一种小鼠精原干细胞分离培养方法.pdf

本发明公开了一种小鼠精原干细胞分离培养方法，利用中性蛋白酶消化性质温和、高效、对细胞刺激性小的特点分离小鼠精原干细胞，将小鼠精原干细胞的富集步骤与传代有机结合，使用中性蛋白消化贴壁的小鼠精原干细胞集落，达到较好的富集效果。本发明具有分离培养操作简单，时间短，效果好，且成本低的特点。

权利要求书
1.  一种小鼠精原干细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、小鼠精原干细胞分离：
小鼠的睾丸去除白膜后，收集生精小管，加入中性蛋白酶，在35-39℃下消化20-30分钟，待消化液中出现白色絮状漂浮物时收集消化液进行离心，离心液去上清后洗涤，然后用小鼠精原干细胞培养液进行重悬、筛分，筛分得到的滤液接种至含小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的培养皿中；
(2)、小鼠精原干细胞培养与传代：
将小鼠精原干细胞培养液加入到所述含小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的培养皿中培养小鼠精原干细胞，培养2-3天后滴加中性蛋白酶至培养皿中，消化时间2-3s，轻微震荡培养皿使小鼠精原干细胞集落脱落，然后添加DMEM基础培养基使脱落的集落悬浮得悬液，悬液进行离心、再用小鼠精原干细胞培养液重悬，将重悬后的细胞悬液接种至新的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上进行培养。

2.  根据权利要求1所述的小鼠精原干细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：所述的小鼠的生精小管在消化前经DPBS漂洗过2-3遍；所述的中性蛋白酶在35-39℃下消化期间要不时震荡离心管或用移液枪反复吹吸；所述的离心液去上清后经DMEM洗涤1-2次；所述的筛分是经190-210目的尼龙筛过滤筛分。

3.  根据权利要求1所述的小鼠精原干细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：所述的小鼠精原干细胞在传代前，将悬浮生长的小鼠精原干细胞集落收集，用DMEM基础培养基洗涤培养皿中细胞2-3遍，收集含精原干细胞集落的DMEM悬液至离心管中，离心后去除上清液，收集精原干细胞集落，与中性蛋白酶消化2-3s后收集的小鼠精原干细胞集落合并；所述的悬液进行离心选用DMEM基础培养基作为离心液进行离心。

4.  根据权利要求2所述的小鼠精原干细胞分离培养方法，其特征在于：所述的小鼠精原干细胞培养液为含8-12％FBS的α-MEM或含8-12％FBS的DMEM，8-12％FBS的α-MEM、8-12％FBS的DMEM培养液内含有占体积百分比0.9-1.1％非必需氨基酸、0.9-1.1％L-谷氨酰胺、0.9-1.1％丙酮酸钠、20ng/mlGDNF；所述的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的培养液为含占体积百分比8-12％FBS的DMEM，无其他成分。

说明书一种小鼠精原干细胞分离培养方法
技术领域
本发明涉及细胞分离培养领域，具体是一种小鼠精原干细胞分离培养方法。
背景技术
精原干细胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是生长于生精小管上皮近基底膜区域的雄性生殖干细胞，它主要参与精子发生，通过自我更新维持生殖干细胞库稳定或是自我分化成一定数量的精母细胞并最终发育成精子，保证雄性动物正常的生殖能力。SSCs是雄性动物中唯一能将遗传信息传递给后代的干细胞，具有很强的可塑性，因此它是生殖医学、干细胞工程和发育生物学、动物转基因等方面的重要研究材料，具有极大的科研价值。SSCs的成功分离培养是对其进行深入研究的基础，但由于其在动物睾丸中含量极少，不易分离纯化，给体外培养SSCs造成很大的困难。
目前国内外常用的分离纯化SSCs方法主要有差速贴壁法、两步酶消化法、Percoll密度梯度分选法、免疫磁珠分选法、免疫荧光激活细胞分选或是上述几种方法的结合，然而这些方法各自存在着如操作流程繁琐、酶消化作用时间长、富集后细胞活力不高或成本较高等缺点。
方法一：两步酶消化与差速贴壁结合分离富集SSCs：
(1)、离体睾丸去除白膜后，将睾丸组织转移到离心管中，DPBS洗涤2-3次；
(2)、加10倍体积的消化液I(含0.2％胶原酶IV的DPBS)，吸管轻轻吸打，室温下作用3-5min；
(3)、DPBS洗涤，离心，弃上清，重复2-3次；
(4)、加5倍体积的消化液II(分别含0.2％胶原酶IV、透明质酸酶和200μg/ml DNase的无血清DMEM)，吸管轻轻吸打，室温下消化2-5min；
(5)、加10倍体积的DPBS，离心，弃上清，反复2-3次；
(6)、DPBS重悬细胞，用60μm孔径的筛网过滤细胞悬液，滤出液于1200r/5min离心，弃上清，DPBS重悬，1200r离心洗涤2次；
(7)、最后用培养基重悬细胞，接种到0.2％(w/v)明胶包被的培养瓶或者6孔板，置培养箱中培养。上述接种的细胞中主要有精原干细胞和支持细胞等其他杂细胞，根据支持细胞等杂细胞贴壁快的特性，再采用差速贴壁法除去杂细胞：a.在培养基中培养40min至1h；b.用吸管轻轻吹打，悬起生精细胞和部分杂细胞，转移到新的明胶包被的培养瓶/皿中，继续培养3-4h；c.用同样的方法，再次悬起尚未紧密贴壁的细胞，转移到第三个新的明胶包被的培养瓶/皿中培养过夜至1天，直到杂细胞完全贴壁并开始铺展生长；d.吹打悬起精原干细胞细胞，收集并离心，弃上清，以培养基重悬细胞并接种至饲养层上培养。
采用两步酶消化与差速贴壁结合分离富集SSCs，其分离使用了胶原酶、透明质酸酶以及DNase或胰蛋白酶消化睾丸细胞，富集步骤持续5-6h甚至24h；此方便操作步骤繁琐，分离富集所需时间较长；且多种消化酶对细胞的刺激和长时间悬浮可导致SSCs活力持续下降，使后期培养的SSCs生长状态较差；且分离液中残留红细胞等不易贴壁杂细胞可与SSCs一起被富集培养，这会影响富集效果。
方法二：两步酶消化与Percoll密度梯度离心结合分离富集SSCs：
两步酶消化步骤与方法一操作步骤(1)-(6)相同，但第7步在离心管中按密度由大到小依次叠加Percoll密度梯度液，将待分离的睾丸细胞悬液置于梯度分离液最上层，1400r/20min离心；收集27％-35％梯度之间界面上的细胞(主要为SSCs)至离心管中。加入适量DPBS，混匀离心，弃上清再加入培养液，吹打混匀后接种培养。
将用两步酶消化法分离得到的睾丸细胞经Percoll密度梯度离心富集SSCs，这样虽缩短了富集时间，但Percoll密度梯度离心时间就长达20min，较长时间内使用较大的离心力作用会对细胞的生物结构造成破坏，从而对细胞活力造成一定的影响，同样使分离富集后的SSCs存活率不高；
方法三：采用细胞分选仪器辅助分离富集SSCs：
目前常用的仪器辅助分选方法有：免疫磁珠分选法(magnetic activatedcell sorting，MACS)、免疫荧光激活细胞分选法(fluorescent activated cellsorting，FACS)；
SSCs的相对特异细胞表面分子标志有c-kit，GFRα-1，c-Ret，MHC-1，Thy-1，αv-integrin，α6-integrin等。MACS原理是通过将已包被一抗的磁珠与SSCs相对特异标志分子结合，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠与预先已与SSCs相对特异标志分子结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的SSCs吸附于分离柱或试管上，实现SSCs分离。
FAGS采用荧光标记SSCs相对特异标志分子的单克隆抗体，将细胞悬液经特殊处理后通过流式细胞分选仪，从而将SSCs分选出来。
MACS和FACS虽分离富集SSCs的纯度较高，但昂贵的仪器费用使发明成本过高，这使得力求深入研究SSCs的常规发明室来说望而却步；而且SSCs在通过仪器前都需经过一定处理使之带上仪器能识别的标记，这种化学过程会对细胞状态造成一定的影响，操作不当甚至引起分化或凋亡；仪器分选细胞的效率不高，所需时间较长，可导致细胞活力下降，细胞状态改变，这些并不适用于常规发明室大批量分选富集SSCs用于科研的需求。
发明内容
本发明提供了一种小鼠精原干细胞分离培养方法，大大简化了传统分离富集步骤，避免了分离富集持续时间过长、多种消化酶对细胞刺激、较长时间离心力作用以及各种化学方式预处理导致的细胞活力不高、状态下降等缺陷；同时未使用大型仪器设备，降低了成本。
本发明的技术方案为：
一种小鼠精原干细胞分离培养方法，包括以下步骤：
(1)、小鼠精原干细胞分离：
小鼠的睾丸去除白膜后，收集生精小管，加入中性蛋白酶，在35-39℃下消化20-30分钟，待消化液中出现白色絮状漂浮物时收集消化液进行离心，离心液去上清后洗涤，然后用小鼠精原干细胞培养液进行重悬、筛分，筛分得到的滤液接种至含小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的培养皿中；
(2)、小鼠精原干细胞培养与传代：
将小鼠精原干细胞培养液加入到所述含小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的培养皿中培养小鼠精原干细胞，培养2-3天后滴加中性蛋白酶至培养皿中，消化时间2-3s，轻微震荡培养皿使小鼠精原干细胞集落脱落，然后添加DMEM基础培养基使脱落的集落悬浮得悬液，悬液进行离心、再用小鼠精原干细胞培养液重悬，将重悬后的细胞悬液接种至新的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上进行培养。
所述的小鼠的生精小管在消化前经DPBS漂洗过2-3遍；所述的中性蛋白酶在35-39℃下消化期间要不时震荡离心管或用移液枪反复吹吸；所述的离心液去上清后经DMEM洗涤1-2次；所述的筛分是经190-210目的尼龙筛过滤筛分；
所述的小鼠精原干细胞在传代前，将悬浮生长的小鼠精原干细胞集落收集，用DMEM基础培养基洗涤培养皿中细胞2-3遍，收集含精原干细胞集落的DMEM悬液至离心管中，离心后去除上清液，收集精原干细胞集落，与中性蛋白酶消化2-3s后收集的小鼠精原干细胞集落合并；所述的悬液进行离心选用DMEM基础培养基作为离心液进行离心。现权利要求2、3为原权利要求2的修改
所述的小鼠精原干细胞培养液为含占体积百分比8-12％FBS的α-MEM或占体积百分比8-12％FBS的DMEM，8-12％FBS的α-MEM、8-12％FBS的DMEM培养液内含有占体积百分比0.9-1.1％非必需氨基酸、0.9-1.1％L-谷氨酰胺、0.9-1.1％丙酮酸钠、20ng/mlGDNF；所述的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的培养液为含占体积百分比8-12％FBS的DMEM，无其他成分。
本发明由于精原干细胞部分是悬浮生长，故在传代前需将悬浮生长的集落收集；用DMEM基础培养基洗涤细胞2-3次是为了将半贴壁集落或贴壁不牢的集落收集。
本发明所述的细胞传代是指细胞正常生长情况下，由于增殖到一定程度需进一步扩充空间使新增殖分裂出来的细胞有地方生长，需转移一定量的细胞至新的培养皿中继续培养，这是细胞生长状态良好的表现。
本发明所述的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞来源为小鼠胚胎成纤维细胞；所有干细胞需在饲养层上附着生长，故在分离后的精原干细胞是在饲养层上生长；饲养层制作具体包括以下步骤：将贴壁汇合至90％的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF，mouse embryonal fibroblast cell)继续用10μg/ml丝裂霉素c处理2.5h，DPBS洗涤细胞5遍，用饲养层培养液继续培养并作为饲养层待用；饲养层培养液为含体积百分比为10％FBS的DMEM，无其他成分。
还可在本发明的基础上再结合MACS或FACS辅助分选进一步纯化SSCs。
本发明带来的有益效果：
本发明采用中性蛋白酶II一次性消化分离睾丸细胞，只需37℃水浴短暂消化，因此简化了传统分离步骤、缩短了分离时间，并且减小酶对细胞的刺激、有效保证SSCs活力；本发明将SSCs富集步骤与传代有机结合，使用中性蛋白酶II短时间(2-3s)消化原代贴壁的SSCs集落，并结合轻微震荡培养皿可使SSCs集落脱落，杂细胞和饲养层不被消化下来，从而达到较好的分离富集效果，即简化了富集步骤也避免了传统富集方法时间过长、细胞活力不高的缺陷，降低了发明成本。本发明成功建立一种简便有效的分离培养小鼠精原干细胞(小鼠精原干细胞)新方法，提高了小鼠精原干细胞分离效果，降低了分离富集成本，为今后常规发明室深入研究精原干细胞功能机理以及在生殖医学、家畜动物性别控制和提高动物转基因生产效率的应用打下基础。
附图说明
图1是小鼠精原干细胞体外分离培养24小时后小鼠精原干细胞的集落形态图1。
图2是小鼠精原干细胞体外分离培养24小时后呈葡萄串状或念珠状的小鼠精原干细胞集落形态图2。
图3是小鼠精原干细胞传代3次后的小鼠精原干细胞集落形态图。
图4是小鼠精原干细胞集落形态图传代4次后的小鼠精原干细胞集落形态图。
图5是用α-MEM培养小鼠精原干细胞的倒置相差显微镜图片。
图6是用DMEM培养的小鼠精原干细胞效果图。
图7是小鼠精原干细胞集落经AKP染色后呈阳性图片。
图8是免疫组化处理后小鼠精原干细胞集落的荧光显微镜图。
图9是小鼠精原干细胞膜特异性表达蛋白c-Kit的荧光显微镜图。
图10是小鼠精原干细胞膜特异性表达β1-Integrin蛋白的荧光显微镜图。
图11是小鼠精原干细胞膜特异性表达Gfrα-1蛋白的荧光显微镜图。
图12是小鼠精原干细胞诱导分化4天后的形态图。
图13是小鼠精原干细胞诱导分化8天后的形态图。
具体实施方式
(1)、材料和试剂：
精原干细胞来源：7日龄雄性ICR小鼠。
饲养层细胞来源：小鼠胚胎成纤维细胞：怀孕12.5天ICR母鼠胎儿；生精管来源细胞：7日龄雄性ICR小鼠睾丸组织生精管。
试剂：DPBS、1mg/ml中性蛋白酶、0.01g/L明胶、10ug/ml丝裂霉素C、0.25％胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、20ng/ml GDNF(胶质细胞源性神经营养因子)、
溶液：α-MEM(Gibco)、DMEM(Gibco)、胎牛血清(FBS，Hyclone，)、非必需氨基酸(NEAA，Sigma，)
培养基：
小鼠精原干细胞培养液：含体积百分比为10％FBS的α-MEM或含体积百分比为10％FBS的DMEM；
10％FBS的α-MEM，10％FBS的DMEM中均添加：体积百分比为1％非必需氨基酸、体积百分比为1％L-谷氨酰胺、体积百分比为1％丙酮酸钠、20ng/ml GDNF；
饲养层培养液：含体积百分比为10％FBS的DMEM。
(2)、具体步骤：
小鼠精原干细胞分离：小鼠颈椎脱臼处死，酒精消毒后取睾丸，用DPBS将组织漂洗3遍；在DPBS中去除脂肪垫、微血管及附睾；在体视镜下用眼科镊剥离睾丸白膜，将游离出来的生精小管撕成1-2mm3小块或小段。
采用一步酶消化法：即离散的生精小管小段用DPBS漂洗2遍后移入离心管中，加入中性蛋白酶，37℃消化20-30min，期间不时震荡离心管或用移液枪反复吹吸；待消化液中出现白色絮状漂浮物时收集消化液800r/min离心3min，去上清液后用DMEM洗涤1次，用小鼠精原干细胞培养液重悬；将悬液用200目尼龙筛过滤；收集滤液，将其接种至含小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的培养皿中。
小鼠精原干细胞培养与传代：分别用α-MEM和DMEM为基础培养基的培养液培养小鼠精原干细胞，每2-3天传代1次。收集细胞培养液至离心管中，用DMEM基础培养基洗涤细胞两次，滴加少量中性蛋白酶至培养皿中，消化时间2-3s，期间轻拍培养皿的边缘使小鼠精原干细胞集落脱落；添加DMEM基础培养基使脱落的集落悬浮并回收至离心管中；800r/min离心3min后用小鼠精原干细胞培养液重悬，轻轻吹打离散细胞后，将重悬后的细胞悬液接种至新的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上进行培养。
(3)、分离培养结果
小鼠精原干细胞生长特性及形态特征：
从睾丸经中性酶消化离散的单个细胞接种至饲养层上，24h后可见一些由多个细胞聚集，形成细胞集落生长于饲养层上，集落中的细胞大小均一、饱满呈圆形，边缘光滑有折光性，DAPI染色表明核质比高；细胞集落一般由三个至几十个细胞聚集成团或呈一字形排列，细胞之间连接紧密呈葡萄串状或念珠状(见图1，2)。传代3次后，细胞集落体积进一步增大、细胞数量增多，集落细胞饱满且葡萄串状明显，立体感增强(见图3)。传代4次后细胞增殖较快，细胞集落状态良好(见图4)。
不同培养基对小鼠精原干细胞生长状态的影响：
分别用α-MEM和DMEM为基础培养基的全培养液培养小鼠精原干细胞，观察细胞集落生长状态的变化。结果显示使用α-MEM为基础培养基的全培养液培养小鼠精原干细胞，小鼠精原干细胞生长状态较好，主要表现为单个集落中所含细胞数量较多，细胞集落增殖速度较快，细胞之间连接致密，形成较为紧凑的小鼠精原干细胞集落(见图5)；以DMEM为基础培养基的全培养液培养小鼠精原干细胞，在其他条件相同的情况下小鼠精原干细胞集落数量较少，体积较小，主要表现为细胞集落增殖速度较慢(见图6)。
小鼠精原干细胞的鉴定：
小鼠精原干细胞集落经AKP染色后倒置显微镜下观察呈深紫色，强阳性(见图7)。荧光显微镜观察免疫组化处理后小鼠精原干细胞集落，结果显示小鼠精原干细胞的Oct-4蛋白为核特异性表达，与特异性核荧光染料DAPI的染色结果相一致(见图8)；c-Kit蛋白为膜特异性表达，蛋白均匀分布于细胞膜上，使球形小鼠精原干细胞组成的集落立体感明显(见图9)，β1-Integrin蛋白为膜特异性表达，呈弥散性分布于小鼠精原干细胞胞膜及细胞之间连接区域(见图10)，Gfrα-1蛋白为膜特异性表达，均匀分布于细胞膜上，使球形小鼠精原干细胞集落立体感明显(见图11)。
小鼠精原干细胞诱导分化精子样细胞：
经RA体外培养诱导24h，用含10％FBS的α-MEM继续培养4d后，观察到小鼠精原干细胞集落部分细胞由圆形变为圆锥形，一端出现尾巴样小突起(见图12)；再继续培养4d后圆锥形细胞增多，圆锥状头部膨大，尾巴样小突起进一步伸长变为尖刺状(见图13)。