用于细胞维持、 扩增和 / 或分化的透明质酸、 其他基质成 分、 激素和生长因子的复合物 相关专利申请的交叉引用
本申请要求 2007 年 3 月 6 日提交的美国临时申请第 60/893,277 号的优先权， 通 过引用将该申请公开的内容全部并入本文。
技术领域 本发明总体上涉及细胞 ( 例如包括肝祖细胞在内的肝细胞 ) 的维持、 扩增和 / 或 分化。 更具体地， 本发明涉及具有其他细胞外基质成分、 激素和生长因子且被用作用于细胞 的维持、 扩增和分化的支架的透明质酸 (hyaluronan) 复合物， 所述细胞包括祖细胞亚群， 例如肝干细胞、 成肝细胞 (hepatoblast)、 定向祖细胞以及它们的后代细胞。
背景技术 先体外后体内的细胞维持取决于营养物、 特异性细胞外基质成分的底物以及包括 激素和生长因子的可溶性信号物的混合物的使用。营养物、 基质成分和水溶性信号物的独 特的确定成分混合物 (defined mixture) 诱发细胞的生存、 扩增和分化。而且， 确定成分混 合物的成分与干细胞 ( 相对于谱系中的过渡细胞 (intermediate) 且相对于成熟细胞 ) 所 需的特异性成分是谱系依赖性的。以透明质酸复合的混合物提供天然的三维 (3-D) 信号支 架， 该信号支架的坚固性程度除了基础基质分子之外还由交联形式调节， 并且该混合物都 为先体外后体内的组织工程和将被再引入至动物 ( 或人 ) 体内的细胞移植物的形式提供相 当大的优势。这些复合物对于干细胞 ( 例如肝干细胞和它们的后代细胞 ( 如成肝细胞和定 向祖细胞 )) 也很有用， 所述干细胞可被建立在由确定成分混合物构成的复合物中以诱发 急剧的三维扩增， 或者所述干细胞可被接种进驱动三维分化的复合物中。对于包括生物人 工肝或细胞移植在内的基于细胞的疗法而言， 干细胞是合乎需要的候选细胞。这种技术应 当有助于所述疗法， 尤其是对于实体器官的细胞而言， 在实体器官的细胞中， 移植方法对于 细胞的体内再引入可能是特别重要的。
需要一种实现干细胞的显著扩增的条件。 这是由可从正常组织中分离的少数干细 胞来决定的。相反， 先体外后体内的组织工程或者细胞疗法的临床程序需要大量的细胞以 达到预期的目标。因此， 迫切地需要允许干细胞自身更新和 / 或大量增殖后继续分化的技 术。
发明内容
在一种实施方式中， 本发明提供了一种先体外后体内维持、 繁殖和 / 或分化肝细 胞 ( 包括祖细胞 ) 的方法， 该方法包括 ： (a) 提供细胞 ( 例如肝祖细胞 ) 的悬浮液 ； 以及 (b) 在无血清培养基中并在具有或不具有其他细胞外基质成分以及具有或不具有激素或者生 长因子的透明质酸的复合物上培养细胞， 其中基质成分和激素 / 生长因子的精确混合有利 于细胞群 ( 可为祖细胞或成熟细胞 ) 的 1) 维持 ； 2) 自身复制 ( 也称为自身更新 ) ； 3) 扩增( 不包括自身更新 ) 和 / 或 3) 分化。祖细胞可以是干细胞 ( 例如， 肝干细胞 )、 短暂扩增细 胞 ( 例如成肝细胞 ( 肝脏的候选短暂扩增细胞 )) 和 / 或定向 ( 单能 ) 祖细胞 ( 例如定向 肝祖细胞或定向胆祖细胞 )。
所述细胞外基质可进一步由与胶原蛋白 ( 例如 I 型、 III 型、 IV 型或 V 型胶原蛋 白 )、 基底粘附分子 ( 例如层粘连蛋白或纤连蛋白 )、 蛋白聚糖或它们的糖胺聚糖链 ( 例如 肝素蛋白聚糖或肝素 ) 和 / 或激素 ( 例如胰岛素 ) 或生长因子 ( 例如表皮生长因子 ) 复合 的透明质酸组成。在某些实施方式中， 透明质酸通过例如醛桥或者二硫桥而被化学交联。
本发明的细胞是从胎儿组织、 新生儿组织、 儿童组织或者成人组织中获得的。无 血清培养基可包含胰岛素、 转铁蛋白、 其他激素 ( 例如三碘甲腺原氨酸、 生长激素、 胰高血 糖素、 皮质醇 )、 微量元素 ( 例如锌、 铜、 硒 )、 生长因子 ( 例如表皮生长因子或 EGF、 成纤维 细胞生长因子或 FGF、 白血病抑制因子或 LIF) 或混合物 ； 并且在某些实施方式中， 无血清 培养基可主要由胰岛素、 转铁蛋白、 脂类和微量元素组成， 或者可主要由胰岛素、 转铁蛋白 和脂类组成。进一步地， 对于上皮细胞而言， 在培养基中的钙浓度可以从适于扩增的浓度 ( ＜ 0.5mM) 变化至适于分化的浓度 ( ＞ 0.5mM)。最后， 无血清培养基可不含任何生长因子 或除胰岛素和转铁蛋白之外的任何激素。 此外， 本发明的透明质酸复合物可用于先体外后体内的组织工程。 例如， 所述复合 物可被用作移植物的支架而用于体内细胞移植。
在本发明的另一种实施方式中， 本发明提供一种先体外后体内繁殖干细胞 ( 例如 肝干细胞 ) 或者短暂扩增细胞 ( 例如成肝细胞 ) 或者它们的混合物的方法， 该方法包括 ： (a) 提供细胞 ； 以及 (b) 在无血清培养基中并在与其他细胞外基质成分和 / 或激素或生长 因子复合的透明质酸中 / 上培养细胞以繁殖祖细胞群， 而不诱导祖细胞群分化为定向祖细 胞。细胞的谱系阶段可按抗原来界定， 使得可以利用分化来识别自身更新和扩增。例如， 肝 干细胞可以被界定为 EpCAM+、 NCAM+、 白蛋白 +、 CK19+、 密蛋白 3+AFP-， 而肝脏的可能的短暂 扩增细胞 ( 成肝细胞 ) 是 EpCAM+、 ICAM-1+、 白蛋白 +、 AFP+、 CK19+ 和密蛋白 3-。
细胞外基质可以进一步包括与以下物质复合的透明质酸 ： 一种或一种以上胶原蛋 白、 一种或一种以上基底粘附分子、 一种或一种以上蛋白聚糖 ( 或它 / 它们的糖胺聚糖链 ) 和一种或一种以上激素或生长因子或它们的混合物。 进一步地， 在某些实施方式中， 透明质 酸通过例如醛桥或者二硫桥而被化学交联。
在本发明的又一实施方式中， 本发明提供一种组合物， 其包含分离细胞的细胞培 养物、 无血清培养基以及与或未与其他成分复合的透明质酸。细胞外基质成分进一步包 含多种胶原蛋白的任何一种， 基底粘附分子和 / 或蛋白聚糖或它们的糖胺聚糖链的任何一 种。同样， 在某些实施方式中， 透明质酸通过例如醛桥或者二硫桥而被化学交联。
在另一种实施方式中， 透明质酸复合物被接种了上皮细胞 ( 例如肝实质细胞 ) 和 某些间质细胞 ( 例如内皮细胞 ) 的混合物， 并且被用作支架而用于体内细胞移植。
附图说明 本专利文件或申请文件包括多幅彩色附图。一旦请求并支付必要的费用， 专利局 即提供具有彩色附图的本专利或专利申请公开文本的副本。
图 1 是显示肝祖细胞上的透明质酸受体的图片。图 1A 显示出了培养塑料上与间
质伴胞结合的人肝祖细胞上的透明质酸受体， 并且透明质酸受体 CD44( 绿色 ) 和 Dapi( 蓝 色 ) 被染色。(10X)。图 1B-1D 是新鲜分离的肝祖细胞的图像， 图中显示出 CD44( 绿色 ) 和 AFP( 红色 )。(60x)。图中 ： B 代表 CD44、 C 代表 AFP、 D 代表重叠。图 1E 是在肝干细胞集落 上透明质酸受体表达与相结合的间质伴胞相比较的对比图片。平板以 Bodipy 共轭的透明 质酸染色。(4X)。图 1F-1I 是显示存在于培养塑料上的各种不同细胞类型的复合图像。人 肝干细胞的集落中的 DNA(Dapi- 蓝色 ) 或 EpCAM( 绿色 ) 被染色。肝星状细胞表达结蛋白 以红色表示。(40x 油 )。图中 ： A 代表 DAPI、 B 代表 EpCAM、 C 代表结蛋白、 D 代表重叠。
图 2 显示接种在透明质酸水凝胶中细胞的生长能力。图 2A 和 2B 是接种有人成 肝细胞的透明质酸水凝胶与培养了 20 天的透明质酸水凝胶的相差图像。(20X)。图 2C 显示在透明质酸水凝胶中培养 11 天随后用溶酶体荧光探针 Lysotracker( 绿色 ； 488nm) 和线粒体荧光探针 Mitotracker( 红色 ； 543nm) 染色 ( 以显示细胞的生存能力 ) 的人肝 祖细胞的集合体 ( 球状体 )。所示的图像是以 40x/1.3Oil DIC 的球状体的共聚焦切片， 缩放比例为 0.06μm x0.06μm。图 2D 是通过球状体的共聚焦切片， 显示在培养第 11 天 时的透明质酸水凝胶内球状体核心内的细胞的生存能力。从画面 1 开始至画面 6 结束， 图像 “切 开”球 状 体， 显 示 中 心 处 的 活 细 胞。 堆 叠 尺 寸 (stack size) ： 1024x1024x45， 921.4μmx921.4μmx132.0μm。 缩放比例 ： 0.9μmx0.9μmx3.0μm。 物镜 ： 平面 - 萤石物镜 10x/0.3。波长 ： 543nm(Zeiss 510)。 图 3 显示在透明质酸水凝胶中培养的人成肝细胞的某些抗原表达。在透明质 酸水凝胶中培养的人成肝细胞的集合体的各种标记物被染色。所有的照片都是在 Zeiss 510(Leica 和 Olympus Flow View 共 聚 焦 显 微 镜 ) 下 拍 摄 的。 图 3A 显 示 细 胞 角 蛋 白 19(CK19) 的表达。 波长 488nm。 40X 物镜 /1.3Oil DIC。 使用的缩放比例为 0.11μmx0.11μm。 图 3B 是透明质酸水凝胶中的肝祖细胞球状体的相显微照片， 使用 40X 物镜 /1.3Oil DIC。 图 3C 是图 3A 和图 3B 的重叠图像。 图 3D 显示与图 3B 中的相同的球状体细胞培养物中的白蛋白 表达。 物镜 ： 平面 - 萤石物镜 40x/1.3Oil DIC。 波长 543nm。 堆叠尺寸 ： 230.3μmx230.3μm。 缩放比例 ： 0.22μmx0.22μm。在透明质酸水凝胶内的人成肝细胞中白蛋白的表达以红色 显示。图 3E 是水凝胶内的成肝细胞的相显微照片。图 3F 是图 3D 和图 3E 的重叠图像。图 3G 显示出了细胞角蛋白 (CK)8 和 18 的表达 ( 绿色 ； Alexa 488)。细胞核用 Dapi( 蓝色 ) 染色。透明质酸水凝胶没有被染色并在背景中显现为 “波纹状” 图像。使用 60x 油浸镜头 (Leica)。 图 3H 显示透明质酸水凝胶内细胞球状体内细胞中的 I-CAM/1 的表达 (Alexa 488 ； 绿色 )。细胞核用 DAPI( 蓝色 ) 染色。60x 油浸镜头 (Leica)。图 3I- 图 3L 显示被维持在水 凝胶培养物中的细胞中的 EpCAM、 AFP 和白蛋白的表达。20x 和 6x 可变焦距镜头。(Olympus FV500)。图 3I.DIC( 黑白 )。图 3J.EpCAM( 绿色 )。图 3K.AFP( 红色 )， 20x 和 6x 可变焦距 镜头。图 3L 白蛋白 ( 黄色 )。20x 和 6x 可变焦距镜头。
图 4 显示在透明质酸 (HA) 水凝胶中培养的成肝细胞合成白蛋白和尿素的证据。 图 4A 显示在 30 天的培养期内所测量的、 与在塑料基底上的细胞白蛋白产量相比较的、 在 HA 凝胶中的细胞白蛋白产量。被涂覆在 HA 水凝胶中的肝祖细胞的标准化白蛋白产量 ( 开放 色码环 ) 在收集的培养物中调节并且可见到在第 8 天和第 9 天后白蛋白产量峰值下降 ( 黄 色 )。塑料条件下培养的白蛋白数据 ( 封闭填充环 ) 被显示在水凝胶条件的白蛋白数据下 方， 所有的点都低于水凝胶条件所检测到的白蛋白浓度的最低值。没有数据线条适合于白
蛋白产量。图 4B 显示相对于其他底物在 HA 水凝胶中细胞中的尿素产量。将由在透明质酸 水凝胶中的肝祖细胞产生的标准化尿素产量 mg/dl( 开放倒三角 ) 与塑料培养物 ( 闭环 )、 I 型胶原蛋白凝胶培养物 ( 开环 ) 或胶原蛋白夹心式凝胶培养物 ( 已填充的三角 ) 培养物 相比较。增加点对点曲线使得所图示点的天对天观察 (following) 更容易。
图 5 显示 CK19、 白蛋白和 AFP 的 RNA 表达 ( 以 GAPDH 标准化 )。编码 CK19(A)、 白 蛋白 (B) 和 AFP(C) 的 RNA 被从新鲜分离的成肝细胞的培养物、 肝干细胞和在 HA 水凝胶中 培养的肝祖细胞中分离。所有的值都以管家基因 GAPDH 标准化并以样品总 RNA 的每 30ng 中存在的链数表达。
图 6 显示被从塑料中挑出并被转移或传递至透明质酸水凝胶的表面的肝干细胞 集落， 该透明质酸水凝胶通过二硫桥交联， 具有或不具有相关的胶原蛋白。
A. 透明质酸水凝胶
B. 具有 I 型胶原蛋白的透明质酸水凝胶
C. 具有 III 型胶原蛋白的透明质酸水凝胶
D. 具有 IV 型胶原蛋白的透明质酸水凝胶
图 7 显示被从组织培养塑料上的培养物中挑出并被转移至透明质酸水凝胶表面 的肝干细胞集落， 该透明质酸水凝胶通过二硫桥交联并与下述成分复合 ： A. 层粘连蛋白 B. 与 I 型胶原蛋白混合的层粘连蛋白
图 8 显示被嵌入在由二硫桥交联的透明质酸水凝胶中的肝干细胞。要注意的是， 所述细胞正在水凝胶各处形成集合体或者球状体。
A. 具有嵌入的肝干细胞的透明质酸水凝胶。4X
B. 具有嵌入的肝干细胞的透明质酸水凝胶。20X
具体实施方式
在体内， 肝细胞与可溶性因子 ( 例如营养物、 气体、 生长因子 ) 和非可溶性因子 ( 例如细胞外基质成分 ) 都发生相互作用。与这些因子的相互作用 - 特别是细胞与细胞之 间的相互作用、 生长因子的有效性以及在成熟肝脏组织中发现的特异性细胞外基质成分的 存在与否 - 已经被研究。然而， 主要在胚胎和胎儿组织中发现的基质化学物质的效果较少 被研究。
透明质酸 (HA) 是由二糖单元组成的糖胺聚糖 (GAG)， 二糖单元之间分别通过 N- 乙 酰基 -D- 葡萄糖胺部分与葡萄糖醛酸部分之间的 β-1-3 键、 β-1-4 键连接。透明质酸有 助于基质结构的稳定性和完整性、 水和蛋白质的动态平衡、 组织保护、 分离和润滑、 细胞移 动 / 迁移的促进、 运送调节 ( 包括空间排阻 )、 作为储藏器而锚定激素以及免疫炎症响应的 整合。
在胚胎组织中和在经历细胞扩增和增殖、 创伤修复和再生的成人组织中， 发现大 量的透明质酸。在肝脏中， 透明质酸存在于胚胎和胎儿组织的基质中并且靠近位于成人肝 脏的 1 区的预定 (presumptive) 干细胞区室 ( 赫林氏管 )。然而， 相信透明质酸不与成熟的 实质细胞结合。因此， 本发明的发明人推测， 透明质酸可以是候选的基质成分， 作为用于细 胞 ( 特别是祖细胞 ) 的先体外后体内的培养的 3-D 支架， 或作为用于将细胞再引入宿主的 移植物的支架。在体内透明质酸具有高转换率， 且得到的支架易碎且不稳定， 影响了它们在以下 实际应用方面用到的能力 ： 先体外后体内培养、 组织工程、 生物反应器体系或移植使用的移 植物。因此， 本发明的透明质酸支架通过化学交联被 “稳定” 。在某些实施方式中， 透明质酸 通过醛桥被交联， 而在其他实施方式中， 透明质酸通过二硫桥被交联。
发明人测试了通过交联而被化学修饰的透明质酸的生物学效果， 交联使得透明质 酸水凝胶支架不溶于水， 但保持了被预期为它们的生物学功能所必须的性质。被接种到透 明质酸水凝胶中的人成肝细胞被发现保留其生存能力和分裂能力超过四周， 比在培养塑料 上的细胞可能具有的时间长 3 倍。 我们惊奇地发现， 被接种到纯透明质酸 ( 没有与其他成分 复合 ) 中的细胞在培养基 (Kubota 氏培养基， 为干细胞 / 祖细胞而设计， 仅由基础培养基、 胰岛素、 转铁蛋白 /Fe、 脂类和两种微量元素 ( 硒、 锌 ) 组成 ) 中保持稳定 ( 即， 不分化 )， 并 且在整个培养期内保持如干细胞或者非常早期的成肝细胞。虽然， 其他培养条件对于肝干 细胞的生存和自身复制是允许的 ( 例如 III 型胶原蛋白和 Kubota 氏培养基 )， 但透明质酸 已经是被发现的有利于干细胞和成肝细胞的生存和自身复制的第一培养条件， 并且是允许 以三维形式维持和自身复制的第一培养条件。在单层形式中， 成肝细胞的生存需要各种养 料， 并且成肝细胞表现出在迄今已发现的养料上的有限扩增潜能 ； 实际上， 已发现成肝细胞 仅在透明质酸上自身复制， 且不在所测试的其他条件下自身复制。
肝脏是由造血细胞、 间质细胞和肝祖细胞的混合物构成的。肝脏中的肝祖细胞亚 群由两个多能细胞群 ( 肝干细胞和成肝细胞 ) 和两个单能细胞群 ( 定向肝祖细胞和定向胆 祖细胞 ) 组成。
肝干细胞和成肝细胞在以下方面具有大量相同点 ： 它们的表型 ； 表达白蛋白、 上 皮 特 异 性 细 胞 角 蛋 白 (CK)8 和 18、 胆 特 异 性 细 胞 角 蛋 白 CK19、 上皮细胞粘附分子 EpCAM(CD326 或 HEA125)、 CD133/1(Prominin)、 端粒酶、 Shh 蛋白和 Ihh 蛋白 ； 并且对于造血 蛋白 (CD45、 CD34、 CD38、 CD14 和血型糖蛋白 A)、 内皮细胞 (CD31、 VEGFr 或 KDR、 血管性血友 病因子 ) 以及其他间质蛋白 (CD146、 结蛋白、 α- 平滑肌肌蛋白或 SMA) 标记物呈阴性。它 们可在以下方面区别开来， 肝干细胞表达 NCAM 和密蛋白 3， 而成肝细胞表达 ICAM-1(CD54)、 甲胎蛋白 (AFP) 和胎儿 P450( 例如 P450A7)( 见表 1)。在体内， 多能肝祖细胞在妊娠的第 11 周到第 13 周之间产生肝谱系和胆谱系。
EpCAM ＝上皮细胞粘附分子 ； CK19 ＝细胞角蛋白 19、 胆特异性细胞角蛋白 ； I-CAM ＝细胞间粘附分子 ； NCAM ＝神经元细胞粘附分子 ； MDR3 ＝多药耐药基因同种型 3( 在胆汁 输运中涉及到 ) ； P450-C3A4 ＝细胞色素 P4503A4 ； 密蛋白 3 ＝紧密结合蛋白 ( 同种型 3)， n.t ＝未测试。本发明提供了一种在长时间内维持、 扩增和 / 或分化包括祖细胞在内的细胞的方 法。该细胞可以在生存条件、 扩增条件或分化条件下被建立， 所述条件依赖于与透明质酸 复合的成分的精确混合物以及无血清成分确定培养基的确切成分。在一种实施方式中， 肝 祖细胞、 成肝细胞或肝干细胞是从人的肝脏中获得的， 并且在具有 “Hiroshi Kubota 氏培 养基” (HK) 的透明质酸水凝胶上 / 中繁殖， 该 Hiroshi Kubota 氏培养基是无血清基础培养 基， 其具有低浓度的铜或没有铜和具有低浓度的钙 ( ＜ 0.5mM)， 且仅补充有胰岛素、 转铁蛋 白 /Fe、 脂类 ( 高密度脂蛋白和与纯化白蛋白结合的游离脂肪酸 ) 以及某些微量元素 ( 锌、 硒 )。该方法还提供用于具有特定表型的细胞的稳定繁殖的装置， 该表型在这些条件下介 于干细胞表型和成肝细胞表型之间。这样， 与为肝祖细胞而调节的无血清培养基 ( 例如， HK 培养基 ) 结合的透明质酸水凝胶可为人肝祖细胞 ( 在这种情况下， 为干细胞和早期的成肝 细胞 ) 提供合适的三维支架。水凝胶加上培养基也能够在生存能力方面使得细胞 ( 例如早 期的成肝细胞 ) 的维持具有繁殖能力、 在延长的培养期中具有表型稳定性， 并且对于向胆 细胞或肝细胞的转变具有最小的谱系限制 ( 如果有的话 )。
不坚持理论或不受理论的约束， 目前认为， 经醛交联 ( 例如， 通过 HA 的羧酸基团 ) 的透明质酸很少被来自肝干细胞的伴胞 ( 例如成血管细胞或内皮细胞 ) 中的酶活性修饰， 并且导致 HA 上的肝祖细胞生长缓慢。细胞外基质的转换， 包括透明质酸的转换， 通常通过 细胞的酶解而在体内完成， 酶解是在细胞的扩增和建立中形成组织或器官的固有过程。因 此， 目前认为先体外后体内的祖细胞需要为了扩增而分解透明质酸的能力。如同包含在水 凝胶中的大流体体积可影响细胞的成熟一样， HA 支架的硬度也可影响细胞的成熟。因此， 应当调节 HA 水凝胶的物化性质 ( 例如柔韧性和交联密度 ) 以优化细胞扩增的过程。 实施例
人肝脏的来源
胎儿肝脏。肝脏组织由官方认可的机构 (Advanced Biological Resources， San Francisco， CA) 提供， 所述肝脏组织是从受孕 18 至 22 周之间任选的时间停止妊娠的胎儿 中得到的。研究方案经 UNC 的人类研究伦理委员会的审核和批准。
新生儿肝脏。来自新生儿、 儿童和成人捐献者的完整肝脏是经 UNOS 通过器官捐献 计划获得的。用于这些研究的肝脏被认为是正常的， 没有疾病过程的迹象。以研究为目的 的肝脏的使用获得了直系亲属的知情同意， 方案得到人类研究伦理委员会的批准， 并且处 理遵从 GMP。
细胞分离
胎儿肝脏。处理人胎儿肝脏组织的方法先前已在例如 Schmelzer E 等 2006(Stem Cells) 中被报道。所有处理过程和细胞富集过程都在细胞清洗缓冲液中进行， 该细胞清洗 缓冲液由补充了 0.1％牛血清白蛋白 (BSA Fraction V， 0.1％， Sigma， St.Louis， Mo.)、 浓度 均为 5μg/ml 的胰岛素和铁饱和转铁蛋白 (Sigma St.Louis， MO)、 微量元素 ( 亚硒酸， 300pM 和硫酸锌， 50pM) 以及抗生素 (AAS， Gibco BRL/Invitrogen 公司， Carlsbad， California) 的基础培养基 (RPMI 1640) 组成。将肝脏组织再分为 3mL 的片段 ( 总体积范围为 2mL 至 12mL)， 用于在 25mL 的、 32EC 的含有 IV 型胶原蛋白和脱氧核糖核酸酶 (SigmaChemical Co.， St.Louis， 均为 6mg/mL) 的细胞清洗缓冲液中分解， 并在 15-20 分钟的时间内频繁搅拌。这 导致产生细胞集合体的均匀悬浮液， 将细胞集合体通过 40 针 (gauge) 的网孔， 并且在重新
悬浮于细胞清洗溶液之前， 以 1200RPM 离心旋转五分钟。红细胞通过低速离心被分离， 或者 通过以下方式被分离 ： 使用抗人红血球 (RBC) 抗体 (Rockland， 109-4139 号 )(1 ∶ 5000 稀 释液 ) 处理悬浮液 15 分钟， 再使用 LowTox Guinea Pig 补体 (Cedarlane Labs， CL4051 号 ) (1 ∶ 3000 稀释液 ) 处理 10 分钟 ( 均在 37℃进行 )。通过台盼蓝排除法估计的细胞生存能 力通常高于 95％。进一步的详细信息参见补充数据。
新生儿肝脏。 在 34℃， 通过门静脉和肝动脉向所述肝脏灌注含有 EGTA 的缓冲液 15 分钟， 然后灌注 600mg/L 的胶原酶 (Sigam)30 分钟。器官在任一种收集缓冲液中被机械解 离； 将细胞悬浮液通过孔径为 1000 微米、 500 微米以及 150 微米的过滤器 ； 收集单个细胞， 随后在 Cobe2991 细胞洗涤器中， 使用在 Optiprep- 补充缓冲液中的密度梯度离心 (500xg， 室温， 15 分钟 ) 从死亡细胞和碎片中分离活细胞。收集所产生的位于 OptiPrep/ 细胞溶液 和不含酚红的 RPMI-1640 之间的界面处的肝细胞带。
在其他实验中， 使用几种活体染料中的一种来评价培养基中的生存能力， 该活体 染料包括 ： 溶酶体绿色荧光探针 Lysotracker Green、 线粒体红色荧光探针 Mitotracker Red 和溶酶体红色荧光探针 Lysotracker Red(Molecular Probes)。 优选地， 当共同染色时， 基于与其他荧光探针的差别选择染料。活体染料在 HK 培养基中培育 30 分钟并且浓度如 下： 溶酶体绿色荧光探针 LysotrackerGreen 75nM、 溶酶体红色荧光探针 Lysotracker Red 75nM 以及线粒体红色荧光探针 Mitotracker Red250nM。 组织培养塑料
被富集用于成肝细胞的人肝祖细胞的悬浮液被接种在塑料上， 其中 2.5％胎牛血 清 (FBS) 被添加至 HK 培养基中。在 37℃、 含有 5％ CO2 条件下培育 16 小时后， 用无血清 HK 培养基代替之前的培养基， 以用于后续研究。塑料上的细胞以每 3 天更换一次培养基的方 式培养， 直到实验结束。在最开始的 16 小时培养过程中没有贴附的细胞在更换培养基时被 吸出。在试验结束时， 在吸出 HK 培养基后， 将 4％的多聚甲醛加至平板上以固定细胞。
人肝干细胞和成肝细胞具有透明质酸受体
使用以相关荧光探针直接标记的一抗或者使用两步染色法 ( 先用一抗染色， 接着 用与荧光探针结合的二抗染色 ) 来给细胞染色， 以用于免疫荧光检测 ( 见下表 2)。染色之 前， 将大约 1mL 的磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 置于需要的地方以洗去任何碎片。 在 1 小时内加入 山羊血清 ( 在磷酸盐缓冲溶液中， 浓度为 10％ ) 以封闭组织内的非特异性结合位点。移除 封闭并且用 1x PBS 清洗位点。加入单克隆抗体并且培育过夜。4℃培育过夜 ( 例如 18 小 时 ) 后， 移除一抗单克隆抗体溶液， 并且用 1x PBS 冲洗样品三次， 每次 10 分钟。以 1 ∶ 750 或 1 ∶ 1000 的稀释比例加入二抗 (Alexa 488 或 Alexa 594， Molecular Probes)。覆盖 样品以避光， 并让其在室温条件下培育 1 小时。用 1x PBS 冲洗样品 3 次， 并且使用用于显 微镜检术的 DPX 封固剂 (Electron Microscopy Science) 或者含有 DAPI 封固剂的 Vector Shield(Vector Laboratories) 来用盖玻片制备样品。
DAPI 的 浓 度 为 1.5μg/ml。 在 培 养 液 中 培 养 10 天 后， 使 用 在 PBS 中 的 4 ％ 多 聚甲醛将胎儿的肝干细胞集落固定， 并且在室温下使用在 PBS 1 ％ Triton-X100 中的 10 ％山羊血清来封闭该细胞集落 1 小时。一抗 ( 兔 IgG 抗结蛋白 (Abcam) 和鼠 IgG1 抗 EpCAM(Labvision)) 被用于在室温条件下封闭缓冲液 1 小时 ； 二抗 ( 抗 - 兔 AlexaFluor568、 共轭的抗 - 鼠 IgG1AlexaFluor488(MolecularProbes/Invitrogen)) 以及用于细胞核染色
的 DAPI(Sigma) 被用于在室温条件下封闭缓冲液 1 小时。使用由 Leica SP2TCS 软件控制 的 Leica SP2 激光扫描共聚焦显微镜 (Leica Microsystems) 分析荧光。
为了分析与荧光探针标记结合的细胞质抗原 ( 例如白蛋白， AFP)， 使用 Leica SP2AOBS 立式激光扫描共聚焦显微镜、 Zeiss 510Meta 反向激光扫描共聚焦显微镜和 Leica DMIRB 反向荧光 /DIC 显微镜 ( 配有 B/W 和彩色数码相机 ) 来使细胞成像。
结果表明， 如图 1A 所示， 人肝干细胞和成肝细胞对于透明质酸受体呈阳性， 该结 果通过使用抗 CD44 的荧光抗体来免疫染色人肝干细胞的紧密结块的 25 日龄集落来证实。 呈 AFP 阳性的新鲜分离的成肝细胞也对 CD44 受体呈阳性 ( 图 1B- 图 1D)。CD44( 细胞表面 糖蛋白 ) 被显示为绿色， 它标记出了用于 HA 附着的受体。在图 1A 中， 受体覆盖干细胞集落 中几乎 100％的细胞， 单个细胞含有不同量的受体， 可见在某些细胞中染色深， 而其他细胞 较明亮， 染色较浅。通过使用 DAPI 染色 ( 蓝色 ) 细胞核， 使单个细胞相互间形成对比。
如图所示， 染色暗示了每个人肝祖细胞具有 HA 附着能力。在图 1E 中， 从人类 胎儿肝脏中分离并在塑料上培养 4 周的人肝祖细胞的原代培养物被以 4x 成像， 并且以 HA-BODIPY 共轭物荧光染色。 肝祖细胞表达 HA 受体水平的速度比培养物中的其他细胞 ( 包 括基质细胞和内皮细胞 ) 快。由于摄入共轭的 HA 而具有大量 BODIPY 染色的肝祖细胞位于 左下象限。
相比较而言， 分别出现在右下象限和上象限的成纤维细胞和非实质细胞在它们的 HA 介导的结合和摄取中活性较小。 已利用以其他限定的标记物来进行非实质细胞的免疫组 化染色， 以识别特异性亚群。间质细胞包含多个亚群， 包括 ： 成血管细胞 (KDR+/CD133-1+/ CD117+) ； 成熟内皮细胞 (CD31+) ； 肝星形细胞 ( 结蛋白 +， α- 平滑肌肌蛋白 +) ； 包括红血 球细胞 ( 血型糖蛋白 A+) 在内的造血细胞 (CD45+)。这些细胞亚群的代表如图 1F- 图 1I 所 示 ( 对于结蛋白的表达呈阳性的肝星形细胞位于邻近 EpCAM 阳性干细胞的位置 )。
人肝祖细胞在 HA 水凝胶中是可存活的且三维扩增
透明质酸 ( 平均分子量 ： 1,500,000) 从 Kraeber GMBH and Co.(Waldhofstr， Germany) 获得。己二酸二酰肼 (ADH) 和乙基 -3-[3- 二甲基氨基 ] 丙基碳二亚胺 (EDCI) 从 Sigma-Aldrich(St.Louis， MO) 购买。本文公开的这些试剂和其他试剂可从多个卖方 获得， 所有这些卖方都提供适用于本发明实施的试剂。用于细胞培养的透明质酸基质是 使用先前已公开方案的一种修饰方法通过醛交联而制备的。参见， 例如， Vercruysse KP 等， Synthesis and In Vitro Degradationof New Polyvalent Hydrazide Cross-Linked Hydrogels of Hyaluronic Acid( 与透明质酸水凝胶交联的新型多价酰肼的合成和体内 降 解 ).Bioconjugate Chemistry1997 ； 8： 686-694 ； 和 Kim A. 等， Characterization of DNA-hyaluronan matrix forsustained gene transfer( 用于持续基因转移的 DNA- 透明质 酸基质的性质 ).Journal of Controlled Release 2003 ； 90 ： 81-95 ； 通过引用将它们的公 开内容全部并入本文。
简言之， 制备、 测量并在适当尺寸的铝模具中沉积 1％的透明质酸水溶液， 干冰上 速冻并且冻干以形成固态海绵状薄片。将该薄片在 0.1％ ADH 溶液 (90％异丙醇 /10％水 ) 中培育 30 分钟以使 ADH 溶液能够完全渗透。将 EDCI(120mg) 加入到 ADH 溶液中并通过搅 拌快速溶解。通过向试剂混合物中加入 1N HCl 以调节 pH 至约为 4.5 来开始部分水合的 HA 海绵状薄片的交联。
通过倾析试剂混合物并且以 100ml 的 90％异丙醇替代它来终止反应。随后， 通过 培育过夜而使用 100ml 的 90％异丙醇连续萃取回收的已交联 HA 基质至少五次。然后将 HA 基质转移至纯的异丙醇中以除去所有的残留水分并风干。已交联的 HA 基质的直径分别为 0.7cm 或 3.5cm。当再次水合时， HA 基质易于吸收水分并且形成高度多孔的 HA 海绵状水凝 胶。 在用于培养之前， 通过具有 40Gray(40 焦耳 /kg) 的递送剂量的铯源 (JL Shepard MarkI Model 68CesiumIrradiator-Department of Radiation Oncology， UNC) 照射 10 分钟的 时间而给 HA 水凝胶灭菌。
在透明质酸水凝胶中的成肝细胞培养物
HA 水 凝 胶 被 置 入 培 养 孔 中， 该培养孔是由聚苯乙烯制成的 6 孔培养板的培 养孔， 或者对于尺寸较小的水凝胶基质而言， 该培养孔是腔室盖玻片培养片的培养孔 (Lab-Tek-Nunc， Napersville， IL)。较小的水凝胶在接种新鲜分离的细胞前， 除了用 HK 培 养基预浸泡之外， 不需要操作 ( 引发 )。轻微的操作有利于较大的水凝胶， 以确保从水凝胶 中移除气泡。在大多数情况下， 在水凝胶上添加 3ml 的 HK 培养基可以捕获气泡， 通过轻轻 挤压水凝胶驱使空气从侧面排出而可使气泡被机械地移除。
引发后， 被富集用于成肝细胞的人肝祖细胞的悬浮液以 2×106 个细胞 / 水凝胶和 2×105 个细胞 / 小水凝胶的密度被接种于在含有 2.5％ FBS 的 HK 培养基中的大 HA 水凝胶 上。在 CO2 恒温箱中， 37℃条件下， 16 个小时的最初培育后， 含有 FBS 的培养基被无血清 HK 培养基代替。6 孔平板的工作体积为 3ml 并且 2- 腔孔的工作体积为 2ml。细胞在这些相同 条件下培养 4 周， 每 2-3 天更换一次培养基。
如 本 文 所 讨 论 的， HK 培 养 基 由 无 血 清 基 础 培 养 基 ( 例 如， RPMI 1640， Gibco-Invitrogen) 构成， 该无血清基础培养基不含铜， 且含有低钙浓度 ( ＜ 0.5mM) 并且补 充有胰岛素 (5μg/ml)、 转铁蛋白 /Fe(5μg/ml)、 高密度脂蛋白 (10μg/ml)、 硒 (10-10M)、 锌 (10-12M) 和 7.6μE 与纯化的白蛋白结合的游离脂肪酸的混合物。这种培养基的具 体制备方法已在别处公开， 例如， Kubota H， Reid LM.Clonogenic hepatoblasts， common precursors forhepatocytic and biliary lineages， are lacking classical maj or histocompatibilitycomplex class I antigen( 产 克 隆 成 肝 细 胞， 肝谱系和胆谱系的 共同前体， 缺少典型的主要组织相容性复合物 I 类抗原 ).Proceeding ofthe National Academyof Science(USA)2000 ； 97 ： 12132-12137 ； 通过引用将其公开内容全部并入本文。
从新鲜分离的人胎儿肝脏中分离的细胞在水凝胶中展现出对聚集 / 扩增的亲和 性。单个细胞和最多具有四个细胞 / 集合体的集合体首先被接种在 HA 水凝胶内。在 3 周 的培养期结束时， 图 2A、 图 2B、 图 2C 和图 2D 所示的细胞集合体展现出更大的细胞集合体。 图 2B 中的抽样集合体具有的细胞计数为每个集合体有 63 到 2595 个细胞。图 2A 和图 2B 图示了在 HA 水凝胶中的可见集合球状体。
而且， 图 2C 和图 2D 中的集合体利用线粒体荧光探针 Mitotracker 活性和溶酶体 荧光探针 Lysotracker 活性的荧光捕获展示了细胞的生存能力， 其中荧光探针在主动吸收 后穿入可见组分中。图 2D 也表示共聚焦平面， 它显示出集合球状体的内部 ( 线粒体红色荧 光探针 Mitotracker-red， 被染色的 ) 结构 2-5 内不是中空的也不是坏死的。DNA 测量显示 出从塑料上的死亡细胞中收集的可计量细胞 DNA 的完全逆转， 与它们在 HA 水凝胶中的扩增 ( 在 14 天的培育期内， 平均每天增加量为约 2％ ) 相对。
与在培养塑料上的成肝细胞相比较， 在透明质酸水凝胶中的成肝细胞存活时间较 长
被富集用于成肝细胞的人肝祖细胞的悬浮液被接种在塑料上， 其中 2.5％胎牛血 清 (FBS) 被添加至 HK 培养基中。在 37℃、 含有 5％ CO2 条件下培育 16 小时后， 用无血清 HK 培养基代替之前的培养基， 以用于后续研究。塑料上的细胞以每 3 天更换一次培养基的方式培养， 直到实验结束。在最开始的 16 小时培养过程中没有贴附的细胞在更换培养基时被 吸出。在试验结束时， 用 4％的多聚甲醛固定细胞。
在水凝胶中和在 HK 培养基中的细胞， 在大于 4 周的整个培养过程中， 维持一种介 于肝干细胞表型和成肝细胞表型之间的稳定表型， 且对于向胆细胞或肝细胞的转变没有谱 系限制。代表性的数据由在图 3 中给出的免疫组化染色而显示。通过胆谱系标记 (CK19) 与白蛋白的共同表达可证实细胞是肝实质祖细胞 ( 图 3A-3F)， 通过 CK8/18 染色可证实细胞 是上皮细胞 ( 图 3G)。在大多数细胞中发现的 I-CAM 染色 ( 图 3H) 以及 AFP 的低水平表达 表明细胞处于接近成肝细胞分化阶段的分化阶段。实际上， 完全分化的成肝细胞被预期具 有高水平的甲胎蛋白， 这是通过生化功能试验证实的一种结论 ( 见下文 )。最后， 成肝细胞 由 EpCAM、 AFP 和白蛋白这三种标记的共同表达来标记 ( 图 3I- 图 3L)。
在 HA 水凝胶中细胞维持早期成肝细胞的表型长于四周
白蛋白的产量由酶联免疫吸附试验 (ELISA) 测试。 在 4 周的培养期内， 每天或每隔 一天从对照 ( 塑料 ) 培养物和 HA 水凝胶中收集一次培养上清液。来自培养物的培养基被 冷冻并被保存在零下 20℃， 直到被分析。 纯化的人白蛋白被作为标准， 过氧化物酶共轭的抗 体被用作抗白蛋白的荧光探针。 使用 Spectromax 250 多孔板读数器 (Molecular Devices， Sunnyvale， CA) 进行测量。 相似地， 基于尿素与二乙酰肟的直接相互作用， 尿素产量采用尿素氮敏感试验来 分析。使用细胞荧光 Spectromax 250 多孔板读数器， 在 515nm-540nm 处， 以分光光度法测 量尿素浓度。在 30 天的培养过程中， 将在 HA 水凝胶中培养的肝祖细胞的白蛋白的产量与 在塑料上培养的肝祖细胞的白蛋白的产量相比较。对于所有的培养物而言， 在第 7 至第 10 天之间， 白蛋白的浓度 ( 每体积 ) 达到峰值。成肝细胞在塑料上的培养物中维持 7 至 10 天 并且可靠地表达相当高水平的白蛋白。相反， 肝祖细胞在水凝胶中的培养物中维持大于四 周的时间。
图 4A 是涂覆在 HA 水凝胶中的成肝细胞的标准化白蛋白产量 ( 开放色码环 )。 白蛋 白的水平在第 8 至第 10 天之间达到峰值并下降， 类似于涂覆在培养塑料上和 I 型胶原蛋白 衬底上的细胞的白蛋白水平变化。标准化的白蛋白数量显著偏高， 调节出接近 4×10-5mg/ ml 的趋势， 然而在塑料上培养的成肝细胞完全低于基线 2.5×10-5mg/ml。当相对水凝胶中 细胞的白蛋白数据绘制塑料上细胞的白蛋白数据时 ( 封闭填充环 )， 标准化的数据一向低 于在 HA 水凝胶中培养的相同的细胞。
当在本研究中使用胶原蛋白凝胶时， 使用鼠尾 I 型胶原蛋白。除非另有说明， 否则 胶原蛋白基质的密度浓度为 1.5mg/ml。对于本研究的平皿培养法而言， 0.4ml 的 I 型胶原 蛋白被涂覆在直径为 35mm 的培养皿表面上， 并且在 37℃、 95％ O2-5％ CO2 条件下培育 1 小 时以允许凝胶化。 然后， 使用补充有 10％ FBS 的培养基将 1 百万活肝细胞接种在凝胶层上。 细胞培育 8 小时之后， 除去培养基并将 0.5ml 的无血清培养基加到所述培养物的上层， 并且 每天更换。
对于本研究的夹心式培养研究而言， 培养使用 35mm 组织培养皿。 简言之， 将 1 百万 活细胞涂覆在平板胶原蛋白基质上并且允许在补充了 10％ FBS 的培养基中， 37℃和 5％ CO2 条件下， 附着 8 小时。然后， 除去培养基并且添加额外的 0.4ml 的胶原蛋白在细胞的上层， 接着在 37℃条件下， 凝胶化 1 小时。随后， 将 0.5ml 的无血清培养基加到培养物的上层， 并
且每天更换。
尿素生产 ( 成熟肝细胞的共同功能 ) 在图 4B 中被图示。对该试验而言， 尿素的浓 度以 mg/dl 形式给出。 由在透明质酸水凝胶中的成肝细胞产生的标准化尿素产量 mg/dl( 开 放倒三角 ) 与塑料上的细胞的标准化尿素产量 mg/dl( 闭环 )、 单层 I 型胶原蛋白培养基上 的细胞的标准化尿素产量 mg/dl( 开环 ) 以及在两层 I 型胶原蛋白之间培养的细胞的标准 化尿素产量 mg/dl 相比较 ( 混杂填充三角 )。同样， 在所有培养物中的尿素产量都有降低， HA 水凝胶比塑料表现得稍微好些， 并形成较缓慢的下降衰减。
在 HA 水凝胶中培养的细胞的 RNA 分离是使用 Invitrogen 提供的 TRIzol 分离试 剂来完成的。从培养板中移除水凝胶并将水凝胶放入 2ml 的 Eppendorf 管中， 在 4℃条件 下， 在微超速离心机上以 12,000rcf(11,953.34g) 的速度离心。通过抽吸移除上清液并且 加入 1ml TRIzol。在对比性的塑料对照培养物 ( 其中细胞贴附在培养平板上 ) 中， TRIzol 被直接加到平板上， 然后被收集至管内 ( 不需要离心， 但在抽吸培养基之后 )。
通过添加 0.2ml 氯仿， 经相分离而收集 RNA。收集水相之后， 通过异丙醇沉淀 RNA， 接着用 70％的乙醇洗涤。最终的 RNA 沉淀被风干， 并被重悬在 100μl 的无 RNA 酶的水中。 使用 DU7400 分光光度计 (Becker) 完成定量。
通过向每个残留 TRIzol 试剂的管中加入 0.3ml 的 100％乙醇来分离 DNA。试管在 室温培育两分钟， 然后以 1000g 在 4℃条件下离心 5 分钟。苯酚 / 乙醇水相被除去以用于蛋 白质的进一步分析。用柠檬酸钠溶液洗涤 DNA 粒两遍， 然后用 75％乙醇洗涤 DNA 粒两遍， 并且每次以 5000g 在 4℃离心。第二次用乙醇洗涤离心之后， 通过抽吸移除上清液， 并且将 样品风干 15 分钟。将 DNA 粒在 100μl 的 8mM 氢氧化钠溶液中重新溶解， 并且使用 3.2μl 1M Hepes(Mediatech) 来缓冲液处理， 最后达到 pH 为 7.0。样品以 12000g 离心 10 分钟， 并 将上清液转移至新的管中。使用 Beckman 分光光度计完成 DNA 定量。
通过定量实时 RT-PCR 分析的基因表达
基因特异性 mRNA 通过以下方法产生 ： 使用 RNeasy 试剂盒 (Qiagen， Valencia， CA) 从肝脏中提取总 RNA， 并通过 Superscript II 型逆转录酶 (Invitrogen) 和寡脱氧胸 苷 (12-18) 引物逆转录总 RNA。在传统的 PCR 中， cDNA 作为模板与基因特异性引物 ( 序列 见下表 3) 一起被使用， 在该基因特异性引物中， 正向引物具有用于 T7 启动子序列 (5’ gac tcg taa tac gac tca cta taggg) 的 5’ 突出端。该扩增的基因特异性 DNA 与 T7-RNA 聚 合酶 (Promega) 一起被用于体外转录， 产生在定量 RT-PCR( 使用不具有 5’ 突出端的基因特 异性引物 ) 中用作标准物的基因特异性 RNA( 具有被 T7-RNA 聚合酶包括的额外的 5’ ggg) 被作为标准使用 ； 标准范围为 1 个模板至 108 个模板。使用 LightCyclerRNA Master SYBR Green I 型试剂盒在 LightCycler 仪器 (Roche) 中完成定量 RT-PCR。使用 RNeasy 小型试 剂盒 (Qiagen) 从样品中提取 RNA。
图 5A- 图 5C 是 CK19 水平、 白蛋白水平和 AFP RNA 水平的图表比较， 这些水平以在 HA 水凝胶中培养的肝祖细胞中的 GAPDH 管家基因、 在塑料上培养的肝干细胞中的 GAPDH 管 家基因以及从胎儿肝细胞悬浮液中新鲜分离的成肝细胞中的 GAPDH 管家基因的水平被标 准化。对于来自新鲜分离的成肝细胞的每 30ng 总 RNA 而言， 具有高水平的 AFP(130 链 )、 白 蛋白 (7000 链 ) 以及相对低水平的 CK19(1.2 链 )。相反， 从肝干细胞中分离的 RNA 中根本 没有 AFP， 且显示出低水平的白蛋白 (2.6 链 ) 和高水平的 CK19(100 链 )。 被接种植在 HA 水凝胶中的肝祖细胞显示出低水平的 CK19(1.66 链 )、 低水平但是可检测的 AFP(0.33 链 ) 以 及一定水平的白蛋白 (5.77 链 )， 该白蛋白水平高于肝干细胞中的白蛋白水平， 但显著低于 在新鲜分离的成肝细胞中观察到的白蛋白水平。在 HA 水凝胶中维持的肝干细胞或肝祖细 胞中都没有检测到 Cyp3A( 在成熟的肝细胞中发现的 P450 细胞色素 )。因此， HA 水凝胶中 的肝祖细胞不是干细胞， 因为它们表达 AFP 和 ICAM-1， 但是与新鲜分离的成肝细胞相比较， 它们的功能定量水平更接近干细胞。事实上， 这些细胞是早期的成肝细胞。
* 如在美国专利申请第 20030148329 号所报道的， AFP 引物是仅检测肝特异性 AFP 的引物， 通过引用将该专利申请的公开内容全部并入本文。
虽然本发明已经描述了与其相关的具体实施方式， 将被理解的是， 本发明能够被 修改并且本发明目的是覆盖任何变化、 用途或者本发明的后续修改。 总体上， 本发明的原则 和对本发明公开的内容作的变更 ( 如在本发明所属的技术领域的公知或惯例范围内作的 变更以及在可能被应用的必要特征上作的变更 ) 在上文中已阐述， 权利要求的保护范围如 下所述。