说明书褪黑素在延迟水稻叶片衰老和耐盐中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及褪黑素在延迟水稻叶片衰老和耐盐中的应用。
背景技术
褪黑素(melatonin，又名美拉酮宁、抑黑素、松果腺素)，其化学式为N-乙酰基 -5-甲氧基色胺，是存在于从藻类到人类等众多生物中的一种胺类激素。褪黑素在生物 体内呈现昼夜节律性的变化，并且伴随着年龄的增长，其含量水平逐渐降低，并且昼 夜节律渐趋平缓甚至消失。1995年植物中褪黑素首次被发现和报道，以后的研究表明 褪黑素同样广泛存在于微管植物中。
衰老是有丝分裂完成后的程序性死亡过程，受到内源遗传物质的精确调控。由于 衰老起始和衰老速率对植物有效光合作用的时间和营养物质从源向库的转运产生重要 的影响，因此通过外源施加有效化学物质延缓衰老具有重要的农业生产意义。发育年 龄是衰老起始的重要因素之一，同时内源激素水平和外部不利环境因素同样诱导衰老 的发生。这些衰老调控因素中一个显著的信号物质就是活性氧含量(ROS)。在ROS的 成分中，过氧化氢(H2O2)具有较长的半衰期，因此H2O2产生和清除之间平衡的破坏而 导致的氧化逆境被认为是衰老起始和衰老速率的关键影响因子。这一推断可以被一些 拟南芥延迟衰老突变证实(比如ore1,ore3,ore9,and gigantean)，和野生型植株 相比较，这些突变体因抗氧能力的提高从而明显的延缓衰老。此外，黑暗和高盐逆境 环境是两个典型的衰老促进因子，他们对衰老的调控同样是通过促进细胞内H2O2积累 而导致的。综合以上的分析，有效的降低细胞内H2O2水平将成为延缓植物衰老和提高 抗逆能力的有效手段。
水稻是重要的粮食作物，满足了人类50％左右能量的需求。然而，叶片早衰对其 产量性状的形成产生极其不利的影响，尤其在具有强大产量优势的杂交水稻品种中， 早衰已经对产量潜力的充分发挥造成严重的威胁。目前水稻中已经克隆了几个关键的 衰老调控基因(比如OsNAP、OsDOS、OsTZF1等)，然而由于转基因植物具有复杂的遗 传特性和广泛的社会争议，这些基因在实际农业生产中尚且无法得到应用。因此，寻 找新型而有效的药物或生物分子并研究其在衰老调控中的作用对于作物早衰的防治具 有积极的生产意义。
发明内容
本发明的目的是提供褪黑素在延迟水稻叶片衰老和耐盐中的应用。
本发明首先要求保护褪黑素在延缓植物衰老中的应用。
所述植物衰老具体可为盐诱导的植物衰老和/或黑暗诱导的植物衰老和/或年龄介 导的植物衰老。
所述植物衰老具体可以体现为如下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)和/或 (e)：(a)植株衰老；(b)叶片衰老；(c)细胞死亡；(d)叶片细胞死亡；(e)叶片 光合速率降低。
褪黑素在延缓植物衰老中的应用具体体现为如下(A)和/或(B)和/或(C)和/ 或(D)和/或(E)：(A)延缓植株衰老；(B)延缓叶片衰老；(C)抑制细胞死亡；(D) 抑制叶片细胞死亡；(E)促使叶片光合速率增高。
褪黑素在延缓植物衰老中的应用具体是通过促使过氧化氢水平降低实现的。
所述植物具体可为水稻，例如日本晴或合江19。
本发明还要求保护一种延缓植物衰老的制剂，其活性成分为褪黑素。所述植物衰 老具体可为盐诱导的植物衰老和/或黑暗诱导的植物衰老和/或年龄介导的植物衰老。 所述植物衰老具体可以体现为如下(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)和/或(e)： (a)植株衰老；(b)叶片衰老；(c)细胞死亡；(d)叶片细胞死亡；(e)叶片光合速 率降低。所述植物具体可为水稻，例如日本晴或合江19。
本发明还要求保护褪黑素在提高植物对非生物胁迫的抗性中的应用。所述非生物 胁迫具体可为黑暗胁迫或盐胁迫。所述植物具体可为水稻，例如日本晴或合江19。
本发明还要求保护一种提高植物对非生物胁迫的抗性的制剂，其活性成分为褪黑 素。所述非生物胁迫具体可为黑暗胁迫或盐胁迫。所述植物具体可为水稻，例如日本 晴或合江19。
本发明还要求保护褪黑素在降低植物过氧化氢水平中的应用。所述植物具体可为 水稻，例如日本晴或合江19。
本发明还要求保护一种降低植物过氧化氢水平的制剂，其活性成分为褪黑素。所 述植物具体可为水稻，例如日本晴或合江19。
以上任意所述制剂具体可为农药、肥料等。
本发明证明提高褪黑素水平能够显著的延迟水稻叶片衰老和死亡时间，提高抗盐 能力。外源施加褪黑素显著降低叶绿素降解速率，抑制衰老相关基因转录水平，从而 延缓叶片衰老抗逆性能。转录组分析和过氧化氢含量测定表明褪黑素通过调控大量氧 化清除相关基因的表达提高植物抗氧化逆境的能力。外源施加褪黑素处理过氧化氢积 累突变体noe1结果证明，褪黑素可以一定程度上降低突变体中过量积累的过氧化氢从 而缓解细胞死亡水平。全生育期褪黑素培养水稻不但可以延迟衰老，还可以延长光合 作时间，维持有效光合速率，暗示褪黑素在提高水稻产量上具有较好的应用潜力。本 发明不但对于深入理解褪黑素介导的衰老调控信号网络有帮助，同时也为农业、园艺、 花卉中衰老的防治提供有效的参考和帮助，在高产分子育种和蔬菜花卉采后储藏运输 中具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中褪黑素处理浓度筛选的结果。
图2为实施例1中褪黑素延缓暗诱导下的叶片衰老和细胞死亡的结果。
图3为实施例1中褪黑素抑制暗诱导下衰老相关基因表达的结果。
图4为实施例2中褪黑素延缓盐诱导下的叶片衰老和细胞死亡的结果。
图5为实施例2中褪黑素抑制盐诱导下衰老相关基因表达的结果。
图6为实施例3中外源施加褪黑素有效降低黑暗和盐处理下过氧化氢含量的结果。
图7为实施例3中褪黑素显著降低noe1突变体过氧化氢含量以及将低细胞死亡水 平的结果。
图8为全生育期施加褪黑素有效延缓年龄介导的叶片衰老的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。
水稻(Oryza.sativa L.)品种日本晴(Nipponbare)，水稻品种合江19，均记载 于如下文献：Sun,C.H.,Fang,J.,Zhao,T.L.,Xu,B.,Zhang,F.T.,Liu,L.C., Tang,J.Y.,Zhang,G.F.,Deng,X.J.,Chen,F.,Qian,Q.,Cao,X.F.and Chu, C.C.(2012)The histone methyltransferase SDG724mediates H3K36me2/3 deposition at MADS50and RFT1and promotes flowering in rice.Plant Cell,24, 3235-3247.。
褪黑素的结构式如下(购自百灵威科技有限公司)：
检测叶片中叶绿素含量的方法：Liang C,Wang Y,Zhu Y,Tang J,Hu B,Liu L, Ou S,Wu H,Sun X,Chu J,and Chu C(2014)OsNAP connects absisic acid and leaf senescence by fine tuning absisic acid biosynthesis and directly targeting senescence-associated genes in rice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111(27): 10013-10018.。
检测叶片中的过氧化氢含量的方法：Lin A,Wang Y,Tang J,Xue P,Li C,Liu L,Hu B,Yang F,Loake GJ,Chu C(2012)Nitric oxide and protein s-nitrosylation are integral to hydrogen peroxide induced leaf cell death in rice,Plant Physiol. 158:451-464。
检测光合速率的方法：Liang C,Wang Y,Zhu Y,Tang J,Hu B,Liu L,Ou S,Wu H,Sun X,Chu J,and Chu C(2014)OsNAP connects absisic acid and leaf senescence by fine tuning absisic acid biosynthesis and directly targeting senescence-associated genes in rice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111(27): 10013-10018.。
营养液(Kimura B solution)：含2mM KNO3、1.8mM KCl、0.36mM CaCl2、0.54mM MgSO4、0.18mM KH2PO4、40μM Fe(II)-EDTA、18.8μM H3BO3、13.4μM MnCl2、0.32μM CuSO4、0.3μM ZnSO4、0.03μM Na2MoO4和1.6mM Na2SiO3，溶剂为水。
实施例1、褪黑素在延缓水稻叶片衰老和细胞死亡过程中发挥关键的作用
一、褪黑素处理浓度筛选
取萌发2周的日本晴幼苗，采用含有不同浓度的褪黑素的营养液培养10天(每天 16小时光照/8小时黑暗)，然后拍照、观察植株的生长情况、测量植株地上部分的长 度。褪黑素的浓度分别为10μM、20μM、50μM、100μM、500μM、1000μM，同时设置不加 入褪黑素的对照处理(即褪黑素的浓度为0μM)。进行三次重复试验，每次重复试验中 每个褪黑素浓度处理10株植株。
照片见图1A，植株地上部分的长度见图1B。低浓度的褪黑素(10μM和20μM) 对幼苗生长具有明显的促进作用。小于20μM时，褪黑素对幼苗生长的促进作用随着 浓度的增加而增强。大于20μM时，随着浓度升高，褪黑素对生长的促进作用逐渐减 弱，当浓度高于一定的水平之后甚至出现抑制生长的现象。
二、褪黑素延缓暗诱导下的叶片衰老和细胞死亡
暗处理：取萌发2周的日本晴幼苗，采用含有10μM或20μM褪黑素的营养液培养 10天(持续黑暗处理)(设置不加入褪黑素的对照处理)，然后对植株拍照、取叶片进 行台盼蓝染色后拍照、取叶片并检测叶片中的叶绿素含量。
正常光照处理：取萌发2周的日本晴幼苗，采用含有10μM或20μM褪黑素的营养 液培养10天(每天16小时光照/8小时黑暗)(设置不加入褪黑素的对照处理)，然后 对植株拍照、取叶片进行台盼蓝染色后拍照、取叶片并检测叶片中的叶绿素含量。
暗处理和正常光照处理均进行三次重复试验，每次重复试验中每个褪黑素浓度处 理10株植株。
正常光照处理的植株照片见图2A，暗处理的植株照片见图2B，正常光照处理和暗 处理的叶片照片见图2C，正常光照处理和暗处理后叶片的叶绿素含量见图2D。正常光 照处理的条件下，施加褪黑素的幼苗和不施加褪黑素的幼苗几乎不存在差异。进行持 续10天的黑暗处理后，与不施加褪黑素的对照相比，10μM褪黑素和20μM褪黑素条 件下的水稻幼苗黄化水平均明显减缓，叶绿素完整性均明显提高，对应的叶绿素含量 水平也均显著增高。进行持续10天的黑暗处理后，与不施加褪黑素的对照相比，10μM 褪黑素和20μM褪黑素条件下的水稻的叶片细胞死亡水平均明显降低。结果表明，褪 黑素能够有效地延缓黑暗条件下的叶片衰老和细胞死亡。
为了进一步确定褪黑素调控水稻叶片衰老和细胞死亡延迟的影响，利用荧光定量 PCR方法检测两类标志衰老起始和衰老速率的相关基因(senescence-associated genes，SAGs)表达的动态变化。叶绿素降解相关基因(chlorophyll degradation-related genes，CDGs)：SGR、RCCR1、NYC1、NYC3。衰老诱导基因：OsNAP、 Osh69、OsI57、Osh36。SAGs基因信息参见如下文献：Yamatani H.,Sato Y.,Masuda Y.,Kato Y.,Morita R.,Fukunaga K.,Nagamura Y.,Nishimura M.,Sakamoto W., Tanaka A.,and Kusaba M(2013)NYC4,the rice orthologs of Arabidopsis THF1, is involved in the degradation of chlorophyll-protein complexes during leaf senescence,Plant J 74(4):652-662。分别于暗处理或正常光照处理的第0天、第 5天和第10天取叶片，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，通过实时荧光 定量PCR检测各个基因的相对表达量。以水稻ACTIN1基因为内参。用于检测各个基因 的引物序列见表1。数据处理采用Comparative Ct的方法，即Ct值为PCR管中荧光 信号达到设定的域值时所经历的循环数，ΔCt＝Ct(SAGs)-Ct(ACTIN1)，以2-ΔCt值衡量 基因转录水平。结果见图3(MO+暗处理代表暗处理中不加入褪黑素的对照处理，M10+ 暗处理代表暗处理中的10μM处理，M20+暗处理代表暗处理中的20μM处理，MO代表正 常光照处理中不加入褪黑素的对照处理，M10代表正常光照处理中的10μM处理，M20 代表正常光照处理中的20μM处理)。暗处理条件下，与不施加褪黑素的对照相比，在 10μM和20μM褪黑素条件下，同期衰老相关基因的表达量均受到明显的抑制。正常 光照处理条件下，施加褪黑素的幼苗和不施加褪黑素的幼苗，同期衰老相关基因的表 达量没有显著的差异。以上结果表明，褪黑素在延缓黑暗诱导的水稻叶片衰老过程中 具有明显的调控作用。
表1引物序列
实施例2、褪黑素提高水稻抗盐性能和延缓盐诱导叶片衰老和细胞死亡
盐处理：取萌发2周的日本晴幼苗，采用含有褪黑素(10μM或20μM)和0.5g/100ml 氯化钠的营养液培养14天(每天16小时光照/8小时黑暗)(设置不加入褪黑素的对 照处理)，然后对植株拍照、取叶片进行台盼蓝染色后拍照、取叶片并检测叶片中的叶 绿素含量。
正常处理：取萌发2周的日本晴幼苗，采用含有10μM或20μM褪黑素的营养液培 养14天(每天16小时光照/8小时黑暗)(设置不加入褪黑素的对照处理)，然后对植 株拍照、取叶片进行台盼蓝染色后拍照、取叶片并检测叶片中的叶绿素含量。
正常处理的植株照片见图4A，盐处理的植株照片见图4B，正常处理和盐处理的叶 片照片见图4C，正常处理和盐处理后叶片的叶绿素含量见图4D。盐处理组中，施加褪 黑素的植株的长势显著优于不施加褪黑素的植株，叶片细胞黄花衰老的症状更加轻微。
分别于盐处理或正常处理的第0天、第5天和第10天取叶片，提取总RNA并反转 录为cDNA，以cDNA为模板，通过实时荧光定量PCR检测。利用荧光定量PCR方法检 测两类标志衰老起始和衰老速率的相关基因(senescence-associated genes，SAGs) 的相对表达量。叶绿素降解相关基因(chlorophyll degradation-related genes，CDGs)： SGR、NYC1。衰老诱导基因：OsNAP、OsI57、Osh36。检测各个基因的引物见表1。结 果见图5(MO+盐处理代表盐处理中不加入褪黑素的对照处理，M10+盐处理代表盐处理 中的10μM处理，M20+盐处理代表盐处理中的20μM处理，MO代表正常处理中不加入褪 黑素的对照处理，M10代表正常处理中的10μM处理，M20代表正常处理中的20μM处理)。 正常处理条件下，0、10或20μM褪黑素条件下衰老标志基因并没有显著的表达差异。 盐处理条件下，10μM和20μM褪黑素条件下SAGs表达水平明显均低于同时期0μM 褪黑素条件下表达量。结果表明，褪黑素不但提高了水稻的抗盐能力，同时也显著的 抑制了盐诱导条件下的叶片衰老和死亡。
实施例3、褪黑素通过降低细胞内H2O2水平延迟叶片衰老和细胞死亡
一、RNA-seq测序结果分析
RNA-seq转录组分析表明：20μM褪黑素处理的日本晴和不施加褪黑素的日本晴相 比较，共获得457个2倍以上差异表达的基因，包括191个上调表达基因和266个下 调表达基因。对这些基因进行聚类分析发现，差异表达基因中最显著富集的基因类别 是氧化还原相关基因，包括28个上调和21个下调的抗氧化基因。这一结果暗示褪黑 素在过氧化氢清除过程中可能存在重要的生物学功能。
二、外源施加褪黑素有效降低黑暗和盐处理下过氧化氢含量
暗处理：取萌发2周的日本晴幼苗，采用含有10μM或20μM褪黑素的营养液培养 10天(持续黑暗处理)(设置不加入褪黑素的对照处理)，分别于处理前、处理5天后 与处理10天后取叶片并检测叶片中的过氧化氢含量。
盐处理：取萌发2周的日本晴幼苗，采用含有褪黑素(10μM或20μM)和0.5g/100ml 氯化钠的营养液培养10天(每天16小时光照/8小时黑暗)(设置不加入褪黑素的对 照处理)，分别于处理前、处理5天后与处理10天后取叶片并检测叶片中的过氧化氢 含量。
正常处理：取萌发2周的日本晴幼苗，采用含有褪黑素(10μM或20μM)的营养液 培养10天(每天16小时光照/8小时黑暗)(设置不加入褪黑素的对照处理)，分别于 处理前、处理5天后与处理10天后取叶片并检测叶片中的过氧化氢含量。
结果见图6(MO代表不加入褪黑素的对照处理，M10代表10μM处理，M20代表20μM 处理)。不管是暗处理还是盐处理，10μM和20μM褪黑素条件下过氧化氢上升水平显 著低于同期对照的过氧化氢水平，过氧化氢水平的受抑制程度和褪黑素的浓度之间成 正相关。正常处理条件下，10μM和20μM褪黑素处理的幼苗中过氧化氢含量同样低 于同期对照。结果表明，褪黑素在降低细胞内过氧化氢含量中起着积极的调控作用。
三、褪黑素显著降低noe1突变体过氧化氢含量以及将低细胞死亡水平
本实施例中所涉及的突变体noe1来源于中国科学院遗传与发育生物学研究所保 存的水稻(Oryza.sativa L.)材料。突变体noe1记载于“Lin A,Wang Y,Tang J,Xue P,Li C,Liu L,Hu B,Yang F,Loake GJ,Chu C(2012)Nitric oxide and protein s-nitrosylation are integral to hydrogen peroxide induced leaf cell death in rice,Plant Physiol.158:451-464.”一文。突变体noe1由于过氧化氢酶(catalase) 活性的丧失而导致H2O2的积累，过量积累的过氧化氢进一步诱导叶片细胞死亡。
取萌发2周的日本晴或突变体noe1幼苗，采用含有20μM褪黑素的营养液培养10 天(每天16小时光照/8小时黑暗)(设置不加入褪黑素的对照处理)，然后对植株叶 片拍照、取叶片进行台盼蓝染色后拍照、取叶片并检测叶片中的过氧化氢含量。
结果见图7(MO代表不加入褪黑素的对照处理，M20代表20μM处理)。20μM褪黑 素条件下，突变体noe1细胞死亡水平明显低于不加入褪黑素的对照，这一结果通过台 盼蓝对死亡细胞的染色获得了进一步的确认。相一致的是，20μM褪黑素条件下突变 体noe1中过氧化氢含量水平仅仅为不加入褪黑素的对照的75％左右。结果表明，褪黑 素是水稻体内是一个有效的H2O2清除剂，而H2O2含量的降低又可以有效的保护的叶片 细胞的延迟衰老和死亡。
实施例4、全生育期施加褪黑素有效延缓年龄介导的叶片衰老
为了评估褪黑素在农业生产上的应用潜力，在人工气候室内对黑龙江地区栽培品 种合江19进行如下试验：
试验组：采用含有20μM褪黑素的营养液对合江19进行全生育期培养(培养条件： 30/28℃、每天16小时光照/8小时黑暗)；
对照组：采用营养液对合江19进行全生育期培养。
开花后第35天的植株照片见图8A，叶片照片见图8B。开花后第35天叶片的叶绿 素含量见图8C，光合速率见图8D，衰老相关基因的相对表达水平(SGR、RCCR1、NYC1、 NYC3、OsNAP、Osh69、OsI57、Osh36；用于检测各个基因的引物见表1；将对照组SAGs 表达量设定为1)见图8E，过氧化氢含量件图8F。图8中，L1、L2和L3分别代表对 主茎蘖上灌浆贡献率最大的顶部三个叶片。
和对照组相比，试验组开花后35天仍保持较好的生长状态，叶片保持绿色。试验 组叶片的叶绿素含量显著的高于不施加褪黑素的对照组。和对照组相比，试验组衰老 相关基因的相对表达水平均显著降低。和对照组相比，试验组光合速率显著增高。和 对照组相比，试验组过氧化氢含量显著降低。结果表明，褪黑素可以显著的延缓年龄 介导的衰老，并且这种生物学过程的实现是通过对过氧化氢含量的调节实现的，更为 重要的是，这种衰老的延迟能够保持使叶片维持较好而且更长时间的光合作用速率， 说明这种衰老的延迟具有明显的生物学意义和生产应用潜力。