从牛初乳中制备多种生物活性物质的方法 所属技术领域
本发明涉及一种制备多种生物活性物质的方法，更具体地说，是一种从牛初乳中同时制备多种生物活性物质的系统方法，这种方法可以最大程度利用牛初乳原料，并且降低制造成本。
发明技术背景
初乳是指分娩后72小时内母体分泌的乳液。多年科学和医学研究发现，牛初乳含有多种珍贵的生物活性物质，具有保健、抗病、抗衰老等功效，其效用可以和人乳相媲美，某些研究人员认为牛乳是迄今为止所发现的最有益的人体健康的食品。
牛初乳的研究始于70年代，30多年来各国科学家在牛初乳成份及其对人体作用方面的研究都有很大进展，综合目前国际上的研究成果，初乳中的活性物质可以分为两大类：免疫因子和生长因子。
牛初乳中的免疫因子可以抵抗病毒、细菌、酵母菌、真菌、过敏原和其他毒素。初乳中含有5种免疫球旦白，分别是IgG，IgD，IgM，IgA和IgE，其中IgG含量最高，在人初乳中，IgG仅占2％左右，而牛初乳中IgG含量可达8％-25％，免疫球旦白对于病毒性感染、细菌性感染、寄生虫和酵母菌都有良好的防御作用，高质量牛初乳中免疫球旦白应最低达到20％。牛初乳中至少含有19种致病菌的抗体，包括沙门氏菌、大肠杆菌和链球菌的抗体。牛初乳中还含有富脯氨基酸多肽(PRP)，可以调节人体胸腺活动而增强人体免疫功能；乳铁旦白对癌症、艾滋病感染、疱疹、慢性疲劳等疾病有效；乳清旦白对于癌症和病毒有很好抵御作用，以及细胞活素和溶菌酶等免疫增强和调节物质。
牛初乳中还含有丰富的生长因子，医学研究表明，牛初乳中的重要生长因子除了有助于正常的生长之外，对人体组织修复有重要的作用。牛初乳中含量最丰富的生长因子是类胰岛素生长因子I和II(GIF-I和GIF-II)，它们帮助机体有效地进行脂肪代谢和葡萄糖代谢，增加葡萄糖利用，增强糖耐量。牛初乳中还含有转移生长因子(TGFA&B)，血小板诱导生长因子(PDGF)，表皮生长因子、骨髓生长因子等。
目前有多项技术用来提取制备牛初乳中生物活性物质，美国专利4,526,715介绍了一种从牛初乳中通过几种层析分离步骤制备免疫球旦白的方法。美国专利3,128,230介绍了一种从牛初乳中制备可用于治疗各种细菌感染的产品和方法。西德专利2,813,284和欧洲专利EP-A0,046,909及EP-A0,064,103叙述了从初乳中制备含免疫球旦白产品的方法，该产品可作为抗感染产品。中国发明专利96116428介绍了一种从牛初乳中提取类胰岛素生长因子的制备方法。
目前技术地缺陷为仅从牛初乳中制备某一种特定生物活性成份，而牛初乳中其余珍贵的生物活性成份被废弃，这无疑是一种资源浪费，也会明显增加制造成本。
本发明所要解决的技术问题是，采用系统的工艺和方法同时从牛初乳中制备多种生物活性成份，最大程度地利用牛初乳这一珍贵资源，同时降低各个单一成份的制备成本。
【发明内容】
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是，采用系统方法逐个从牛初乳中提取单个生物活性成份。其特征是，将新鲜收取或冷冻牛初乳用离心方式脱脂，然后用酸制剂将脱脂初乳调整PH值至强酸性，直接用分子量8000～20,000的超微滤膜进行超滤，收集过滤液，用碱性制剂调整过滤液PH至接近弱酸性或中性，用分子量3,000～6,000的超微滤膜进行浓缩，浓缩物送入冷冻干燥装置进行冷冻干燥成粉状物，内含丰富的类胰岛素生长因子。第一次超滤的浓缩物加碱性制剂调整PH至弱酸性或中性并加热后离心沉淀酪旦白，收集的酪旦白用旦白水解酶在一定温度下水解，加工制作酪旦白磷酸多肽(CPPs)。残余的乳清液用分子量80,000～160,000的超滤膜再次浓缩，浓缩物喷雾干燥或冷冻干燥成粉状物质，富含各种免疫球旦白。
本发明的技术解决方案也可以采用另一种方法和程序，其特征是将牛初乳用离心方式脱脂，然后用酸性制剂将脱脂初乳酸化，同时，稀释脱脂初乳，用低分子量超微滤膜进行超滤分离(分子量8,000～20,000滤膜)，收集过滤液，用碱性制剂调整过滤液PH至弱酸性或中性，用分子量3,000～6,000的超微滤膜进行浓缩，浓缩物进行冷冻干燥成千粉，内含丰富的类胰岛素生长因子。第一次超滤浓缩物加碱性制剂调整PH至弱酸性或中性后，直接用分子量80,000～160,000的超微滤膜进行超滤分离，分离浓缩物直接采用冷冻干燥或喷雾干燥的方法制备富含免疫球旦白的干粉。而过滤液高温旦白变性后加入旦白水解酶在一定温度条件下进行旦白水解过程，结束时高温灭活旦白水解酶，喷雾干燥成干粉，其中，含有丰富的酪旦白磷酸多肽。如果希望制备高纯度磷酸多肽，可以在酪旦白水解结束后，用分子量4,000～10,000的超滤膜进行超滤分离，过滤液喷雾干燥，即可获得高纯度磷酸多肽。
通过上述工艺和方法，从牛初乳中加工制备高生物活性类胰岛素生长因子(IGF-1)制剂、酪旦白磷酸多肽(CPPs)制剂和高生物活性的免疫球旦白制剂，
本发明的技术特征是，收集的牛初乳是母牛分娩三日内(72小时)的牛初乳，收集的牛初乳是新鲜或冷冻状态(4℃)，对收集的牛初乳进行脱脂程序，可以采用冷冻离心的方法，离心速度2,000～4,000转/分，最佳为3,000转/分，离心时温度不高于10～28℃，离心后去除离心液表面的脂肪。
本发明的技术特征是，采用酸制剂调整脱脂初乳的PH值至强酸性，采用的酸制剂可以是HCL或其他酸制剂，调整PH值至2.2～3.5，优选2.8～2.9，调整PH值至规定的区间后，采用分子量为8,000～20,000的超滤膜，采用常规超滤设备，最理想的是采用切面交错流体超滤设备进行分离，收集过滤液，用碱性制剂调整过滤液的PH值至5.5～7.5，优选5.8～6.2，调整PH值后的过滤液采用分子量为3,000～6,000的超滤膜，优选为分子量4,000～5,000超滤膜采用常规超滤设备浓缩至起始容量10％～60％，优选20％～30％后，送至冷冻干燥设备，制备冷冻干燥粉，内含丰富的类胰岛素生长因子。在调整PH值后，也可以在过滤液中加入相当于过滤液1倍～5倍，优选2倍～3倍的无菌蒸镏水稀释过滤液后进行浓缩，尤其采用切面交错流体超滤装置时更应采用后一步骤。与此同时，收集第一次超滤分离的浓缩物，加碱性制剂，可以是NaOH也可以是其他碱性制剂，调整浓缩物PH至弱酸性或中性，PH值3.8～5.2，优选4.5～4.8，调整浓缩物PH值后，加热析出酪旦白，加热温度40℃～55℃，最好45℃～50℃，加热时间15分钟～90分钟，最好30分钟～45分钟，最好是加热至看到乳水明显分离，然后用离心机离心沉淀析出酪旦白，离心速度3,000～6,000转/分，优选5,000转/分，收集离心上清液，用分子量80,000～160,000的超微滤膜进行分离和浓缩，浓缩物冷冻干燥或喷雾干燥成干粉，即获得含生物活性免疫球旦白的制剂。而离心沉淀的酪旦白被收集后，在75℃～85℃下加热10～30分钟，然后加入胰旦白酶和/或胰凝乳旦白酶，其中酶的重量与旦白重量约0.4～1.2％，在温度30℃～50℃和PH值6.5～8.0条件下进行2～6小时，在水解过程结束后，历经10分钟85℃或45秒130℃的酶灭活程序，然后喷雾干燥成含有大量磷酸多肽的旦白水解产物，如果希望得到更高纯度的磷酸多肽，在高温酸灭活程序后，将旦白水解溶液用分子量为4,000～10,000的超微滤膜分离过滤，过滤液喷雾干燥，即可得到高纯度的酪旦白磷酸多肽制剂。
本发明的技术特征是，为了制备高生物活性的免疫球旦白制剂，在脱脂初乳酸化用分子量为8,000～20,000的超滤膜分离后，浓缩物加入1倍～5倍，优选2倍～3倍的蒸馏水稀释，直接采用分子量为80,000～160,000，优选分子量为100,000～120,000的超微滤膜，采用超滤分离设备，优选切面交错流体过滤(TFF)设备进行分离，浓缩物直接冷冻干燥成粉，内含高生物活性的免疫球旦白，也可以采用喷雾干燥方法干燥成粉，而含有大量酪旦白的过滤液可以调整PH至4.5～4.8，优选4.7，加热50℃，半小时至1小时后，用离心机离心沉淀，离心速度5,000转/分，收集沉淀物，进行旦白水解过程。
本发明与现有技术相比的优点是，采用系统方法，一次性从牛初乳中提取多种生物活性物质，减少了原材料采集、运输、保藏的费用，而且一次系统加工过程获得多种收益，大幅度降低了加工成本。同时本发明的工艺中采取的措施保护了生物活性物质的生物活性，临床使用效果更佳。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
收集母牛分娩后3日内分泌的牛初乳，冷冻离心脱脂，速度为3,000转/分，离心时间为30分钟，去除离心液上层脂肪，在脱脂初乳内滴入2N HCL调整PH值至2.8，采用装有分子量为10,000超微滤膜的美国Pall公司生产的切面交错流体过滤设备(TFF)进口压为3500千克/厘米2，出口压0.4千克/厘米2，料液温度＜35℃，收集过滤液，用2N NaOH调PH至6.5，过滤液继续用同样设备和参数，但改用分子量为5,000的超微滤膜进行浓缩，弃去过滤液，收集浓缩液，送入冷冻干燥装置冷冻干燥成粉，制备内含丰富类胰岛素生长因子的制剂。
同步收集第一次过滤分离的浓缩液，用2N NaOH调节PH值至4.7，加热至50℃，30分钟，使酪旦白凝固，用5000转/分速度离心15分钟，收集离心上清液，用分子量100,000的超滤膜及上述超滤装置浓缩，浓缩物直接喷雾干燥成粉，制备含有免疫球旦白的制剂。
收集离心沉淀的酪旦白，进行预热处理，在75℃温度下保持30分钟，冷却至50℃时加胰旦白酶，胰旦白酶占旦白重量1％，在30℃～50℃温度下进行2～6小时，在水解结束后，向水解产物内注入130℃蒸汽45分钟，喷雾干燥成粉，制备含有丰富酪旦白磷酸多肽的制剂。
实施例2
收集牛初乳。以2000转/分速度离心脱脂，用2N HCL滴入调节脱脂初乳至PH2.9，采用12,000分子量的超微滤膜用板框式超滤器过滤分离，过滤液用2N NaOH调整PH至6.2，换用分子量为4,000的超滤膜在板框式超滤器浓缩，浓缩物冷冻干燥成内含丰富类胰岛素生长因子的干粉。第一次超滤分离的浓缩物用2N NaOH调节PH至4.7，用分子量为120,000的超滤膜分离，浓缩液直接冷冻干燥成粉，含有大量生物活性物质的免疫球旦白。而过滤液加热至85℃温度下20分钟预热，冷却至45℃时加入胰凝乳旦白酶，占旦白重量的0.8％，在30-50℃温度保持2-6小时，用85℃加热1分钟灭活酶，旦白水解液用分子量为10,000的中空纤维或超滤膜分离过滤，过滤液在85℃温度下喷雾干燥成酪旦白磷酸多肽粉。