重组的DNA质粒，其构建方法，含该质粒的多价疫苗及其应用 (1)技术领域
本发明涉及一种多价疫苗及其制备方法，本发明也涉及所述的多价疫苗在制备抗肝癌药物中的应用。
(2)背景技术
肝癌的死亡率在所有癌症中名列第三，每年全世界有数以百万计的病人死于肝癌，尤其以东南亚与非洲南部比例最高。虽然目前肝癌的发病原因并不明确，但无外乎化学致癌与病毒致癌。就病毒致癌而言，流行病学统计数据表明，乙型肝炎病毒携带者患肝癌的比例是20-25％，丙型肝炎病毒携带者为25-30％，据保守估计，目前全中国病毒(乙、丙)携带者约总人口5％。据此推算，现有人口中约有几千万人将在其人生的某一阶段得肝癌，这估算尚不包括化学致癌的肝癌患者。
在确诊之后，肝癌患者一般仅能存活6个月左右。目前除了肝移植及外科手术切除癌肿之后，没有其他有效的治疗手段。而这两种方法本身具有很大的局限性。因此，人们很需要寻找一种安全、方便、有效的治疗肝癌的手段。
注射疫苗是防止疾病的发生与扩散的有效手段，其本身也有安全与经济的特点。常规疫苗常为免疫促进剂，其作用是产生抵抗特定抗原地免疫记忆功能来预防疾病的发生。通常这类的免疫反应兼有B淋巴细胞和T淋巴细胞两部分。
肿瘤的免疫治疗是近年来癌症治疗中的最新概念与技术，其原理是通过注射肿瘤疫苗刺激机体产生抗肿瘤相关抗原的免疫反应，来控制肿瘤增长，甚至导致肿瘤萎缩。近年来已有不少蛋白质被确定与某几类癌症有关，为癌症的免疫治疗提供了广阔的前景。
临床与实验室大量结果证明，机体的细胞免疫系统在肿瘤免疫中起着重要的作用。一般认为，细胞毒T淋巴细胞(CTL)的作用尤其突出。如果肿瘤细胞表面带有I类组织相容性抗原(MHC class I)所递呈的多肽抗原，其对应的CTL能够识别并诱导肿瘤细胞的自灭过程。因此，CTL为基础的肿瘤免疫治疗具有专一性强，毒性低，副作用小等优点，是固体肿瘤手术切除前后的最佳辅助治疗手段，以防止癌细胞的扩散与转移。
肿瘤疫苗制剂均由其细胞因子组成，分为以下几类：癌症细胞来源型、重组蛋白型、合成多肽型、重组病毒型及脱氧核糖核酸(DNA)型。多项临床试验的结果表明重组蛋白与合成多肽不能在癌症病人机内产生有效并持久的抗肿瘤免疫反应。从病人的肿瘤采样中分离癌细胞，经体外灭活或提取细胞匀浆，注射回病人机内的治疗方法，虽然有一些比较成功的临床观察结果，在绝大部分的病例中是个体病人特异性的，这类制剂只能用于材料来源的病人而不能用于任何其他同类病人。重组病毒型疫苗则具有长期潜在的生物活性的危险。
近年来肿瘤免疫治疗的一个前沿领域是DNA疫苗的研发。简单而言，是将所要表达的基因产物或抗原决定簇构建到个哺乳类细胞表达盒中。这些编码的DNA分子被注入病体内后，可转染到抗原递呈细胞(Antigen presenting cells)中表达并递呈所编码的肿瘤相关抗原，刺激并活化CTL，这些肿瘤免疫信号特异的CTL将寻找并消灭带有此类信号的肿瘤细胞。裸露DNA疫苗具有多方面的优越性，包括抗原表达的严密调控，副作用小，低毒性。从经济的角度来讲，它具有构建相对比较容易以及生产工艺及制剂的比较简单。然而，如何提高裸露DNA疫苗的效价以及如何构建指定的编码序列，指导抗原递呈细胞在其细胞膜表表达出所设计的信号，一直是这一领域的研究人员所面临的难题。
(3)发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组的DNA质粒。
本发明的另一个目的是提供所述质粒的制备方法。
本发明还有一个目的是提供含有所述质粒，通过采用多效价的模型，二元表达系统来提高裸露DNA疫苗的效价的多价疫苗。
本发明的再一个目的是提供所述的多价疫苗在制备抗肝癌药物中的应用。
本发明的发明目的是通过如下的构思来实现的：一种重组DNA质粒，包括肝癌相关多肽抗原决定簇和白细胞介素。所述的多肽抗原决定簇的序列如SEQ.NO.1所示。
所述的白细胞介素选自共激活因子B7-1(CD-80)，IL-2，GM-CSF或CD40配体，优选的是共激活因子B7-1(CD-80)。
在一个实施方案中，所述的质粒还进一步包括多个CpG序列，在下列参考文献中公开了有关CpG的技术内容：
Takeshita，F.等，Cutting edge：Role oftoll-like receptor 9in CpG DNA-inducedactivation of human cells.J.Immunol.(2001)，3555-3558.
Verthelyi，D.等，Human peripheral blood cells differentially recognize andrespond to two distinct CpG motifs.J.Immunol.(2001)，2372-2377.
优选的是有三个CpG，保证质粒中CpG有一定程度的暴露，能与免疫细胞的TLR(Toll-1ike receptor 9)结合，起到活化免疫细胞的作用。
更特定的是，所述的质粒具有SEQ No.2的序列
所述的质粒是这样制备的：A)构建所述的蛋白多肽的具有SEQ.No.1的编码，
所编码的氨基酸顺序如下：
B)克隆白细胞介素编码cDNA；
C)质粒整合：将步骤A)制得的肝癌相关多价抗原决定簇编码区和B)步骤得到的白细胞介素编码cDNA克隆到疫苗表达载体pTope，所述的pTope选自质粒pVAX1(Invitrogen出售)，或是对pVAX1作如下的构建：以MHC Class I promoter取代pVAX1中的CMV promoter，以SV40 polyA取代pVAX1中的BGH polyA。
一种多价DNA疫苗，包括如上所述的质粒，它在体内表达含有价抗原决定簇的蛋白多肽和一个白血病介素，所述的多肽选自下列的一种或其组合：
HBx 92-100：Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly-Leu (SEQ.NO.3)
MAGE1 41-49：Gly-Thr-Leu-Glu-Glu-Val-Pro-Thr-Ala (SEQ.NO.4)
MAGE1 278-286：Lys-Val-Leu-Glu-Tyr-Val-Ile-Lys-Val (SEQ.NO.5)
MAGE1 270-279：Ala-Leu-Ala-Glu-Thr-Ser-Tyr-Val-Lys-Val (SEQ.NO.6)
HBx 115-123：Cys-Val-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu(SEQ.NO.7)
MAGE3 271-279：Phe-Leu-Trp-Gly-Pro-Arg-Ala-Leu-Val(SEQ.NO.8)
MAGE3 277-286：Ala-Leu-Val-Glu-Thr-Ser-Tyr-Val-Lys-Val(SEQ.NO.9)。
本发明还涉及上述的多价DNA疫苗在制备抗肝癌药物中的应用。
(4)附图说明
图1显示了本发明所构建的特定质粒。
图2显示了本发明疫苗在HLA-A转基因小鼠中所产生的对本发明疫苗有特异性的细胞毒T淋巴细胞。
图3显示了带有多肽抗原的T2靶细胞的细胞裂解活力。
图4显示了用HBx 92-100特异细胞毒T淋巴细胞对肝癌细胞产生的裂解作用。
图5显示了免疫后质粒的拷贝情况。
(5)具体实施方式
下面结合具体的实施方案和具体构思进一步阐述本发明。
1.肝癌相关抗原的选择
肿瘤细胞所表达的抗原可广谱地分为两大类：肿瘤分化抗原与癌睾类抗原。前者特异地在某种特定种类肿瘤细胞表达；后者则在细胞分化的初期有表达，在成熟的正常细胞中则消失，但在脱分化的肿瘤细胞中又重新出现。此类抗原往往在多种不同肿瘤中均有表达。
基于对大量有关文献资料查考比对的结果，发明人选择乙肝病毒X蛋白(HBx)以及癌睾类抗原MAGE1，3，10作为本肝癌疫苗的目标抗原。
HBx是乙型肝炎病毒所编码的一个非结构蛋白，它的主要功能是与病毒DNA复制有关。大量数据表明在乙型病毒携带者中，检验呈DNA阳性的患者中肝癌病人的比例为表面抗原阳性病人的数十倍，表明HBx在肝癌细胞的作用。
MAGE1与MAGE3在肝癌组织细胞中的表达已被广泛地分析，从循环血取样，活检取样及手术切除取样中，MAGE1的阳性率在48％至81％之间，MAGE3的阳性率略低，约为34％，所以选择MAGE-1与MAGE-3能够有相对广谱性。
2.组织相容性抗原A的CTL抗原决定簇的选择
本发明的疫苗是利用机体本身的免疫系统中CTL来达到杀伤肿瘤细胞的目的，其使用的人群受白细胞分型的限制。本发明所针对的人群为HLA-A2亚型，约占人口的45％左右。
我们运用两种不同的CTL抗原决定簇预测法(NIH与Rammensee法)来推测四个目标抗原中(HBx，MAGE-1，3，10)所含有的HLA-A2的多肽决定簇，并选择指数较高的多肽(NIH＞15，R＞20)决定簇来测定结合指数。
这些多肽并进一步被用来免疫HLA-A2的转基因小鼠筛选出具有免疫活性的多肽为以下：
HBx 92-100：Val-Leu-His-Lys-Arg-Thr-Leu-Gly-Leu
MAGE1 41-49：Gly-Thr-Leu-Glu-Glu-Val-Pro-Thr-Ala
MAGE1 278-286：Lys-Val-Leu-Glu-Tyr-Val-Ile-Lys-Val
MAGE1 270-279：Ala-Leu-Ala-Glu-Thr-Ser-Tyr-Val-Lys-Val
HBx 115-123：Cys-Val-Phe-Lys-Asp-Trp-Glu-Glu-Leu
MAGE3 271-279：Phe-Leu-Trp-Gly-Pro-Arg-Ala-Leu-Val
MAGE3 277-286：Ala-Leu-Val-Glu-Thr-Ser-Tyr-Val-Lys-Val
3.构建含多价抗原决定簇的蛋白多肽的编码区
为了能在一个药物充分运用上述具免疫活性的多肽抗原决定簇，我们采用重组DNA表达质粒作为剂型。多肽抗原决定簇的编码顺序以“串珠”形式串联之后，成为一段编码86个氨基酸的DNA片段，其顺序如SEQ.NO.1所示。
所编码的氨基酸顺序如SEQ.NO.10所示。
4.克服免疫耐受性与癌症患者的免疫低迷
本发明的质粒可充分运用国外近年来在CpG领域的成果(参见上文的参考文献)。在本发明所构建的重组DNA质粒中，在多个位点植入了不同的CpG序列，保证质粒中CpG有一定程度的暴露，能与免疫细胞的TLR(Toll-like receptor9)结合，起到活化免疫细胞的作用。
此外，本发明的疫苗在人体的目标靶细胞是树突状抗原递呈细胞，而此类细胞在体内大部分是以非成熟型的形式存在。为加快接受了疫苗DNA的树突状抗原递呈细胞的成熟与活化，我们在本发明中引入了一个二元表达系统。这一质粒除了表达含多价抗原决定簇的蛋白多肽之外，同时表达一个白细胞介素，在本设计中，此一白细胞介素为共激活因子B7-1(CD-80)。
脑脊髓炎病毒的核糖体内位起始区(IRES)已被广泛用于二元表达系统中，其特点是大大缩小双表达盒所需的质粒大小。我们在实验动物及体外细胞实验中发现由于此IRES富有多重的二级结构且源之于病毒，其本身具有一种非特异的免疫刺激作用，即所谓“分子佐剂”的作用。
实施例1
构建质粒
如图1所示，人类白细胞抗原I类(HLA class I)合成启动子指导肝癌相关多价抗原决定簇的表达。其激活因子B7-1(CD-80)的表达则由EMCV IRES所控制。在此二元表达系统中，启动子的作用是指导合成一条信使RNA，而此mRNA可转译成两个蛋白分子：多价抗原与B7-1。多腺苷化(polyA)信号则增加mRNA在细胞内的稳定性。为辅助质粒DNA进入细胞后能迅速转入细胞核，我们在质粒中加入一段源之于SV40的核进口顺序。质粒中总共有三个CpG拷贝。最后pUCori和KANR的存在是为有助于在大肠肝菌中扩增质粒。
A：肝癌相关多价抗原决定簇编码区的构建
首先合成4对互补的长链多聚核苷酸。这些多聚核苷酸依此连接后便能形成上述编码区的正链与负链。每一对互补的多聚核苷酸经退火后产生双链DNA，前后对应的短DNA之间有互补的粘性末端可用于连接，在整个编码区的5’，3’端我们分别设计加上Afl II与EcoRI的酶切位点的顺序以利于克隆。这些短链DNA经逐步连接以后，得到所预期的250bp左右的编码区DNA，此编码区DNA被克隆到质粒载体上后，其顺序被全部证实。
B：共激活因子B7-1(CD-80)cDNA的克隆
从人循环血单核细胞中抽提出全RNA，通过逆转录成cDNA，经PCR扩增后得到B7-1(CD-80)的cDNA。所得到的cDNA经测序后证实其编码与文献发表的顺序完全一致。在此CDNA的5’非转译区引入了一个Bst XI的酶切位点，在3’端引入了一个Not I的位点。我们将此BstXI/Not I的CDNA片段克隆到一个二元表达质粒中，插入在EMCV的IRES的下游区。
C：质粒整合
肝癌相关多价抗原决定簇编码区(HCC specific polyepitope)和共激活因子B7-1编码CDNA再被克隆到我们所构建的疫苗表达载体pTope中，得到如图1所示质粒的Hepatope。
实施例2
疫苗活性测定
将实施例1得到的质粒制剂用于在HLA-A2转基因小鼠上测定DNA疫苗所诱导的免疫反应。每一只转基因小鼠分别在第一、四、七天接受肌肉注射疫苗，注射剂量为50微克DNA溶于生理盐水中。在第十四天，实验鼠被解剖，取出脾脏细胞。这些脾细胞在体外培养经一次带有决定簇多肽的细胞刺激7天后，测其细胞裂解活力。
参见图2，细胞裂解活力的测试是用标准的铬51释放试验T2细胞(T，B杂合细胞)首先用于Cr51标记后，加入相关的多肽，然后再与CTL一起保温数小时。测上清中Cr51的含量。上清中T2细胞所释放的铬51含量越高，则有较多的带多肽抗原的T2靶细胞被裂解，也表明CTL的活性越高。
如图3所示，Hepatope免疫的转基因小鼠能产生抗原特异的CTL，能够识别所有七个抗原决定簇。其中每一个抗原决定簇特异的CTL的活力有所不同，但效靶比例为90∶1均有50％以上的裂解能力。这些数据表明所注射的疫苗质粒被抗原递呈细胞摄取，所编码的多价抗原被合成并被蛋白酶体降解为短肽，而每一个编入的多肽抗原决定簇均结合到HLA-A并成递呈出来刺激CTL的产生。
为了进一步证实所选择的多肽抗原决定簇的确在肝癌细胞中有表达并在其表面经HLA-A2而递呈，在体外扩增了抗原特异的CTL并用来测定这些CTL能否裂解HLA-A2限制性的肝癌靶细胞。
如图4所示，HBx 92-100特异CTL能对6种HLA-A2肝癌细胞中的4种有比较明显的裂解反应，说明HBx 92-100到在这4种细胞中被递呈出来。当肿瘤细胞先被干扰素处理后再进行细胞裂解试验，其被裂解能力增强，可能是由于干扰素提高靶细胞膜表HLA-A2的表达效率。
用其他抗原特异CTL进行同样的试验，所得到的实验结果相似。进一步证实，由于肝瘤细胞的遗传不稳定性与多变性，采用多效价模型来对付多个肝癌相关抗原具有很重要的优势。
实施例3
药代动力学
基因治疗的一个重要议题是它的安全性。如何确定DNA在体内完成其使命后迅速降解而不致于整合到细胞染色体上是关键。我们检测了DNA疫苗在注射以后体内存活过程所采用的检测手段为真实时间PCR作定量签定。如图五所示，若从注射部位(肌肉)取样提取总DNA进行检测，我们发现在注射的最初三天内维持有较高的疫苗DNA拷贝数，然后，从第三天起，疫苗DNA的拷贝数迅速下降，以至于数日后低于方法所能检测的灵敏度。此外，从被注射动物的尿液及排泄物中并未检测到明显大量的质粒DNA，一种比较合理的解释便是质粒DNA在注射部位被降解。
实施例4
毒理学试验
为了初步了解Hepatope的毒理，用研究用品级(research grade)的制剂在转基因小鼠(HLA-A2)上进行了一个微型的毒理试验，包括单剂量与重复剂量的毒理研究。对照组小鼠被注射同等容量的缓冲液。所检测的一般毒理指标包括：活动中观察、血液学参数与组织病理分析。
对照组与治疗组的小鼠在注射后体重与体温没有明显的差异，并都在食物与饮水的摄取有减少。因此，疫苗注射没有引起小鼠生活习性的改变。疫苗注射也没有引起小鼠循环中白血球、红血球、单核细胞与嗜酸性细胞的数量改变，然而，接受疫苗注射的小鼠的淋巴细胞比例与绝对淋巴细胞数目明显高于对照组小鼠，各个组织切片中也没有观察到明显的异常病变。
序列表
<110>刘，柄荣
<120>重组的DNA质粒，其构建方法，含该质粒的多价疫苗及其应用
<130>030957
<160>10
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>264
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>抗原决定簇的编码序列
<400>1
gccaccatgg tcttacataa gaggactctt ggactcggca ccctggagga ggtgcccact 60
gctaaagtcc ttgagtatgt gatcaaggtc gccctcgctg aaaccagcta tgtaaaagtc 120
aaagtccttg agtatgtgat caaggtctgt gtgtttaagg actgggagga gctgttcctg 180
tggggtccaa gggccctcgt tgtcttacat aagaggactc ttggactcgc cctcgttgaa 240
accagctatg tgaaagtcta gtga 264
<210>2
<211>4783
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>质粒
<400>2
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tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc 300
tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg 360
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ggactcgccc tcgttgaaac cagctatgtg aaagtctagt gag 4783
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<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
Cys Val Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu
1 5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>抗原决定簇短肽
<400>8
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val
1 5
<210>9
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>抗原决定簇短肽
<400>9
Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val
1 5 10
<210>10
<211>84
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>含抗原决定簇的多肽
<400>10
Met Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu Gly Thr Leu Glu Glu Val
1 5 10 15
Pro Thr Ala Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Ala Leu Ala Glu
20 25 30
Thr Ser Tyr Val Lys Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Cys
35 40 45
Val Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu
50 55 60
Val Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ala Leu Val Glu Thr Ser
65 70 75 80
Tyr Val Lys Val