一种来自于阴沟肠杆菌的L苏氨酸醛缩酶及其应用.pdf

本发明涉及一种从阴沟肠杆菌中分离的编码L-苏氨酸醛缩酶的核苷酸序列，它是具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或该核苷酸序列的片段、类似物和衍生物。本发明包括编码L－苏氨酸醛缩酶的核苷酸序列与外源性调节序列连接，进行功能性表达的载体以及含有本发明载体的细胞生物体以及这类生物体的子代。用上述的核苷酸序列或多肽序列或含有本发明载体的细胞生物体以及这类生物体的子代制备L-β-羟基α-氨基酸或D-β-羟基α-氨基酸的方法。

权利要求书
1.  一种从阴沟肠杆菌中分离的编码L－苏氨酸醛缩酶的核苷酸序列，其特征在于它是具 有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或该核苷酸序列的片段、类似物或衍生物,所述阴沟杆菌 在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M 2012240。

2.  按照权利要求1所的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列是选自:
(a)编码具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列多肽的核苷酸序列；
(b)与核苷酸序列(a)互补的核苷酸序列，或前述有至少65％相同性的核苷酸序列。

3.  一种多肽，其特征在于它是具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽或其氨基酸 变异不超过30％。

4.  一种重组表达载体，其特征在于它是由权利要求1所述的核苷酸序列与质粒表达载 体所构建的重组载体。

5.  一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于它是选自：
(a)它是用权利要求1所述的核苷酸序列转化的宿主细胞；
(b)它是用权利要求4所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞。

6.  权利要求1-5任一项用于制备L-β-羟基α-氨基酸或D-β-羟基α-氨基酸的方法。

说明书一种来自于阴沟肠杆菌的L-苏氨酸醛缩酶及其应用
技术领域
本发明属于化学工程领域和酶工程领域，涉及一种来自于阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae tzyx2)的L-苏氨酸醛缩酶，具体讲是阴沟肠杆菌的L-苏氨酸醛缩酶的核苷酸序列及其应用。
背景技术
醛缩酶是一类可逆的裂解酶类，于1934年首次被人类所认知。酸缩酶可以催化供体(亲核试剂,通常是酮)和受体醛(亲电子试剂)进行可逆的羟醛缩合反应。大多数酸缩酶对于它们的供体是非常专一的，而对于受体醛却拥有较大的自由度。按照醛缩酶对供体专一性的不同，醛缩酶可分为五大类：磷酸二羟基丙酮(DHAP)依赖型醛缩酶，丙酮酸和磷酸稀醇式丙酮酸依赖型醛缩酶,乙醛依赖型醛缩酶，甘氨酸依赖型醛缩酶以及二羟基基丙酮依赖型醛缩酶。
苏氨酸醛缩酶(Threonine Aldolase，TA；EC4.1.2.5)属于甘氨酸依赖型醛缩酶，该类型醛缩酶最大的特点是在辅助因子磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate；PLP)的存在下，能以氨基酸作为供体，反应后生成β-羟基-α-氨基酸。苏氨酸醛缩酶催化苏氨酸裂解成甘氨酸和乙醛，在一定条件下它也能催化甘氨酸和乙醛合成苏氨酸。研究表明，该酶对于其醛受体往往显示出很广泛的底物耐受性，包括各种取代的芳香醛和脂肪醛，因此，近几年来苏氨酸醛缩酶开始受到关注，人们试图拓展该酶在合成中的应用,促进化学与酶工程的结合。
在苏氨酸醛缩酶所催化生成的β-羟基-α-氨基酸中，包括万古霉素、环孢菌素A和多氧菌素D等许多抗生素及免疫抑制剂的关键前体。在化学合成工艺中，该类型β-羟基-α-氨基酸的合成需多步工艺来分离异构体，工艺复杂，成本高，环境污染严重。而利用苏氨酸醛缩酶能特异性地催化合成特定构型的不同β-羟基α-氨基酸，它不需要任何保护基，也不需要任何多余的步骤，也不产生副产物，无疑是合成β-羟基α-氨基酸最直接，最吸引人的方式。
根据对所作用的苏氨酸上α碳原子的立体专一性，可将该酶分为L型和D型两类。L-苏氨酸醛缩酶(L-TA)，可作为合成D-β羟基α氨基酸的拆解试剂。还可以以甘氨酸和醛类为底物一步酶法合成L-β-羟基α-氨基酸。
发明内容
本发明的一个目的是提供从阴沟肠杆菌中分离的编码L-苏氨酸醛缩酶的核苷酸序列或其核苷酸序列的片段、类似物或衍生物。从一种杆状革兰氏阴性细菌—阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae tzyx2)中克隆的L-苏氨酸醛缩酶基因，将该基因与不同表达载体连接，转入到细菌、酵母、植物或动物中，利用其编码L-苏氨酸醛缩酶产生或拆分L-β-羟基α-氨基酸的方法和应用。
本发明的另一个目的是提供该核苷酸序列所编码的L-苏氨酸醛缩酶多肽、或其片段、类似物或衍生物。
本发明的另一个目的是提供含有该基因核苷酸序列与异源调节序列连接，进行功能性表达的 重组载体。
本发明的另一个目的是提供一种含有该基因核苷酸序列或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组载体转化或转导的宿主细胞及其后代。
本发明的另一个目的是提供一种用含有该基因核苷酸序列或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的重组载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞，或该核苷酸序列所编码的L-苏氨酸醛缩酶多肽产生或拆分L-β-羟基α-氨基酸的方法。
本发明的第一方面，提供的是具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或该核苷酸序列的片段。分离的L-苏氨酸醛缩酶基因的核苷酸序列，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列相同：(1)具有编码SEQ ID NO:2氨基酸序列的活性多肽的核苷酸序列；(2)与核苷酸序列(1)互补的核苷酸序列，或前述有至少65％相同性的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供分离的这个核苷酸序列所编码的多肽，该多肽包含：具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽、或其片段。
本发明的第三方面，提供了含有上述核苷酸序列的质粒表达载体，以及被上述核苷酸序列或质粒表达载体转化的宿主细胞及其后代细胞。
本发明的第四方面，提供了一种用含有该基因核苷酸序列或该基因核苷酸序列与异源调节序列连接的质粒表达载体转化或转导宿主细胞及其后代细胞或用该核苷酸序列所编码的L-苏氨酸醛缩酶多肽产生或拆分L-β-羟基α-氨基酸的方法。
本发明的其他方面由于本文技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。例如，活体细胞内的天然状态下的核苷酸序列和多肽是没有分离纯化的，但同样的核苷酸序列或多肽如从天然状态中与同存在的其它物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的核苷酸序列”是指基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的DNA纯化技术纯化的。
本发明提供了一种新的分离的核苷酸序列——编码阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae tzyx2的L－苏氨酸醛缩酶的核苷酸序列，其基本上是由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成的，其特征是：该序列长为1002bp(碱基)，为编码L－苏氨酸醛缩酶成熟多肽SEQ ID NO:2的开放阅读框。
本发明提供了分离的核苷酸序列，该核苷酸序列由编码具有SEQ ID NO:2氨基酸序列的活性多肽的核苷酸序列组成。具体地，本发明的核苷酸序列具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列。编码SEQ ID NO:2活性多肽的核苷酸序列包括：只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
本发明中的多肽和核苷酸序列优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明中特异核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离核苷酸序列。这些技术包括但不局限于：(1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的核苷酸序列；和(2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的核苷酸序列片段。
本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得：(1)从基因组DNA分离双链DNA序列；(2)化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。
本发明还提供了一种新的多肽序列,阴沟肠杆菌L－苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列，是由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术 从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞中产生。
可用本领域的技术人员熟知的方法来构建含编码阴沟肠杆菌L－苏氨酸醛缩酶的核苷酸序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等[Sambroook,et al.,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989]。所述的编码阴沟肠杆菌L－苏氨酸醛缩酶的核苷酸序列可有效连接到表达载体的恰当启动子上，以指导mRNA合成。
本发明还涉及用含有本发明编码阴沟肠杆菌L－苏氨酸醛缩酶的核苷酸序列的重组载体或直接用编码阴沟肠杆菌L－苏氨酸醛缩酶的核苷酸序列经基因工程产生的宿主细胞。本发明中，编码阴沟肠杆菌L－苏氨酸醛缩酶的核苷酸序列或含有该核苷酸序列的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该核苷酸序列或重组载体的基因工程化宿主细胞。
用本发明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域的技术人员熟知的方法进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期收集菌体，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域是众所周知的。也可用MgCl2，电穿孔等方法进行。当宿主是真核生物，可选用DNA转染法、显微注射、电穿孔、脂质体包装等方法。
本发明还涉及用上述转基因宿主细胞生产，根据宿主细胞，用本领域技术人员所共知的方法生长或培养。比如微生物细胞通常是在0-100℃，优选10-60℃，同时还要氧气。培养基中含有碳源，如葡萄糖，氮源，通常是有机氮的形式，如酵母提取物、氨基酸，或盐，如硫酸铵，微量元素，如铁、镁盐，如果需要的话还有维生素。在此期间培养基的pH可以保持固定的值，就是说，在培养期间进行控制或不控制。培养可以分批培养、半不连续培养或连续培养形式进行。在培养之后，收集细胞，捣碎或直接使用，通过本领域技术人员熟知的方法从细胞中提取L-苏氨酸醛缩酶。
本发明还涉及利用L-苏氨酸醛缩酶多肽产生L-β-羟基α-氨基酸的方法，该方法是这样实现的，将甘氨酸和醛类与SEQ ID NO:2一起培养。在一定的环境条件下，优选为温度10-50℃，pH6-10，可以催化合成相应的L-β-羟基α-氨基酸(如附图1所示)。
本发明还涉及利用L-苏氨酸醛缩酶多肽拆分L-β-羟基α-氨基酸的方法，该方法是这样实现的，DL-β-羟基α-氨基酸与SEQ ID NO:2一起培养。在一定的环境条件下，优选为温度10-50℃，pH6-10，可以催化L-β-羟基α-氨基酸拆分成相应地甘氨酸和醛类，进而获得对映纯的D-β-羟基α-氨基酸(如附图1所示)。
本发明还涉及用上述方法制备L-β-羟基α-氨基酸或D-β-羟基α-氨基酸，以及将其应用于生产人类食品、动物饲料、化妆品或药品用途。
分类命名：阴沟肠杆菌tzyx2
拉丁文名：Enterobacter cloacae tzyx2
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
地址：中国武汉武汉大学
保藏日期：2012年6月24日
保藏编号：CCTCC NO:M 2012240。
附图说明
图1、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae tzyx2)L－苏氨酸醛缩酶粗酶催化合成L-β-羟基α-氨基酸反应。
图2、构建的大肠杆菌测序载体pGEMT-LTA。
图3、构建的大肠杆菌表达载体pET11-LTA。
图4、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae tzyx2)L－苏氨酸醛缩酶粗酶催化合成L-苯基丝氨酸反应。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。
实施例1从阴沟肠杆菌中分离L－苏氨酸醛缩酶的核苷酸序列
根据《分子克隆实验指南》提供的方法从培养36小时的阴沟肠杆菌菌体中提取总的DNA，取7μg为模板进行聚合酶链式反应。根据所发表的L－苏氨酸醛缩酶序列设计，以上述提取的DNA为模板在T-Gradient PCR仪(Biometra公司)上进行PCR扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下：
引物1:5’-ATGATTGATTTACGCAGTGATACCG-3’
引物2：5’-TTAACGCTGTAAAAACGCCTGCCAG-3’

扩增条件：94℃变性3min，再用94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min进行30个循环，最后72℃ 10min。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，扩增得到大小约1000bp的片段，用UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)回收，把回收片段亚克隆到测序载体pGEM-T(Promega公司产品)中；质粒构建结果见附图2，所构建的含有L－苏氨酸醛缩酶基因的质粒命名为pGEMT-LTA。连接产物转化到用CaCl2法处理的大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(终浓度为100μg/ml)的LB固体培养基上培养过夜；挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素(终浓度为60μg/ml)的LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体按碱裂解法[Sambroook,et al.，1989，Molecular Cloning,a Laboratory Manual,cold Spring Harbor Laboratory，New York,p19-21]提取质粒，经NcoI和SacI双酶切和PCR扩增鉴定正确，测序(上海生工生物工程技术服务有限公司)。测序结果显示所扩增得到的片段大小为1002bp，通过其编码的氨基酸序列在Genbank数据库中用Blast程序(Basic local Alignment seatch tool)[Altschul SF et al，1997，Nucleic Acids Res.25:3389-3402]进行同源检索，检索结果表明与该片段最相似的同源片段为L-苏氨酸醛缩酶，但并不完全相同，证明所扩增片段为新的L-苏氨酸醛缩酶。
实施例2：大肠杆菌重组表达载体的构建
根据SEQ ID NO:1所示编码区序列，设计出一对基因特异性扩增引物分离其潜在开放阅 读框序列：
引物3：5’-GGCTCTAGA ATGATTGATTTACGCAGTGATACCG-3’；
引物4：5’-GCCGGATCC TTAACGCTGTAAAAACGCCTGCCAG-3’；
此两个引物的5`端黑体分别含有XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点。所用的扩增条件和反应组分同上，扩增产物的测序结果显示和SEQ ID NO:1所示的序列一致。然后取50μl PCR产物和1μl pET11a(Invitrogen公司)分别进行双酶切，回收酶切大片段，并用T4连接酶在4度冰箱中过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α，通过质粒提取和PCR筛选阳性克隆，并进行测序鉴定。质粒构建结果见附图3，所构建的含有L－苏氨酸醛缩酶基因的大肠杆菌表达质粒命名为pET-LTA。连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选鉴定出重组质粒。
实施例3：L－苏氨酸醛缩酶粗酶的制备
将鉴定的阳性转化子单菌落接种于含Amp(100μg/ml)的SOC培养基，37℃振荡培养过夜，菌浓度达OD600＝1时，以1％接种于含Amp(100μg/ml)的LB培养基中，37℃继续培养至OD600处于1.2～1.5时，离心收获细胞。细胞用0.1M磷酸盐缓冲溶液重悬，超声破碎后20000转离心1小时，收获上清即为L－苏氨酸醛缩酶的粗酶，分装，-20℃保藏。
实施例4：L－苏氨酸醛缩酶粗酶催化合成L-苯基丝氨酸(附图4)
酶活单位定义:室温下,每分钟催化L-苏氨酸分解生成1mmol乙醛，定义为1个酶活单位。 
催化条件：缓冲液，KH2PO4，50mM；PH8.0。1ml反应体系：L-TA，77U；PLP，13ng；苯甲醛，10mg；甘氨酸，75mg。反应温度，25℃，反应时间，45min。
HPLC检测条件：仪器，Agilent1260；流动相，0.1％庚烷磺酸钠：甲醇＝80：20；色谱柱，C18，5μm，4.6×150mm；柱温，20℃；检测器，紫外；波长，225nm；溶剂，甲醇。
检测结果：产率80％，ee>99％。