重组菌耦合表面活性剂强化纤维素酶回收再用制备生物乙醇的方法.pdf

本发明公开了重组菌耦合表面活性剂强化纤维素酶回收再用制备生物乙醇的方法，步骤：1)原料预处理；2)将预处理的木质纤维素与含有Tween80的营养液混合得到混合物1；3)在混合物1中加纤维素酶；加重组酿酒酵母表达菌发酵，固液分离，得到发酵液和残渣；4)在发酵液中加入预处理后的木质纤维素吸附，固液分离，得到液体和固体，液体经精馏得乙醇，固体和残渣混合，加入含有Tween80的营养液混合，得混合物；5)将步骤4)得到的混合物预酶解，添加重组酿酒酵母表达菌发酵，固液分离，得到发酵液和残渣；6)重复步骤4)-5)。本方法避免纤维素酶回收再利用过程中补加昂贵的β-葡萄糖苷酶，极大地降低了乙醇生产纤维素酶用量和成本。

权利要求书
1.  一种重组菌耦合表面活性剂强化纤维素酶回收再用制备生物乙醇的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)原料预处理：将粉碎后的木质纤维素预处理，低温烘干；
2)配制混合物：按比例将2.5-10g步骤1)得到的木质纤维素与50mL含有Tween80的营养液混合得到混合物1；
3)同步糖化发酵：将混合物1置于反应器中，在45-50℃下，按木质纤维素中纤维素的量计算，每g纤维素添加10-50FPU纤维素酶，预酶解12-24小时；降温至30-37℃，添加能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为1g/L-5g/L，在30-37℃发酵72-168小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣；
4)纤维素酶回收再用：在发酵液中加入与步骤2)相同质量的预处理后的木质纤维素，4-25℃下吸附60-120min，固液分离，得到液体和固体，所述液体经精馏分离得到乙醇，固体和发酵残渣混合，加入与步骤2)含有Tween80的营养液相同体积的含有Tween80的营养液混合，得混合物；
5)再次同步糖化发酵：将步骤4)得到的混合物置于反应器中,在45-50℃下，预酶解12-24小时；降温至30-37℃，添加能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为1g/L-5g/L，在30-37℃发酵72-168小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣；
6)重复步骤4)-5)；含有Tween80的营养液中Tween80的浓度为0.5g/L-20g/L。

2.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的木质纤维素为粉碎后的玉米芯、甘蔗渣、玉米秸秆、麦秆、稻草、木屑、废纸或柳枝稷。

3.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤(1)预处理的方法为稀酸预处理、碱法预处理、机械预处理、生物预处理、氨浸预处理、硫酸-氢氧化钠耦合预处理或硫酸-氨水耦合预处理。

4.  根据权利要求3所述的方法,其特征在于步骤(1)预处理的方法为硫酸-氨水耦合预处理。

说明书重组菌耦合表面活性剂强化纤维素酶回收再用制备生物乙醇的方法
技术领域
本发明涉及一种木质纤维素炼制生物乙醇过程中的纤维素酶回收方法，属于工业生物技术领域。
背景技术
木质纤维素制备生物乙醇是发展绿色、可持续能源最具潜力的生产路线之一，也是解决资源、环境和能源问题最为行之有效的方法之一。以木质纤维素为原料生产乙醇过程中，需使用纤维素酶，纤维素酶成本约占总生产成本的50％，已成为纤维素乙醇商业化进程的主要障碍。纤维素酶活力低、耗量大和成本高是其成本持续居高的主要原因。因此，为大幅降低纤维素酶成本，纤维素酶高效回收再用工艺的开发已成为解决这一问题的重要途径。
纤维素酶包括外切β-1,4-葡聚糖酶(CBH)、内切β-1,4-葡聚糖酶(EG)和纤维二糖酶(CB)。重吸附法回收纤维素酶因其工艺简单、设备要求低和成本低廉，已广泛地应用在纤维素酶回收再用工艺中，但该回收方法主要适用于发酵液中游离酶的回收。在大规模工业生产中，木质纤维素糖化发酵通常在高底物浓度下进行，以得到高浓度乙醇满足工业生产的经济性要求(﹥4％)。高浓度木质纤维素同步糖化发酵后，在固相中分布的纤维素酶含量显著增加，仅仅回收发酵液中的纤维素酶将极大地降低酶回收效率，发酵残渣上吸附酶的回收再用尤为重要。发酵液(重吸附法)和发酵残渣上纤维素酶回收主要是针对CHB和EG；CB由于缺乏吸附端，很难在上述过程中实现有效回收。因此，在酶回收后再用过程中通常需要额外补加与纤维二糖酶(CB)作用相同的β-葡萄糖苷酶以获得高乙醇产率和高纤维素转化率。然而，在工业上常用黑曲霉菌株生产β-葡萄糖苷酶，它价格昂贵，其在再用过程的补加显著增加了纤维素乙醇生产的酶成本。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的，在利用回收的纤维素酶实现木质纤维素制备生物乙醇时，需补加β-葡萄糖苷酶和纤维素酶回收效率低的不足，提供一种重组菌耦合表面活性剂强化纤维素酶回收再用制备生物乙醇的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种重组菌耦合表面活性剂强化纤维素酶回收再用制备生物乙醇的方法，包括以下步骤：
1)原料预处理：将粉碎后的木质纤维素预处理，低温烘干；
2)配制混合物：按比例将2.5-10g步骤1)得到的木质纤维素与50mL含有Tween80的营养液混合得到混合物1；
3)同步糖化发酵：将混合物1置于反应器中，在45-50℃下，按木质纤维素中纤维素的量计算，每g纤维素添加10-50FPU纤维素酶，预酶解12-24小时；降温至30-37℃，添加能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为1g/L-5g/L，在30-37℃发酵72-168小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣；
4)纤维素酶回收再用：在发酵液中加入与步骤2)相同质量的预处理后的木质纤维素，4-25℃下吸附60-120min，固液分离，得到液体和固体，所述液体经精馏分离得到乙醇，固体和发酵残渣混合，加入与步骤2)含有Tween80的营养液相同体积的含有Tween80的营养液混合，得混合物；
5)再次同步糖化发酵：将步骤4)得到的混合物置于反应器中,在45-50℃下，预酶解12-24小时；降温至30-37℃，添加能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为1g/L-5g/L，在30-37℃发酵72-168小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣；
6)重复步骤4)-5)；含有Tween80的营养液中Tween80的浓度为0.5g/L-20g/L。
木质纤维素优选为粉碎后的玉米芯、甘蔗渣、玉米秸秆、麦秆、稻草、木屑、废纸或柳枝稷。
步骤(1)预处理的方法优选为稀酸预处理、碱法预处理、机械预处理、生物预处理、氨浸预处理、硫酸-氢氧化钠耦合预处理或硫酸-氨水耦合预处理，最好是硫酸-氨水耦合预处理。
本发明的优点：
(1)本发明的方法由于采用了能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌，避免纤维素酶回收再利用过程中昂贵的β-葡萄糖苷酶的补加，极大地降低了乙醇生产的纤维素酶用量和成本；
(2)发酵液和发酵残渣中纤维素酶共回收显著提高了高底物浓度下同步糖化发酵后的酶回收效率；
(3)添加表面活性剂Tween80进一步强化纤维素酶的回收效率；
(4)该方法工艺简单、操作方便、成本低廉，易于建立起经济可行的纤维素酶回收工艺，在乙醇工业化生产中有非常重要的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中纤维素酶回收再用效果图。
图2为实施例2中纤维素酶回收再用效果图。
具体实施方法
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
下面的实施例是为了使本领域技术人员能够更好地理解本发明，但并不对权利要求作任何限定。
本发明各实施例采用的能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌是以中国专利号201110034926.9，发明名称为：编码β-葡萄糖苷酶的基因及重组表达载体及重组酿酒酵母表达菌株及应用公开的“重组酿酒酵母”为例，但并不以此为限定，凡是能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌均可用于本发明。
各实施例中用于可以分泌编码β-葡萄糖苷酶的重组酵母菌的扩大培养的培养基为YPD培养基：
含有Tween80的营养液：在pH＝4.9，50mM柠檬酸钠缓冲液中添加了终浓度为0.5g/L的(NH4)2HPO4，0.025g/L的MgSO4.7H2O，1.0g/L的酵母膏，40mg/L的四环素和Tween80。
实施例1
一种重组菌耦合表面活性剂强化纤维素酶回收再用制备生物乙醇的方法，包括以下步骤：
1)原料预处理：将粉碎后的玉米芯(木质纤维素)通过硫酸-氨水耦合的方法预处理，低温烘干；
2)配制混合物：将5g步骤1)得到木质纤维素与50mL含有Tween80的营养液混合得到混合物1；
3)同步糖化发酵：将混合物1置于摇瓶中，在50℃下，在摇瓶中添加纤维素酶，按木质纤维素中纤维素的量计算，每g纤维素添加纤维素酶30FPU(纤维素占木质纤维素的质量比为70％)，预酶解12小时；降温至30℃，添加扩大培养后的能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为2g/L，在30℃发酵96小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣；
4)纤维素酶回收再用：在发酵液中加入5g预处理后的木质纤维素，20℃下吸附120min，固液分离，得到液体和固体，所述液体经精馏分离得到乙醇，固体和发酵残渣混合，加入50mL含有Tween80的营养液混合，得混合物；
5)再次同步糖化发酵：将步骤4)得到的混合物置于摇瓶中,在50℃下，预酶解12小时；降温至30℃，添加扩大培养后的能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为2g/L，在30℃发酵96小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣；
6)重复1次步骤4)-5)；含有Tween80的营养液中Tween80的浓度为5g/L。
(在重复步骤4)时，步骤4)的发酵液是上一次反应步骤5)获得的发酵液)
以乙醇浓度和纤维素酶生产能力为考察指标，评价纤维素酶回收及利用效率，如图1所示。
第一次同步糖化发酵，即步骤1)-3)，从步骤3)获得的发酵液取微量检测乙醇浓度；
第二次同步糖化发酵，即步骤5)，从步骤5)获得的发酵液取微量检测乙醇浓度；
第三次，即重复1次步骤4)-5)，从重复1次的步骤5)获得的发酵液取微量检测乙醇浓度；
测发酵液中乙醇的浓度：三次所得乙醇浓度依次为33.05g/L、29.98g/L和28.36g/L，产醇能力回收率为90.7％和85.8％。
实验证明，用稻草、木屑、废纸或柳枝稷替代本实施例的玉米芯，其它同本实施例，其效果与本实施例的效果相似。
实验证明，稀酸预处理、机械预处理、生物预处理替代本实施例的硫酸-氨水耦合预处理其它同本实施例，其效果与本实施例的效果相似。
实施例2
重组菌耦合表面活性剂强化纤维素酶回收再用制备生物乙醇的方法，包括以下步骤：
1)原料预处理：将粉碎后的玉米秸秆(木质纤维素)通过氨浸的方法预处理，低温烘干；
2)配制混合物：将5g步骤1)得到木质纤维素与50mL含有Tween80的营养液混合得到混合物1；
3)同步糖化发酵：将混合物1置于摇瓶中，在45℃下，在摇瓶中添加纤维素酶，按木质纤维素中纤维素的量计算，每g纤维素添加纤维素酶30FPU，预酶解24小时；降温至35℃，添加扩大培养后的能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为1g/L，在35℃ 发酵168小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣；
4)纤维素酶回收再用：在发酵液中加入5g预处理后的木质纤维素，4℃下吸附120min，固液分离，得到液体和固体，所述液体经精馏分离得到乙醇，所述固体和发酵残渣混合，加入50mL含有Tween80的营养液混合，得混合物；
5)再次同步糖化发酵：将步骤4)得到的混合物置于摇瓶中,在45℃下，预酶解24小时；降温至35℃，添加扩大培养后的能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为1g/L，在35℃发酵168小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣；
6)重复1次步骤4)-5)；含有Tween80的营养液中Tween80的浓度为0.5g/L。
以乙醇浓度和纤维素酶生产能力为考察指标，评价纤维素酶回收及利用效率，如图2所示。
第一次同步糖化发酵，即步骤1)-3)，从步骤3)获得的发酵液取微量检测乙醇浓度；
第二次同步糖化发酵，即步骤5)，从步骤5)获得的发酵液取微量检测乙醇浓度；
第三次，即重复1次步骤4)-5)，从重复1次的步骤5)获得的发酵液取微量检测乙醇浓度；
测发酵液中乙醇的浓度：三次所得乙醇浓度依次为32.23g/L、27.65g/L和24.53g/L，产醇能力回收率为85.8％和76.1％。
实施例3
重组菌耦合表面活性剂强化纤维素酶回收再用制备生物乙醇的方法，包括以下步骤：
1)原料预处理：将粉碎后的麦秆(木质纤维素)通过碱法(20g/L氢氧化钠水溶液)预处理，低温烘干；
2)配制混合物：将10g步骤1)得到木质纤维素与50mL含有Tween80的营养液混合得到混合物1；
3)同步糖化发酵：将混合物1置于摇瓶中，在50℃下，在摇瓶中添加纤维素酶，按木质纤维素中纤维素的量计算，每g纤维素添加纤维素酶50FPU，预酶解12小时；降温至37℃，添加扩大培养后的能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为5g/L，在37℃发酵72小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣；
4)纤维素酶回收再用：在发酵液中加入10g预处理后的木质纤维素，25℃下吸附60min，固液分离，得到液体和固体，所述液体经精馏分离得到乙醇，所述固体和发酵残渣混合，加入50mL含有Tween80的营养液混合，得混合物；
5)再次同步糖化发酵：将步骤4)得到的混合物置于摇瓶中,在50℃下，预酶解12小时；降温至37℃，添加扩大培养后的能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为5g/L，在37℃发酵72小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣；
6)重复2次步骤4)-5)；含有Tween80的营养液中Tween80的浓度为20g/L。
以乙醇浓度和纤维素酶生产能力为考察指标，评价纤维素酶回收及利用效率。
第一次同步糖化发酵，即步骤1)-3)，从步骤3)获得的发酵液取微量检测乙醇浓度；
第二次同步糖化发酵，即步骤5)，从步骤5)获得的发酵液取微量检测乙醇浓度；
第三次，即重复1次步骤4)-5)，从重复1次的步骤5)获得的发酵液取微量检测乙醇 浓度；
第四次，即重复1次步骤4)-5)，从重复1次的步骤5)获得的发酵液取微量检测乙醇浓度；
测发酵液中乙醇的浓度：四次所得乙醇浓度依次为51.62g/L、47.41g/L、43.85g/L和35.52g/L，产醇能力回收率为91.8％、84.9％和68.8％。
实施例4
重组菌耦合表面活性剂强化纤维素酶回收再用制备生物乙醇的方法，包括以下步骤：
1)原料预处理：将粉碎后的甘蔗渣(木质纤维素)通过硫酸-氢氧化钠耦合预处理，低温烘干；
2)配制混合物：将2.5g步骤1)得到木质纤维素与50mL含有Tween80的营养液混合得到混合物1；
3)同步糖化发酵：将混合物1置于摇瓶中，在50℃下，在摇瓶中添加纤维素酶，按木质纤维素中纤维素的量计算，每g纤维素添加纤维素酶10FPU，预酶解12小时；降温至37℃，添加扩大培养后的能分泌β‐葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为5g/L，在37℃发酵168小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣；
4)纤维素酶回收再用：在发酵液中加入2.5g预处理后的木质纤维素，25℃下吸附60min，固液分离，得到液体和固体，所述液体经精馏分离得到乙醇，所述固体和发酵残渣混合，加入50mL含有Tween80的营养液混合，得混合物；
5)再次同步糖化发酵：将步骤4)得到的混合物置于摇瓶中,在50℃下，预酶解12小时；降温至37℃，添加扩大培养后的能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为5g/L，在37℃发酵168小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣；
6)重复1次步骤4)-5)；含有Tween80的营养液中Tween80的浓度为20g/L。
以乙醇浓度和纤维素酶生产能力为考察指标，评价纤维素酶回收及利用效率。
第一次同步糖化发酵，即步骤1)-3)，从步骤3)获得的发酵液取微量检测乙醇浓度；
第二次同步糖化发酵，即步骤5)，从步骤5)获得的发酵液取微量检测乙醇浓度；
第三次，即重复1次步骤4)-5)，从重复1次的步骤5)获得的发酵液取微量检测乙醇浓度；
测发酵液中乙醇的浓度：三次所得乙醇浓度依次为18.23g/L、16.22g/L和13.68g/L，产醇能力回收率为88.9％和75.0％。