一种一次性卫生用品中5种常见致病菌多重PCR快速检测的试剂盒及检测方法.pdf

本发明涉及一种一次性卫生用品中5种常见致病菌多重PCR快速检测的试剂盒及检测方法，该试剂盒包括无核酸酶水、10×PCR缓冲溶液、dNTP、上下游合并引物、DNA聚合酶、阴性质控品、阳性质控品。本发明的技术方案具有良好的检测特异性，可实现沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和白色念珠菌的快速检测，比常规的细菌学诊断快速简便经济。

权利要求书
1.  一种一次性卫生用品中5种常见致病菌多重PCR快速检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括无核酸酶水、10×PCR缓冲溶液、dNTP、上下游合并引物、DNA聚合酶、阴性质控品、阳性质控品。

2.  如权利要求1所述的一次性卫生用品中5种常见致病菌多重PCR快速检测的试剂盒，其特征在于，所述上下游合并引物为：以沙门氏菌的invA基因序列、绿脓杆菌的ETA基因序列、金黄色葡萄球菌的nuc基因序列，大肠杆菌的phoA基因序列和白色念珠菌5SrRNA区特异的非转录区设计的引物。

3.  如权利要求1或2所述的一次性卫生用品中5种常见致病菌多重PCR快速检测的试剂盒，其特征在于，所述上下游合并引物为：沙门氏菌上游引物：5’- TCATCGCACCGTCAAAGGAACC -3’，沙门氏菌下游引物：5’- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA -3’；绿脓杆菌上游引物：5’- GACAACGCCCTCAGCATCACCAGC -3’；绿脓杆菌下游引物：5’- CGCTGGCCCATTCGCTCCAGCGCT -3’；金黄色葡萄球菌上游引物：5’- CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC -3’；金黄色葡萄球菌下游引物：5’- AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT -3’；大肠杆菌上游引物：5’- TACAGGTGACTGCGGGCTTATC -3’；大肠杆菌下游引物：5’- CTTACCGGGCAATACACTCACTA -3’；白色念珠菌上游引物：5’- TAGCGATGAGGTAGTGCAAGT -3’；白色念珠菌下游引物：5’- GCTGCAGCTACGAATGTTAG -3’。

4.  如权利要求1所述的一次性卫生用品中5种常见致病菌多重PCR快速检测的试剂盒，其特征在于，dNTP浓度为10mM，上下游合并引物浓度各为5μM，DNA聚合酶为Taq酶浓度为5U/μl，阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为沙门氏菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，白色念珠菌基因组DNA，浓度分别为：沙门氏菌DNA，85.5ng/μl；绿脓杆菌DNA，206.1ng/μl；金黄色葡萄球菌DNA，82.43ng/μl；大肠杆菌DNA，66.7ng/μl；白色念珠菌DNA，55.4ng/μl。

5.  一种使用权利要求1-4任意一项的检测试剂盒进行一次性卫生用品中5种常见致病菌多重PCR快速检测的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）样品的预处理
取每份样品分别至LB液体培养基，CM0002营养肉汁培养基和YPD液体培养基中37℃增菌24h，提取DNA作为多重PCR检测的模板，并对样品中的微生物进行检测；
2）阳性细菌的活化及DNA的提取
分别从沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的原始菌液中吸取200μl接种到液体LB中，从绿脓杆菌的原始菌液中吸取200μl接种到CM0002营养肉汁培养基中，从白色念珠菌的原始菌液中吸取200μl接种到YPD液体培养基中，在摇床（转速180r/min）经过37℃培养24h，活化3次后备用，对活化后的菌液用无菌生理盐水进行梯度稀释，分别取200μl稀释了105、106和107菌液，均匀涂布于对应的固体培养基上，在培养箱经过37℃培养24h，对不同菌种进行计数，然后挑取单菌落接种到对应的液体培养基中，在转速180r/min的摇床经过37℃培养24h，离心收集菌体，采用离心柱法细菌基因组DNA提取试剂盒（solaibio，D1600-50）提取DNA； 
3）PCR扩增：沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和白色念珠菌的单重PCR反应体系均一致，具体为：无菌水16.2μl，10×缓冲液2.5μl，dNTP（10mM，包含四种核苷酸）1μl，上下游合并引物3μl，模板2μl，酶（5U/μl）0.3μl；两重PCR的反应体系为：无菌水11.2μl，10×缓冲液2.5μl，dNTP（10mM，包含四种核苷酸）1μl，两种上下游合并引物各3μl，两种模板各2μl，酶（5U/μl）0.3μl；三重PCR的反应体系为：无菌水13.7μl，10×缓冲液2.5μl，dNTP（10mM，包含四种核苷酸）1μl，三种上下游合并引物各1.5μl，三种模板各1μl，酶（5U/μl）0.3μl；四重PCR的反应体系为：无菌水11.2μl，10×缓冲液2.5μl，dNTP（10mM，包含四种核苷酸）1μl，四种上下游合并引物各1.5μl，四种模板各1μl，酶（5U/μl）0.3μl；
4）PCR反应条件：PCR反应循环参数如下：94℃预变性9min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环，最后72℃延伸7min；
5）扩增产物电泳检测：将扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测及UV I凝胶成像系统分析结果。

6.  如权利要求5所述的一次性卫生用品中5种常见致病菌多重PCR快速检测的检测方法，其特征在于，如果琼脂糖凝胶电泳结果在284bp处有一条带，则证明有沙门氏菌存在；如果琼脂糖凝胶电泳结果在396bp处有一条带，则证明有绿脓杆菌存在；如果琼脂糖凝胶电泳结果在484bp处有一条带，则证明有金黄色葡萄球菌存在；如果琼脂糖凝胶电泳结果在622bp处有一条带，则证明有大肠杆菌存在；如果琼脂糖凝胶电泳结果在684bp处有一条带，则证明有白色念珠菌存在。

说明书一种一次性卫生用品中5种常见致病菌多重PCR快速检测的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及一种一次性卫生用品中5种常见致病菌多重PCR快速检测的试剂盒和检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
卫生用品安全是国内关注的重大问题，而其中易感染致病菌是影响卫生用品安全的主要原因之一。沙门氏菌（Salmonella spp）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），大肠杆菌（E.coli）和白色念珠菌（Candida albicans）普遍存在于卫生用品中，是引起卫生用品污染的重要因素。根据现行国家卫生用品安全监管体系，沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和白色念珠菌是众多卫生用品标准中的检测项目，要求不得检出。目前对这些病原细菌的检测主要采用传统细菌学培养法，一般需3至7天，存在着操作繁琐、灵敏度低、出现假阴性等缺点，且每次实验通常只能检测一种病原细菌。因此这些方法已不能完全适应于一次性卫生用品检测的需要。
随着以核酸为基础的微生物分子检测技术的发展，特别是PCR技术的应用，使病原菌诊断发展到一个新的水平。近年来，多种致病菌的单一PCR快速检测方法有很多已经被建立起来，如沙门氏菌、单核增生李斯特氏菌等，然而在口岸业务中，企业和政府监管部门需要对大批致病菌进行检测，且检测量大，显然也无法满足日常快速检测的需要。
多重PCR技术是在同一反应体系中同时加入多对引物扩增多条目的DNA片段，实现多种病原微生物的同时检测，为病原微生物的鉴定提供了快速、灵敏、经济的方法。依据相关研究，invA、ETA、nuc和phoA基因各为沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌特有的毒力因子基因，且序列高度保守；同时5SrRNA区特异的非转录区是白色念珠菌的保守区域。本发明参照文献中沙门氏菌的invA基因、绿脓杆菌的ETA基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因，大肠杆菌的phoA基因和白色念珠菌5SrRNA区特异的非转录区为靶基因，旨在建立一种高灵敏度和特异性的单重及多重体系检测卫生用品中沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和白色念珠菌，最终为一次性卫生用品中病原微生物的检测建立一种快速有效的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供能够快速对一次性卫生用品中5种常见致病菌进行检测的快速检测试剂盒和检测方法。
本发明具体提供如下技术方案：一种一次性卫生用品中5种常见致病菌多重PCR快速检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括无核酸酶水、10×PCR缓冲溶液、dNTP、上下游合并引物、DNA聚合酶、阴性质控品、阳性质控品。
所述上下游合并引物为：以沙门氏菌的invA基因序列、绿脓杆菌的ETA基因序列、金黄色葡萄球菌的nuc基因序列，大肠杆菌的phoA基因序列和白色念珠菌5SrRNA区特异的非转录区设计的引物。
所述上下游合并引物为：沙门氏菌上游引物：5’- TCATCGCACCGTCAAAGGAACC -3’，沙门氏菌下游引物：5’- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA -3’；绿脓杆菌上游引物：5’- GACAACGCCCTCAGCATCACCAGC -3’；绿脓杆菌下游引物：5’- CGCTGGCCCATTCGCTCCAGCGCT -3’；金黄色葡萄球菌上游引物：5’- CTTTAGCCAAGCCTTGACGAAC -3’；金黄色葡萄球菌下游引物：5’- AAAGGGCAATACGCAAAGAGGT -3’；大肠杆菌上游引物：5’- TACAGGTGACTGCGGGCTTATC -3’；大肠杆菌下游引物：5’- CTTACCGGGCAATACACTCACTA -3’；白色念珠菌上游引物：5’- TAGCGATGAGGTAGTGCAAGT -3’；白色念珠菌下游引物：5’- GCTGCAGCTACGAATGTTAG -3’。
所述dNTP浓度为10mM，上下游合并引物浓度各为5μM，DNA聚合酶为Taq酶浓度为5U/μl，阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为沙门氏菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，白色念珠菌基因组DNA，浓度分别为：沙门氏菌DNA，85.5ng/μl；绿脓杆菌DNA，206.1ng/μl；金黄色葡萄球菌DNA，82.43ng/μl；大肠杆菌DNA，66.7ng/μl；白色念珠菌DNA，55.4ng/μl。
同时，本发明还提供了一种使用上述检测试剂盒进行一次性卫生用品中5种常见致病菌多重PCR快速检测的检测方法，包括如下步骤：
(1)样品的预处理
取每份样品分别至LB液体培养基，CM0002营养肉汁培养基和YPD液体培养基中37℃增菌24h，提取DNA作为多重PCR检测的模板，并对样品中的微生物进行检测；
(2)阳性细菌的活化及DNA的提取
分别从沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的原始菌液中吸取200μl接种到液体LB中，从绿脓杆菌的原始菌液中吸取200μl接种到CM0002营养肉汁培养基中，从白色念珠菌的原始菌液中吸取200μl接种到YPD液体培养基中。在摇床（转速180r/min）经过37℃培养24h，活化3次后备用。对活化后的菌液用无菌生理盐水进行梯度稀释，分别取200μl稀释了105、106和107菌液，均匀涂布于对应的固体培养基上，在培养箱经过37℃培养24h。对不同菌种进行计数，然后挑取单菌落接种到对应的液体培养基中，在摇床（转速180r/min）经过37℃培养24h，离心收集菌体，采用离心柱法细菌基因组DNA提取试剂盒（solaibio，D1600-50）提取DNA；
(3)PCR扩增：沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和白色念珠菌的单重、两重、三重、四重反应体系见表1；
表1 PCR反应体系

(4)PCR反应条件：单重、两重、三重、多重PCR反应循环参数如下：94℃预变性9min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环。最后72℃延伸7min；
(5)扩增产物电泳检测：将扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测及UV I凝胶成像系统分析结果。
如果琼脂糖凝胶电泳结果在284bp处有一条带，则证明有沙门氏菌存在；如果琼脂糖凝胶电泳结果在396bp处有一条带，则证明有绿脓杆菌存在；如果琼脂糖凝胶电泳结果在484bp处有一条带，则证明有金黄色葡萄球菌存在；如果琼脂糖凝胶电泳结果在622bp处有一条带，则证明有大肠杆菌存在；如果琼脂糖凝胶电泳结果在684bp处有一条带，则证明有白色念珠菌存在。
本发明根据沙门氏菌的invA基因序列、绿脓杆菌的ETA基因序列、金黄色葡萄球菌的nuc基因序列，大肠杆菌的phoA基因序列和白色念珠菌5SrRNA区特异的非转录区设计出5对特异性引物（表2）。在分别进行单重和多重PCR后，验证了引物和产物的正确性，并建立了快速、准确和灵敏的检测方法，可应用于一次性卫生用品中常见致病菌的快速检测。
表2 多重PCR引物序列

附图说明
图1 单重PCR目的基因DNA电泳图，其中，M代表DNA marker，1代表沙门氏菌，2代表绿脓杆菌，3代表金黄色葡萄球菌，4代表大肠杆菌，5代表白色念珠菌。
图2 多重PCR目的基因DNA电泳图；其中，M代表DNA marker，1代表沙门氏菌，2代表绿脓杆菌，3代表金黄色葡萄球菌，4代表大肠杆菌，5代表沙门氏菌和绿脓杆菌，6代表绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌，7代表金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
图3 多重PCR对多种细菌的特异性检测；M代表DNA marker，1代表沙门氏菌、绿脓杆菌和大肠杆菌，2代表沙门氏菌和绿脓杆菌，3代表沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，4代表沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，5代表沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，6代表沙门氏菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌。
图4 不同组合目标菌株DNA多重PCR产物电泳分析；其中，M代表DNA marker，1至6代表加入两种目标菌，7至11代表加入三种目标菌。
图5 单重PCR检测沙门氏菌DNA的检出限；其中，M代表DNA marker，1表示沙门氏菌85.51ng，2表示沙门氏菌8.551ng，3表示沙门氏菌0.8551ng，4表示沙门氏菌85.51pg，5表示沙门氏菌8.551pg，6表示沙门氏菌0.8551pg。
图6 单重PCR检测绿脓杆菌DNA的检出限；其中，M代表DNA marker，1表示绿脓杆菌206.09ng，2表示绿脓杆菌20.609ng，3表示绿脓杆菌2.0609ng，4表示绿脓杆菌206.09pg，5表示绿脓杆菌20.609pg，6表示绿脓杆菌2.0609pg。
图7 单重PCR检测金黄色葡萄球菌DNA的检出限；其中，M代表DNA marker，1表示金黄色葡萄球菌81.27ng，2表示金黄色葡萄球菌8.127ng，3表示金黄色葡萄球菌0.8127ng，4表示金黄色葡萄球菌81.27pg，5表示金黄色葡萄球菌8.127pg，6表示金黄色葡萄球菌0.8127pg。
图8 单重PCR检测大肠杆菌DNA的检出限；其中，M代表DNA marker，1表示大肠杆菌66.71ng，2表示大肠杆菌6.671ng，3表示大肠杆菌0.6671ng，4表示大肠杆菌66.71pg，5表示大肠杆菌6.671pg，6表示大肠杆菌0.6671pg。
图9 单重PCR检测白色念珠菌DNA的检出限；其中，M代表DNA marker，1表示白色念珠菌55.41ng，2表示白色念珠菌5.541ng，3表示白色念珠菌0.5541ng，4表示白色念珠菌55.41pg，5表示白色念珠菌5.541pg，6表示白色念珠菌0.5541pg。
图10 多重PCR检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌DNA的检出限；其中，M代表DNA marker，1表示沙门氏菌85.51ng、金黄色葡萄球菌81.27ng；2表示沙门氏菌8.551ng、金黄色葡萄球菌8.127ng；3表示沙门氏菌0.8551ng、金黄色葡萄球菌0.8127ng；4表示沙门氏菌85.51pg、金黄色葡萄球菌81.27pg；5表示沙门氏菌8.551pg、金黄色葡萄球菌8.127pg。
图11 多重PCR检测沙门氏菌和绿脓杆菌DNA的检出限；其中，M代表DNA marker，1表示沙门氏菌85.51ng、绿脓杆菌206.09ng；2表示沙门氏菌8.551ng、绿脓杆菌20.609ng；3表示沙门氏菌0.8551ng、绿脓杆菌2.0609ng；4表示沙门氏菌85.51pg、绿脓杆菌206.09pg；5表示沙门氏菌8.551pg、绿脓杆菌20.609pg。
图12 多重PCR检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌DNA的检出限；其中，M代表DNA marker，1表示沙门氏菌85.51ng、金黄色葡萄球菌81.27ng、大肠杆菌66.71ng；2表示沙门氏菌8.551ng、金黄色葡萄球菌8.127ng、大肠杆菌6.671ng；3表示沙门氏菌0.8551ng、金黄色葡萄球菌0.8127ng、大肠杆菌0.6671ng；4表示沙门氏菌85.51pg、金黄色葡萄球菌81.27pg、大肠杆菌66.71pg；5表示沙门氏菌8.551pg、金黄色葡萄球菌8.127pg、大肠杆菌6.671pg；6表示沙门氏菌0.8551pg、金黄色葡萄球菌0.8127pg、大肠杆菌0.6671pg。
图13 多重PCR检测沙门氏菌、绿脓杆菌和大肠杆菌DNA的检出限；其中，M代表DNA marker，1表示沙门氏菌85.51ng、绿脓杆菌206.09ng、大肠杆菌66.71ng；2表示沙门氏菌8.551ng、绿脓杆菌20.609ng、大肠杆菌6.671ng；3表示沙门氏菌0.8551ng、绿脓杆菌2.0609ng、大肠杆菌0.6671ng；4表示沙门氏菌85.51pg、绿脓杆菌206.09pg、大肠杆菌66.71pg；5表示沙门氏菌8.551pg、绿脓杆菌20.609pg、大肠杆菌6.671pg。
图14 模拟阳性样品Point的多重PCR检测结果；其中，M代表DNA marker，1代表沙门氏菌6×108cfu/ml ，金黄色葡萄球菌2×109cfu/ml；2代表沙门氏菌6×106cfu/ml ，金黄色葡萄球菌2×107cfu/ml；3代表沙门氏菌6×104cfu/ml ，金黄色葡萄球菌2×105cfu/ml；4代表绿脓杆菌1.5×109cfu/ml ，大肠杆菌1×109cfu/ml；5代表绿脓杆菌1.5×107cfu/ml ，大肠杆菌1×107cfu/ml；6代表绿脓杆菌1.5×105cfu/ml ，大肠杆菌1×105cfu/ml。
图15 模拟阳性样品Merries的多重PCR检测结果；其中，M代表DNA marker，1代表沙门氏菌6×108cfu/ml ，金黄色葡萄球菌2×109cfu/ml；2代表沙门氏菌6×106cfu/ml ，金黄色葡萄球菌2×107cfu/ml；3代表沙门氏菌6×104cfu/ml ，金黄色葡萄球菌2×105cfu/ml；4代表绿脓杆菌1.5×109cfu/ml ，大肠杆菌1×109cfu/ml；5代表绿脓杆菌1.5×107cfu/ml ，大肠杆菌1×107cfu/ml；6代表绿脓杆菌1.5×105cfu/ml ，大肠杆菌1×105cfu/ml。
图16 模拟阳性样品Petpad的多重PCR检测结果，其中，M代表DNA marker，1代表沙门氏菌6×108cfu/ml ，金黄色葡萄球菌2×109cfu/ml；2代表沙门氏菌6×106cfu/ml ，金黄色葡萄球菌2×107cfu/ml；3代表沙门氏菌6×104cfu/ml ，金黄色葡萄球菌2×105cfu/ml；4代表绿脓杆菌1.5×109cfu/ml ，大肠杆菌1×109cfu/ml；5代表绿脓杆菌1.5×107cfu/ml ，大肠杆菌1×107cfu/ml；6代表绿脓杆菌1.5×105cfu/ml ，大肠杆菌1×105cfu/ml。
图17 实验样品的多重PCR检测结果；其中，M代表DNA marker，1为待测样品Point，2为待测样品Merries，3为待测样品Petpad，4为待测样品卷纸A，5为待测样品卷纸B，6为待测样品卷纸C。其中Point检出沙门氏菌，Petpad检出大肠杆菌，卷纸A和卷纸C检出金黄色葡萄球菌。
具体实施方式
单重及多重PCR扩增
用编码沙门氏菌invA基因的引物进行PCR，结果扩增出大小约为284bp特异性片段；用编码绿脓杆菌ETA基因的引物进行PCR，结果扩增出大小约为396bp特异性片段；用编码金黄色葡萄球菌nuc基因的引物进行PCR，结果扩增出大小约为484bp特异性片段；用编码大肠杆菌phoA基因的引物进行PCR，结果扩增出大小约为622bp特异性片段；用白色念珠菌5SrRNA区特异的非转录区设计的引物进行PCR，结果扩增出大小约为684bp的特异性片段。无论是单一目标菌的DNA（参见说明书附图1）或混合目标菌的DNA（参见附图2-4）均能良好扩增，扩增片段与预期一致。说明本方法对沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和白色念珠菌有良好的检测特异性和准确性。
灵敏度实验
以不同的目标菌的DNA模板浓度对PCR方法的检测灵敏度进行测试。其中沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和白色念珠菌的单重PCR检测灵敏度分别为0.8551pg（见图5）、2.0609pg（见图6）、0.8127pg（见图7），0.6671pg（见图8）和0.5541pg（见图9）。沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重PCR检测灵敏度为8.551pg和8.127pg（见图10）。沙门氏菌和绿脓杆菌的二重PCR检测灵敏度为8.551pg和20.609pg（见图11）。沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的三重PCR检测灵敏度为85.51pg、81.27pg和66.71pg（见图12）。沙门氏菌、绿脓杆菌和大肠杆菌的三重PCR检测灵敏度为85.51pg、206.09pg和66.71pg（见图13）。可以看出无论是单重PCR还是多重PCR，其检测灵敏度均达到皮克级。说明本方法对沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和白色念珠菌有较好的检测灵敏度。
具体实施例
实施例1，样品Point（报验编号：1200170213004740），Merries（报验编号：1200170213006229）和Petpad（报验编号：1200170213004629）经高压灭菌后，进行人工随机致病菌污染。人工污染样品Point，Merries和Petpad的多重PCR检测结果分别见图14、图15和图16。实验结果表明LB培养液获得较好的增菌效果。PCR能够有效地随机扩增出相应的目的基因片段，从而可识别出污染的任意两种菌。其中模拟阳性样品Point、Merries和Petpad的沙门氏菌检出限均可达到6×104cfu/ml、金黄色葡萄球菌检出限均可达到2×105cfu/ml、绿脓杆菌检出限均可达到1.5×105cfu/ml、大肠杆菌检出限均可达到1×105cfu/ml。应用本方法对模拟样品的多重PCR检测结果与预期符合，说明本方法具有较好的特异性和实用性。
实施例2，对实验在检的三份尿不湿，三份卷纸的PCR检测结果显示，在两份尿不湿中检出沙门氏菌和大肠杆菌，其中Point（报验编号：1200170213004740）检出沙门氏菌，Petpad（报验编号：1200170213004629）检出大肠杆菌。在两份面纸中检出金黄色葡萄球菌，分别为卷纸A和卷纸C，结果见图17。