例(百分比)；或通过肠活检中基线αE蛋白表达(低，低于中值vs.高，高于中值)分层并且在第10周缓解时(D)，在第10周显示粘膜愈合(E)，或在第10周显示临床应答(F)利用安慰剂(斑点棒)、100mg/剂量的etrolizumab(阴影棒)，或300mg/剂量etrolizumab(开放棒)治疗的患者的比例(百分比)。
图9显示了如实施例2中描述，通过肠活检中基线αE基因表达水平(低，低于中值vs.高，高于中值)分层并且在第10周缓解时(A)，在第10周显示粘膜愈合(B)，或在第10周显示临床应答(C)利用安 慰剂(斑点棒)、100mg/剂量的etrolizumab(阴影棒)，或300mg/剂量etrolizumab(开放棒)治疗的TNF未经处理的患者的比例(百分比)；或通过肠活检中基线αE蛋白表达(低，低于中值vs.高，高于中值)分层并且在第10周缓解时(D)，在第10周显示粘膜愈合(E)，或在第10周显示临床应答(F)利用安慰剂(斑点棒)、100mg/剂量的etrolizumab(阴影棒)，或300mg/剂量etrolizumab(开放棒)治疗的TNF未经处理的患者的比例(百分比)。
图10显示了如实施例2中描述，通过筛选时外周血中基线αE基因表达水平(低，低于中值vs.高，高于中值)分层并且在第10周缓解时(A)，在第10周显示粘膜愈合(B)，或在第10周显示临床应答(C)利用安慰剂(斑点棒)、100mg/剂量的etrolizumab(阴影棒)，或300mg/剂量etrolizumab(开放棒)治疗的患者的比例(百分比)；或通过第1天外周血中αE基因表达(低，低于中值vs.高，高于中值)分层并且在第10周缓解时(D)，在第10周显示粘膜愈合(E)，或在第10周显示临床应答(F)利用安慰剂(斑点棒)、100mg/剂量的etrolizumab(阴影棒)，或300mg/剂量etrolizumab(开放棒)治疗的患者的比例(百分比)。
图11显示了如实施例2中描述，通过筛选时外周血中基线αE基因表达水平(低，低于中值vs.高，高于中值)分层并且在第10周缓解时(A)，在第10周显示粘膜愈合(B)，或在第10周显示临床应答(C)利用安慰剂(斑点棒)、100mg/剂量的etrolizumab(阴影棒)，或300mg/剂量etrolizumab(开放棒)治疗的TNF未经处理的患者的比例(百分比)；或通过第1天外周血中αE基因表达(低，低于中值vs.高，高于中值)分层并且在第10周缓解时(D)，在第10周显示粘膜愈合(E)，或在第10周显示临床应答(F)利用安慰剂(斑点棒)、100mg/剂量的etrolizumab(阴影棒)，或300mg/剂量etrolizumab(开放棒)治疗的TNF未经处理的患者的比例(百分比)。
图12显示了如实施例1中描述的II期标签公开延长临床研究的研究方案。
图13显示了来自标签公开延长研究通过临床缓解期(A)或显示临床应答(B)的肠活检中基线αE基因表达(低，低于中值vs.高，高于中值)分层；或通过临床缓解期(C)或显示临床应答(D)的肠活检中基线αE蛋白表达(低，低于中值vs.高，高于中值)分层；或通过临床缓解期(E)或显示临床应答(F)的外周血中αE基因表达分层的TNF-IR患者的百分比。
发明详述
除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有如本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第2版,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994),and March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms and Structure第4版,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992)，为本领域技术人员提供本申请中所用的许多术语的一般指导。
某些定义
为解释本说明书的目的，将应用以下定义并且适当时，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。在下文阐明的任何定义与本文通过参考并入的任何文件冲突的事件中，以下文阐明的定义为准。
除非上下文明确说明，本说明书和附属的权利要求中所用的单数形式“a”“an”和“the”包括复数指示物。因此，例如，提及的“蛋白质”包括大量蛋白质；提及的“细胞”包括细胞的混合物等。
说明书和附属的权利要求中提供的范围包括两个终点和终点之间的所有点。因此，例如，2.0-3.0的范围包括2.0，3.0和2.0-3.0之间的所有点。
“治疗”及其语法变体指尝试改变被治疗的个体或细胞的天然过程的临床干预，并且可以为预防或在临床病理学过程中进行。想要的治疗效果包括防止疾病的发生或复发、减轻症状、消除疾病的任何直接或间接病理学结果、降低疾病进行的速率、改善或缓和疾病状态，和减缓或提高预后。
“治疗方案”指施用剂量、频率，或治疗持续时间，加入或不加入第二种药疗法的组合。
“有效治疗方案”指将为接受治疗的患者提供有益应答的治疗方案。
可以使用为患者指示益处的任何终点评估“患者应答”或“患者应答性”，包括但不限于，(1)一定程度上抑制疾病进行，包括减慢和完全阻止；(2)减少疾病发作和/或症状的数量；(3)减少损伤的大小；(4)抑制(即，减少、减慢或完全终止)疾病细胞浸润到附近的周围器官和/组织中；(5)抑制(即，减少、减慢或完全终止)疾病扩散；(6)降低自身免疫应答，其可能，但不必一定导致疾病损伤的退化或切除；(7)在一定程度上缓解与病症相关的一种或多种症状；(8)治疗后增加无疾病表现的长度；和/或(9)降低治疗后给定时间点上的死亡率。术语“应答性”指可测量的应答，包括完全应答(CR)和部分应答(PR)。
如本文所用，“完全应答”或“CR”表示应答治疗后炎症的所有征兆消失或缓解。这不必然表示已经治愈了疾病。
“部分应答”或“PR”指应答治疗后炎症严重性至少50％的降低。
患者对利用整联蛋白β7拮抗剂的治疗的“有益应答”和类似词语指传递给具有胃肠炎性病症的风险或患有胃肠炎性病症的患者由于或因为利用拮抗剂，如抗β7整联蛋白抗体的治疗的临床或治疗益处。此类益处包括细胞或生物应答、完全应答、部分应答、稳定的疾病(不进展或复发)，或患者由于或因为利用拮抗剂的治疗的更迟的复发的应答。
如本文所用，“无应答”或“缺少应答”或类似的词语表示缺少对利用整联蛋白β7拮抗剂的治疗的完全应答、部分应答或有益应答。
当在治疗过程中患者的应答性不随时间降低时，“患者维持对治疗的应答性”。
如本文所用的术语“样品”或“测试样品”指获自或衍生自目的受试者的组合物，所述受试者含有例如待基于物理、生物化学、化学和/或生理特征进行表征和/或鉴定的细胞和/或其他分子实体。在一个实施方案中，所述定义包括血液和其他生物来源的液体样品和组织样品，如活检样本或来源于其的组织培养物或细胞。组织样品的来源可以是固体组织，如来自新鲜的、冰冻的和/或保存的器官或组织样品或活检或抽吸物；血液或任何血液成分；体液；和来自受试者妊娠或发育任何时间的细胞或血浆。术语“样品”或“测试样品”包括在其获得后已经以任何方式处理的生物样品，如通过试剂处理、增溶或富集某些组分，如蛋白质或多核苷酸，或包埋在半固体或固体基质中用于切片目的。为了本文目的，组织样品的“切片”表示单一部分或一片组织样品，例如从组织样品中切下来的组织或细胞的薄片。样品包括，但不限于全血、血液来源的细胞、血清、血浆、淋巴液、滑膜液、细胞提取物及其组合。在一个实施方案中，样品是临床样品。在另一实施方案中，样品用于诊断测定中。
如本文所用，“参考样品”指用于比较目的的任何样品、标准或水平。在一个实施方案中，从相同受试者或患者的身体的健康和/或无疾病部分(例如，组织或细胞)获得参考样品。在另一实施方案中，从相同受试者或患者的身体的未处理组织和/或细胞获得参考样品。在仍另一实施方案中，从非受试者或患者的个体的身体的健康和/或无疾病部分(例如，组织或细胞)获得参考样品。在甚至另一实施方案中，从非受试者或患者的个体的身体的未处理组织和/或细胞部分获得参考样品。
“β7整联蛋白拮抗剂”或“β7拮抗剂”指抑制β7整联蛋白一种或多种生物活性或阻断β7整联蛋白与一种或多种其结合分子结合的任何分子。本发明的拮抗剂可以用于调节β7相关效应的一个或多个方面，包括但不限于与α4整联蛋白亚基结合、与αE整联蛋白亚基结合、α4β7整联蛋白与MAdCAM、VCAM-1或纤连蛋白结合以及αEβ7整联蛋白与E钙 黏蛋白结合。这些效应可以通过任何生物相关机制调节，包括破坏配体结合β7亚基或结合α4β7或αEβ7二聚体整联蛋白，和/或通过破坏α和β整联蛋白亚基之间的结合，以便抑制二聚体整联蛋白的形成。在本发明的一个实施方案中，β7拮抗剂是抗β7整联蛋白抗体(或抗β7抗体)。在一个实施方案中，抗β7整联蛋白抗体是人源化的抗β7整联蛋白抗体并更特别是重组的人源化单克隆抗β7抗体(或rhuMAbβ7)。在一些实施方案中，本发明的抗β7抗体是抗整联蛋白β7拮抗抗体，其抑制或阻断β7亚基与α4整联蛋白亚基之间的结合、与αE整联蛋白亚基之间的结合、与α4β7整联蛋白与MAdCAM、VCAM-1或纤连蛋白的结合以及αEβ7整联蛋白与E钙黏蛋白结合。
“β7亚基”或“β7亚基”表示人β7整联蛋白亚基(Erle等,(1991)J.Biol.Chem.266:11009-11016)。β7亚基与α4整联蛋白亚基，如人α4亚基结合(Kilger和Holzmann(1995)J.Mol.Biol.73:347-354)。据报道α4β7整联蛋白在大部分成熟淋巴细胞，以及小群胸腺细胞、骨髓细胞和肥大细胞上表达。(Kilshaw和Murant(1991)Eur.J.Immunol.21:2591-2597；Gurish等,(1992)149:1964-1972；和Shaw,S.K.和Brenner,M.B.(1995)Semin.Immunol.7:335)。β7亚基也与αE亚基，如人αE整联蛋白亚基结合(Cepek,K.L,等(1993)J.Immunol.150:3459)。αEβ7整联蛋白在肠内上皮淋巴细胞(iIELs)上表达(Cepek,K.L.(1993)上文)。
“αE亚基”或“αE整联蛋白亚基”或“αE亚基”或“αE整联蛋白亚基”或“CD103”表示发现与上皮内淋巴细胞上的β7整联蛋白结合的整联蛋白亚基，所述αEβ7整联蛋白介导iELs结合表达E-钙黏蛋白的肠上皮(Cepek,K.L.等(1993)J.Immunol.150:3459；Shaw,S.K.和Brenner,M.B.(1995)Semin.Immunol.7:335)。
“MAdCAM”或“MAdCAM-1”在本发明的上下文中互换使用并指蛋白质粘膜地址素细胞粘着分子1，其是包含短的细胞质尾区、跨膜区和由三个免疫蛋白样结构域组成的细胞外序列的单链多肽。已经克隆了 鼠类、人和猕猴MAdCAM-1的cDNA(Briskin,等,(1993)Nature,363:461-464；Shyjan等,(1996)J.Immunol.156:2851-2857)。
“VCAM-1”或“血管细胞粘着分子-1”或“CD106”指α4β7和α4β1的配体，其在激活的内皮上表达并且在内皮-白细胞相互作用，如炎症过程中白细胞的结合和迁移中重要。
“CD45”指蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的蛋白质。已知PTP是信号分子，其调节多个细胞过程，包括细胞生长、分化、有丝分裂循环和致癌性转化。该PTP含有细胞外结构域、单次跨膜区段和两个串联胞浆内催化结构域，并因此属于受体类型PTP。该基因特异地在造血细胞中表达。已经显示该PTP是T细胞和B细胞抗原受体信号传递的必要调节子。其通过与抗原受体复合体的组分直接相互作用或通过激活抗原受体信号传递所需要的多种Src家族激酶起功能。该PTP还抑制JAK激酶，并因此充当细胞因子受体信号传递的调节子。已经报道了该基因的四个可变剪接的转录物变体，其编码不同的同工型。(Tchilian EZ,Beverley PC(2002)，“CD45in memory and disease”，Arch.Immunol.Ther.Exp.(Warsz.)50(2):85-93.Ishikawa H,Tsuyama N,Abroun S,等(2004)."Interleukin-6,CD45and the src-kinases in myeloma cell proliferation."Leuk.Lymphoma 44(9):1477-81。
存在CD45的多种同工型：CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、CD45RAC、CD45RBC、CD45RO、CD45R(ABC)。CD45也是高度糖基化的。CD45R是最长的蛋白并且当从T细胞分离时迁移到200kDa。B细胞也表达具有较重糖基化的CD45R，使分子量成为200kDa，因此命名为B220；200kDa的B细胞同工型。B220表达不限于B细胞并且还可以在激活的T细胞、树状突细胞亚组和其他抗原呈递细胞上表达。Stanton T,Boxall S,Bennett A,等(2004)。"CD45variant alleles:possibly increased frequency of a novel exon 4CD45polymorphism in HIV seropositive Ugandans."Immunogenetics 56(2):107-10。
“消化道归巢淋巴细胞”指具有选择性归巢到肠淋巴结和组织中但不归巢到外周淋巴结和组织中的特征的淋巴细胞亚组。该淋巴细胞亚组的特征在于大量细胞表面分子，包括但不限于CD4、CD45RA和β7的组合的独特表达模式。通常，可以基于CD45RA和β7的标志物细分外周血CD4+淋巴细胞的至少两个亚组：CD45RA-β7高和CD45RA-β7低CD4+细胞。CD45RA-β7高CD4+细胞优先归巢到肠淋巴结和组织中，然而CD45RA-β7低CD4+细胞优先归巢到外周淋巴结和组织中(Rott等1996；Rott等1997；Williams等1998；Rosé等1998；Williams和Butcher 1997；Butcher等1999)。消化道归巢淋巴细胞因而是在流式细胞术中鉴定为CD45RA-β7高CD4+的淋巴细胞的特色亚群。鉴定该淋巴细胞群的方法为本领域所熟知。
如本文在细胞表面标志物方面所用，符号“+”表示细胞表面标志物的阳性表达。例如，CD4+淋巴细胞是在其细胞表面上具有CD4表达的淋巴细胞群。
如本文在细胞表面标志物方面所用，符号“-”表示细胞表面标志物的阴性表达。例如，CD45RA-淋巴细胞是在其细胞表面上没有CD45RA表达的淋巴细胞群。
“胃肠炎性病症”是一群慢性病症，其在粘膜中引起炎症和/或溃疡。这些病症包括例如炎性肠病(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎、不确定结肠炎和传染性结肠炎)、粘膜炎(例如，口腔粘膜炎、胃肠粘膜炎、鼻粘膜炎和直肠炎)、坏死性小肠结肠炎和食管炎。
“炎性肠病”或“IBD”在本文中互换使用，指引起炎症和溃疡的肠疾病并且包括但不限于克罗恩病和溃疡性结肠炎。
“克罗恩病(CD)”和“溃疡性结肠炎(UC)”是病因未知的慢性炎性肠病。不像溃疡性结肠炎，克罗恩病可以影响肠的任何部分。克罗恩病最明显的特征是肠壁颗粒状的红紫色水肿性增厚。随着炎症的发展，这些肉芽肿经常丧失它们的局限边界并与周围组织结合。腹泻和肠梗阻是主要的临床特征。与溃疡性结肠炎一样，克罗恩病的过程可能是连续的或 反复的、轻度的或严重的，但不像溃疡性结肠炎，克罗恩病是不能通过切除涉及的肠区段可以治愈的。患有克罗恩病的大多数患者需要在一些部位进行手术，但是后续的复发是常见的并且连续的医学治疗是平常的。
克罗恩病可能涉及从口到肛门的消化道的任何部分，尽管其通常出现在回结肠、小肠或结肠-肛门直肠区域。在组织病理学上，疾病表现为不连续的淋巴瘤样肉芽肿病(granulomatomas)、隐窝脓肿、脑裂和口疮性溃疡。将炎性浸润物混合，其由淋巴细胞(T细胞和B细胞)、血浆细胞、巨噬细胞和中性粒细胞组成。分泌IgM和IgG血浆细胞、巨噬细胞和中性粒细胞具有不成比例的增加。
抗炎药物柳氮磺吡啶和5-氨基水杨酸(5-ASA)用于治疗轻度活跃的结肠克罗恩病并且通常为尝试维持疾病的缓解而开药。Metroidazole和环丙沙星在效力上与柳氮磺吡啶相似并且特别建议用于治疗肛周疾病。在更严重的情况下，建议皮质类固醇治疗活跃的恶化并且有时候可以维持缓解。硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤也已经用于需要长期施用皮质类固醇的患者。已经提示这些药物可能在长期预防中起作用。不幸的是，在一些患者中开始作用之前具有非常长的延迟(高达六个月)。止泻药也可以在一些患者中提供症状缓解。营养治疗或要素饮食可以改善患者的营养状况并诱导急性疾病的症状改善，但不诱导持续的临床缓解。抗生素可以用于治疗次级小肠细菌过度生长并用于治疗化脓并发症。
“溃疡性结肠炎(UC)”影响大肠。疾病病程可以是连续的或复发的，轻度的或严重的。最早的损伤是炎性浸润，其在肠腺的基底具有脓肿形成。这些膨胀的和破裂的隐窝的聚结趋向于从其血液供给分离上面的粘膜，导致溃疡。疾病的症状包括绞痛、小腹痛、直肠出血和频繁的释放主要由血液、脓和粘液组成的排出物，具有极少的粪便颗粒。全结肠切除术可能为急性严重的或慢性持续的溃疡性结肠炎所需。
UC的临床特征是高度变化的，并且起始是隐伏的或突然的，并且可包括腹泻、下坠和复发的直肠出血。随着整个结肠的爆发性参与，可 能发生中毒性巨结肠，其为威胁生命的紧急状况。肠外表现包括关节炎、坏疽性脓皮病(pyoderma gangrenoum)、眼色素层炎和结节性红斑。
用于UC的治疗包括柳氮磺吡啶和相关的含水杨酸盐药物用于轻度情况和皮质类固醇药物用于严重情况。局部施用水杨酸盐或皮质类固醇有时候是有效的，特别是当疾病限于末端肠时，并且与全身使用相比与降低的副作用相关。有时候指示支持性措施，如施用铁和止泻药。硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤和氨甲喋呤有时候也被建议用于顽固的皮质类固醇依赖性情况。
“有效剂量”指实现想要的治疗或预防结果必需的剂量和时间内有效的量。
如本文所用，术语“患者”指需要所述治疗的任何单个受试者。在某些实施方案中，本文中的患者是人。
本文中的“受试者”通常是人。在某些实施方案中，受试者是非人哺乳动物。示例性非人哺乳动物包括实验室动物、家畜、宠物、运动动物和家畜动物，例如，小鼠、猫、狗、马和牛。通常，受试者适合治疗，例如治疗胃肠炎性病症。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在最广泛意义上互换使用并且包括单克隆抗体(例如，全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们展示想要的生物活性)，并且还可以包括某些抗体片段(如本文中更详细描述)。抗体可以是人抗体、人源化抗体和/或亲和力成熟的抗体。
“抗体片段”仅包含完整抗体的部分，其中所述部分优选保留正常与当存在于完整抗体中时的部分相关的至少一种，并通常是大部分或全部功能。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点并因此保留结合抗原的能力。在另一实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的一个抗体片段保留正常与当存在于完整抗体中时的Fc区相关的至少一种生物功能，如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是单价抗体，其具有与完整抗体基 本上类似的体内半衰期。例如，该抗体片段可能包含连接能够赋予片段体内稳定性的Fc序列的抗原结合臂。
如本文所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体种群中获得的抗体，即包含单个抗体的种群是相同的，除了少量存在的可能发生的天然突变。单克隆抗体是高度特异的，针对单个抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
本文的单克隆抗体特异地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的部分与来源于特定种类或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，同时链的剩余部分与来源于另一种类或属于另一抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展示想要的生物活性(美国专利号,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
非人(例如，鼠类)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。对于大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基被来自非人种类(供体抗体)，具有想要的特异性、亲和力和能力的如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个，通常两个的基本上整个可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白lo序列的那些。任选地，人源化抗体也将包含通常人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。对于其他细节，参见Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还参见以下综述文章和其中引用的参考文献：Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris, Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995)；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。
“人抗体”是这样的抗体，其包含对应于由人产生的和/或使用用于制备如本文公开的人抗体的任何技术制备的抗体的氨基酸序列。此类技术包括筛选人来源的组合文库，如噬菌体展示文库(参见例如，Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)和Hoogenboom等,Nucl.Acids Res.,19:4133-4137(1991))；使用人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系用于产生人单克隆抗体(参见例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第55-93页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991))和在转基因动物(例如，小鼠)中产生单克隆抗体，所述转基因动物能够在缺少内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的全部组成成分(参见，例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature,362:255(1993)；Bruggermann等,Year in Immunol.,7:33(1993))。人抗体的此定义明确排除包含来自非人动物的抗原结合残基的人源化抗体。
“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中鉴定并分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素或其他蛋白质性质的或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，抗体将纯化至(1)如通过Lowry方法测定，超过抗体的95重量％，并且经常超过99重量％；(2)用转杯式蛋白测序仪，达到足以获得N-末端或内部氨基酸序列至少15个残基的程度，或(3)使用考马斯蓝或银染色，达到在还原或非还原条件下SDS-PAGE的同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为不会存在抗体天然环境的至少一种组分。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。
当用于本文时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环的区域。一般地，抗体包含6个 高变区；三个在VH中(Hl、Η2、Η3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。许多高变区描述正在使用并且包括在本文中。Kabat互补性决定区(CDRs)基于序列变异性并且是最常使用的(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。Chothia更换为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM高变区代表Kabat CDRs与Chothia结构环之间的折中，并且为Oxford Molecular's AbM抗体模拟软件所使用。“接触”高变区基于对可用复杂晶体结构的分析。在下文中指出了来自每个这些HVR的残基。

高变区可包含如下的“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1),46-56或49-56或50-56或52-56(L2)和89-97(L3)和VH中的26-35(H1)，50-65或49-65(H2)和93-102，94-102或95-102(H3)。根据Kabat等上文针对这些定义的每个编号可变域残基。
“构架”或“FR”残基是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变域残基。
“人共有构架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列选集中最常存在的氨基酸残基的构架。一般地，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。一般地，序列的亚组是如Kabat等中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等中的亚组III。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDR中具有一个或多个改变的抗体，与不具有这些改变的亲本抗体相比，其导致抗体对抗原的亲和力提高。在某些实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶标抗原将具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。Marks等Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或构架残基的随机诱变由以下描述：Barbas等Proc Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813(1994)；Schier等Gene 169:147-155(1996)；Yelton等J.Immunol.155:1994-2004(1995)；Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins等J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
如本文所用，短语“基本上类似”或“基本上相同”表示两个数值(一般是一个与本发明的抗体相关，另一个与参考/比较抗体相关)之间相似性十分高的程度，以便本领域的技术人员会考虑两个值之间的差异在通过所述值测量的生物学特征背景中是很小或没有生物学和/或统计学显著性。
术语“结合亲和力”一般指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间非共价相互作用的合计强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”指内在结合亲和力，其反映结合对的成员之间(例如，抗体与抗原之间)的1：1相互作用。一般可以通过解离常数(Kd)代表分子X对其配偶体Y的亲和力。可以通过本领域常规方法，包括本文描述的那些来测量亲和力。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原并容易趋向于解离，然而高亲和力抗体一般更快地结合抗原并趋向于更久的保持结合。测量结合亲和力的多种方法为本领域所知，其任何方法均可用于本发明的目的。
与抗体或免疫球蛋白相关的术语“可变的”指这样的事实，即可变域的某些部分在抗体之间序列广泛不同并且用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性上。然而，可变性在抗体的可变域内并不平均分布。其富集于轻链和重链可变域中称为高变区的三个区段中。可变域较高保 守性的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，大多采取β-折叠构型，通过三个高变区连接，所述高变区形成环形连接，并且在一些情况下形成部分β-折叠结构。每条链中的高变区通过FR紧密邻近地结合在一起，与来自另一条链的高变区促进形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定区不直接参与抗体结合抗原，但是显示出多种效应子功能，如抗体参与对抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每一个具有单个抗原结合位点，和剩余的“Fc”片段，其名字反映了其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并仍然能够交联抗原的F(ab')2片段。
“Fv”是最小的抗体片段，其含有完整的抗原识别和抗原结合位点。该区域由紧密非共价结合的一个重链和一个轻链可变域的二聚体组成。在该构型中，每个可变域的三个高变区相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。总体上，六个高变区赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个可变域(或包含仅三个对抗原特异的高变区的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，尽管以比完整结合位点低的亲和力。
Fab片段还含有轻链的恒定域和重链的第一个恒定域(CH1)。Fab'片段因在重链CH1结构域的羧基端添加了一些残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而不同于Fab片段。Fab’-SH在本文中是Fab’的命名，其中恒定域的半胱氨酸残基携带至少一个游离的巯基。F(ab')2抗体片段最初产生为Fab'片段对，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可以根据它们恒定域的氨基酸序列被分派为两个明显不同类型中的一种，称为kappa(κ)和lambda(λ)。
根据它们的重链的恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可以被分派为不同的种类。有5大类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的并一般描述于例如Abbas等,Cellular and Mol.Immunology,第4版(W.B.Saunders,Co.,2000)。抗体可以是较大融合分子的一部分，由抗体与一个或多个其他蛋白质或肽共价或非共价结合而形成。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”在本文中互换使用，指其基本上完整形式的抗体，而非下文定义的抗体片段。术语特别指具有含有Fc区的重链的抗体。
用于本文目的的“裸抗体”是不缀合细胞毒素部分或放射性标记的抗体。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但是人IgG重链Fc区一般限定为从位置Cys226或Pro230上的氨基酸残基延伸到其羧基末端。例如，在抗体的产生或纯化过程中，或通过重组改造编码抗体的重链的核酸去除Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统的447位残基)。因此，完整抗体的组分可以包含所有K447残基被去除的抗体群、K447残基不被去除的抗体群，和具有含有和不含有K447残基的抗体混合物的抗体群。
除非另有说明，本文中免疫球蛋白重链中残基的编号是如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中的EU索引的编号，该文献通过参考明确并入本文。“Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。
“功能性的Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。该效应子功能一般需要Fc区与结合域(例如，抗体可变域)组合并可以使用例如本文公开的多种测定来评估。
“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列一致的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1Fc区域(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区域；天然序列人IgG3Fc区域；和天然序列人IgG4Fc区域以及其天然发生的变体。
“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，相比于天然序列Fc区或相比于亲本多肽的Fc区，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区中或在亲代多肽的Fc区中从约一个至约十个氨基酸取代，并且在某些实施方案中从约一个至约五个氨基酸取代。在某些实施方案中，本文的变体Fc区将与天然序列Fc区和/或与亲代多肽的Fc区具有至少约80％同源性，或与其具有至少约90％同源性，或与其具有至少约95％同源性。
根据它们的重链的恒定域的氨基酸序列，完整抗体可以被分派为不同的“种类”。有5大类完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的若干种可以进一步分成“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcRs)的非特异性细胞毒性细胞(例如,天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并随后导致靶细胞的裂解。用于介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，然而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev. Immunol 9:457-92(1991)的第464页的表3中总结了造血细胞上的FcR的表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如在美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的测定。用于该测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者或额外地，可以在体内，例如在动物模型，如Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。
“人效应细胞”是表达一个或多个FcR并且执行效应子功能的白细胞。在某些实施方案中，细胞表达至少FcγRIII并且执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和中性粒细胞。可以从其天然来源，例如从如本文所述的血液或PBMC中分离效应细胞。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体的Fc区的受体。在某些实施方案中，FcR是天然序列人FcR。此外，FcR是结合IgG抗体(γ受体)的并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的一种受体，包括等位基因变体和这些受体的可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有相似氨基酸序列，主要不同在其胞质结构域中。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997)中的M)。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中综述了FcR。其他FcR，包括在未来要鉴定的那些包括在本文的术语“FcR”中。术语还包括新生儿受体FcRn，其负责将母本IgG转移到胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))，并调节免疫球蛋白的稳态。在WO00/42072(Presta,L.)和US2005/0014934A1(Hinton等)中描述了具有与新生儿Fc受体(FcRn)提高结合和增加的半衰期的抗体。这些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，其提 高Fc区与FcRn的结合。例如，Fc区可以在位置238、250、256、265、272、286、303、305、307、311、312、314、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428或434的一个或多个(残基的Eu编号)上具有取代。在某些实施方案中，具有提高的FcRn结合的包含Fc区的抗体变体在其Fc区的位置307、380和434的一个、两个或三个(残基的Eu编号)中包含氨基酸取代。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。在某些实施方案中，Fv多肽还在VH和VL结构域之间包含多肽接头，其使得scFv能够形成想要的结构用于抗原结合。对于scFv的综述，参见The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)中的Plückthun。在WO93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458中描述了HER2抗体scFv片段。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在同一条多肽链(VH-VL)中连接可变轻链结构域(VL)的可变重链结构域(VH)。通过使用太短以至于不允许同一条链上的两个结构域配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中更彻底地描述了双抗体。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个高变区中具有一个或多个改变的抗体，与不具有这些改变的亲本抗体相比，其导致抗体对抗原的亲和力提高。在某些实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶标抗原将具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。通过本领域已知的方法产生亲和力成熟的抗体。Marks等Bio/Technology 10:779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或构架残基的随机诱变由以下描述：Barbas等Proc Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813(1994)；Schier等Gene 169:147-155(1995)；Yelton等J.Immunol.155:1994-2004(1995)； Jackson等,J.Immunol.154(7):3310-9(1995)；和Hawkins等,J.Mol.Biol.226:889-896(1992)。
本文中的“氨基酸序列变体”抗体是具有不同于主要种类抗体的氨基酸序列的抗体。在某些实施方案中，氨基酸序列变体与主要种类抗体具有至少约70％的同源性，或它们与主要种类抗体具有至少约80％，或至少约90％的同源性。氨基酸序列变体在主要种类抗体的氨基酸序列中或附近的某些位置上具有取代、缺失和/或添加。本文中氨基酸序列变体的实例包括酸性变体(例如去酰胺基抗体变体)、碱性变体、在其一条或两条轻链上具有氨基末端前导延伸(例如VHS-)的抗体、在其一条或两条重链上具有C末端赖氨酸残基的抗体等，并且包括重链和/或轻链的氨基酸序列的变异的组合。本文特别感兴趣的抗体变体是在其一条或两条轻链上具有氨基末端前导延伸，任选地相对于主要种类抗体还包含其他氨基酸序列和/或糖基化差异的抗体。
本文的“糖基化变体”抗体是具有附着到其上的一个或多个糖类部分的抗体，其不同于附着到主要种类抗体上的一个或多个糖类部分。本文糖基化变体的实例包括具有G1或G2寡糖结构，而不是G0寡糖结构附着到其Fc区上的抗体、具有一个或两个糖类部分附着到其一条或两条轻链上的抗体、没有糖类附着到抗体的一条或两条重链上的抗体等，和糖基化改变的组合。抗体具有Fc区时，寡糖结构可附着到抗体的一条或两条重链上，例如299位残基(298，残基的Eu编号)上。
如本文所用的术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞毁坏的物质。术语旨在包括放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化学治疗剂和毒素，如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。
术语“细胞因子”是用于一个细胞群体释放的蛋白质的总称，其作为细胞间介导物作用于另一细胞上。此类细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统多肽激素。细胞因子中包括的是生长激素，如人生长激素、 N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；prorelaxin；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；mullerian抑制物质；小鼠促性腺素关连肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(ILs)，如IL-1、IL-lα、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；和其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用,术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等同物。
如本文所用用于辅助疗法的术语“免疫抑制剂”指作用于抑制或掩蔽本文治疗的受试者的免疫系统的物质。这包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自我抗原表达或掩蔽MHC抗原的物质。此类试剂的实例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(参见美国专利号4,665,077)；非类固醇抗炎药(NSAID)；更昔洛韦；他克莫司；糖皮质类固醇，如氢化可的松或醛固酮；抗炎剂，如环加氧酶抑制剂；5-脂加氧酶抑制剂；或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂如硫唑嘌呤或麦考酚酸酯(MMF)；烷基化试剂如环磷酰胺；溴隐亭；达那唑；氨苯砜；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利号4,120,649中所述)；用于MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢霉素；6-巯基嘌呤；类固醇如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质类固醇类似物，例如泼尼松、甲基氢化泼尼松，包括SOLU-MEDROL.RTM.甲基氢化泼尼松琥珀酸钠，和地塞米松；二氢叶酸还原酶抑制剂如氨甲喋呤(口服或皮下)；抗疟剂，如氯喹和羟氯喹；柳氮磺吡啶；来氟米特；细胞因子或细胞因子受体抗体或拮抗剂，包括 抗干扰素α、β或γ抗体、抗肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(英夫利昔单抗(REMICADE.RTM.)或阿达木单抗)、抗TNF-α免疫粘附素(依那西普)、抗TNFβ抗体、抗白细胞介素-2(IL-2)抗体和抗IL-2受体抗体，和抗白细胞介素-6(IL-6)受体抗体和拮抗剂；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；panT抗体，抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA3结合结构域的可溶性肽(在1990年7月26日发表的WO 1990/08187)；链激酶；转化生长因子β(TGF-β)；streptodomase；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；苯丁酸氮芥；脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T细胞受体(Cohen等,美国专利号5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等,Science,251:430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway,Nature,341:482(1989)；和WO91/01133)；BAFF拮抗剂，如抗BAFF或BR3抗体或免疫粘附素和zTNF4拮抗剂(对于综述，参阅Mackay和Mackay,Trends Immunol.,23:113-5(2002),还参见下文的定义)；干扰T细胞辅助信号的生物试剂，如抗CD40受体或抗CD40配体(CD154)，包括针对CD40-CD40配体的封闭抗体(例如，Durie等,Science,261:1328-30(1993)；Mohan等,J.Immunol.,154:1470-80(1995))和CTLA4-Ig(Finck等,Science,265:1225-7(1994))；和T细胞受体抗体(EP 340,109)，如T10B9。
如本文所用的术语“改善(ameliorates)”或“改善(amelioration)”指状况、疾病、病症或表型，包括异常或症状的降低、减少或消除。
疾病或病症(例如，炎性肠病，例如溃疡性结肠炎或克罗恩病)的“症状”是来自正常人的结构、功能或感觉的任何不健康现象或偏离，其为受试者所经历并预示疾病。
表述“治疗有效量”指对预防、改善或治疗疾病或病症(例如，炎性肠病，例如溃疡性结肠炎或克罗恩病)有效的量。例如，抗体的“治疗有效量”指对预防、改善或治疗具体疾病或病症有效的抗体的量。类似地，抗体和第二种化合物的组合的“治疗有效量”指组合中对预防、改善或治疗具体疾病或病症有效的抗体的量和第二种化合物的量。
应理解，术语两种化合物的“组合”不表示化合物必须彼此混合施用。因此，利用或使用该组合治疗包括化合物的混合物或分别施用化合物，并包括在同一天或不同天施用。因此，术语“组合”表示两种或多种化合物单独或彼此混合用于治疗。当抗体和第二种化合物例如组合向受试者施用时，抗体在第二种化合物也存在于受试者中时存在于受试者中，无论抗体和第二种化合物是单独向受试者施用还是混合施用。在某些实施方案中，除抗体外的化合物在抗体之前施用。在某些实施方案中，除抗体外的化合物在抗体之后施用。
为了本文目的，“肿瘤坏死因子α(TNF-α)”指人TNF-α分子，其包含在Pennica等,Nature,312:721(1984)或Aggarwal等,JBC,260:2345(1985)中描述的氨基酸序列。
本文中的“TNF-α抑制剂”是一般通过结合TNF-α并中和其活性在一定程度上抑制TNF-α的生物功能的试剂。本文特别设想的TNF抑制剂的实例是etanercept英夫利昔单抗阿达木单抗golimumab(SIMPONITM)和certolizumab pegol
“皮质类固醇”指具有类固醇的一般化学结构的若干合成或天然发生的物质中的任何一种，其模拟或增强天然发生的皮质类固醇的效果。合成的皮质类固醇的实例包括泼尼松、泼尼松龙(包括甲基泼尼松龙)、地塞米松曲安西龙和倍他米松。
“拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、废除、减少或干扰特定或具体蛋白质的活性的分子，包括在配体的情况下，其结合一个或多个受体或在受体的情况下结合一个或多个配体。拮抗剂包括抗体及其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药理学试剂及其代谢物、转录和翻译调控序列等。拮抗剂还包括蛋白质的小分子抑制剂，和特异性结合蛋白质的融合蛋白，受体分子和衍生物并由此分离与其靶标的结合，蛋白质的拮抗剂变体，针对蛋白质的反义分子，RNA适体和针对蛋白质的核酶。
“自我注射装置”指例如通过患者或住家护理自我施用治疗剂的医学装置。自我注射装置包括自动注射器装置和设计用于自我施用的其他装置。
如本文所用的“寡核苷酸”指短的单链多核苷酸，其长度为至少约7个核苷酸并且长度少于约250个核苷酸。寡核苷酸可以是合成的。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并非相互排斥。上文用于多核苷酸的描述同等并且完全适用于寡核苷酸。
术语“引物”指单链多核苷酸，其能够与核酸杂交并允许互补核酸聚合，一般通过提供游离的3’–OH基团实现。
术语“扩增”指产生一个或多个拷贝的参考核酸序列或其互补物的过程。扩增可以是线性的或指数的(例如，PCR)。“拷贝”不必表示相对于模板序列的完全的序列互补性或同一性。例如，拷贝可以包括核苷酸类似物，如脱氧肌苷、有意的序列改变(如通过包含这样的序列的引物引入的序列改变，所述序列可与模板杂交，但不是完成互补)，和/或在扩增过程中发生的序列错误。
术语“检测”包括检测的任何手段，包括直接和间接检测。
“升高的表达”或“升高的水平”指相对于对照(如没有患有自身免疫疾病，例如IBD的个体或多个个体)，或相对于预先确定的阈值或截止值，或相对于患者和/或受试者的群体的中值，患者中mRNA或蛋白质的增加的表达。
“低表达”或“低表达水平”指相对于对照，如没有患有自身免疫疾病，例如IBD的个体或多个个体，或相对于预先确定的阈值或截止值，或相对于患者和/或受试者的群体的中值，患者中mRNA或蛋白质的降低的表达。
术语“多重PCR”指在从单一来源(例如，患者)获得的核酸上，使用用于在单次反应中扩增两条或多条DNA序列的目的的多于一个引物组进行的单次PCR反应。
如本文所用的术语“生物标志物”指患者表型的指示物，例如病理状态或对治疗剂的可能应答性，其可以在患者的生物样品中检测。生物标志物包括，但不限于DNA、RNA、蛋白质、糖类或基于糖脂的分子标志物。
术语“诊断”在本文中用于指鉴定或分类分子或病理状态、疾病或状况。例如，“诊断”可以指鉴定IBD的特定类型，例如UC或克罗恩病。“诊断”还可以指例如通过组织病理学标准或通过分子特征(例如，通过表达一个特定基因或所述基因编码的蛋白质或其组合表征的亚型)分类IBD的特定亚型。
术语“辅助诊断”在本文中用于指在症状或状况的特定类型的存在或性质方面帮助进行临床决定的方法。例如，辅助诊断IBD的方法可以包括在来自个体的生物样品中测量某些基因的表达。
术语“预后”在本文中用于指预测自身免疫疾病(如IBD)的可归因于自身免疫病症的疾病症状的可能性。
术语“预测”在本文中用于指患者有利地或不利地应答药物(治疗剂)或药物组或治疗方案的可能性。在一个实施方案中，预测涉及那些应答的程度。在一个实施方案中，预测涉及患者在治疗(例如利用特定治疗剂治疗)后是否将存活或改善，和/或存活或改善的可能性，或疾病不复发特定时间的可能性。本发明的预测方法可以在临床上使用，以通过为任何特定患者选择最适当的治疗方式进行治疗判定。本发明的预测方法在预测患者是否可能有利地应答治疗方案(如给出的治疗方案，包括例如施用给出的治疗剂或组合、外科手术、类固醇治疗等)中是有价值的工具，或治疗方案后患者的长期存活或缓解或持续缓解是否可能中是有价值的工具。
“对照受试者”指健康的受试者，其未被诊断为患有特定疾病，例如IBD，并且其没有患有与该疾病相关的任何征兆或症状。
“相关(correlate)”或“相关(correlating)”表示以任何方式比较第一个分析或方案的表现和/或结果与第二个分析或方案的表现和/或结 果。例如，在进行第二个方案中可以使用第一个分析或方案的结果和/或可以使用第一个分析或方案的结果以决定是否应该进行第二个分析或方案。对于基因表达分析或方案的实施方案，可以使用基因表达分析或方案的结果以决定是否应该进行特殊的治疗方案。
如本文所用的术语“比较”指比较来自个体或患者的样品中生物标志物的水平与在该说明书中其他地方详细说明的生物标志物的参考水平。应该理解，如本文所用的比较一般指比较相应的参数或值，例如绝对量与绝对参考量比较，而浓度与参考浓度比较或从样品中生物标志物获得的强度信号与从参考样品获得的相同类型的强度信号比较。可以手动或计算机辅助进行比较。因此，可以通过计算装置(例如，本文公开的系统的计算装置)进行比较。来自个体或患者的样品中生物标志物的测量或检测水平的值例如可以与参考水平彼此进行比较并且可以通过执行用于比较的算法的计算机程序自动进行所述比较。进行所述评估的计算机程序将提供合适输出格式的想要的评估。对于计算机辅助的比较，测定量的值可以与对应于通过计算机程序在数据库中储存的合适参考的值比较。计算机程序可以进一步评估比较结果，即自动提供合适输出格式的想要的评估。对于计算机辅助的比较，测定量的值可以与对应于通过计算机程序在数据库中储存的合适参考的值比较。计算机程序可以进一步评估比较结果，即自动提供合适输出格式的想要的评估。
如本文所用的短语“推荐治疗”指使用相对于患者样品中整联蛋白β7mRNA或蛋白质、整联蛋白αE mRNA或蛋白质，或CD3εmRNA或蛋白质的水平或存在产生的信息或数据来鉴定患者适合利用疗法进行治疗或不适合进行治疗。在一些实施方案中，所述疗法可以包含整联蛋白β7拮抗剂，包括抗整联蛋白β7抗体，如etrolizumab。在一些实施方案中，短语“推荐治疗/疗法”包括鉴定需要调整所施用的整联蛋白β7拮抗剂的有效量的患者。在一些实施方案中，推荐治疗包括推荐调整所施用的整联蛋白β7拮抗剂的量。如本文所用的短语“推荐治疗”还指使用为提出或选择包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法产生的信息或数据，用于被鉴定 或选择为更可能或更不可能应答包含整联蛋白β7拮抗剂的疗法的患者。所使用或产生的信息或数据可以是书写的、口述的或电子的任何形式。在一些实施方案中，使用所产生的信息或数据包括交流、呈现、报告、分选、传送、转移、供应、传递、调剂或其组合。在一些实施方案中，通过计算装置、分析仪设备或其组合进行交流、呈现、报告、分选、传送、转移、供应、传递、调剂或其组合。在一些其他实施方案中，通过实验室或医学专家进行交流、呈现、报告、分选、传送、转移、供应、传递、调剂或其组合。在一些实施方案中，信息或数据包括整联蛋白β7mRNA或蛋白质、整联蛋白αE mRNA或蛋白质或CD3εmRNA或蛋白质的水平与参考水平的比较。在一些实施方案中，信息或数据包括整联蛋白β7mRNA或蛋白质、整联蛋白αE mRNA或蛋白质或CD3εmRNA或蛋白质在样品中存在或缺失的指示。在一些实施方案中，信息或数据包括患者适合被包含整联蛋白β7拮抗剂，包括抗整联蛋白β7抗体，如etrolizumab的疗法治疗或不适合治疗的指示。
“包装说明书”用于指通常在治疗产品或药剂的商业包装中包括的说明，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、禁忌症、与包装产品组合的其他治疗产品，和/或警告该治疗产品或药剂的用途等方面的信息。
“试剂盒”是任何制造产品(例如，包装或容器)，其包含至少一种试剂，例如用于治疗IBD，例如UC或克罗恩病的药剂，或用于特异性检测本发明的生物标志物基因或蛋白质的探针。在某些实施方案中，制造产品作为用于进行本发明方法的单元进行宣传、分配或销售。
“目标观众”是一群人或机构，如通过上市或广告对其宣传或旨在对其宣传特定药剂，尤其是特定用途、治疗或适应症，所述人或机构如个体患者、患者群体、报纸、医学文献和杂志的读者、电视或互联网观众、收音机或互联网听众、医师、制药公司等。
术语“血清样品”指从个体中获得的任何血清样品。用于从哺乳动物获得血清的方法为本领域所熟知。
术语“全血”指从个体中获得的任何全血样品。通常，全血含有所有血液成分，例如细胞组分和血浆。用于从哺乳动物获得全血的方法为本领域所熟知。
表述“不应答”、“无应答”及其语法变体，因为其涉及受试者或患者与先前向其施用的一种或多种药剂(治疗剂)的反应，所以所述表述描述了那些受试者或患者其在施用这些药剂后不显示病症(他们正被治疗所述病症)治疗的任何或足够体征，或他们对药剂显示临床上不能接受的高度毒性，或第一次施用这些药剂后他们不维持治疗体征，用于此处上下文中的词语治疗如本文所定义的。短语“不应答”包括对那些受试者的描述，所述受试者对先前施用的药物具有抗性和/或具有耐性，并包括这样的情况，其中接受给予他或她的药剂的同时，受试者或患者已经恶化了，并且其中完成方案后12个月(例如，6个月)内受试者或患者已经恶化了，所述方案涉及他或她不再应答的药剂。对一种或多种药剂的不应答性因此包括受试者，其在先前或目前治疗后继续具有活动性疾病。例如，患者在他们不应答的药剂治疗约1到3个月，或3到6个月，或6到12个月后具有活动性疾病活性。可通过熟悉治疗正在讨论的病症的医师评估这种应答性。
为了不应答药剂目的，经历来自利用一种或多种药剂的前期或目前治疗的“临床上不可接受的高水平毒性的”受试者经历熟练临床医生认为显著的一种或多种阴性副作用或与其相关的不利事件，如例如，严重的传染、充血性心力衰竭、脱髓鞘(导致多发性硬化)、明显的超敏反应、神经病理性事件、高度的自身免疫性、癌如子宫内膜癌、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌或黑素瘤、肺结核等。
与对患有某些疾病或病症的患者具有增加的临床益处相关的或预示对特定治疗剂或治疗方案应答的生物标志物的“量”或“水平”是生物样品中可检测的水平。这些可通过本领域技术人员已知的方法测量，并还在本文中有所公开。评估的生物标志物的表达水平或量可用于测定对治疗或治疗剂的应答或预测应答。
术语“表达的水平”或“表达水平”一般可互换使用，并一般指生物样品中多核苷酸或氨基酸产品或蛋白质的量。“表达”一般指基因编码信息转换成在细胞中存在并操作的结构的过程。因此，如本文所用，基因的“表达”指转录成多核苷酸，翻译成蛋白质，或甚至指蛋白质的翻译后修饰。也应该认为转录的多核苷酸、翻译的蛋白质，或翻译后修饰的蛋白质的片段表达了，无论它们来自可变剪接产生的转录物或降解的转录物，还是来自蛋白质的翻译后加工，例如通过蛋白质水解。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)，然后翻译成蛋白质的那些基因，并也包括转录成RNA，但不翻译成蛋白质的那些基因(例如，转运和核糖体RNA)。
本文定义或另外表征了多个额外的术语。
组合物和方法
A.β7整联蛋白拮抗剂
提供通过施用β7整联蛋白拮抗剂在受试者(例如人)中治疗胃肠炎性病症的方法。潜在拮抗剂的实例包括结合免疫球蛋白与β7整联蛋白的融合物的寡核苷酸，特别是抗体，其包括但不限于多克隆抗体和单克隆抗体以及抗体片段、单链抗体、抗独特型抗体，和此类抗体或片段的嵌合或人源化形式，以及人抗体和抗体片段。或者，潜在的拮抗剂可以是密切相关的蛋白质，例如β7整联蛋白的突变形式，其识别配体但不传递任何作用，由此竞争性地抑制β7整联蛋白的作用。
另一潜在的β7整联蛋白拮抗剂是使用反义技术制备的反义RNA或DNA构建体，其中例如反义RNA或DNA分子通过与靶mRNA杂交而发挥直接阻断mRNA的翻译的作用并防止蛋白质翻译。反义技术可以用于通过三螺旋形成或反义DNA或RNA控制基因表达，两种方法均基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，编码本文的β7整联蛋白的多核苷酸序列的5'编码部分用于设计长度约10-40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。将DNA寡核苷酸设计为与参与转录的基因区域互补(三螺旋-参见Lee等,Nucl.Acids Res.,6:3073(1979)；Cooney等,Science, 241:456(1988)；Dervan等,Science,251:1360(1991))，由此防止β7整联蛋白的转录和产生。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交并阻断mRNA分子翻译成β7整联蛋白(反义-Okano,Neurochem.,56:560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press:Boca Raton,Fla.,1988)。上述寡核苷酸也可以用于向细胞中递送，以便反义RNA或DNA可以在体内表达，以抑制PRO多肽的产生。当使用反义DNA时，来自翻译起始位点，例如靶基因核苷酸序列的-10至+10位置之间的位点的寡脱氧核糖核苷酸是典型的。
其他潜在的拮抗剂包括结合活性位点的小分子、配体或结合分子结合位点，由此阻断β7整联蛋白的正常生物学活性。小分子的实例包括，但不限于小肽或肽样分子，通常是可溶性肽，和合成的非肽基有机或无机化合物。
核酶是能够催化RNA的特异切割的酶RNA分子。核酶通过与互补靶RNA的序列特异性杂交，随后通过内切核苷酸切割起作用。可以通过已知技术鉴定潜在RNA靶标内的特异性核酶切割位点。对于其他细节参见例如Rossi,Current Biology,4:469-471(1994),和PCT公开号WO97/33551(1997年9月18日发表)。
用于抑制转录的三螺旋形式的核酸分子应该是单链的并且由脱氧核苷酸组成。设计这些寡核苷酸的碱基组成，以便其促进通过Hoogsteen碱基配对原则形成三螺旋，其一般需要双链体的一条链上嘌呤或嘧啶的相当大的延伸。对于其他细节，参见例如PCT公开号WO 97/33551。可以通过上文讨论的任何一种或多种筛选测定和/或通过本领域技术人员所熟知的任何其他筛选技术来鉴定这些小分子。
设计用于拮抗剂的筛选测定以鉴定与本文鉴定的基因编码的β7整联蛋白结合或复合，或另外干扰所编码的多肽与其他细胞蛋白质相互作用的化合物。此类筛选测定将包括易于高通量筛选化学文库，使得它们特别适合于鉴定小分子药物候选物的测定。
可以以多种形式进行测定，包括蛋白质-蛋白质结合测定、生物化学筛选测定、免疫测定和基于细胞的测定，其在本领域中被充分表征。
B.抗β7整联蛋白抗体
在一个实施方案中，β7整联蛋白拮抗剂是抗β7抗体。示例性抗体包括如下文所述的多克隆、单克隆、人源化、人、双特异性和异源缀合抗体等。
1.多克隆抗体
可以通过多次皮下(SC)或腹膜内(IP)注射相关抗原和佐剂在动物中产生多克隆抗体。其可以用于使用双功能或衍生剂，例如马来酰亚胺苯甲酰硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烷基基团)将相关抗原与在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合。
通过组合例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂，并在多个部位皮内注射该溶液以针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物来免疫动物。一个月后，利用1/5-1/10的最初量的弗氏完全佐剂中的肽或缀合物在多个部位上皮下注射来加强免疫动物。7-14天后，给动物放血，并测定血清中的抗体效价。加强免疫动物直到该效价达到平台。在某些实施方案中，利用相同抗原但是缀合到不同蛋白质上和/或通过不同交联剂缀合的缀合物来加强免疫动物。缀合物也可在重组细胞培养物中制备为蛋白质融合物。同样，凝集剂(如明矾)适合用于增强免疫应答。
2.单克隆抗体
可以使用Kohler等,Nature,256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法，或通过重组DNA方法(参见例如，美国专利号4,816,567)制备单克隆抗体。
在杂交瘤方法中，如上文所述免疫小鼠或其他合适的宿主动物(如仓鼠)，以诱导淋巴细胞，其产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体。或者，可在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将其与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986))。
在合适培养基中接种并培养因此制备的杂交瘤细胞，所述培养基含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也称为融合配偶体)的生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的选择性培养基通常包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，所述物质阻止缺乏HGPRT的细胞的生长。
在某些实施方案中，融合配偶体骨髓瘤细胞是有效融合、支持通过所选抗体产生细胞稳定高水平产生抗体，并对针对未融合的亲本细胞进行选择的选择性培养基敏感的那些。在某些实施方案中，骨髓瘤细胞系是鼠类骨髓瘤系，如来自Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA可获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，和从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,Va.,USA)获得的SP-2和衍生物，例如X63-Ag8-653细胞。也已经描述了人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系，用于产生人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；和Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。
测定其中生长杂交瘤细胞的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。在某些实施方案中，通过免疫沉淀或通过体外结合测定(如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
例如可通过Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析测定单克隆抗体的结合亲和力。鉴定产生具有想要的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释方法亚克隆所述克隆并通过标准方法进行培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,第59-103页(Academic Press,1986))。用于该目的的合适培养基包括例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可以例如通过向小鼠中腹膜内注射细胞，杂交瘤细胞作为动物中的腹水肿瘤在体内生长。通过常规抗体纯化方法，如例如，亲和力色谱(例如，使用A蛋白或蛋白G-琼脂糖)或离子交换色谱、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析等从培养基、腹水或血清中适当分离通过亚克隆分泌的单克隆抗体。
使用常规方法(例如通过使用寡核苷酸探针，其能够特异性结合编码鼠类抗体重链和轻链的基因)容易地分离并测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞充当该DNA的来源。一旦得到分离，将DNA置于表达载体中，其然后转移到宿主细胞，如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或不另外产生抗体蛋白质的骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述文章包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)和Pluckthun,Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在其他实施方案中，可从使用McCafferty等,Nature,348:552-554(1990)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.,222:581597(1991)描述了使用噬菌体文库分别分离鼠类和人类抗体。随后的出版物描述了通过链改组(Marks等,Bio/Technology,10:779-783(1992))来产生高亲和力(nM范围)的人抗体，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等,Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的常规单克隆抗体杂交瘤技术的可行备选。
例如可通过用人重链和轻链恒定域(CH和CL)序列替换同源鼠类序列(美国专利号4,816,567；和Morrison,等,Proc.Natl Acad.Sci.USA,81:6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的全部或部分编码序列融合来修饰编码抗体的DNA，以产生嵌合或融合抗体多肽。这些非免疫球蛋白多肽序列可以替换抗体的恒定域，或它们替换抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合的二价抗体，其包含对抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
示例性抗β7抗体是Fib504、Fib 21、22、27、30(Tidswell,M.J Immunol.1997Aug 1；159(3):1497-505)或其人源化衍生物。在美国专利公开号20060093601(授权为美国专利号7,528,236)中详细公开了Fib504的人源化抗体，所述内容以其整体通过参考并入(还参见下文的讨论)。
3.人和人源化抗体
本发明的抗β7整联蛋白抗体可以进一步包含人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠类)抗体的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合亚序列)，其含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人种类(供体抗体)，如具有想要的特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基被相应的非人残基替换。人源化抗体还可以包含即不在受体抗体又不在输入CDR或构架序列中发现的残基。一般而言，人源化抗体将包含至少一个，通常两个可变域的基本上整个，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体任选地还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区[Jones等,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)]。
用于人源化非人抗体的方法为本领域所熟知。一般地，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或更多氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变域。可基本根据Winter及其同事[Jones等,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988)]的方法，通过将啮齿类CDR或CDR序列替换人抗体的相应序列来进行人源化。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整人可变域已经被非人物种的相应序列替换。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基替换。选择待用于制备人源化抗体中的人轻链和重链可变域对抗体旨在用于人治疗用途时降低抗原性和HAMA应答(人抗小鼠抗体)非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变域序列的整个文库筛选啮齿类抗体可变域的序列。鉴定与啮齿类序列最接近的人V结构域序列并且其中接受用于人源化抗体的人构架区(FR)(Sims等,J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia等,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。另一方法使用特定的构架区，其来自轻链或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列。相同的构架可用于若干不同的人源化抗体(Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等,J.Immunol.151:2623(1993))。更重要的是，抗体被人源化，以对抗原保持高的亲和力和其他有利的生物学性质。为了实现该目标，根据某些实施方案，通过分析亲本序列和多种概念上的人源化产物的过程，使用亲本和人源化序列的三维模型制备人源化抗体。通常可获得三维免疫球蛋白模型，并且其为本领域技术人员所熟悉。可获得计算机程序，其阐明并展示所选的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选择并组合FR残基，以便实现想要的抗体特征，如对靶抗原提高的亲和力。一般而言，高变区残基直接并最实质地参与影响抗原结合。
设想多种形式的人源化抗β7整联蛋白抗体。例如，人源化抗体可以是抗体片段，如Fab，其任选地与一种或多种细胞毒素剂缀合，以产生免疫缀合物。或者，人源化抗体可以是完整抗体，如完整IgG1抗体。
示例性人源化抗β7抗体包括，但不限于rhuMAbβ7，其是针对整联蛋白亚基β7的人源化单克隆抗体并且来源于大鼠抗小鼠/人单克隆抗体FIB504(Andrew等,1994J Immunol 1994；153:3847-61)。其已经被设计以包括人免疫球蛋白IgG1重链和κ1轻链构架并且通过中国仓鼠卵巢细胞产生。该抗体结合两个整联蛋白，α4β7(Holzmann等1989Cell,1989；56:37-46；Hu等,1992,Proc Natl Acad Sci USA 1992；89:8254-8)和αEβ7(Cepek等,1993J Immunol 1993；150:3459-70)，其在胃肠道中调节淋巴细胞亚群的运输和滞留并且参与炎性肠病(IBD)，如溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。rhuMAbβ7是α4β7与其配体(粘膜地址素细胞粘着分子1[MAdCAM]-1、血管细胞粘着分子[VCAM]-1和纤连蛋白)之间的细胞相互作用以及αEβ7与其配体(E-钙粘蛋白)之间的相互作用的有效体外封闭剂。rhuMAbβ7以类似的高亲和力可逆地结合来自兔、短尾猴和人的淋巴细胞上的β7。其还以高亲和力结合小鼠β7。例如在美国专利申请公开号20060093601(授权为美国专利号7,528,236)中详细公开了rhuMAbβ7的氨基酸序列以及制备和使用及其变体，所述内容以其整体并入。
图1A和1B描述了以下的可变轻链和重链的序列比对：轻链人亚组kappa I共有序列(图1A，SEQ ID NO:12)，重链人亚组III共有序列(图1B，SEQ ID NO:13)，大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变轻链(图1A，SEQ ID NO:10)，大鼠抗小鼠β7抗体(Fib504)可变重链(图1B，SEQ ID NO:11)，和人源化抗体变体：人源化hu504K移植物可变轻链(图1A，SEQ ID NO:14)，人源化hu504K移植可变重链(图1B，SEQ ID NO:15)，变体hu504-5、hu504-16和hu504-32(来自人源化hu504K移植的氨基酸变异示于图1A(轻链)(以出现顺序 分别是SEQ ID NOS:22-24)中和图1B(重链)，用于变体hu504-5、hu504-16和504-32(SEQ ID NO:25)。
4.人抗体
作为人源化的备选，可产生人抗体。例如，目前可以产生转基因动物(例如，小鼠)，其在免疫后能够在缺少内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的所有组成成分。例如，已经描述了嵌合和种系突变体小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到该种系突变体小鼠中将导致在抗原攻击后产生人抗体。参见，例如，Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等,Year in Immuno.7:33(1993)；美国专利号5,545,806、5,569,825、5,591,669(全部是GenPharm)；美国专利号5,545,807；和WO 97/17852。
或者，噬菌体展示技术(McCafferty等,Nature 348:552-553[1990])可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因的所有组成成分中产生人抗体和抗体片段。根据该技术，抗体V结构域基因框内克隆到丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或较小外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能抗体片段。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体功能性质的选择也导致选择编码显示那些性质的抗体的基因。因此，噬菌体模拟B细胞的一些性质。以多种方式进行噬菌体展示，其综述于例如，Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)中。V基因区段的若干来源可用于噬菌体展示。Clackson等,Nature,352:624-628(1991)从来自免疫小鼠脾的V基因的小的随机组合文库中分离不同阵列的抗噁唑酮抗体。可构建未免疫人供体V基因的所有组成成分，并根据Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991),或Griffith等,EMBO J.12:725-734(1993)描述的技术基本分离针对不同阵列的抗原(包括自体抗原)的抗体。还参见美国专利号5,565,332和5,573,905。
如上讨论，也可通过体外激活的B细胞产生人抗体(参见美国专利号5,567,610和5,229,275)。
5.抗体片段
在某些环境中，使用抗体片段，而非全长抗体是有优势的。片段较小的大小允许快速的清除，并可导致改善的进入实体瘤。
已经开发了多种技术用于产生抗体片段。通常，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化得到(参见例如，Morimoto等,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan等,Science,229:81(1985))。然而，现在可通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可从上文讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，从大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段，并经化学偶联形成F(ab')2片段(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一方法，可直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab')2片段。用于产生抗体片段的其他技术对技术人员而言是显而易见的。在其他实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458。抗体片段也可以是“线性抗体”，例如在美国专利号5,641,870中描述的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
6.双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可结合如本文所述的β7整联蛋白的两个不同表位。其他此类抗体可以组合TAT结合位点与另一蛋白质的结合位点。或者，抗β7整联蛋白臂可以与结合白细胞上的触发分子，如T细胞受体分子(例如CD3)，或用于IgG的Fc受体(Fc.γ.R)，如Fc.γRI(CD64)、Fc.γRII(CD32)和Fc.γ.RIII(CD16)的臂组合，以便聚焦和定位TAT表达细胞的细胞防御机制。双特异性抗体还可以用于将细胞毒素剂定位到表达TAT的细胞中。这些抗体具有TAT结合臂和结合细胞毒素剂(例如，皂草素、抗干扰素α、长春花生物碱、篦麻毒素A链、氨甲喋呤或放射性同位素 半抗原)的臂。双特异性抗体可制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)。
用于制备双特异性抗体的方法为本领域所知。全长双特异性抗体的常规制备基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等,Nature 305:537-539(1983))。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机组合，这些杂交瘤(细胞杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混和物，其中仅一个具有正确的双特异性结构。一般通过亲和层析步骤完成正确分子的纯化是非常繁琐的，并且产物产量低。在WO 93/08829和Traunecker等,EMBO J.10:3655-3659(1991)中公开了类似的方法。
根据不同的方法，具有想要的结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变域融合到免疫球蛋白恒定域序列上。在某些实施方案中，融合是与Ig重链恒定域，其包含至少部分铰链、CH2和CH3区。在某些实施方案中，含有轻链键合必需的位点的第一个重链恒定区(CH1)存在于至少一个融合物上。编码免疫球蛋白重链融合物和免疫球蛋白轻链(如果需要)的DNA插入到分开的表达载体上，并共转染到合适的宿主生物中。当在构建中使用不等比例的三条多肽链时，这在实施方案中调整三个多肽片段的相互比例中提供极大的灵活性，提供了想要的双特异性抗体的最佳产量。然而，当等比例的至少两条多肽链表达导致高产量或当比例对想要的链组合产量没有显著影响时，可以将两条或所有三条多肽链的编码序列插入到单个表达载体中。
在某些实施方案中，双特异抗体由在一条臂中具有第一种结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)组成。发现该不对称结构促进想要的双特异性化合物从不想要的免疫球蛋白链组合中分离，因为仅一半双特异性分子中免疫球蛋白轻链的存在提供容易的分离方式。在WO 94/04690中公开了该方法。对于产生双特异性抗体的其他详细信息，参阅例如Suresh等,Methods in Enzymology 121:210(1986)。
根据美国专利号5,731,168中描述的另一方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比达到最大。在某些实施方案中，界面包含至少部分CH3结构域。在该方法中，来自第一个抗体分子的界面的一条或多条小氨基酸侧链被更大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代。通过用更小的氨基酸链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替代大氨基酸侧链来在第二个抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的互补“腔”。这为相对于其他不想要的终产物(如同源二聚体)提高异源二聚体的产量提供了机制。
双特异性抗体包括交联的或“异源缀合物”抗体。例如，异源缀合物中的抗体之一可偶联抗生物素蛋白，另一个偶联生物素。例如已经提议此类抗体将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利号4,676,980)，并用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法制备异源缀合物抗体。合适的交联剂为本领域所熟知，并与许多交联技术一起公开于美国专利号4,676,980中。
已经在文献中描述了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接制备双特异性抗体。Brennan等,Science 229:81(1985)描述了这样的方法，其中将完整抗体经蛋白水解切割产生F(ab').sub.2片段。在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠下将这些片段还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间形成二硫键。所产生的Fab'片段然后转化成硫代亚硝基苯甲酸盐(thionitrobenzoate(TNB))衍生物：Fab'-TNB衍生物之一然后通过巯乙胺还原转化成Fab'-硫醇并与等摩尔量的其他Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作选择性固定化酶的试剂。
近期的进展已经促进了从大肠杆菌中直接回收Fab'-SH片段，其可以经化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.175:217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体F(ab')2的产生。每个Fab'片段分别从大肠杆菌中分泌并在体外进行直接化学偶联以形成双特异性抗体。因此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常的 人T细胞，以及触发人细胞毒素淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶标的裂解活性。还已经描述了用于从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已经使用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。来自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接两个不同抗体的Fab'部分。抗体同源二聚体在铰链区进行还原，形成单体，然后被重新氧化，形成抗体异源二聚体。也可利用该方法产生抗体同源二聚体。Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术已经为制备双特异性抗体片段提供了备选机制。片段包含通过接头连接V.sub.L的V.sub.H，所述接头太短以至于在同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段的V.sub.H和V.sub.L结构域与另一个片段的互补V.sub.H和V.sub.L结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。也已经报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一策略。参见Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994)。
设想多于二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。
7.异源缀合物抗体
异源缀合物抗体也在本发明的范围内。异源缀合物抗体包含两个共价连接的抗体。例如已经提议此类抗体将免疫系统细胞靶向不想要的细胞[美国专利号4,676,980]，并用于治疗HIV感染[WO 91/00360、WO92/200373；EP 03089]。设想可以使用合成蛋白质化学中的已知方法，包括涉及交联剂的那些方法在体外制备抗体。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的合适的试剂的实例包括iminothiolate和甲基-4-mercaptobutyrimidate和例如在美国专利号4,676,980中公开的那些。
8.多价抗体
多价抗体可以比双价抗体被表达抗体结合的抗原的细胞更快速地纳入(和/或分解代谢)。本发明的抗体可以是具有三个或多个抗原结合位 点的多价抗体(其为除IGM种类以外的，例如四价抗体)，其可以通过重组表达编码抗体多肽链的核酸容易地产生。多价抗体可以包含二聚化结构域和三个或多个抗原结合位点。在某些实施方案中，二聚化结构域包含Fc区或铰链区或由其组成。在该情景中，抗体将包含Fc区和Fc区氨基末端的三个或多个抗原结合位点。在某些实施方案中，本文的多价抗体包含三个至约八个，但通常是四个抗原结合位点或由其组成。多价抗体包含至少一条多肽链(通常两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变域。例如，多肽链可以包含VD1-(X1).sub.n-VD2-(X2).sub.n-Fc，其中VD1是第一个可变域，VD2是第二个可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，并且n是0或1。例如，多肽链可以包含：VH-CH1-可变接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体可以进一步包含至少两条(通常四条)轻链可变域多肽。本文的多价抗体可以例如包含约两条至约八条轻链可变域多肽。本文设想的轻链可变域多肽包含轻链可变域和任选地，进一步包含CL结构域。
9.效应子功能改造
期望修饰本发明的抗体其效应子功能，例如以增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。或者或额外地，可在Fc区引入半胱氨酸残基，由此允许在该区域中形成链间二硫键。因此产生的同源二聚体抗体可能具有提高的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等,J.Exp Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。也可使用如Wolff等,Cancer Research53:2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂制备具有提高的抗肿瘤活性的同源二聚体抗体。或者，可改造抗体，其具有二元Fc区并由此具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson等,Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)。为了增加抗体的血清半衰期，可以将补救受体 结合表位掺入到如美国专利号5,739,277中描述的抗体(尤其是抗体片段)中。如本文所用，术语“补救受体结合表位”指负责增加IgG分子的体内血清半衰期的IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位。
10.免疫缀合物
用于本文方法中的拮抗剂或抗体任选地与另一试剂，如细胞毒素剂或细胞因子缀合。
通常通过共价连接实现缀合，其精确性质将通过整联蛋白β7拮抗剂或抗体多肽上的靶向分子和连接位点来决定。通常，通过加入接头来修饰非肽试剂，允许通过其氨基酸侧链、糖链或通过化学修饰在抗体上引入的反应基团缀合到抗β7整联蛋白抗体上。例如，药物可以通过赖氨酸残基的ε氨基基团，通过游离的α氨基基团，通过与半胱氨酸残基的二硫化物交换，或通过高碘酸对糖链中1,2-二元醇的氧化附着，以允许通过Schiff-碱基连接附着含有多种亲核物质的药物。参见例如美国专利号4,256,833。蛋白质修饰剂包括胺反应试剂(例如，反应酯类、异硫氰酸酯、醛，和磺酰卤)、巯基反应试剂(例如，haloacetyl衍生物和马来酰亚胺)，和羧酸以及醛反应试剂。整联蛋白β7拮抗剂或抗体多肽可以通过使用双功能交联剂共价结合肽试剂。异源双功能试剂更常使用并允许通过使用两个不同的反应部分(例如，胺反应加硫醇、碘乙酰胺或马来酰亚胺)来可控偶联两个不同的蛋白质。此类连接剂的用途为本领域所熟知。参见例如Brinkley,上文和美国专利号4,671,958。还可以使用肽接头。或者，抗β7整联蛋白抗体多肽可以通过制备融合多肽连接肽部分。
其他双功能蛋白质偶联剂的实例包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-maleiimidomethyl)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二甲基己二酰亚胺盐酸)、活性酯类(如双丁二酰亚胺基辛二酸盐)、醛类(如戊二醛(glutareldehyde))、双叠氮组分(如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(如双(对-重氮苯甲酰基)-乙 烯二胺)、二异氰酸酯(如tolyene 2,6-二异氰酸酯)，和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
11.免疫脂质体
本文公开的抗β7整联蛋白抗体还可以配制成免疫脂质体。“脂质体”是由多种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，其用于向哺乳动物递送药物。脂质体的组分经常排列成双层结构，与生物膜的脂质排列类似。含有抗体的脂质体通过本领域已知的方法，如描述于Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688(1985)；Hwang等,Proc.Natl Acad.Sci.USA 77:4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；和1997年10月23日公布的WO97/38731中的方法制备。在美国专利号5,013,556中公开了具有增加的循环时间的脂质体。
可以通过反相蒸发方法，利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生特别有用的脂质体。通过确定孔径的过滤器挤出脂质体，以产生具有想要的直径的脂质体。
本发明抗体的Fab'片段可以通过二硫键交换反应缀合到如Martin等,J.Biol.Chem.257:286-288(1982)中描述的脂质体上。脂质体中任选地含有化学治疗剂。参见Gabizon等,J.National Cancer Inst.81(19):1484(1989)。
12.载体、宿主细胞和用于抗体产生的重组方法
还提供编码本文所述抗β7抗体或多肽试剂的分离核酸、包含所述核酸的载体和宿主细胞以及用于产生抗体的重组技术。
为了重组产生抗体，可以分离编码其的核酸并将其插入到可复制载体中用于进一步的克隆(扩增DNA)或表达。在另一实施方案中，可以通过同源重组，例如如美国专利号5,204,244中所述产生抗体，通过参考明确并入本文。使用常规方法(例如通过使用寡核苷酸探针，其能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因)容易地分离并测序编码单克隆抗体的DNA。许多载体是可用的。载体组分一般包括，但不限于以下的一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标志物基因、增强子元件、 启动子，和转录终止序列(例如，在1996年7月9日授权的美国专利号5,534,615中描述的，其通过参考明确并入本文)。
用于克隆或表达本文载体中的DNA的合适的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核生物细胞。用于该目的的合适的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)，例如Serratia marcescans，和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，在1989年4月12日公布的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。一个示例性大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其他菌株，如大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些实例是说明性的而非限制性的。
除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码抗β7整联蛋白抗体的载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种和菌株是本文通常可获得并且有用的，如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆弱克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、K.wickeramii(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、K.drosophilarum(ATCC 36,906)、K.thermotolerans和K.marxianus；耶罗威亚酵母(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia) (EP 244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，例如，链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、Tolypocladium和曲霉(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于糖基化抗β7抗体表达的合适宿主细胞来自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经从宿主，如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)，和家蚕(Bombyx mori)中鉴定了许多杆状病毒菌株和变体，以及相应的适合昆虫宿主细胞。可公开获得用于转染的多种病毒菌株，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5菌株，并且此类病毒可用作本文本发明的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、番茄和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。
然而，最大的兴趣在于脊椎动物细胞，并且在培养(组织培养)中繁殖脊椎动物细胞已经成为了常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是SV40转化的猴肾CVl系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚肾系(亚克隆用于在悬浮培养中生长的293或293细胞，Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳房肿瘤 (MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌系(Hep G2)。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞用于抗β7整联蛋白抗体产生，并且在适当时改良的常规营养培养基中进行培养用于诱导启动子、选择转化体，或扩增编码想要的序列的基因。
可在多种培养基中培养用于产生本发明使用的抗β7整联蛋白抗体的宿主细胞。市售培养基，如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM),(Sigma),RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco's改良的Eagle培养基((DMEM),Sigma)适合于培养宿主细胞。此外，在Ham等,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes等,Anal.Biochem.102:255(1980),美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利号Re.30,985中描述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。必要时可以用激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCIN.TM.药物)、微量元素(定义为一般以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等同能源补充任何这些培养基。还可包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其他必需补充物。培养条件，如温度、pH等是被选择用于表达的宿主细胞先前使用的那些条件，并且对于普通技术人员而言将是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体可以在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果在细胞内产生抗体，那么作为第一步，例如通过离心或超滤移出颗粒碎片(宿主细胞或裂解的片段)。Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了用于分离分泌到大肠杆菌的周质空间中的抗体的方法。简言之，在存在醋酸钠(pH 3.5),EDTA和苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的情况融化细胞沉淀超过约30分钟。通过离心去除细胞碎片。当抗体分泌到培养基中时，一般首先使用商品化的蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤设备浓缩来自该表达 系统的上清液。可以在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂，如PMSF，以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素，以防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来制备抗体组合物，其中亲和层析是典型的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的可适性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γl、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。为所有小鼠同种型和人γ3推荐蛋白G(Guss等,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体附着的基质最经常是琼脂糖，但其他基质也是可用的。与使用琼脂糖可实现的相比，机械稳定的基质如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许更快的流速和更短的处理时间。其中抗体包含C.sub.H3结构域时，Bakerbond ABX.TM.树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)用于纯化。根据待回收的抗体，也可获得用于蛋白质纯化的其他技术，如在离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的层析、肝素SEPHAROSE.TM.上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE，和硫酸铵沉淀。任何初步纯化步骤之后，包含目的抗体和污染物的混合物可以使用pH在约2.5-4.5的洗脱缓冲液进行低pH疏水相互作用层析，尤其在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。
C.药物制剂
通过将具有想要程度的纯度的抗体与任意生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备包含本发明的治疗剂、拮抗剂或抗体的治疗制剂用于储存(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版,Osol,A.编辑(1980))，其是水溶液、冻干或其他干燥的制剂形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度上对受试者是无毒的，并且包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸酯如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和 m-甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖，和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖，或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的平衡离子如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质金属复合物)；和/或非离子型表面活性剂如TWEEN.TM.,PLURONICS.TM.或聚乙二醇(PEG)。
本文的制剂还含有多于一种必要时用于所治疗的特定适应症的活性化合物，通常是具有不彼此负面影响的互补活性的那些成分。此类分子以对预期目的有效的量组合适当存在。
活性成分还可以包裹在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳颗粒和纳胶囊)或大乳剂中的羟基甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。在Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编辑(1980)中公开了此类技术。
待用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过无菌滤膜过滤容易地实现。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明的免疫球蛋白的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质是成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇)、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非降解的乙烯-醋酸乙烯、可降解的乳酸-羟乙酸(glycolic acid)共聚物，如LUPRON DEPOT.TM.(由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微球体)和聚-D-(-)-3-羟丁酸)。尽管聚合物，如乙烯-醋酸乙烯和乳酸-羟乙酸使得能够释放分子超过100天，但是某些水凝胶释放蛋白质较短的时间。当包裹的免疫球蛋白长时间保留在体内时，它们可能因为暴露于37℃的湿度下变性或聚集，导致生物活性丧失和免疫原性的 可能改变。可以根据涉及的机理为稳定设计合理的策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫-二硫互换的分子间S--S键形成，那么可以通过修饰巯基残基，从酸性溶液冻干，控制湿度，使用适当的添加剂，并开发特殊的聚合物基质组合物来实现稳定。
D.施用
施用治疗的医师将能够为单个受试者确定适当剂量用于基于体重给药或用于平给药，将遵循标签上的说明。用于市售第二种治疗化合物和其他化合物与整联蛋白β7拮抗剂组合施用的制备和给药方案可以根据制造商的说明书使用或由技术人员根据经验来确定。
对于疾病的预防或治疗，整联蛋白β7拮抗剂和任何第二种治疗化合物或与非耗尽抗体组合施用的其他化合物的适当剂量将取决于待治疗的胃肠炎性病症的类型，例如IBD、UC、CD、疾病的严重性和病程、整联蛋白β7拮抗剂或组合是为预防目的施用还是治疗目的施用、先前的疗法、患者的临床史和对整联蛋白β7拮抗剂或组合的应答，和主治医师的判断。整联蛋白β7拮抗剂或组合适当地向患者一次施用或更通常在一系列治疗中施用。在某些实施方案中，整联蛋白β7拮抗剂每周施用一次，或每两周施用一次，或每四周施用一次，或每六周施用一次，或每八周施用一次，共施用一个月(4周)、或两个月、三个月、或六个月、或12个月、或18个月、或24个月或在患者生命中长期施用。在某些实施方案中，治疗由患者自我施用。
根据疾病的类型和严重性，约0.5mg/kg-4.0mg/kg的抗β7抗体是用于向患者施用的初始备选剂量，例如无论是通过一次或多次单独施用，或通过连续输注。对于若干天或更长时间内的重复施用，根据条件，治疗持续直至出现想要的疾病症状抑制。然而，其他剂量方案可以是有用的。
例如，在某些实施方案中，向患者施用平剂量的抗β7抗体。平剂量是向每个患者施用的抗β7抗体的特定量而不管患者的体重如何。根据疾病的类型和严重性，向患者施用约50mg-450mg的抗β7抗体的平剂量， 其可以是一次或多次单独注射或输注或施用。该平剂量可以静脉内或皮下或通过本文所述的其他途径施用。在某些实施方案中，平剂量是50mg、或100mg、或150mg、或200mg、或300mg、或400mg、或420mg、或450mg。
在某些实施方案中，初始平负荷剂量的抗β7抗体随后是一次或多次平维持剂量的抗β7抗体。负荷剂量是比维持剂量更大量的抗β7抗体。在某些实施方案中，负荷剂量在约400mg-450mg之间并且维持剂量在约50mg-350mg之间。在某些实施方案中，负荷剂量是400mg、或420mg、或430mg、或450mg。在某些实施方案中，维持剂量是50mg、或100mg、或150mg、或200mg、或300mg、或350mg。
通常，临床医师将施用本发明的抗体(单独或与第二种化合物组合)直至达到提供所需生物效应的剂量。通过常规技术和测定容易地监测本发明的疗法的过程。
整联蛋白β7拮抗剂可以通过任何合适的方法施用，包括肠胃外、局部、静脉内、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和/或损伤内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。也设想鞘内施用(参见例如Grillo-Lopez的美国专利公开号2002/0009444)。此外，可以通过脉冲输注例如用减少剂量的抗体合适地施用整联蛋白β7拮抗剂。在某些实施方案中，静脉内或皮下进行给药。可以使用相同的或不同的施用方法提供每一次暴露。在一个实施方案中，每一次暴露于抗β7抗体中是通过皮下施用。在一个实施方案中，第一次暴露于抗β7抗体，例如负荷剂量是通过静脉内施用并且每一次随后的暴露是通过皮下施用。
在某些实施方案中，使用例如自我注射装置、自动注射器装置或设计用于自我施用的其他装置来施用抗β7抗体。多种自我装置，包括自动注射器装置为本领域所知并是可通过商业途径获得的。示例性装置包括，但不限于预装注射器(如来自Becton Dickinson的BD HYPAKREADYFILLTM和STERIFILL SCFTM；来自Baxter的CLEARSHOTTM共聚物预装注射器；和可从West Pharmaceutical  Services获得的Daikyo Seiko CRYSTAL 预装注射器)；一次性的笔式注射装置，如来自Becton Dickinson的BD Pen；极尖的和显微针装置(如来自Becton Dickinson的INJECT-EASETM和显微输注装置；和可从Valeritas获得的H-PATCHTM)以及无针头注射装置(如可从Bioject获得的和以及可从Medtronic获得的和贴剂装置)。在某些实施方案中，rhuMAbβ7是包含预装注射器的制成品，所述预装注射器包含2ML(150mg)rhuMAbβ7。在某些实施方案中，rhuMAbβ7是包含预装注射器的制成品，所述预装注射器包含1ML(180mg)rhuMAbβ7。
如所指出，整联蛋白β7拮抗剂可以单独施用或与至少第二种治疗化合物组合施用。这些第二种治疗化合物一般以相同剂量使用并且以迄今使用的施用途径，或约1-99％迄今使用的剂量使用。如果使用该第二种化合物，它们以比如果整联蛋白β7拮抗剂不存在时低的量在某些实施方案中使用，以消除或减少由此引起的副作用。
还如所指出(例如参见下文)，用于治疗IBD，例如溃疡性结肠炎和克罗恩病的多种合适的第二种治疗化合物为本领域所知，并且同样已经描述了用于该第二种治疗化合物的剂量和施用方法。
整联蛋白β7拮抗剂和任何第二种治疗化合物的施用可以例如作为单一组合物或作为两个或多个不同组合物，使用相同或不同的施用途径同时完成。或者或额外地，可以以任何顺序依次完成施用。在某些实施方案中，在施用两个或多个组合物之间可以存在从分钟到天到星期到月的间隔。例如，可以首先施用整联蛋白β7拮抗剂，随后施用第二种治疗化合物。然而，也设想同时施用或在整联蛋白β7拮抗剂之前施用第二种治疗化合物。
用于患有活性中度-重度活性UC的受试者的护理标准涉及利用标准剂量的氨基水杨酸酯、口服皮质类固醇、6-巯基嘌呤(6-MP)和/或硫唑嘌呤的疗法。利用整联蛋白β7拮抗剂，如本文公开的抗β7整联蛋白抗体 的疗法将导致疾病缓解改善(快速控制疾病和/或延长缓解)，和/或临床应答改善，其优于利用用于此类受试者的护理标准实现的。
在一个实施方案中，本发明用于在患有IBD的人受试者中治疗炎性肠病(IBD)包括向所述受试者施用有效量的治疗剂，如抗β7整联蛋白抗体，并进一步包括向该受试者施用有效量的第二种药剂，其为免疫抑制剂、疼痛控制剂、止泻药、抗生素或其组合。
在示例性实施方案中，所述第二种药物选自氨基水杨酸酯、口服皮质类固醇、6-巯基嘌呤(6-MP)和/或硫唑嘌呤。在另一示例性实施方案中，所述第二种药物是另一种整联蛋白β7拮抗剂，如另一种抗β7整联蛋白抗体或针对细胞因子的抗体。
所有这些第二种药剂可以分别彼此组合使用或其自身与第一种药剂组合使用，以便如本文所用的表述“第二种药剂”不表示其仅是除第一种药剂以外的药剂。因此，第二种药剂不需要是一种药剂，但是可以由多于一种这样的药物组成或包含这样的药物。
本文的组合施用包括使用单独制剂或单个药物制剂的共同施用，和任何顺序的连续施用，其中一般而言存在两种(或全部)活性剂同时发挥其生物活性的时期。
第二种药剂的组合施用包括使用单独制剂或单个药物制剂的共同施用(同时施用)，和任何顺序的连续施用，其中一般而言存在两种(或全部)活性剂(药剂)同时发挥其生物活性的时期。
E.设计治疗方案
药物开发是复杂并昂贵的过程。估计将新药推向市场的费用在8亿到10亿美元之间。I期临床试验中少于10％的药物进入批准期。药物为什么在最后阶段失败的两个关键原因是缺少对剂量-浓度应答和不曾预料的安全性事件之间关系的理解。考虑到该情形，具有帮助预测药物怎样在体内表现并促进临床治疗候选物成功的可能工具是重要的(Lakshmi Kamath,Drug Discovery and Development；Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery&Development(2006))。
药物动力学(PK)表征了药物的吸收、分布、代谢和消除性质。药效动力学(PD)定义了对所施用药物的生理学和生物学应答。PK/PD模型建立了这两种过程之间的数学和理论连接并帮助更好地预测药物作用。整合的PK/PD模型和计算机辅助的通过模拟的试验设计被整合到许多药物开发程序中并且具有越来越高的影响(Lakshmi Kamath,Drug Discovery and Development；Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery&Development(2006))。
通常在药物开发过程的每个阶段进行PK/PD测试。因为开发变得越来越复杂、耗时并且成本密集，公司正在留意更好地利用PK/PD数据，以在开始时排除有缺陷的候选物并坚定具有最大临床成功可能的那些候选物。(Lakshmi Kamath,上文)。
证明PK/PD模型方法在确定生物标志物应答、药物水平和给药方案中有用。药物候选物的PK/PD谱和预测患者对其应答的能力对临床试验的成功至关重要。分子生物学技术中的近期发展和对用于多种疾病的靶标的更好理解已经证实生物标志物是药物治疗效力的良好临床指示物。生物标志物测定(包括本文描述的那些)和此类生物标志物测定的使用帮助鉴定对药物候选物的生物应答。一旦在临床上证实了生物标志物，那么可以有效地对试验模拟做模型。生物标志物具有实现代用状态的潜力，其有一天可以取代药物开发中的临床结果。(Lakshmi Kamath,上文)。
外周血，如本文所述的那些中的生物标志物的量可以用于鉴定对利用整联蛋白β7拮抗剂的治疗的生物应答并因而可以充当候选治疗的治疗效力的良好临床指示物。
药物开发中的常规PK/PD模型限定了参数，如药物剂量浓度、药物暴露效果、药物半衰期、针对时间的药物浓度，和针对时间的药物效果。当更广泛使用时，定量技术，如药物模型、疾病模型、试验模型和市场模型可以支持完整的开发过程，其通过明确的风险考虑和更好的知识利用产生更好的决定。药物开发研究人员可获得多种PK/PD模型工具，例 如Pharsight,Inc.Mountain View,California开发的WinNonlin和Knowledgebase Server(PKS)。
一般生物标志物技术
除非另有说明，本发明的实践一般采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其在本领域技术内。此类技术在以下文献中得到全面解释，如"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",第二版(Sambrook等,1989)；"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait,ed.,1984)；"Animal Cell Culture"(R.I.Freshney编辑，1987)；"Methods in Enzymology"(Academic Press,Inc.)；"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel等编辑,1987,和定期更新)；"PCR:The Polymerase Chain Reaction",(Mullis等编辑,1994)。
可以使用本领域已知的标准技术产生本发明中使用的引物、寡核苷酸和多核苷酸。
本文提供与预测IBD患者，包括患有UC或克罗恩病的患者对某些治疗剂的应答性相关的基因表达生物标志物。由基因编码的mRNA或单个蛋白质的表达水平组成了用于预测对IBD治疗剂、UC治疗剂和/或克罗恩病治疗剂的应答性的生物标志物。因此，本文公开的发明用于多种环境中，例如用于与炎性肠病诊断和治疗相关的方法和组成物中。
基因表达水平的检测
本文所述任何方法的核酸可以是从基因组DNA转录的RNA或从RNA或mRNA产生的cDNA。核酸可以来源于脊椎动物，例如哺乳动物。如果直接从该来源获得或如果其是在来源中发现的核酸的拷贝，那么称该核酸为“来源于”特定来源。
核酸包括核酸的拷贝，例如因扩增产生的拷贝。在某些情况中期望扩增，例如以获得想要量的材料用于检测变异。扩增子然后可以进行多种检测方法，如下文描述的那些，以测定某些基因的表达。
可以通过本领域技术人员所熟知的多种方法，包括使用市售试剂盒和试剂来测量和定量mRNA的水平。一种该方法是聚合酶链式反应(PCR)。用于定量用途的另一方法是实时定量PCR或qPCR。参见例如，“PCR Protocols,A Guide to Methods and Applications,”(M.A.Innis等,编辑,Academic Press,Inc.,1990)；"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel等,编辑,1987,以及期刊更新)；和"PCR:The Polymerase Chain Reaction",(Mullis等编辑,1994)。
微阵列是多路技术，其通常使用阵列系列的成千核酸探针以与例如cDNA或cRNA样品在严格杂交条件下杂交。通常通过检测荧光基团、银或化学发光标记的靶标来检测并定量探针-靶标杂交，以确定靶标中核酸序列的相对丰度。在典型的微阵列中，通过共价键合化学基质(通过环氧-甲硅烷、氨基-甲硅烷、赖氨酸、聚丙烯酰胺或其他)将探针附着到固体表面上。固体表面例如是玻璃、硅芯片或显微珠。多种微阵列是可以通过商业途径获得的，包括例如由Affymetrix,Inc.and Illumina,Inc.制造的那些。
可以使用本领域技术人员已知的某些方法获得生物样品。可以从脊椎动物，并且具体而言从哺乳动物获得生物样品。在某些情况下，生物样品是滑液组织、血清或外周血单核细胞(PBMC).通过筛选这种身体样品，可以为疾病，如溃疡性结肠炎和克罗恩病实现简单的早期诊断。此外，可以通过测试这种身体样品其靶核酸(或编码的多肽)的表达水平的变异更容易地监测疗法的进程。
在确定受试者或组织或细胞样品包含本文公开的基因表达标签或某些生物标志物的相对水平后，设想可以向受试者施用有效量的适当治疗剂以在该受试者中治疗特定疾病，例如UC或克罗恩病。可以由熟练医师在哺乳动物中进行对本文所述多种病理学状况的临床诊断。可以在本领域中获得临床诊断技术，其允许例如在哺乳动物中诊断或检测炎性肠病，例如溃疡性结肠炎和克罗恩病。
试剂盒
为了用于本文所述或建议的实施中，还提供试剂盒或制成品。此类试剂盒包含划分开以紧密限制接受一种或多种容器工具，如小瓶、管等的载体工具，所述每一种容器工具包含待用于方法中的单独成分之一。例如，容器工具之一可包含标记的或可检测标记的探针。该探针可以是对包含基因表达标签的一个或多个基因的多核苷酸特异的多核苷酸。其中试剂盒利用核酸杂交来检测靶核酸，所述试剂盒还可以具有容器(其含有用于扩增靶核酸序列的核苷酸)和/或容器(其包含报告工具，如结合报告分子(如酶、荧光或放射性同位素标记)的生物素结合蛋白质，如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)。
试剂盒通常包含上文描述的容器和一个或多个其他容器，其包含从商业化和使用者观点上所期望的物质，包括缓冲液、稀释液、过滤器、针、注射器和具有使用说明的包装插页。标记可存在于容器上，以指示组合物用于特定应用或非治疗性应用，并还指示体内或体外使用的指导，如上文描述的那些。试剂盒的其他任选组分包括一种或多种缓冲液(例如，封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)、其他试剂如通过酶标记化学改变的底物(例如色原)、表位恢复溶液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照载玻片等。
销售方法
本文的发明还包括用于销售治疗剂或其药学上可接受的组合物的方法，其包括向目标观众促销、指导和/或说明，所述试剂或其药物组合物用于治疗患有特定疾病，例如UC或克罗恩病的患者或患者群体的用途，从所述患者中已经获得的样品显示如本文公开的血清生物标志物的基因表达标记或水平。
销售一般是通过非人介质交流，其中确定赞助并控制信息。用于本文目的的销售包括公开、公共关系、产品配置、赞助、保险和推销。该术语还包括以任何打印交流介质出现的赞助信息公告，其被设计用于吸引大量观众来劝说、通知、促销、刺激或另外针对购买、支持或允许本文的本发明的有利方式的改变行为。
可以通过任何方式实现本文诊断方法的销售。用于传递这些信息的销售介质的实例包括电视、广播、电影、杂志、报纸、互联网和广告牌，包括商品化的，其是在广播介质中出现的信息。
所使用的销售类型将取决于许多因素，例如取决于待教导的目标观众的性质，例如医院、保险公司、诊所、医生、护士和患者，以及成本考虑和管理药剂和诊断的销售的相关管辖法律和法规。基于服务的相互制约和/或其他数据(如使用者人口统计和地理位置)定义的使用者特征个性化或定制销售。
认为上述书面说明书和以下的实施例足以使得本领域技术人员实践本发明。从前述的说明书和以下实施例，除了本文所示和所述的那些之外的本发明的多种修改对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且落入所附权利要求的范围内。
应理解，本发明教导的对特定问题或情形的应用基于本文包含的教导将落入本领域普通技术人员的能力内。
通过以下非限制性实施例阐明本发明的其他细节。说明书中所有引用的公开内容明确通过参考并入本文。
实施例
实施例1
II期随机双盲安慰剂对照的研究以评价rhuMAbβ7(etrolizumab)在患有中度至重度溃疡性结肠炎的患者中的效力和安全性和开放标签延长研究
临床研究描述
rhuMAbβ7(etrolizumab)描述
RhuMAbβ7(etrolizumab)是基于人IgG1亚群III VH,κ亚群-I VL共有序列的人源化单克隆抗体并且特异性针对整联蛋白异源二聚体的β亚基。参见图1A和B。已经显示其以高亲和力结合α4β7(约116pM的Kd)和αEβ7(约1800pM的Kd)。
该重组抗体具有通过IgG1抗体典型的链间和链内二硫键共价连接的两条重链(446个残基)和两条轻链(214个残基)。对于本文所述的工作，其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生。完整的非糖基化rhuMAbβ7分子的分子量是大约144kDa。rhuMAbβ7的每条重链在Asn297上具有一个保守的N连接糖基化位点。该位点上存在的寡糖通常是在CHO细胞中表达的重组抗体中观察到的那些，主要的糖链异质体(glycoforms)是缺乏唾液酸基的双触角G0和G1葡聚糖。含有两个G0葡聚糖并且没有C末端赖氨酸残基的最普遍rhuMAbβ7形式的质量是大约147kDa。
RhuMAbβ7药物产品和安慰剂由Genentech制备。它们是清澈的至稍微乳白色的，无色的至稍微黄色的水溶液。两种溶液均是旨在用于IV和SC施用的无菌的且无防腐剂的液体。
研究设计
研究描述
该II期研究是随机的双盲安慰剂对照的多中心研究，以在患有中度至重度UC的患者中评价两种rhuMAbβ7剂量水平与安慰剂相比的效力和安全性。在第10周评价主要效力终点(施用最后剂量的研究药物后两周)，在第6周评价次要效力终点。
以1:1:1比例将患者随机分组，并施用如下剂量范围：在第0、4和8周的rhuMAbβ7100mg SC(平剂量)，和第0周的420mg SC(平负荷剂量)，随后在第2、4和8周的300mg SC或匹配的安慰剂SC的。在图2中显示了研究方案。将研究分为0-35天的筛选期、10周的双盲处理期、18周的安全性随访期和17个月的进行性多灶性白质脑病(PML)随访期(随机分配后2年)。
为了获得资格，根据American College of Gastroenterology(ACG)实践指导方针，患者必须被诊断具有最少12周的UC持续时间；即，通过组织病理学报告证实的临床和内窥镜证据，具有如通过在某些情况下≥5的MCS，或在某些情况下，≥6的MCS证实的中度至重度疾病的证 据，包括≥2的内窥镜子分数；≥1的直肠出血子分数(参见表1)；和距离肛外缘最小25cm的疾病活性的内窥镜证据。在国际专利公开号.WO/2012/135589中提供了对于该研究的额外的纳入和排除标准。
表1.用于评估溃疡性结肠炎活性的Mayo临床评分系统。

a每个患者作为他或她自身的对照，以确定大便频率的异常程度。
b每日出血得分代表一天中最严重的出血。
c医生整体评估承认其他三项标准，患者每天对腹部不适的回顾和总体幸福感，以及其他观察，如体检发现和患者的表现状态。
随机分组之前，患者必须已经接受用于UC的稳定剂量的伴随药物。在第1天随机分组之前，口服5-氨基酸水杨酸(5-ASA)和免疫抑制剂(硫唑嘌呤[AZA]、6-巯基嘌呤[6-MP]，或氨甲喋呤)剂量必须保持稳定至少4周。接受局部5-ASA或皮质类固醇的患者在第1天随机分组 前必须已经终止了2周。在第1天随机分组之前，口服皮质类固醇剂量必须保持稳定至少2周。在第1天随机分组之前，接受高剂量类固醇的患者必须已经使剂量减少至≤20mg/天，共2周。对于在研究治疗期间接受口服皮质类固醇的患者，逐渐停止类固醇必须在第10周已经以每周5-mg泼尼松或泼尼松等同物的速率开始2周，然后以每周2.5mg泼尼松或泼尼松等同物的速率来终止。对于接受口服免疫抑制剂(除了口服皮质类固醇)的患者，逐渐停止免疫抑制剂在第8周必须已经开始，并且患者到第10周必须已经完全终止免疫抑制剂。先前接受抗TNF疗法的患者在随机分组之前必须终止疗法最少8周以在第1天接受研究药物。如果患者在研究过程中的任何时间经历持续的或增加的疾病活动性，可以根据研究者的临床判断增加或起始增加类固醇和或免疫抑制剂剂量形式的救援疗法。允许需要救援疗法的患者留在研究中，但是终止研究治疗，并且在数据分析过程中，划分为经历治疗失败。
评估患者以确定他们是否不能应答常规疗法，包括至少一种抗TNF试剂。如本文所用，对抗TNF试剂的应答丧失和/或不耐受和免疫抑制剂表示以下方面。对于抗TNF试剂，丧失应答和/或不耐受表示尽管利用以下中的一种或多种进行了前期治疗，但是活动性疾病的症状仍然持续：(a)英夫利昔单抗：5mg/kg IV，在6周内3次剂量，在8周评估；(b)阿达木单抗:在第0周一次160-mg SC剂量，随后在第2周一次80-mg剂量，然后在第4周和第6周40mg，在8周评估；或在前期应答(已经应答并且不丢失应答的患者选择性终止治疗并不符合)后的定期维持给药过程中反复活跃的症状；或对至少一种抗TNF抗体不耐受的历史(包括但不排除或不限于输注相关的反应或注射位点反应、感染、充血性心力衰竭、脱髓鞘)。对于免疫抑制剂试剂，丧失应答和/或不耐受表示尽管利用以下中的一种或多种进行了前期治疗，但是活动性疾病的症状仍然持续：每周硫唑嘌呤(≥1.5mg/kg)或等同剂量的6-巯基嘌呤mg/kg(≥0.75mg/kg)或氨甲喋呤,25mg SC/肌内(或如指示)，至少8周；或至少一种免疫抑制剂的不耐受历史(包括，但不排除胰腺炎、药物热、 皮疹、恶心/呕吐、肝功能检查升高、thiopurine S-甲基转移酶遗传突变、感染)。
通过利用皮质类固醇(是/否)的共同治疗、利用免疫抑制剂(是/否)的共同治疗、先前抗TNF暴露(是/否)(除了在美国随机分组的患者)和研究地点分层随机分组的研究治疗。
在筛选期(并且这被认为是基线MCS)、第6周(在第4周给药后2周)和第10周(在研究药物的最后剂量后2周)使用MCS评估UC疾病活动性。在这些相同时间点上进行的可弯曲乙状结肠镜检查过程中获得结肠的活检。在研究中也收集部分MCS。还通过使用简短的炎性肠病调查问卷(SIBDQ)和MCS(其在第1天和第6周以及第10周由患者完成)评估患者报告结果(PROs)。此外，在患者日记中收集疾病活动性、每日症状和UC的影响，以由患者从筛选期(第1天之前大约7天直至第1天)和第6周以及第10周研究访问之前至少7天直至研究访问每日完成。还获得血清和粪便样品用于生物标志物分析。在筛选期和第6、10和28周获得大便用于生物标志物的测量。被认为用于测量的示例性生物标志物包括，但不限于脂质运载蛋白、钙防卫蛋白和乳铁蛋白。在筛选期、第1天和第4、6、10、16和28周获得血清和血浆用于探索性生物标志物的测量。
该研究的主要效力终点是实现临床缓解的患者的比例，定义为到第10周时MCS绝对减少至≤2，其中无单个子分数超过1点。在下文所述的研究结果测定中列出了额外的次要终点。
结果测定
主要效力结果测定
主要效力结果测定是在第10周时的临床缓解。通过MCS≤2，其中无单个子分数超过1点来定义临床缓解(参见表1)。
次要效力结果测定
用于该研究的次要效力结果测定是(1)在第6周和第10周时的临床应答，其中通过MCS中至少3个点降低和从基线30％减少和直肠出血 子分数≥1点降低或0或1的绝对直肠出血分数来定义临床应答；(2)在第6周时的临床缓解(上文定义)；和(3)在第6周和第10周时用于内窥镜得分的指示物和直肠出血得分0。
探索性结果测定
用于该研究的探索性结果测定是实现应答或缓解的患者中UC爆发(flare)的时间。对于该结果测定，爆发定义为部分MCS中2个点增加伴随3天连续直肠出血和可弯曲乙状结肠镜检查内窥镜得分为2。
安全性结果测定
使用以下量度评估rhuMAbβ7的安全性和耐受性：(1)根据National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events(NCI CTCAE)版本4.0分级的不利事件和严重不利事件的发生率；(2)生命体征和安全性实验室量度的临床显著改变；(3)由于不利事件的终止；(4)注射位点反应和超敏性的发生率和性质；(5)感染并发症的发生率；和(6)如通过ATA的发生率测定的免疫原性。
药物代谢动力学结果测定
药物代谢动力学结果测定包括以下：(1)第一次和最终剂量后的Cmax；(2)第一次和最终剂量后达到最大浓度的时间(Tmax)；(3)最终剂量后给药间隔内血清浓度-时间曲线下的面积(AUC)；(4)从时间0到最后可检测观察(AUClast)或到无穷大(AUCinf)的AUC；(5)表观清除率(CL/F)；(6)表观分布容积(V/F)；和(7)排除半衰期(t1/2)。
实施例2-预测性生物标志物研究和分析
选择预测性生物标志物整联蛋白β7和CD3ε用于在利用etrolizumab治疗的患者中强化效力的原理
如上所讨论，etrolizumab结合β7整联蛋白并阻断结合MAdCAM1，其在粘膜内皮细胞上表达。表达β7整联蛋白的淋巴细胞与MAdCAM1的结合在细胞迁移到小肠、大肠的淋巴滤泡和肠系膜淋巴结中起重要作用。我们假设因为认为消化道归巢淋巴细胞通过α4β7:MAdCAM相互作 用的增加迁移驱动UC中持续不断的炎症，具有该淋巴细胞增加的消化道归巢证据的患者将受益于利用etrolizumab的治疗。我们因此选择了预测性诊断标志物，其测定淋巴细胞和/或β7:MAdCAM1途径活性，以在患者中寻找增加的效力，所述患者可能具有由淋巴细胞迁移和存在于疾病组织中强烈驱动的疾病。
在临床效力结果分析之前预先选择候选预测诊断标志物整联蛋白β7和CD3ε。选择CD3ε(其为T细胞受体-CD3信号传递复合体的组分)的活检表达作为潜在的预测生物标志物，因为其在T细胞上的相对独特表达，其可能在消化道中驱动疾病。此外，β7整联蛋白在淋巴细胞和树状突细胞和其他细胞类型上表达。如临床前和I期临床研究所预测，应该阻断该β7表达细胞运输到利用etrolizumab治疗的患者中的消化道中。因此，我们试图确定活检和/或外周血中β7整联蛋白的水平是否预示对利用etrolizumab的治疗的应答。
肠活检组织的收集和处理
在筛选访问(治疗前至多4周)时，在可弯曲乙状结肠镜检查/完全结肠镜检查过程中从研究参与者收集肠活检。从肛外缘10-40cm内结肠的大部分炎性区域获得活检。避免溃疡粘膜的坏死区域或先前结肠切除的患者中缝合位点上的活检。将活检置于组织RNA稳定缓冲液(RNAlater,Qiagen,Cat.No.76104)中并冷冻用于运送。接受后，将活检样品融化并利用3mm钢珠使用TissueLyzer(Qiagen,Cat.No.69989)将其匀浆，并使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Cat.No.74106)，根据制造商的说明书分离RNA。利用Agilent 2100Bioanalyzer使用Agilent RNA 6000Pico Kit(Agilent Technologies,Cat.No.5067-1513)评估RNA完整性。从分析中排除具有低RNA质量(RIN≤5)的样品。使用ABI高容量RT试剂盒(Life Technologies,Cat.No.4368814)将RNA反转录成cDNA。通过实时PCR，也称为定量PCR或qPCR评估基因表达水平(即RNA水平)。在BioMarkTM HD系统上利用Fluidigm pre-amp主要混合物(Life Technologies,Cat.No.4391128)和试剂(Fluidigm,Cat.No. BMK-M10-96.96)，使用人CD3ε(Cat.No.Hs00167894_m1)、αE(Cat.No.Hs01025372_m1)、β7(Cat.No.Hs01565750_m1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(Cat.No.Hs99999905_m1)引物组(全部来自Applied Biosystems[Life Technologies])，根据制造商的说明书运行实时PCR反应。使用先前所述的δCT方法将CD3ε、αE和β7表达针对GAPDH表达进行归一化。
在图3A-C(β7基因表达)和4A-C(CD3ε基因表达)中显示了这些实验的结果。在每个棒图图表中，在图表的左半边显示了安慰剂、100mg/剂量etrolizumab和300mg/剂量etrolizumab的低基因表达(低于II期研究的患者群体的中值)并在图表的右半边显示了安慰剂、100mg/剂量etrolizumab和300mg/剂量etrolizumab的高基因表达(高于II期研究的患者群体的中值)。对于基线(也称为筛选，即第一次药物或安慰剂施用之前)上的β7基因表达和CD3ε表达，我们评估了在上述临床研究的第10周已经实现临床应答(图3C和4C；定义为MCS中3个点降低和从基线30％减少和直肠出血子分数≥1点降低或0或1的绝对直肠出血得分)、粘膜愈合(图3B和4B；定义为0或1的内窥镜子分数)或缓解(图3A和4A；定义为MCS≤2，没有个体子分数>1)的患者的百分比。在β7高和β7低群体(图3A-C)中和CD3ε高和CD3ε低群体(图4A-C)中针对安慰剂校正了所有报道值(高于棒的数字)。
如可以从图3A-C中看出，在基线时具有高水平β7基因表达的患者对利用100mg/剂量etrolizumab的治疗显示较高的安慰剂校正的应答，如通过(i)缓解(31％β7高vs.18％β7低)，(ii)粘膜愈合(37％β7高vs.1％β7低)和(iii)临床应答(29％β7高vs.-3％β7低)的全部三个终点所测量的。利用300mg/剂量etrolizumab没有观察到粘膜愈合(14％β7高vs.16％β7低)和缓解终点(7％β7高vs.20％β7低)的这种强化的临床益处，但是观察到临床应答终点的临床益处(21％β7高vs.-1％β7低)。同样，在基线时具有高水平CD3ε基因表达的患者对利用100mg/剂量etrolizumab(不是300mg/剂量etrolizumab)的治疗显示较高的安慰剂校正的应答，如 通过临床应答(在100mg/剂量时，36％CD3ε高vs.-6％CD3ε低；在300mg/剂量时，10％CD3ε高vs.9％CD3ε低)、粘膜愈合(在100mg/剂量时，36％CD3ε高vs.5％CD3ε低；在300mg/剂量时，12％CD3ε高vs.21％CD3ε低),和缓解(在100mg/剂量时，36％CD3ε高vs.15％CD3ε低；在300mg/剂量时，13％CD3ε高vs.15％CD3ε低)的全部三个终点所测量的。因此，这些结果证明高于在结肠发炎区域的肠活检中β7基因表达和/或CD3ε基因表达的中值水平与etrolizumab治疗的增加的临床益处相关，并且当以100mg/剂量施用etrolizumab时，该临床益处最大。因此，高于在结肠发炎区域的肠活检中β7基因表达和/或CD3ε基因表达的中值水平显示作为预测生物标志物以鉴定最可能受益于利用靶向β7整联蛋白亚基的治疗剂，包括etrolizumab的治疗的UC患者的潜力。
在某些情形中，期望比获得肠活检较少入侵性的方法。评估外周血中基因表达水平的方法是此类较少侵入性方法的实例。因此，我们试图确定在肠活检组织中具有高于基线β7基因表达的中值水平的etrolizumab治疗患者中看到的强化的临床益处是否也可以通过评估外周全血样品中β7基因表达水平来观察。
在I期试验中，我们已经观察到通过FACS分析在CD3+细胞上表达高水平β7的患者比在CD3+细胞上具有低水平β7的患者看起来更好地应答etrolizumab治疗(数据未显示)。在该试验中，我们没有收集外周血用于RNA分析，因此不能分析那些样品β7RNA水平和β7蛋白质水平以及对etrolizumab的应答之间的任何关联。因此，分析来自II期试验的患者样品之前，我们试图确定CD3+细胞和来自不加入II期试验的IBD患者和来自健康对照受试者的样品中的其他血细胞群中的β7基因表达水平(RNA水平)是否与β7蛋白质表达水平相关联。
对于下文所述的实验，根据标准程序收集全血；在PAXgene管中根据制造商的方案收集用于RNA分析的血液。对于FACS分析，从Becton Dickenson获得抗体(参见表2)。来自外周血样品的细胞与标记的抗体根据本领域已知的标准程序温育并在FACSCalibur机器中分析。使用 Quantum PE-MESF珠(Bangs Laboratory,Cat.No.827)定量β7表达。我们还确定当患者样品在进行FACS分析之前在室温下运送和/或储存过夜时，通过FACS分析的β7表达是最佳的。
表2.用于FACS分析的抗体。
 缀合物BD目录#β7PE555945CD45RAFETC347723CD19FITC555412CD27APC558664CD3APC340440CD3FITC555332CD3PE347347CD4PerCP Cy5.5341654IgDPerCP Cy5.5561315小鼠同种型 IgG1FITC556649小鼠同种型 IgG1APC550854小鼠同种型 IgG2aFITC554647 小鼠同种型 IgG2aPerCP Cy5.5552577小鼠同种型 IgG1PerCP Cy5.5550795大鼠同种型 IgG2aPE555844
对于qPCR，我们使用BioRad iScript Select cDNA Synthesis Kit(Cat.No.170-8897)，根据制造商的方案产生cDNA，然后为整联蛋白β7、CD3ε、CD20(Cat.No.Hs00544819_m1)、CD45(Cat.No.Hs04189704_m1)和GAPDH使用ABI Taqman测定，根据制造商的方案进行qPCR。图5显示了将这些FACS分析与qPCR测量相关联的图表。如可以在图5中看出，如通过qPCR测量的β7RNA水平与CD3+T细胞或CD19+B细胞中的β7蛋白质水平不相关。然而，淋巴细胞中的β7蛋白质水平与针对持家基因GAPDH的水平归一化的β7RNA水平或CD45的RNA水平显著相关。参见图5，盒形正方形，统计关联(指示了Spearman r和p值)。因此，我们确定外周血(在PAXgene管中收集的全血)中β7表达(RNA水平)可以通过qPCR可靠地检测并定量。
我们然后分析了根据上述II期方案利用etrolizumab治疗的患者的外周血中的β7基因表达并寻找外周血中β7RNA水平与效力量度之间的关联。
通过在KingFisher磁性颗粒分离器上自动分离从冰冻的PAXgene血管中分离总的RNA。简言之，允许管在室温下融化16小时。离心并 洗涤收集白细胞沉淀后，在含有guanidinium的缓冲液中裂解细胞。进行有机抽提，然后在制备物中加入结合缓冲液和磁珠之前用于KingFisher运行。将程序优化用于microRNA的贮留并且在从磁珠洗脱之前包括DNAse处理步骤和清除。使用NanoDrop ND-1000UV紫外分光光度计通过在260和280nm的吸光度读数确定总RNA样品的纯度和量。通过Agilent Bioanalyzer 2100microfluidic电泳，使用Nano Assay和Caliper LabChip系统检查总RNA的完整性。
使用高容量cDNA合成试剂盒(Applied Biosystems[Life Technologies])，根据制造商的说明书在20uL总反应体积中反转录总RNA(高达2μg)1小时。在ViiaTM 7Real-Time PCR System(Applied Biosystems[Life Technologies])上使用人β7和GAPDH引物组(Applied Biosystems[Life Technologies])，根据制造商的说明书运行快速实时PCR反应。将β7表达针对GAPDH表达归一化。
在图6A-C中显示了结果。在基线具有高水平β7外周血基因表达的患者对用100mg/剂量etrolizumab的治疗显示较高安慰剂-校正的应答：粘膜愈合终点(30％β7高vs.3％β7低)(图6B)和缓解终点(42％β7高vs.11％β7低)(图6A)。在100mg/剂量etrolizumab组中表达高β7的患者比表达低水平β7的患者对用于临床应答终点的etrolizumab治疗也显示较高应答，但是这些结果并非安慰剂校正的(图6C)。对于粘膜愈合(图6B)和临床应答终点(图6C)，利用300mg/剂量etrolizumab，没有看到在100mg/剂量组中的β7高患者中所看到的强化临床益处，但是观察到了缓解终点的临床益处(图6A)，尽管β高患者和β7低患者之间的差异等级小。因此，这些结果证明在外周血中比中值水平高的β7基因表达与etrolizumab处理的增加的临床益处相关，并且当以100mg/剂量施用etrolizumab时，该临床益处最大。因此，在外周血中高于中值水平的β7基因表达显示作为预测生物标志物以鉴定最可能受益于利用靶向β7整联蛋白亚基的治疗剂，包括etrolizumab的治疗的IBD患者，如UC和克罗恩病患者的潜力。
选择预测生物标志物整联蛋白αE用于在利用etrolizumab治疗的患者中强化效力的原理
Etrolizumab结合β7整联蛋白并阻断与MAdCAM1(其在粘膜内皮细胞上表达)和E-钙粘蛋白(其在上皮细胞上表达)的结合。表达αEβ7整联蛋白的淋巴细胞与E-钙粘蛋白的结合可以帮助定位并保持细胞附着到肠上皮上。我们假设αEβ7:E-钙粘蛋白的结合在UC中持续不断的炎症中重要并因而具有增加的αEβ7+淋巴细胞证据的患者将受益于利用etrolizumab的治疗。我们因此扩展了我们预测的诊断性标志物，以包括αE在我们β7途径标志物中，以在患有受疾病组织中淋巴细胞迁移和存在强烈驱动的疾病的患者中寻找增加的效力。因此，我们试图确定活检和/或外周血中αE整联蛋白的水平是否预示对利用etrolizumab的治疗的应答。
如上所述收集肠活检，置于RNAlater中进行处理。获得额外的活检并置于福尔马林中并储存直至运送。接受之后，第二组活检样品包埋在石蜡块中。为了在该部分中所述的研究，在上述II期试验过程中收集或从其他来源中获得肠活检，其中为了与上述II期试验不相关的原因从进行肠活检程序的患者收集样品。将石蜡块加工成4μm切片并置于载玻片上。在Ventana Benchmark XT(Ventana Medical Systems；Tucson,AZ)自动染色机上进行染色。利用Cell Conditioner 1完成预处理推荐时间。一级抗体抗αE(兔单克隆EPR4166(2),Cat.No.ab129202,Abcam,Cambridge,MA)以1.896μg/ml的浓度使用并在载玻片上在37℃下温育60分钟。该步骤后是载玻片与Ventana Ultraview(Ventana Medical Systems；AZ)的温育。Ventana DAB和苏木精II用于发色检测和复染。
如图7中所示，αE的免疫组织化学证明可能对淋巴细胞的小圆细胞的染色。这些细胞的大部分邻接或结合结肠中的上皮细胞隐窝(图7A，左图)和在小肠的绒毛内(图7A，右图)。我们还观察到与表面上皮的结合(数据未显示)。还观察到具有较多弥散染色的较大细胞的亚群并可以代表树状突细胞。我们列举了来自非IBD患者的一组结肠、回肠和 空肠组织样品的染色切片中的αE+细胞。计算机化的自动计数用于列举染色载玻片上的αE+细胞；分析限于在组织切片的粘膜区域中显示放射对称的细胞。与结肠组织样品相比，在空肠和回肠中观察到增加数量的αE+细胞/总细胞(图7B)。还在来自CD患者的回肠和空肠样品中观察到作为总细胞百分比的增加数量的αE+细胞(图7B)。最后，我们在来自IBD患者与非IBD患者相比的组织样品中没有观察到作为总细胞百分比的αE+细胞之间的差异。还在来自非IBD和UC结肠和CD结肠、回肠和空肠的样品中进行αE基因表达针对GAPDH的归一化(图7C)。再次，在小肠中观察到增加的αE基因表达并且在IBD和非IBD组织样品之间没有观察到差异。
小肠在CD中特别重要，因为大部分(50-60％)的CD患者具有疾病，其包括末端回肠。小肠样品中αE+细胞和αE基因表达的较高水平可能表明这些细胞在CD病理学中起关键作用并且其相对丰度因此可以充当CD患者中用于etrolizumab治疗的预测标志物。认为筛选活检样品中αE+细胞与αE基因表达是UC中etrolizumab的II期研究中的潜在预测生物标志物(上文所述)。
将来自加入II期研究的患者的石蜡块中包埋的福尔马林固定的筛选组织活检切开并通过免疫组织化学染色αE并如上详细计数。具有可用组织样品的登记患者上的筛选活检用于建立中值αE+细胞/总细胞截止值(图7D(其中斑点代表利用etrolizumab治疗的患者中的筛选水平，所述患者继续缓解，开放圆点代表没有实现缓解的患者，并且黑点代表接受安慰剂的患者；虚线表示中值；还显示了TNF未经处理的和TNF不足够应答者[TNF-IR]))。图7E显示了来自加入II期研究的患者的筛选活检中αE染色的实例，其具有高于(αE高)和低于(αE低)中值的αE+细胞/总细胞的水平。在图7F中显示了来自加入II期研究的患者的筛选活检中αE基因表达的分布并且在图7G中显示了两种测量的关系。
在图8A-C和8D-F中分别显示了通过基因表达和免疫组织化学，使用来自患者的肠活检确定的αE的表现。在这些实验中，不通过TNF状态(TNF-未经处理的或TNF-IR)分层患者。在每个棒图图表中，在安慰剂、100mg/剂量etrolizumab和300mg/剂量etrolizumab的图表的左半边显示了低基因表达或αE+细胞数量(低于来自II期研究的患者群体的中值)并且在安慰剂、100mg/剂量etrolizumab和300mg/剂量etrolizumab的图表的右半边显示了高基因表达(高于来自II期研究的患者群体的中值)。显示了来自所有患者的数据。对于基线(也称为筛选，即第一次药物或安慰剂施用之前)上的αE基因表达和免疫组织化学，我们评估了在上述临床研究的第10周已经实现临床应答(图8C和F；定义为MCS中3个点降低和从基线30％减少和直肠出血子分数>1点降低或0或1的绝对直肠出血得分)、粘膜愈合(图8B和E；定义为0或1的内窥镜子分数)或缓解(图8A和D；定义为MCS＜2，没有个体子分数>1)的患者的百分比。所有报道值(棒上的数值)代表相对于部分分析的每个剂量组中患者的数量(分母)实现该终点的患者数量(分子)。
如在图8A-C中可以看出，在筛选时具有高水平αE基因表达的患者对利用100mg/剂量etrolizumab的治疗显示较高的安慰剂校正的应答，如通过粘膜愈合(19％αE高vs.13％αE低)和缓解(38％αE高vs.13％αE低)所测量。利用300mg/剂量的etrolizumab没有观察到该强化的临床益处。具有高水平αE+细胞/总细胞的患者对利用100mg/剂量etrolizumab的治疗显示较高的安慰剂校正的应答，如通过粘膜愈合(图8E；19％αE高vs.-3％αE低)和缓解(图8D；50％αE高vs.7％αE低)所测量。在该实验中，仅缓解在筛选时给予300mg/剂量的具有高水平αE+细胞/总细胞的患者中被强化(图8D；14％αE高vs.9％αE低)。
图9A-F显示了TNF未经处理的患者中的结果。在筛选时具有高水平αE基因表达的TNF未经处理的患者对利用100mg/剂量etrolizumab的治疗显示较高的安慰剂校正的应答，如通过临床应答(28％αE高 vs.13％αE)、粘膜愈合(42％αE高vs.17％αE)和缓解(67％αE高vs.17％αE low)的全部三个终点所测量的；仅缓解在给予300mg/剂量的etrolizumab的患者中被强化(在300mg/剂量，50％αE高vs.20％αE低)(图9A-C)。同样，在筛选时具有高水平αE+细胞/总细胞的TNF未经处理的患者对利用etrolizumab的治疗显示较高的安慰剂校正的应答，如通过粘膜愈合(图9E；在100mg/剂量组，38％αE高vs.25％αE和在300mg/剂量组，46％αE高vs.25％αE)和缓解(图9D；在100mg/剂量组，67％αE高vs.25％αE和在300mg/剂量组，50％αE高vs.25％αE)所测量的。
如先前讨论，期望比获得肠活检较少入侵性的方法。评估外周血中基因表达水平的方法是此类较少侵入性方法的实例。因为我们早已通过评估了外周全血样品中β7基因表达水平检查了etrolizumab治疗患者中的强化临床益处并且β7可以与α4和αE配对，我们然后使用筛选和第一天αE的外周血基因表达用于强化应答和缓解。在图10A-F中显示了这些实验的结果。在这些实验中，不通过TNF状态(TNF未经处理的或TNF-IR)来分层患者。
如图10A所示，在筛选时在外周血中具有较高水平αE基因表达的患者对针对缓解终点的etrolizumab治疗显示较高的安慰剂-校正的应答(图10A；在100mg/剂量组,29％αE高vs.8％αE低，在300mg/剂量组，19％αE高vs.5％αE低)。还在第1天外周血中测量了αE基因表达并且发现100mg/剂量组中αE高患者具有增加的缓解(图10D；33％αE高vs.13％αE低)和粘膜愈合(图10E；27％αE高vs.2％αE低)。
图11A-F显示了TNF未经处理的患者中在筛选或第1天时的外周血基因表达结果。在筛选(图11A；在100mg/剂量组，29％αE高vs.8％αE，在300mg/剂量组，40％αE高vs.17％αE)和第1天(图11D；55％αE高vs.20％αE)时具有高水平外周血αE基因表达的TNF未经处理的患者对利用etrolizumab的治疗显示较高的安慰剂-校正的缓解。
给予加入II期研究的患者加入开放标签延长研究的选择，其中全部患者如上所述每四周接受一次300mg/剂量的etrolizumab。不应答的患者可以在完成10周时间点后或安全性随访期间的任何时间进入研究。如图12中所示，在II期研究中接受活性药物但在10周没有应答的33名TNF-IR患者(14名在100mg/剂量组中，19名在300mg/剂量组中)加入开放标签延长研究，但不中断给药方案。在4周后(第一次剂量后14-16周)，使用部分Mayo临床得分评分这些患者的缓解。部分Mayo临床得分是9点临床得分，其中收集所有Mayo子分数，除了内窥镜子分数。缓解定义为≤2点的总得分并且应答定义为基线部分Mayo临床得分25％和≥2点的减少。
在筛选时在肠活检中具有高水平αE基因表达的TNF-IR患者(其在第10周主要终点时不具有应答)对继续的治疗显示较高的缓解(图13A；18％αE高vs.0％αE低)和应答(图13B；53％αE高vs.8％αE低)。在筛选时具有高水平αE+细胞/总细胞的TNF-IR患者对额外的治疗也显示较高的缓解(图13C；22％αE高vs.0％αE低)和应答(图13D；56％αE高vs.17％αE低)。在外周血中具有高水平αE的TNF-IR患者显示较高的应答(图13F；41％αE高vs.15％αE低)。
因此，这些结果证明，在结肠发炎区域的肠活检中高于中值水平的αE基因表达或αE+细胞/总细胞以及外周血中高于中值水平的αE基因表达与患者中etrolizumab治疗的增加的临床益处相关，并且当以100mg/剂量每四周一次皮下施用etrolizumab时，该临床益处最大。因此，在结肠发炎区域的肠活检中高于中值水平的αE基因表达或αE+细胞或外周血中αE基因表达显示作为预测生物标志物来鉴定最可能受益于利用靶向β7整联蛋白亚基的治疗剂(包括etrolizumab)的治疗的IBD患者(如UC和克罗恩病患者)的潜力。