一种女性阳虚质不孕症的筛查试剂盒技术领域
本发明涉及一种女性阳虚质不孕症的筛查试剂盒。
背景技术
不孕的医学定义为一年未采取任何避孕措施，性生活正常而没有成功妊娠。主要分为原发不孕及继发不孕。原发不孕为从未受孕；继发不孕为曾经怀孕以后又不孕。根据这种严格的定义，不孕是一种常见的问题，大约影响到至少10％～15％的育龄夫妇。引起不孕的发病原因分为男性不孕和女性不孕。
阳虚是阳虚证和阳虚体质的共同病理机制，其主要病机为体内阳气虚衰，以肢寒身冷等寒象为主要表现。阳虚质是阳气不足、以虚寒现象为主要特征的体质状态。先天不足，或病后阳亏，是形成阳虚质的主要原因。
近年来研究发现不孕患者中阳虚质所占比例位居首位。女性阳虚质不孕症患者，临床上多由肾气虚弱，经血不足，冲任失调；或胞宫虚寒，胞脉失养，运用中医专方治疗效果较佳。
但是，关于女性阳虚质不孕症的中医诊断和评价，目前均必须依赖于医生对患者的访问，技术性强，对检测人员的专业要求高，而且工作量非常大。
testisin是一种糖基磷脂酰肌醇锚定的丝氨酸蛋白酶，其在精子生成、附睾精子成熟和受精中起重要作用。
未见testisin与阳虚不孕之间的关系的报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种女性阳虚质不孕症的筛查试剂盒。
本发明女性阳虚质不孕症的筛查试剂盒，它包括任选的用于检测testisin基因表达水平的试剂。
优选地，所述试剂是用于检测血清中testisin基因表达水平的试剂。
优选地，所述testisin基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
testisin基因的核苷酸序列如下：
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优选地，所述检测testisin基因表达水平的试剂时Northern-blot检测方法用试剂、RT-PCR检测方法用试剂或原位杂交检测方法用试剂。进一步优选地，所述RT-PCR检测方法用试剂包括SEQIDNO:2～3所示的引物对。
本发明还提供了检测testisin基因表达水平的试剂在制备女性阳虚质不孕症筛查用试剂中的用途。
优选地，所述试剂是用于检测血清中testisin基因表达水平的试剂。
优选地，所述testisin基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
优选地，所述检测testisin基因表达水平的试剂时Northern-blot检测方法用试剂、RT-PCR检测方法用试剂或原位杂交检测方法用试剂。进一步优选地，所述RT-PCR检测方法用试剂包括SEQIDNO:2～3所示的引物对。
本发明试剂盒通过检测testisin基因的表达水平，可以判断待检人群患女性阳虚质不孕症的风险：若testisin基因的表达水平高，则患女性阳虚质不孕症的风险低，若testisin基因的表达水平低，则患女性阳虚质不孕症的风险高，可用于临床女性阳虚质不孕症的辅助诊断，临床应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1testisin基因的表达水平与女性阳虚质不孕症的关系
1.材料与方法
1.1实验材料
1.1.1主要实验仪器
定量PCR仪MJResearch,PTC-200
紫外分光光度仪BECKMAN
C1000ThermalCyclerBIO-RAD
1.1.2主要实验材料与试剂
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1.1.3试剂配制：
(1)PBS缓冲液(g/1,000mL)：
NaCl 8.0
KCl 0.2
Na2HPO4·12H2O
1.54
KH2PO40.2
加入DEPC处理的RNase-Free的水，pH值为7.3左右，定容至1000mL，高压灭菌。
(2)红细胞裂解液：
药品 终浓度 分子量 所需量
KHCO310mM 100 1g
NH4Cl 155mM 53.49 8.29g
EDTA 0.1mM 372.24 0.5M 100μL
加入DEPC处理的RNase-Free的水，定容至1000mL，过滤除菌。
(3)血液抗凝剂：10μL0.5MEDTA/ml血液
1.2临床资料
1.2.1对象来源
来源于2013年12月～2015年1月于成都中医药大学第二附属医院门诊，选取典型女性阳虚质不孕患者为研究对象，选取典型平和体质正常健康人为对照组。
1.2.2不孕的诊断标准(参照第七版全国高等学校教材《妇产科学》)
婚后夫妇同居一年以上，有正常性生活，男方生殖功能正常，未避孕而未能受孕者称为不孕症。婚后未避孕而从未妊娠者，称为原发不孕。曾经妊娠，而后未避孕连续一年未再妊娠者，称为继发不孕。
1.2.3中医体质类型分类标准(参照中华中医药学会《中医体质分类与判定》)
阳虚质：
主项：平素畏冷，手足不温，喜热饮食，精神不振，睡眠偏多。
副项：面色晄白，目胞晦暗，口唇色淡，毛发易落，易出汗，大便溏薄，小便清长，舌淡胖嫩，边有齿痕，苔润，脉象沉迟。
平和质：
主项：阴阳气血调和，以体态适中、面色红润、精力充沛等。
副项：面色、肤色润泽，头发稠密有光泽，目光有神，鼻色明润，嗅觉通利，唇色红润，不宜疲劳，精力充沛，耐受寒热，睡眠良好，胃纳佳，二便正常，舌色淡红，苔薄白，脉和缓有力。
1.2.4纳入标准
(1)年龄21～49岁的育龄期女性；
(2)自愿参加实验，签署知情同意书。
1.2.5排除标准
(1)合并有肝、肾、心血管和造血系统等严重原发性疾病者；
(2)有严重视听和语言障碍，可能影响对调查问卷的正确理解和回答者；
(3)严重精神病患者。
1.2.6剔除标准
(1)不符合纳入标准或符合排除标准者；
(2)未按规定完整填写调查表者。
1.2.7一般资料分析
(1)病例分布情况
本实验共纳入受试者28例，最终进入评价的受试者28例：病例组22例，对照组6例。
(2)两组患者基本资料
表1对照组体质类型
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表2阳虚组体质类型
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1.3实验方法
1.3.1中医体质评定标准
依据最新2009版中华中医药学会《中医体质分类与判定》标准进行体质筛选。阳虚体质诊断标准为：阳虚亚量表转化分≥40分，且平和质亚量表中转化分<60分；平和体质诊断标准为：平和质亚量表中转化分≥60分，且阳虚及其他偏颇体质亚量表转化分<40分。具体量表见附录1。
1.3.2qRT-PCR技术检测testisin基因的研究
(1)样品制备
抽取每例患者新鲜EDTA抗凝血2ml，400-500g离心5min，弃上清；
加入6-10倍细胞体积的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温放置4-5min；
4℃，400-500g离心5min，弃上清；
重复b)和c)
洗涤1-2次：加入适量PBS，重悬沉淀，400-500g离心3min，弃上清；
加入200μLTrizol。
(2)提取RNA，合成cDNA
①提取RNA
在分离出的每一管细胞中加入200μLTRIZOL，用枪头吹打使细胞全部脱离板底，将其转入1.5mLEp管中；
用5mL带7号针头的1次性注射器快速吹打10次进行匀浆以剪切基因组DNA，将匀浆样品在室温孵育5min以使核蛋白体完全分解；
加40μL氯仿，盖紧Ep管盖，用手剧烈振荡15s并于室温孵育2-3min；
4℃，12,000×g离心15min。离心后混合物分成3层：下层红色的为苯酚-氯仿层，中间层为细胞残渣，上层无色的为水相层，RNA存在于水相层中，水相层的容量大约为所加TRIZOL容量的60％；
将水相层转移到干净的1.5mLEp管中，加入等量异丙醇，颠倒混匀，将混匀后的样品于室温孵育10min；
4℃，12,000×g离心10min。倒掉上清液，用75％的乙醇1mL洗涤RNA沉淀1-2次，旋涡振荡混合样品后，4℃，7,500×g离心5min；
倒掉乙醇，常温干燥RNA沉淀10min，加入20μL无RNA酶的H2O，并于55℃孵育5min，以使RNA充分溶解；
取5μLRNA样品，加495μL无RNA酶的TE缓冲液(pH8.0)稀释后，用紫外分光光度计检测样品在260nm和280nm处的吸收值，分析纯度和浓度。
②合成cDNA
提前取出cDNA合成试剂盒，室温下至少放置30min，实验前15min内取出RNA样品。
将合成试剂与样品按如下比例配制：
表3cDNA合成试剂配制表
内容物 每管所需量
5x iScript reaction mix
4ul
iScript reverse transcriptase
1ul
Nuclease-free water 7ul
RNA样品 8ul
Total Volume 20ul
将配制好的cDNA样品放置于PTC-200中，选择cDNA合成程序开始进行合成。cDNA合成程序如下：
1＝5minutesat25℃
2＝60minutesat42℃
3＝5minutesat70℃
4＝10minutesat20℃
5＝End
(3)testisin基因的检测
①qPCR实验样品配制
a)qRT-PCR实验样品配制
提前取出qRT-PCR试剂盒及合成好的cDNA样品，室温下放置15-20min。实验样品配制如下：
qRT-PCR样品：15ul＝10ulMasterMix+0.2ulSample+4.8ulH2O
引物：5ul＝1ulForwardPrimer+1ulReversePrimer+3ulH2O
利用PrimerExpress5.0软件对所需检测基因进行引物设计，检测testisin基因的表达量变化情况，选择小鼠β-Actin基因为内参基因。
表4标识基因及内参基因的引物信息
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b)qRT-PCR样品上机
将配制好的qPCR样品分装置0.5ml薄壁管中，瞬时离心10-30s，样品上机。上机程序如下：
1＝95℃for3:00
2＝95℃for0:10
3＝55℃for0:20
+PlateRead
4＝72℃for0:30
5＝GOTO2,39moretimes
6＝MeltCurve50.0to95.0℃，increment0.5℃
For0:05+PlateRead
7＝END
c)qRT-PCR实验数据处理与分析
将软件BioRad所分析得出的ct值悉数拷至EXCEL表格中排列整齐，参照qPCR经典数据处理方法，以同组中β-Actin为内参，计算出每组基因△ct值(△ct＝ct1-ctβ-Actin)，以2为底数算出2△ct即每个基因表达量的绝对值。
利用PrimerExpress5.0软件对所需检测基因进行引物设计，检测Testisin基因的表达量变化情况，选择人β-Actin基因为内参基因。
2.结果
运用EXCEL软件计算出各组各基因2△ct，所有数据均扩大103倍。经SPSS17.0软件统计，采用非参数检验法。
如表5所示，运用qRT-PCR对对照组及阳虚质组testisin基因检测可知，阳虚质组外周血细胞testisin基因表达与正常健康人相比显著下调(P＜0.05)。
表5阳虚患者testisin基因表达情况
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注：与对照组比较，▲P<0.05
3.结论
实验结果说明，与正常健康女性相比，女性阳虚不孕患者外周血细胞testisin基因表达下调。
说明女性阳虚不孕与testisin基因的表达水平负相关，通过检测testisin的表达水平，可以筛查女性阳虚不孕患者。
实施例2本发明试剂盒的组成及待检样本的检测
一、RT-PCR检测试剂盒
1、试剂盒的组成
逆转录试剂(50人份)：
组分 体积
5x iScript reaction mix
200ul
iScript reverse transcriptase
50ul
Nuclease-free water 350ul
RNA样品 400ul
Total Volume 1ml
扩增和检测试剂(50人份)：
组分 浓度 体积
MasterMix
500ul
目标基因testisin的引物对 5μM 50μl
β-Actin的引物对 5μM 50μl
RNase free水
2ml
PCR反应孔板
384孔板2块
目标基因testisin的引物对(SEQIDNO.2～3所示)：
F:5-ATAGTGGGTGGCGATGA-3
R:5-TTGGTAACGGTTGGAAT-3
β-Actin的引物对(SEQIDNO.4～5所示)：
F:5-TGGCATCCATGAAACTACATTCA-3
R:5-TGCCTGGGTACATGGTGGTA-3
2、试剂盒的使用方法
(1)取待检样品，用常规的TRIZOL法提待检样本的总RNA。
(2)反转录
以步骤(1)得到的总RNA为模板，用上述逆转录试剂，得cDNA混合物。
(3)cDNA扩增
取步骤(2)得到的cDNA为模板，用上述cDNA扩增及实时荧光定量检测试剂扩增并检测cDNA的量。
(4)数据分析作图
设定一个荧光强度的阈值，利用BIO-RAD公司开发的CFXManager软件分析各组细胞的基因表达情况，分析方法使用△Ct值法。
综上，本发明试剂盒通过检测testisin基因的表达水平，可以筛查待检女性患女性阳虚质不孕症的风险：若testisin基因的表达水平高，则患女性阳虚质不孕症的风险低，若testisin基因的表达水平低，则患女性阳虚质不孕症的风险高，可用于临床女性阳虚质不孕症的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。
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