利用大豆总DNA导入改良大麦籽粒的营养品质 【技术领域】
本发明涉及作物育种领域，更具体地说，本发明涉及一种产生蛋白质含量提高的大麦种子的方法，以及含有所述大麦种子的饲料。
背景技术
大麦是一种广泛分布的作物，总面积与总产量在世界各类作物中居第四位。在我国，大麦也是一种重要的农作物，约有70％以上用于饲料加工。作为饲料的大麦种子的蛋白质含量和氨基酸含量是衡量大麦品质的重要指标。据报道普通大麦种子蛋白质含量较低，而且氨基酸组分不均衡，尤其第一限制性氨基酸赖氨酸的平均含量仅为0.47％(孙桂华等，辽宁农业科学，1996，3：38-41；桂连起等，粮食与油脂，2001，2：40-42)。根据Munch等人(俞志隆等，大麦遗传与改良，上海科技出版社，1994)的试验显示，优质饲料大麦的饲喂报酬率大大高于一般大麦。因此在目前耕地不断减少，单产已达较高水平的情况下，种植优质高蛋白大麦是提高大麦生产量的主要途径。又由于近年来在许多国家先后因使用动物饲料不当而引起疯牛病的恐慌事件时有发生，在这种情况下培育利用优质地高蛋白饲料大麦已是当务之急。
在大麦高蛋白育种中，常规育种是最常用的方法。尽管常规育种方法在改良作物种子蛋白质方面已取得了一些进展，如高赖氨酸谷物和大麦突变体的获得，但众所周知利用纯粹的传统杂交育种，要获得稳定的后代往往需要花费很长的时间(繁殖9-10代以上)，而且提高蛋白质含量的幅度也不高，同时由常规育种选育的高蛋白大麦大多同时存在产量低、抗虫及抗病性差等不良性状，这是由于对于常规育种大麦的产量和品质之间常存在着不利的负相关关系，使它们在农业生产中难以被推广应用(NelsonO E，Proc.of a panel meeting organized by FAO/IAEA，Sweden，1968；朱睦元等，大麦育种与生物工程，上海科学技术出版社，1999，p127)。
20世纪90年代，有报道(吴耀武，西北农业学报，1994，3(1)：9-12)尝试进行豌豆与大麦原生质体融合，然而该报道只描述了关于如何提高两种物种原生质体融合频率的条件，至今未有后代植株成功再生的报道。从资料显示异源物种原生质体融合后代的再生的确是很困难的。
随着基因工程技术的发展，植物功能基因分离技术也不断完善。先后有人尝试利用某个功能基因的导入改良作物种子的蛋白质含量及质量。目前这方面的报道主要是水稻等作物，大麦在这方面的研究还未见报道。如Momma K等试图提高稻米的蛋白质含量，将一个大豆贮藏蛋白基因导入水稻，转基因后代检测显示稻米蛋白质含量比对照提高20％(Momma K，等，Biosci Biotechnol Biochem，1999，63(2)：314-318)。为提高水稻的赖氨酸含量，高越峰等人将源于四棱豆的高赖氨酸蛋白基因导入水稻，经检测大部分转基因水稻叶片中赖氨酸含量有不同程度提高，最高达16.04％(高越峰等，植物学报，2001，43(5)：506-511)。张秀君等将两个含高赖氨酸蛋白基因cDNA的表达载体导入玉米，经测定13株T1代种子的赖氨酸含量，其中有3株含量提高10％以上(张秀君等，农业生物技术学报，1999，7(4)：363-367)。孙学辉等采用同样的方法也获得赖氨酸含量最高提高16％的转基因玉米植株(孙学辉等，农业生物技术学报，2001，9(2)：156-158)。从这些报道显示，虽然采用1-2个已知功能的基因导入作物的确能够提高种子的蛋白质含量和质量，但提高的幅度最高也仅为20％。
种子蛋白质是由多基因编码的性状(张宪银，浙江农业学报，2000，12(2)：108-111)，因此只采用导入个别基因的方式，可能很难实现大幅度地提高作物种子蛋白质含量的目的。
利用总DNA导入是基因工程研究中另一种无需载体的导入法。利用此方法改良作物种子的营养品质虽然目前也有报道，如朱新产等将豌豆DNA导入小麦，使小麦的蛋白质、总氨基酸、赖氨酸含量分别提高16.22％，15.45％和31.42％(朱新产等，莱阳农学院学报，2002，19(2)：79-82)，但由于小麦与大麦是不同的物种，遗传背景有极大的差异性，大麦与小麦在试验中不存在可比性。
在20世纪70年代周光宇提出了DNA片段杂交假说，并在80年代建立了利用花粉管通道法直接导入外源DNA的技术。目前总DNA直接导入技术的操作已逐渐扩展到浸种法、茎注射法等。利用基因枪法导入总DNA改良作物品质的操作不论是在大麦方面从未有人尝试过，在其他所有作物改良研究中也从未有人做过。
因此，本领域中仍然需要一种新的大幅度提高大麦蛋白质含量的方法。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种蛋白质含量提高的大麦种子的产生方法。
本发明提供了一种蛋白质含量提高的大麦种子的产生方法，该方法包括：
a)提供大豆总DNA和大麦种子；
b)用基因枪法将大豆总DNA导入大麦种子中；
c)使步骤b)获得的种子生长并收获其后代种子；
d)鉴定出蛋白质含量提高的后代大麦种子。
本发明另一方面还提供了一种饲料，该饲料含有用上述方法获得的蛋白质含量有所提高的大麦种子。
本发明还有一方面提供了上述方法获得的蛋白质含量有所提高的大麦种子用于饲料的用途。
本发明建立了一种快速且操作简便的改良大麦种子营养品质的方法，利用该方法获得的大麦第一代种子在蛋白质、总氨基酸和赖氨酸含量上最高可分别比对照提高47.40％、46.52％和64.44％。而且，经过对其后代进行表型分析，没有发现其它明显的表型变异现象，其高产、抗病性等性状并没有因为种子蛋白质含量和质量的提高而发生变化，并且在数代后可获得能够稳定遗传的高蛋白品系。因此，从该大麦种子可制得优质的饲料，使饲喂报酬率提高。
【具体实施方式】
具体地说，本发明提供了一种蛋白质含量提高的大麦种子的产生方法，该方法包括：
a)提供大豆总DNA和大麦种子；
b)用基因枪法将大豆总DNA导入大麦种子中；
c)使步骤b)获得的种子生长并收获其后代种子；
d)鉴定出蛋白质含量提高的后代种子。
在一个较佳的实施方案中，所述大豆总DNA可从大豆组织如花、叶、茎、苗、种子等获得。更佳的是，从大豆种子的胚根和胚芽中获得大豆总DNA。
从大豆组织中获得大豆总DNA的方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如可采用陈永强等报道(遗传，1979，1(1)：39-40；Bendich A.J等，Plant Physiology，1967，42(7)：959-967)的快速提取植物组织DNA的方法来制备获得大豆总DNA。
本发明方法中所用的大豆和大麦并不局限于任何特定的品种(系)，但是为了使大麦种子蛋白质含量有较大的提高，宜选用蛋白质含量较高的品系。另外，在选择大麦品系，宜根据大麦抗病性、产量等性状来选择较佳的大麦品种(系)作为受体。
在本发明的方法中，采用基因枪(基因颗粒轰击)轰击方法将大豆总DNA转化到大麦种子。基因枪轰击方法是本领域技术人员所熟知的，它利用小颗粒进行高速弹道贯穿，在这些小珠或颗粒的基质中带有核酸，从而将目标基因导入靶细胞内。该方法例如可参见Klein等，Nature，1987，327：70-73和Weeks等，Plant Physiology，1993，102：1077-1084)。本领域技术人员可根据公知技术来确定待导入总DNA的浓度以及压力等实验条件进行基因枪的条件。在本发明的一个较佳的方案中，基因枪处理宜采用1300psi和1500psi的压力，更佳的宜采用1300psi的压力。
在导入大豆总DNA后，可用常规方法使大麦种子生长并栽培获得后代种子，然后选出蛋白质有所提高的单株进行播种，连续数代后得到遗传性状稳定的种子。大麦种子的蛋白质含量和氨基酸含量的测定可用本领域常规技术进行。
在用本发明方法获得了高产、抗病且蛋白质含量大幅度提高的大麦种子后，就可对其进行饲料加工，获得优质的大麦饲料。
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
实施例
1.供试材料的准备
外源大豆DNA供体为南京农业大学大豆研究所提供的南农87-C38大青豆(Glycine max)；受体大麦为上海市农业科学院作物育种栽培研究所大麦室提供的高产、抗病性好大麦品系980662。
2.总DNA制备
大青豆干种子经蒸馏水浸泡24小时后，剥取胚根和胚芽。采用陈永祥和Bendich等人的方法(陈永强，遗传，1979，1(1)：39-40；Bendich A.J等，Plant Physiology，1967，42(7)：959-967)为基础的快速提取植物组织DNA的方法制备供体DNA。提纯后的DNA经紫外光谱测定A260/230＝2.31，A260/280＝2.03，符合作为外源DNA导入的要求。
3.外源DNA的导入
980662大麦种子经20％次氯酸钠灭菌后，无菌水浸种24小时。将萌动种子铺于1/2MS盐分培养基(Murashige T.等，Physiol Plant，15：473-479)的中央，芽点朝上，24小时后进行基因枪轰击(Klein等人，Nature，1987，327：70-73)。大豆总DNA浓度为3400ug/ul，基因枪处理分别采用两种压力：1300psi和1500psi，每皿打两枪。30小时后将种子移入相同培养基培养。出苗后与未经DNA处理的对照一起种植于试验田中，经常规栽培获得后代种子。
4.后代材料的获得
从第一代材料中，选出蛋白质含量较高的单株于当年秋按穗行播种，获得第二代种子。再选出蛋白质含量较高的单株继续种植获得第三代种子，同样操作收获第四代种子。
5.大麦种子处理
在大麦穗子基部选择五粒饱满种子，去种皮，于研钵内研磨成粉，60℃烘4小时，放置干燥瓶中备用。
6.大麦种子蛋白质含量和氨基酸含量分析
种子蛋白质含量测定采用微量凯氏定氮法(朱展才，稻麦质量分析，中国食品出版社，1988)。氨基酸含量采用HITACHI(日立)835-50型氨基酸自动分析仪进行测定。
利用基因枪法将大豆总DNA导入大麦品系980662，两种压力处理共获得144个单株后代(1300psi：74个单株，1500psi：70单株)(见表1)。如表1所示，在两种压力处理中各获得6个单株种子蛋白质含量比当年对照(13.29％)有明显提高的后代。它们的蛋白质含量分别是1300psi：16.70％、16.52％、17.91％、19.59％、17.44％和18.56％；1500psi：18.46％、17.31％、16.51％、18.81％、18.81和19.02％。方差分析显示，与对照组都有极显著的差异(P＜0.01)。第一代种子蛋白质含量最高可比对照提高47.40％。
在检测第一代大麦种子蛋白质含量的基础上，对这12个高蛋白单株的种子进行氨基酸含量分析(结果见表1)。测定结果显示，两种处理获得的高蛋白变异后代随着种子蛋白质含量增加的同时，种子总氨基酸和各种氨基酸含量也有明显提高。经直线相关分析显示，导入大豆总DNA的后代种子总氨基酸含量与蛋白质含量呈正相关关系，赖氨酸等7种测定的必需氨基酸含量与总氨基酸含量也都呈正相关关系。对照种子赖氨酸含量为0.45％，经基因枪导入大豆总DNA后获得的高蛋白大麦种子赖氨酸含量最高值达到0.74％，比对照提高了64.44％。第一代高蛋白材料又经过三代继续种植筛选，在第四代获得了蛋白质含量能够稳定遗传的高蛋白株系。
表1导入大豆总DNA的第一代大麦后代种子各氨基酸、总氨基酸和蛋白质含量(mg/100mg) 处理 方法 株 系 编 号 各氨基酸含量 总氨 基酸 蛋白 含量 Lys His Aag Asp Thr Ser Glu Pro Gly Ala Cys Val Met Ile Leu Tyr Phe 对照 0.45 0.31 0.70 0.78 0.41 0.38 3.72 1.35 0.56 0.57 0.18 0.70 0.25 0.55 1.04 0.31 0.79 13.09 13.29 1300psi 基因枪 1 0.54 0.37 0.81 0.89 0.53 0.60 4.62 1.66 0.65 0.65 0.25 0.82 0.26 0.67 1.25 0.45 1.06 16.08 16.70 2 0.56 0.26 0.85 0.91 0.55 0.66 5.02 1.77 0.66 0.67 0.26 0.85 0.27 0.70 1.31 0.48 1.14 16.92 16.52 3 0.62 0.39 0.88 1.02 0.56 0.59 4.48 1.82 0.65 0.71 0.26 0.91 0.28 0.75 1.37 0.47 1.15 17.30 17.91 4 0.58 0.44 0.91 1.01 0.88 0.52 5.41 1.95 0.72 0.71 0.26 0.93 0.29 0.78 1.42 0.46 1.23 18.50 19.59 5 0.59 0.43 0.93 1.00 0.56 0.59 5.27 1.94 0.69 0.71 0.27 0.92 0.30 0.78 1.42 0.49 1.23 18.12 17.44 6 0.71 0.45 1.04 1.14 0.63 0.74 5.26 1.89 0.78 0.79 0.31 0.95 0.28 0.78 1.45 0.52 1.29 19.01 18.56 1500psi 基因枪 7 0.74 0.45 1.02 1.19 0.56 0.54 5.44 1.96 0.78 0.76 0.29 0.97 0.32 0.80 1.45 0.50 1.25 19.02 18.46 8 0.56 0.38 0.83 0.92 0.55 0.65 5.06 1.77 0.59 0.67 0.27 0.85 0.26 0.71 1.32 0.49 1.15 17.03 17.31 9 0.55 0.38 0.80 0.93 0.45 0.38 4.72 1.59 0.67 0.66 0.20 0.81 0.26 0.68 1.25 0.39 1.06 15.81 16.51 10 0.57 0.41 0.87 0.94 0.54 0.58 5.07 1.77 0.68 0.69 0.27 0.89 0.30 0.74 1.36 0.46 1.16 17.30 18.81 11 0.58 0.42 0.90 0.98 0.56 0.62 5.25 1.97 0.68 0.70 0.26 0.90 0.28 0.77 1.38 0.47 1.24 17.96 18.81 12 0.62 0.43 0.95 1.04 0.60 0.69 5.60 2.12 0.74 0.74 0.29 0.95 0.31 0.80 1.47 0.52 1.31 19.18 19.02
综合四代的分析结果可以得知，利用基因枪法能够提高大麦种子的蛋白质含量和质量，而且效果很好，在第四代即可获得能够稳定遗传的高蛋白品系。
虽然导入大麦中的DNA不是一个目的性非常明确的高蛋白基因，而且由于没有抗性标记基因协助筛选，从而增加了后期筛选的工作量。但从食品的安全性角度考虑，目前许多可能存留抗生素等抗性选择标记基因的转基因作物的推广已受到限制，而本发明中利用总DNA导入法培育的高蛋白大麦中不存在任何可能影响动物或人类的不利基因，因此其推广不会受到限制。
在本发明实施过程中，还对经大豆DNA导入的后代进行表型分析，除了在第一代基因枪法处理后代中曾出现两棵植株明显高于对照的情况外，没有发现其它明显的表型变异现象，其高产、抗病性等性状因为种子蛋白质含量和质量的提高而发生变化。在本发明中成功培育高蛋白大麦品系表明，利用基因枪法导入大豆总DNA的方法不仅可以快速有效地提高大麦种子的蛋白质含量和质量，而且还能克服大麦高产与高蛋白之间的负相关性。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。