抗逆相关蛋白R10在调控植物抗逆性中的应用.pdf

本发明公开了抗逆相关蛋白R10在调控植物抗逆性中的应用。本发明所提供的抗逆相关蛋白R10为a)或b)或c)：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有所述抗逆相关蛋白功能的蛋白质。实验证明，本发明提供的抗逆相关蛋白R10能调控植物的抗逆性，可以用来提高植物抗旱性。

权利要求书1.  抗逆相关蛋白R10在调控植物抗逆性中的应用；所述抗逆相关蛋白R10为a)或b)或c)：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与抗逆性相关的蛋白质。2.  与权利要求1所述抗逆相关蛋白R10相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用；所述与权利要求1所述抗逆相关蛋白R10相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：A1)编码权利要求1所述抗逆相关蛋白R10的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。3.  根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2) 或3)所示的基因：1)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子或cDNA分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述抗逆相关蛋白R10的cDNA分子或基因组DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述抗逆相关蛋白的R10的cDNA分子或基因组DNA分子。4.  权利要求1所述的抗逆相关蛋白R10或权利要求2所述的生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用。5.  根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。6.  根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗旱性。7.  一种培育抗逆性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1所述抗逆相关蛋白R10的编码基因得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物的步骤。8.  根据权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求1所述抗逆相关蛋白R10的编码基因是如下1)或2)或3)所示的基因：1)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子或cDNA分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述抗逆相关蛋白R10的cDNA分子或基因组DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述抗逆相关蛋白的R10的cDNA分子或基因组DNA分子。9.  根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。10.  根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为抗旱性。

说明书抗逆相关蛋白R10在调控植物抗逆性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中抗逆相关蛋白R10在调控植物抗逆性中的应用。
背景技术
在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，获得抗逆农作物新品种的途径包括利用经典遗传学方法的常规选育技术和利用基因工程手段培育转基因新品种技术。常规选育技术周期长，不定向，优异性状难控制；相比之下，转基因技术更快速，可以定向改良单一性状。因此，利用分子生物学技术改造农作物，提高农作物的抗逆能力已经成为近年来的研究热点。
水资源匮乏是我国农业生产面临的巨大威胁。水稻是最重要的粮食作物，是我国一半以上人口的主粮，水稻生长季需水量大，特别容易受到干旱缺水的影响，干旱已成为影响水稻生产最大限制因素之一。在当前水资源普遍短缺的形式下，如何提高水稻对干旱的抵御能力具有重要的生产意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗逆性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了抗逆相关蛋白在调控植物抗逆性中的应用。
本发明所提供的抗逆相关蛋白在调控植物抗逆性中的应用中，所述抗逆相关蛋白R10为a)或b)或c)：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；
b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与抗逆性相关的蛋白质。
其中，SEQ ID No.2由212个氨基酸残基组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID No.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHH
FLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL
上述c)中的蛋白质R10，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质R10可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质R10的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述抗逆相关蛋白在调控植物抗逆性中的应用中，所述植物为陆生植物。所述陆生植物可为双子叶植物和/或单子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物，如水稻(Oryza sativa)。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述R10相关的生物材料。
本发明所提供的与所述R10相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，与所述R10相关的生物材料，为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)编码所述R10的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
上述与所述R10相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，A1)所述核酸分子为如下a1)或a2)或a3)所示的基因：
1)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子或cDNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述抗逆相关蛋白R10的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述抗逆相关蛋白的R10的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID No.1由639个核苷酸组成，编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码R10的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的R10的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码R10且具有R10功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码R10的核酸分子的表达盒(R10基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达R10的DNA，该DNA不但可包括启动R10基因转录的启动子，还可包括终止R10基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型 启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述R10基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr 基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述与所述R10的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述与所述R10的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，所述的微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述与所述R10的生物材料在调控植物抗逆性中的应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
在本发明的一个实施方式中，R10的编码基因(即SEQ ID No.1所示的DNA分子)通过含有R10的编码基因的表达盒的重组载体导入农杆菌EHA105中。所述重组载体为将载体pCUbi1390用PstI单酶切后，插入SEQ ID No.1所示的DNA分子得到的重组载体pCUbi1390-R10，pCUbi1390-R10表达R10蛋白。
上述抗逆相关蛋白R10或所述R10的生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。
上述与所述R10的生物材料在调控植物抗逆性中的应用和抗逆相关蛋白R10或所述R10的生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用中，所述植物为陆生植物。所述陆生植物可为双子叶植物和/或单子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物，如水稻(Oryza sativa)。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗逆性转基因植物的方法。
本发明所提供的一种培育抗逆性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述R10的编码基因得到抗逆性高于所述受体植物的抗逆性转基因植物的步骤。
上述培育抗逆性转基因植物的方法中，所述R10的编码基因的编码序列是如下1)或2)或3)所示的基因：
1)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子或cDNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述抗逆相关蛋白R10的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述抗逆相关蛋白的R10的cDNA分子或基因组DNA分子。
在本发明的实施例中，所述R10的编码基因(即SEQ ID No.1所示的DNA分子)通过含有R10基因表达盒的R10基因重组表达载体导入所述受体植物中。
上述方法中，其中所述R10基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述R10基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述R10基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition))。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述R10基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明中，所述抗逆性可为抗旱性。所述抗旱性具体可为苗期的抗旱性。所述苗期的抗旱性具体可体现为与受体植物相比，植株存活率大于所述受体植株。
实验证明，本发明提供的抗逆相关蛋白R10及其编码基因能提高植物的抗旱性：干旱处理前，野生型水稻、T1代转空载体水稻和T1代转R10基因水稻株系OE1-OE6的生长状态良好；干旱处理后T1代转R10基因水稻株系OE1-OE6失水较少，野生型水稻和T1代转空载体水稻的失水较多；复水后T1代转空载体水稻的幼苗在干旱处理后全部 死亡，而T1代转R10基因水稻株系OE1-OE6有一定比例的存活，T1代转R10基因水稻株系OE3的存活率为85.0％，而野生型水稻的存活率为18.3％，复水后野生型水稻(WT)和T1代转空载体水稻的存活率无明显差异。结果表明，可以利用本发明的抗逆相关蛋白R10及其编码基因提高植物的抗逆性。
附图说明
图1为pCUbi1390载体结构示意图。
图2为荧光定量PCR鉴定转R10基因水稻植株中R10基因的表达结果。
WT为野生型水稻；OE1为转R10基因水稻株系OE1；OE2为转R10基因水稻株系OE2；OE3为转R10基因水稻株系OE3；OE4为转R10基因水稻株系OE4；OE5为转R10基因水稻株系OE5；OE6为转R10基因水稻株系OE6。
图3为干旱处理前后以及复水后的野生型水稻和T1代转R10基因水稻株系OE3的生长状态。
WT为野生型水稻；OE3为转R10基因水稻株系OE3。
图4为复水后的野生型水稻(WT)和T1代转R10基因水稻株系OE3的存活率统计结果。
WT为野生型水稻；OE3为转R10基因水稻株系OE3。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的水稻(Oryza sativa)japonica.cv.Nipponbare(J Exp Bot.2015Jan；66(1):271-81.)公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。水稻(Oryza sativa)japonica.cv.Nipponbare在下文中简称为野生型水稻。
下述实施例中的根癌农杆菌EHA105(Agrobacterium tumefaciens EHA105)(Plant Cell.2014Jan；26(1):410-25.).公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
下述实施例中的表达载体pCUbi1390(J Exp Bot.2015Jan；66(1):271-81.)公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。
实施例1、利用抗逆相关蛋白基因培育抗逆性增强的转基因水稻
1、重组载体和重组农杆菌的构建
以野生型水稻2周苗提取RNA反转录得到的总cDNA为模板，用引物5’-TCTGCACTAGGTACCTGCAGATGGAGCAGCAGGAGGAAGTG-3’和5’- ATGGATCCGTCGACCTGCAGCTATTCCGCCGCCGCCGGTGGAG-3’进行扩增，得到679bp的PCR产物。经过测序，该PCR产物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸。
回收上述PCR产物，通过clontech infusion kit(takara公司产品)同源重组到双元表达载体pCUbi1390的酶切位点PstI上，得到的连接产物转入大肠杆菌中，得到转化子。提取转化子的质粒送去测序，该质粒为将SEQ ID No.1所示的核苷酸同源重组到双元表达载体pCUbi1390上得到的载体，将其命名为pCUbi1390-R10，为过表达重组载体。pCUbi1390-R10表达SEQ ID No.2所示的R10蛋白。
将重组载体pCUbi1390-R10导入根癌农杆菌EHA105中，得到含有重组载体pCUbi1390-R10的重组农杆菌EHA105/pCUbi1390-R10。
将空载体质粒pCUbi1390转入根癌农杆菌EHA105，得到含有质粒pCUbi1390的重组农杆菌EHA105/pCUbi1390。
2、转R10基因水稻的获得
将野生型水稻种子脱壳灭菌，然后采用Hiei等的方法(Hiei,Y.et al.Plant J,1994，6(2):271–282)用重组农杆菌EHA105/pCUbi1390-R10转化野生型水稻获得T0代转R10基因水稻植株。T0代转R10基因水稻植株收种后播种得到T1代转R10基因水稻株系，分别取编号为0E1-OE6的6个T1代转R10基因水稻株系进行下述实验。。
按照上述方法，将重组农杆菌EHA105/pCUbi1390-R10替换为重组农杆菌EHA105/pCUbi1390，其他步骤均相同，得到T1代转空载体水稻的植株。
3、荧光定量PCR鉴定转R10基因水稻植株中R10基因的表达
实验重复三次，每次重复的具体步骤如下：
用植物总RNA快速提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取在水田中生长30天的转R10基因水稻株系OE1的叶片组织的RNA，得到转R10基因水稻株系OE1的RNA，简称株系OE1的RNA。
按照上述方法，将转R10基因水稻株系OE1分别替换为转R10基因水稻株系OE2、转R10基因水稻株系OE3、转R10基因水稻株系OE4、转R10基因水稻株系OE5和转R10基因水稻株系OE6，其它步骤均不变，分别得到株系OE2的RNA、株系OE3的RNA、株系OE4的RNA、株系OE5的RNA和株系OE6的RNA。
提取在水田中生长30天的野生型水稻的叶片组织的RNA，得到对照RNA。
提取在水田中生长30天的转空载体水稻的叶片组织的RNA，得到空载对照RNA。
对上述RNA中的R10编码基因的表达量进行定量分析，鉴定R10基因的引物为5’-TCTTCGGCTTCACCATCACCG-3’和5’-GATGTAGGACTCGAGGACGAG-3’，内参为UBI-F:5’-TGAAGACCCTGACTGGGAAG-3’和UBI-R:5’-CACGGTTCAACAACATCCAG-3’。
实验结果见图2。转R10基因水稻株系OE1、转R10基因水稻株系OE2、转R10 基因水稻株系OE3、转R10基因水稻株系OE4、转R10基因水稻株系OE5和转R10基因水稻株系OE6中R10基因的表达量分别为野生型水稻中R10基因的表达量的18.5倍、15.6倍、25.8倍、30.5倍、23.7倍和29.0倍；野生型水稻中R10基因的表达量和转空载体水稻中R10基因的表达量的无显著差异。结果表明，T1代转R10基因水稻株系OE1、OE2、OE3、OE4、OE5和OE6中均有R10基因的表达。
4、转R10基因水稻植株的抗逆性鉴定
将野生型水稻(WT)、T1代转空载体水稻和T1代转R10基因水稻株系OE3的种子分别种植在装有营养土和蛭石的盆中(营养土和蛭石体积比为1:1)，在25℃，12h光照下进行培养，分别得到3周幼苗，将上述3周幼苗进行干旱处理而后复水。具体为3周幼苗干旱处理前浇足水，之后一直不浇任何液体(包括营养液和水)，20天后再浇水，复水4天后观察水稻植株表型并统计水稻植株存活率。实验重复三次，每次重复30株。
按照上述步骤，将T1代转R10基因水稻株系OE3的种子分别替换为T1代转R10基因水稻株系OE1的种子、T1代转R10基因水稻株系OE2的种子、T1代转R10基因水稻株系OE4的种子、T1代转R10基因水稻株系OE5的种子和T1代转R10基因水稻株系OE6的种子，其它步骤均相同，得到各水稻植株表型并统计水稻植株存活率。
结果表明，干旱处理前，野生型水稻、T1代转空载体水稻和T1代转R10基因水稻株系OE1、T1代转R10基因水稻株系OE2、T1代转R10基因水稻株系OE3、T1代转R10基因水稻株系OE4、T1代转R10基因水稻株系OE5和T1代转R10基因水稻株系OE6的生长状态良好；干旱处理后T1代转R10基因水稻株系OE1-OE6失水较少，野生型水稻和T1代转空载体水稻的失水较多；复水后T1代转空载体水稻的幼苗在干旱处理后全部死亡，而T1代转R10基因水稻株系OE1-OE6有一定比例的存活。干旱处理前后以及复水后的野生型水稻(WT)和T1代转R10基因水稻株系OE3的生长状态如图3所示。上述复水后野生型水稻(WT)、T1代转空载体水稻和T1代转R10基因水稻株系OE3的存活率统计结果表明(图4)，T1代转R10基因水稻株系OE3的存活率为85.0％，而野生型水稻的存活率为18.3％，复水后野生型水稻(WT)和T1代转空载体水稻的存活率无明显差异。
结果表明T1代转R10基因水稻的抗旱性明显提高。