一种从胶红酵母中提取海红虾青素的方法.pdf

本申请公开了一种从胶红酵母中提取海红虾青素的方法，包括步骤：胶红酵母菌体破壁，采用酶法对所述胶红酵母菌体进行破壁，破壁条件：加入酶活为10000U/g的β-葡聚糖酶和酶活为60000U/g的β-甘露聚糖酶，两种酶的比例为1:1，分别加酶量为0.005-0.05g/ml，调节pH至4.5-5.0，50℃水浴1-2h，得到胶红酵母破壁菌体；无水乙醇浸提；超声提取；去除极性杂质；获得产品。本发明中采用酶法破壁比较彻底，破壁效果明显好于化学法，有利于保持海红虾青素结构的完整性，成本方面也存在较大的优势，可以进行大规模提取，容易实现工业化生产。

权利要求书
1.  一种从胶红酵母中提取海红虾青素的方法，其特征在于，包括步骤：
胶红酵母菌体破壁：采用酶法对所述胶红酵母菌体进行破壁，破壁条件：加入酶活为10000U/g的β-葡聚糖酶和酶活为60000U/g的β-甘露聚糖酶，两种酶的比例为1:1，分别加酶量为0.005-0.05g/ml，调节pH至4.5-5.0，50℃水浴1-2h，得到胶红酵母破壁菌体；
无水乙醇浸提：收集所述胶红酵母破壁菌体，按料液比为1:3-9加入无水乙醇溶液浸提，25-30℃浸提10-25min，离心后舍弃上清液，得到海红虾青素混合液；
超声提取：对所述海红虾青素混合液进行超声提取，超声条件为：功率500W-1000W，工作5-10s，间歇5-10s，超声80-120次，时间15-30min，得到海红虾青素粗提液；
去除极性杂质：向所述海红虾青素粗提液中添加等体积的石油醚和无水乙醇，轻轻晃动，待分层后加入蒸馏水，得到石油醚相萃取液；
获得产品：将所述石油醚相萃取液用真空旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩液于通风橱中用氮气吹干，得到海红虾青素产品。

2.  根据权利要求1所述的从胶红酵母中提取海红虾青素的方法，其特征在于，还包括胶红酵母菌体收集的步骤，胶红酵母发酵液3500-5500g，离心15-30min，弃上清液，用蒸馏水洗后再次离心，重复操作3-4次，得到胶红酵母菌体。

3.  根据权利要求1所述的从胶红酵母中提取海红虾青素的方法，其特征在于，所述真空旋转蒸发仪浓缩时的浓缩温度为20-35℃、真空度为-0.05—-0.1MPa，浓缩至黏稠状停止。

4.  根据权利要求1所述的从胶红酵母中提取海红虾青素的方法，其特征在于，所述步骤去除极性杂质中加入蒸馏水至上层澄清为止。

说明书一种从胶红酵母中提取海红虾青素的方法
技术领域
本发明涉及酵母菌技术领域，具体地说，是涉及一种从胶红酵母中提取海红虾青素的方法。
背景技术
虾青素是一种类胡萝卜素，具有极强的抗氧化能力和生物着色能力,已广泛应用于食品、医药、化妆品、饲料等许多领域。在预防心脑血管疾病、保护眼睛和中枢神经系统、防紫外线辐射、抑制肿瘤、抗炎、缓解运动疲劳等方面具有较高的应用价值。
海红虾青素，是一种具有高抗氧化能力的类胡萝卜素，薄层层析时其迁移率与天然虾青素酯接近，抗氧化能力也与天然左旋虾青素接近而得名，DPPH法检测其抗氧化能力强于天然左旋虾青素20～40％左右。
目前，国际上对虾青素需求量很大。虾青素的生产来源主要是水产品加工废弃物、雨生红球藻等，产量较低，满足不了市场的需求。美国、加拿大、欧盟等国的许多生物技术公司致力于开发生产这类产品，但还远远不能满足市场需求，价格很高。目前市场上的虾青素化学合成的约占销售总量的90％。随着全球天然食品及天然饲料添加剂的兴起，人们对化学合成色素越来越警惕，从酵母中提取的天然虾青素以其特有的功能引起了越来越多的注意。本专利提供的提取方法，成本低，操作简单，更重要的是在提取过程中有利于保证海红虾青素结构的完整性。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种从胶红酵母中提取海红虾青素的方法，包括步骤：
胶红酵母菌体破壁：采用酶法对所述胶红酵母菌体进行破壁，破壁条件： 加入酶活为10000U/g的β-葡聚糖酶和酶活为60000U/g的β-甘露聚糖酶，两种酶的比例为1:1，分别加酶量为0.005-0.05g/ml，调节pH至4.5-5.0，50℃水浴1-2h，得到胶红酵母破壁菌体；
无水乙醇浸提：收集所述胶红酵母破壁菌体，按料液比为1:3-9加入无水乙醇溶液浸提，25-30℃浸提10-25min，离心后舍弃上清液，得到海红虾青素混合液；
超声提取：对所述海红虾青素混合液进行超声提取，超声条件为：功率500W-1000W，工作5-10s，间歇5-10s，超声80-120次，时间15-30min，得到海红虾青素粗提液；
去除极性杂质：向所述海红虾青素粗提液中添加等体积的石油醚和无水乙醇，轻轻晃动，待分层后加入蒸馏水，得到石油醚相萃取液；
获得产品：将所述石油醚相萃取液用真空旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩液于通风橱中用氮气吹干，得到海红虾青素产品。
优选地，还包括胶红酵母菌体收集的步骤，胶红酵母发酵液3500-5500g，离心15-30min，弃上清液，用蒸馏水洗后再次离心，重复操作3-4次，得到胶红酵母菌体。
优选地，所述真空旋转蒸发仪浓缩时的浓缩温度为20-35℃、真空度为-0.05—-0.1MPa，浓缩至黏稠状停止。
优选地，所述步骤去除极性杂质中加入蒸馏水至上层澄清为止。
本发明的胶红酵母菌(英文名Rhodotorula mucilaginosa)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年12月01日，保藏编号：CGMCC No.10123。
与现有技术相比，本发明所述的从胶红酵母中提取海红虾青素的方法，达到了如下效果：
(1)本发明中采用酶法破壁比较彻底，破壁效果明显好于化学法，有利于保持海红虾青素结构的完整性，成本方面也存在较大的优势，可以进行大规模提取，容易实现工业化生产。
(2)本发明在浓缩海红虾青素时在氮气环境下吹干，由于海红虾青素抗氧化能力很强，在空气中易被氧化，采用氮气吹干法可有效的保证其结构的 稳定性和其功能性。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1a-图1b为酶法破壁效果图；
图2为乙醇浸提超声波提取后的海红虾青素粗提液；
图3为本发明从胶红酵母中提取海红虾青素的方法流程图。
具体实施方式
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。此外，“耦接”一词在此包含任何直接及间接的电性耦接手段。因此，若文中描述一第一装置耦接于一第二装置，则代表所述第一装置可直接电性耦接于所述第二装置，或通过其他装置或耦接手段间接地电性耦接至所述第二装置。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本发明的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
以下结合附图对本发明作进一步详细说明，但不作为对本发明的限定。
实施例1：
制备胶红酵母菌体：称取胶红酵母发酵液3500g，离心15min，弃上清液，用蒸馏水洗后再次离心，重复操作3次，得到胶红酵母菌体。
准确称取胶红酵母菌体(湿菌泥)8g，加入40ml水(底物浓度20％)，加入β-葡聚糖酶(酶活10000U/g)和β-甘露聚糖酶(酶活60000U/g)各 0.2g(0.005g/ml×40ml＝0.2g)，调节pH至4.5，调节pH值所用试剂是盐酸和氢氧化钠溶液，50℃水浴1h，之后4200rpm，离心25min，弃去上清胶红酵母破壁菌体，收集菌体。本发明中采用酶法破壁比较彻底，破壁效果明显好于化学法，有利于保持海红虾青素结构的完整性。
胶红酵母破壁菌体中添加40ml无水乙醇，菌体与无水乙醇的质量体积比为1:3，充分混匀后，30℃浸提10min，仅到此步时，虾青素的提取率较低；因此，采用超声波进一步提取，得到海红虾青素粗提液，如图2所示。超声条件：功率600W，超声时间9s，间歇6s，超声100次，时间25min。
本实施例中对超声功率和超声时间进行了研究，过高过低的超声功率提取效果均欠佳，适当延长超声时间也不会再提高提取率，因此，选择超声功率为600W，时间25min为最佳超声条件。
按照海红虾青素乙醇提取液：石油醚体积比为1:1加入石油醚萃取，轻轻晃动几下，以免出现乳化现象，待分层后加入再加适量蒸馏水，待上层石油醚相澄清为止，使虾青素等极性小的物质被充分萃取到石油醚相中，而在乙醇相中为极性较大的一些非虾青素类物质。将石油醚相的萃取液移入旋转瓶，用真空旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩温度20℃，真空度为-0.05MPa，浓缩至黏稠状停止。
浓缩液于通风橱中用氮气吹干，得到海红虾青素粗品。海红虾青素抗氧化能力很强，在空气中易被氧化，采用氮气吹干法可有效的保证其结构的稳定性。
实施例2：
制备胶红酵母菌体：称取胶红酵母发酵液4000g，离心15min，弃上清液，用蒸馏水洗后再次离心，重复操作4次，得到胶红酵母菌体(湿菌泥)。
准确称取胶红酵母菌体(湿菌泥)9g，加入30ml水(底物浓度30％)，加入β-葡聚糖酶(酶活10000U/g)和β-甘露聚糖酶(酶活60000U/g)各2g(0.05g/ml×40ml＝2g)，调节pH至5.0，50℃水浴2h，之后4200rpm，离心25min，弃去上清胶红酵母破壁菌体，收集胶红酵母破壁菌体，破壁情况如图1a-图1b所示。
胶红酵母破壁菌体中添加90ml无水乙醇，菌体与无水乙醇的质量体积 比为1:9，充分混匀后，25℃浸提25min；
采用超声波进一步提取，得到海红虾青素粗提液。超声条件：功率为1000W，超声时间10s，间歇8s，超声120次，时间30min。
按照海红虾青素乙醇提取液：石油醚体积比为1:1加入石油醚萃取，轻轻晃动几下，以免出现乳化现象，待分层后加入再加适量蒸馏水，待上层石油醚相澄清为止，使虾青素等极性小的物质被充分萃取到石油醚相中，而在乙醇相中为极性较大的一些非虾青素类物质。将石油醚相的萃取液移入旋转瓶，用真空旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩温度35℃，真空度为-0.1MPa，浓缩至黏稠状停止。
浓缩液于通风橱中用氮气吹干，得到海红虾青素粗品。海红虾青素抗氧化能力很强，在空气中易被氧化，采用氮气吹干法可有效的保证其结构的稳定性。
实施例3：
准确称取胶红酵母菌体(湿菌泥)8g，加入40ml水(底物浓度20％)，加入β-葡聚糖酶(酶活10000U/g)和β-甘露聚糖酶(酶活60000U/g)各0.2g，调节pH至4.8，50℃水浴2h，之后4200rpm，离心20min，弃去上清胶红酵母破壁菌体，收集胶红酵母破壁菌体。
胶红酵母破壁菌体中添加50ml无水乙醇，菌体与无水乙醇的质量体积比为1:5，充分混匀后，26℃浸提20min；
采用超声波进一步提取，得到海红虾青素粗提液，如图2所示。超声条件：功率为600W，超声时间8s，间歇8s，超声90次，时间20min。
按照海红虾青素乙醇提取液：石油醚体积比为1:1加入石油醚萃取，轻轻晃动几下，以免出现乳化现象，待分层后加入再加适量蒸馏水，待上层石油醚相澄清为止，使虾青素等极性小的物质被充分萃取到石油醚相中，而在乙醇相中为极性较大的一些非虾青素类物质。将石油醚相的萃取液移入旋转瓶，用真空旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩温度23℃，真空度为-0.095MPa，浓缩至黏稠状停止。
浓缩液于通风橱中用氮气吹干，得到海红虾青素粗品。海红虾青素抗氧化能力很强，在空气中易被氧化，采用氮气吹干法可有效的保证其结构的稳 定性。
实施例4：
准确称取胶红酵母菌体(湿菌泥)9g，加入45ml水(底物浓度25％)，加入β-葡聚糖酶(酶活10000U/g)和β-甘露聚糖酶(酶活60000U/g)各0.2g，调节pH至4.7，50℃水浴2h，之后4200rpm，离心22min，弃去上清胶红酵母破壁菌体，收集胶红酵母破壁菌体。
胶红酵母破壁菌体中添加60ml无水乙醇，菌体与无水乙醇的质量体积比为1:6，充分混匀后，27℃浸提23min；
采用超声波进一步提取，得到海红虾青素粗提液。超声条件：功率为500W，超声时间8s，间歇8s，超声90次，时间30min。
按照海红虾青素乙醇提取液：石油醚体积比为1:1加入石油醚萃取，轻轻晃动几下，以免出现乳化现象，待分层后加入再加适量蒸馏水，待上层石油醚相澄清为止，使虾青素等极性小的物质被充分萃取到石油醚相中，而在乙醇相中为极性较大的一些非虾青素类物质。将石油醚相的萃取液移入旋转瓶，用真空旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩温度20℃，真空度为-0.1MPa，浓缩至黏稠状停止。
浓缩液于通风橱中用氮气吹干，得到海红虾青素粗品。海红虾青素抗氧化能力很强，在空气中易被氧化，采用氮气吹干法可有效的保证其结构的稳定性。
实施例5：
准确称取胶红酵母菌体(湿菌泥)9g，加入45ml水(底物浓度25％)，加入β-葡聚糖酶(酶活10000U/g)和β-甘露聚糖酶(酶活60000U/g)各0.22g，调节pH至4.8，50℃水浴1.5h，之后4200rpm，离心20min，弃去上清胶红酵母破壁菌体，收集胶红酵母破壁菌体。
胶红酵母破壁菌体中添加70ml无水乙醇，菌体与无水乙醇的质量体积比为1:7，充分混匀后，28℃浸提15min；
采用超声波进一步提取，得到海红虾青素粗提液。超声条件：功率为1000W，超声时间8s，间歇8s，超声90次，时间15min。
按照海红虾青素乙醇提取液：石油醚体积比为1:1加入石油醚萃取，轻 轻晃动几下，以免出现乳化现象，待分层后加入再加适量蒸馏水，待上层石油醚相澄清为止，使虾青素等极性小的物质被充分萃取到石油醚相中，而在乙醇相中为极性较大的一些非虾青素类物质。将石油醚相的萃取液移入旋转瓶，用真空旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩温度20℃，真空度为-0.1MPa，浓缩至黏稠状停止。
浓缩液于通风橱中用氮气吹干，得到海红虾青素粗品。海红虾青素抗氧化能力很强，在空气中易被氧化，采用氮气吹干法可有效的保证其结构的稳定性。
实施例6：
制备胶红酵母菌体：称取胶红酵母发酵液3800g，离心20min，弃上清液，用蒸馏水洗后再次离心，重复操作4次，得到胶红酵母菌体(湿菌泥)。
准确称取胶红酵母菌体(湿菌泥)8g，加入40ml水(底物浓度20％)，加入β-葡聚糖酶(酶活10000U/g)0.2g和β-甘露聚糖酶(酶活60000U/g)0.22g，调节pH至5.0，50℃水浴2h，之后4200rpm，离心25min，弃去上清胶红酵母破壁菌体，收集胶红酵母破壁菌体。
胶红酵母破壁菌体中添加70ml无水乙醇，菌体与无水乙醇的质量体积比为1:7，充分混匀后，28℃浸提23min；
采用超声波进一步提取，得到海红虾青素粗提液。超声条件：功率为900W，超声时间9s，间歇9s，超声95次，时间30min。
按照海红虾青素乙醇提取液：石油醚体积比为1:1加入石油醚萃取，轻轻晃动几下，以免出现乳化现象，待分层后加入再加适量蒸馏水，待上层石油醚相澄清为止，使虾青素等极性小的物质被充分萃取到石油醚相中，而在乙醇相中为极性较大的一些非虾青素类物质。将石油醚相的萃取液移入旋转瓶，用真空旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩温度25℃，真空度为-0.1MPa，浓缩至黏稠状停止。
浓缩液于通风橱中用氮气吹干，得到海红虾青素粗品。海红虾青素抗氧化能力很强，在空气中易被氧化，采用氮气吹干法可有效的保证其结构的稳定性。
实施例7
制备胶红酵母菌体：称取胶红酵母发酵液4000g，离心15min，弃上清液，用蒸馏水洗后再次离心，重复操作4次，得到胶红酵母菌体(湿菌泥)。
准确称取胶红酵母菌体(湿菌泥)9g，加入30ml水(底物浓度30％)，加入β-葡聚糖酶(酶活10000U/g)0.2g和β-甘露聚糖酶(酶活60000U/g)0.3g，调节pH至5.0，50℃水浴2h，之后4200rpm，离心25min，弃去上清胶红酵母破壁菌体，收集胶红酵母破壁菌体，破壁情况如图1a-图1b所示。
胶红酵母破壁菌体中添加90ml无水乙醇，菌体与无水乙醇的质量体积比为1:9，充分混匀后，29℃浸提25min；
采用超声波进一步提取，得到海红虾青素粗提液。超声条件：功率为1000W，超声时间8s，间歇7s，超声115次，时间19min。
按照海红虾青素乙醇提取液：石油醚体积比为1:1加入石油醚萃取，轻轻晃动几下，以免出现乳化现象，待分层后加入再加适量蒸馏水，待上层石油醚相澄清为止，使虾青素等极性小的物质被充分萃取到石油醚相中，而在乙醇相中为极性较大的一些非虾青素类物质。将石油醚相的萃取液移入旋转瓶，用真空旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩温度25℃，真空度为-0.1MPa，浓缩至黏稠状停止。
浓缩液于通风橱中用氮气吹干，得到海红虾青素粗品。海红虾青素抗氧化能力很强，在空气中易被氧化，采用氮气吹干法可有效的保证其结构的稳定性。
实施例8
制备胶红酵母菌体：称取胶红酵母发酵液4000g，离心15min，弃上清液，用蒸馏水洗后再次离心，重复操作4次，得到胶红酵母菌体(湿菌泥)。
准确称取胶红酵母菌体(湿菌泥)9g，加入30ml水(底物浓度30％)，加入β-葡聚糖酶(酶活10000U/g)0.2g和β-甘露聚糖酶(酶活60000U/g)1.5g，调节pH至5.0，50℃水浴2h，之后4200rpm，离心25min，弃去上清胶红酵母破壁菌体，收集胶红酵母破壁菌体，破壁情况如图1a-图1b所示。
胶红酵母破壁菌体中添加90ml无水乙醇，菌体与无水乙醇的质量体积比为1:9，充分混匀后，28℃浸提25min；
采用超声波进一步提取，得到海红虾青素粗提液。超声条件：功率为 1000W，超声时间8s，间歇7s，超声115次，时间19min。
按照海红虾青素乙醇提取液：石油醚体积比为1:1加入石油醚萃取，轻轻晃动几下，以免出现乳化现象，待分层后加入再加适量蒸馏水，待上层石油醚相澄清为止，使虾青素等极性小的物质被充分萃取到石油醚相中，而在乙醇相中为极性较大的一些非虾青素类物质。将石油醚相的萃取液移入旋转瓶，用真空旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩温度31℃，真空度为-0.1MPa，浓缩至黏稠状停止。
浓缩液于通风橱中用氮气吹干，得到海红虾青素粗品。海红虾青素抗氧化能力很强，在空气中易被氧化，采用氮气吹干法可有效的保证其结构的稳定性。
与现有技术相比，本发明所述的从胶红酵母中提取海红虾青素的方法，达到了如下效果：
(1)本发明中采用酶法破壁比较彻底，破壁效果明显好于化学法，有利于保持海红虾青素结构的完整性，成本方面也存在较大的优势，可以进行大规模提取，容易实现工业化生产。
(2)本发明在浓缩海红虾青素时在氮气环境下吹干，由于海红虾青素抗氧化能力很强，在空气中易被氧化，采用氮气吹干法可有效的保证其结构的稳定性。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。