一种二联手足口病灭活疫苗及其制备方法.pdf

本发明涉及生物技术领域，公开了两种手足口病病毒株以及由该两种病毒株制备的二联手足口病灭活疫苗。将保藏编号为CGMCC No.7753的人肠道71型病毒株CC-09和保藏编号为CGMCC No.7752的柯萨奇A16型病毒株CC-16病毒分别接种于扩大传代培养的Vero细胞中培养；分别收获两种病毒培养液，除杂质后浓缩、灭活、纯化得到两种病毒原液；两种病毒原液除菌，混合，吸附佐剂，制备得到二联手足口病灭活疫苗。本发明所述二联手足口病灭活疫苗免疫原性强，且两种病毒间无交叉抑制作用，可有效预防目前国内流行的手足口病。本发明所述二联手足口病灭活疫苗制备工艺简单，生产成本低，适合疫苗的规模化生产。

权利要求书
1.  一种人肠道71型病毒株CC-09，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7753。

2.  一种柯萨奇A16型病毒株CC-16，保藏在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7752。

3.  一种手足口病疫苗，其特征在于，由保藏编号为CGMCC No.7753的 人肠道71型病毒株CC-09和保藏编号为CGMCC No.7752的柯萨奇A16型病毒 株CC-16制备得到。

4.  如权利要求3所述的手足口病疫苗，其特征在于，所述疫苗为二联灭 活疫苗。

5.  一种二联手足口病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将保藏编号为CGMCC No.7753的人肠道71型病毒株CC-09和保藏 编号为CGMCC No.7752的柯萨奇A16型病毒株CC-16分别接种于扩大传代培 养的Vero细胞或人胚肺二倍体细胞中培养；
步骤2：分别收获两种病毒培养液，除杂质后浓缩、灭活、纯化得到两种 病毒原液；
步骤3：取步骤2制备的两种病毒原液除菌，混合即得所述二联手足口病 灭活疫苗。

6.  如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述培养为33℃～ 36℃培养72～120小时。

7.  如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述灭活为用 甲醛溶液或β-丙内酯溶液灭活。

8.  如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述纯化为阴 离子交换层析、分子筛凝胶过滤层析、复合模式介质层析中的一种或多种。

9.  如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述混合为将除 菌后的两种病毒原液混合后吸附佐剂；或者为将除菌后的两种病毒原液分别 吸附佐剂然后再混合。

10.  如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述佐剂为氢 氧化铝溶液。

说明书一种二联手足口病灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种疫苗及其制备方法。
背景技术
手足口病(Hand foot and mouth disease HFMD)是一种儿童传染病， 又名发疹性水疱性口腔炎。多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口 腔等部位的疱疹，该病以手、足和口腔粘膜疱疹或破溃后形成溃疡为 主要临床症状。少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等 并发症。个别重症患儿如果病情发展快，导还会导致死亡。
手足口病是由肠道病毒引起的传染病，肠道病毒传染性强，传播 途径广泛，流行范围广，传播快，其疾病的流行在一年四季均可出现， 且有周期性流行的特点。人是肠道病毒唯一的自然宿主，主要传染源 为患病者、病毒携带者及隐性感染者。引发手足口病的肠道病毒有20 多种(型)，其中以A组的柯萨奇病毒A组16型(Coxsachievirus，CA16) 和肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)最为常见。1972～1973年、 1986年和1999年澳大利亚均发生过EV71流行，重症病人大多伴有中枢 神经系统症状(CNS)，一些病人还有严重的呼吸系统症状。20世纪70年 代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以CNS为主要临床特征的EV71流 行，仅保加利亚就超过750例发病，149人致瘫，44人死亡。日本是手 足口病发病较多的国家，历史上有过多次大规模流行，1969～1970年 的流行以CA16感染为主，1973和1978年的2次流行均为EV71引起，主 要临床症状为手足口病，病情一般较温和，但同时也观察到伴无菌性 脑膜炎的病例。1997～2000年手足口病在日本再度流行，EV71、CoxA16 均有分离，EV71毒株的基因型也与以往不同。20世纪90年代后期，EV71 开始肆虐东亚地区。1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口 病流行，4～8月共有2628例发病，仅4～6月就有29例病人死亡。死者 平均年龄1.5岁，病程仅2天，100％发热，62％手足皮疹，66％口腔溃 疡，28％病症发展迅速，17％肢软瘫，17例胸片显示肺水肿。
我国自1981年在上海始见手足口病，以后北京、河北、天津、福 建、吉林、山东、安徽、广东等省市均有报道。2008年安徽阜阳、山 东菏泽、河南多地集中暴发流行手足口病，并造成多例患儿死亡。自 2008年5月2日起，手足口病被国家纳入丙类传染病管理。近年来我国 手足口病发病率及死亡率呈逐渐上升趋势，据卫生部统计:2011年全国 共报告发病人数是，1619706例，死亡病例509例，2012年全国共报告 发病数2198442例，死亡数569例。EV71和CoxA16引起的手足口病存在 隐性感染和轻症病例多，传染源难以发现和控制，儿童普遍易感，传 播途径多，难以有效阻断等特征，且目前手足口病大都仅是依靠常用 阿昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦等高效广谱的抗病毒药物来缩短发热 及皮损愈合时间、减轻口腔疱疹疼痛，至今还没有针对预防该病的特 异性治疗药物。因此研制手足口病疫苗对预防手足口病的发生具有重 要意义。
发明内容
本发明的目的是提供两种手足口病病毒株以及由该两种病毒株制 备的二联手足口病灭活疫苗，所述二联手足口病灭活疫苗预防手足口 病，预防免疫效果佳，安全性好。
本发明提供的一种人肠道71型病毒株CC-09，保藏在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7753。
本发明提供的另一种柯萨奇A16型病毒株CC-16，保藏在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7752。
本发明通过颅腔注射所述人肠道71型病毒株CC-09病毒和柯萨奇 A16型病毒株CC-16病毒的方法对1日龄ICR乳鼠进行攻毒，结果显示3 天即可发现小鼠出现精神状态不佳，行动迟缓、嗜睡等临床症状，4天 个别小鼠出现四肢瘫痪的典型手足口临床症状，随后其他小鼠也都表 现出四肢瘫痪的症状，6天时开始出现死亡，第7天小鼠无存活，而对 照组小鼠无临床症状表现。表明本发明所述人肠道71型病毒株CC-09 和柯萨奇A16型病毒株CC-16两株病毒为强毒株。
本发明还提供由上述两种手足口病病毒株制备的手足口病疫苗。
所述的手足口病疫苗，作为优选，为二联灭活疫苗。
本发明还提供一种二联手足口病灭活疫苗的制备方法，包括以下 步骤：
步骤1：将保藏编号为CGMCC No.7753的人肠道71型病毒株CC-09 和保藏编号为CGMCC No.7752的柯萨奇A16型病毒株CC-16分别接种 于扩大传代培养的Vero细胞或人胚肺二倍体细胞中培养；
步骤2：分别收获两种病毒培养液，除杂质后浓缩、灭活、纯化得 到两种病毒原液；
步骤3：取步骤2制备的两种病毒原液除菌，混合即得所述二联手 足口病灭活疫苗。
作为优选，步骤1所述培养为33℃～36℃培养72～120小时。
作为优选，步骤2所述灭活为用甲醛溶液或β-丙内酯溶液灭活。
作为优选，步骤2所述纯化为阴离子交换层析、分子筛凝胶过滤 层析、复合模式介质层析中的一种或多种。
进一步的，步骤2所述纯化为先采用阴离子交换层析再采用分子 筛凝胶过滤层析。
作为优选，步骤3所述除菌为经0.2μm滤膜除菌。
作为优选，步骤3所述混合为将除菌后的两种病毒原液混合后吸附 佐剂；或者为将除菌后的两种病毒原液分别吸附佐剂然后再混合。其 中，所述佐剂优选为氢氧化铝溶液。
本发明通过小鼠体内效力试验证明本发明所述二联手足口病灭 活疫苗针对两种病毒产生了较高的抗体效价，免疫原性强，且两种病 毒间无交叉抑制作用。
本发明所述由人肠道71型病毒株CC-09和柯萨奇A16型病毒株 CC-16混合制成的二联手足口病灭活疫苗，针对两种病毒产生了较高的 抗体效价，免疫原性强，且两种病毒间无交叉抑制作用，并对不同地 区病毒有广泛的中和保护作用。可有效预防目前国内流行的手足口病。 本发明所述二联手足口病灭活疫苗其制备工艺简单，有效地去除了宿 主蛋白和DNA，病毒纯度高，疫苗安全性好，生产成本低，适合疫苗的 规模化生产，具有良好的应用前景。
生物保藏信息：
病毒株CC-09：分类命名：肠道病毒71型，于2013年6月13日保藏 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC No.7753。
病毒株CC-16：分类命名：柯萨奇A16型病毒，于2013年6月13日 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC No.7752。
具体实施方式：
本发明公开了人肠道71型病毒株CC-09和柯萨奇A16型病毒株 CC-16及用所述两种病毒株制备的二联手足口病灭活疫苗及其制备方 法。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来 说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法 已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内 容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组 合，来实现和应用本发明技术。
针对当前国内手足口病的流行趋势，为更好的预防手足口病的爆 发，发明人经过多年的不懈努力，最终筛选出具有广泛交叉保护作用 的人肠道71型病毒株CC-09和柯萨奇A16型病毒株CC-16，建立三级病 毒种子库，经检定合格后作为疫苗生产用种子库。对于上述病毒株， 申请人于2013年6月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，其中人肠道71型病毒株CC-09的保藏编号为CGMCC  No.7753，柯萨奇A16型病毒株CC-16的保藏编号为CGMCC No.7752。
在此基础上，本发明的发明人开发了用于预防手足口病的疫苗。 一种手足口病疫苗，由保藏编号为CGMCC No.7753的人肠道71型病 毒株CC-09和保藏编号为CGMCC No.7752的柯萨奇A16型病毒株 CC-16制备得到。本发明所述手足口病疫苗可以更广泛的用于预防 EV71病毒和CA16病毒引起的手足口病。疫苗是预防接种工作的重要 物质基础。按其性质划分，可分为灭活疫苗、减毒活疫苗、组分疫苗、 重组基因工程疫苗等，作为优选，本发明所述手足口病疫苗为二联灭 活疫苗，更适合于婴幼儿的免疫预防。
为更好的生产出优质量二联灭活疫苗，本发明还提供了所述二联 手足口病灭活疫苗的制备方法。
一种二联手足口病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：将保藏编号为CGMCC No.7753的人肠道71型病毒株CC-09 和保藏编号为CGMCC No.7752的柯萨奇A16型病毒株CC-16分别接种 于扩大传代培养的Vero细胞或人胚肺二倍体细胞中培养；
步骤2：分别收获两种病毒培养液，除杂质后浓缩、灭活、纯化得 到两种病毒原液；
步骤3：取步骤2制备的两种病毒原液除菌，混合即得所述二联手 足口病灭活疫苗。
本发明所述二联手足口病灭活疫苗的制备方法首先将两种病毒株 接种于扩大传代培养的Vero细胞或人胚肺二倍体细胞中培养以获得病 毒培养液。
Vero细胞是非洲绿猴肾细胞是一种异倍体细胞，经猕猴肾细胞培 养衍化后产生，是常用的疫苗生产细胞系，常作为培养病毒的宿主细 胞。
人胚肺二倍体细胞是常用的疫苗生产细胞系。优选的，所述人胚 肺二倍体细胞为MRC-5、2BS等细胞株。
优选的，所述Vero细胞或人胚肺二倍体细胞的扩大传代培养为利 用生物反应器或多层细胞工厂进行扩大传代培养。应用生物反应器或 多层细胞工厂培养细胞，细胞密度高，接种病毒后，病毒产量高，从 而提高疫苗产量。
优选的，所述病毒培养时所用的培养基为199培养基，所述培养 基不含有血清，接种病毒后获得的病毒培养液牛血清白蛋白含量低， 疫苗安全性高。
作为优选，步骤1所述接种按0.001MOI～0.1MOI比例接种病毒。 其中，MOI是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数，普 遍用于病毒感染细胞的研究中。一般认为MOI是一个比值，没有单位， 其实其隐含的单位是pfu number/cell，含义是感染时病毒与细胞数量的 比值。即步骤1所述接种优选为按照病毒与细胞数量为1:10～1:1000的 比例接种。
进一步的，步骤1所述培养为33℃～36℃培养72～120小时。即 两种病毒株的培养条件为33℃～36℃培养72～120小时。
本发明所述二联手足口病灭活疫苗的制备方法培养病毒后收获两 种病毒培养液后，除杂质、浓缩、灭活、纯化得到两种病毒原液。
其中，所述除杂质优选为通过离心或多级过滤器过滤除杂质。
进一步的，所述离心为6000rpm离心30min；所述多级过滤器所 用滤柱孔径大小为0.1μm～0.5μm。
本发明所述病毒培养液浓缩为超滤浓缩，进一步的，所述超滤浓 缩的超滤膜的截留分子量为100KD～300KD。
病毒培养液经浓缩后灭活以使其在保留免疫原性的同时失去繁殖 能力。作为优选，所述灭活为用甲醛溶液或β-丙内酯溶液灭活。
进一步的，所述用甲醛溶液灭活的具体条件为甲醛溶液中的甲醛 与水的浓度比为1∶2000～1∶4000，灭活温度为35℃～37℃，灭活时 间为6天～12天。
进一步的，所述用β-丙内酯溶液灭活具体条件为β-丙内酯溶液中 的β-丙内酯与灭活病毒液的浓度比为1∶2000～1∶4000，灭活温度为 4℃灭活时间2天～5天。
本发明所述制备方法在灭活病毒后对病毒进行纯化，其中所述纯 化优选为阴离子交换层析、分子筛凝胶过滤层析、复合模式介质层析 中的一种或多种，以得到高纯度的EV71和CA16病毒原液。
进一步的，步骤2所述纯化为先采用阴离子交换层析再采用分子 筛凝胶过滤层析。采用阴离子交换对病毒灭活液进行初步纯化，以去 除宿主细胞DNA，再应用分子筛凝胶过滤的纯化方法进行精制纯化， 去除各种杂质蛋白，得到纯度较高的病毒原液。
本发明所述制备方法取纯化制得的两种病毒原液除菌，混合即得 所述二联手足口病灭活疫苗。
优选的，所述除菌为经0.2μm滤膜除菌。
为增强灭活疫苗免疫原性，通常需要加入佐剂。佐剂又称非特异 性免疫增生剂，本身不具抗原性，但同抗原一起或预先注射到机体内 能增强免疫原性或改变免疫反应类型。因此本发明所述二联手足口病 灭活疫苗的制备方法步骤3所述混合为将除菌后的两种病毒原液混合 后吸附佐剂；或者为将除菌后的两种病毒原液分别吸附佐剂然后再混 合。
优选的，所述佐剂为氢氧化铝溶液。氢氧化铝在疫苗中使用不仅 可以提高机体的免疫应答而且具有较好的安全性。
优选的，所述混合的比例为保藏编号为CGMCC No.7753的人肠道 71型病毒株CC-09的病毒原液和保藏编号为CGMCC No.7752的柯萨奇 A16型病毒株CC-16的病毒原液按1:0.5～1:2.5的混合。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。 实施例1：病毒株的筛选及毒株的毒力的测定
1、病毒株筛选：
从手足口患者咽拭子中分离出EV71阳性的病毒共15株，CA16阳性 的病毒共20株，分别进行适应Vero培养，并对其生物学特性逐一进行 分析研究，挑选出现蚀斑大并典型、感染性滴度高、交叉保护范围广 的病毒2～3株作为首轮疫苗候选株。
对首轮疫苗候选株进行蚀斑克隆纯化，挑取多个克隆株进行全序 列测定，选取与原始毒株序列一致的建立原始种子批，进行试验性疫 苗工艺研究，最终确定人肠道71型病毒株CC-09和柯萨奇A16型病毒株 CC-16作为疫苗生产株。
2、病毒株毒力测定
毒力测定方法：分别选取7.0LgCCID50/ml的人肠道71型病毒株 CC-09、6.0LgCCID50/ml的柯萨奇A16型病毒株CC-16病毒，通过颅腔 注射的方法对1日龄ICR乳鼠(购自吉林大学基础医学院动物实验中心) 进行攻毒，同时采用PBS作为对照，整个实验过程按照动物保护和使用 指导方针进行。每组攻毒10只乳鼠，10μL/只。每天观察记录乳鼠临床 症状，共观察21天。
毒力测定结果：颅腔注射人肠道71型病毒株CC-09病毒和柯萨奇 A16型病毒株CC-16病毒3天即可发现小鼠出现精神状态不佳，行动迟 缓、嗜睡等临床症状，4天个别小鼠出现四肢瘫痪的典型手足口临床症 状，随后其他小鼠也都表现出四肢瘫痪的症状，6天时开始出现死亡， 第7天小鼠无存活，而对照组小鼠无上述临床症状出现。据此判断所述 人肠道71型病毒株CC-09和柯萨奇A16型病毒株CC-16两株病毒为强毒 株。
将上述两种病毒株CC-09和CC-16进行生物保藏，其相关信息如下：
病毒株CC-09：分类命名：肠道病毒71型，于2013年6月13日保藏 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC No.7753。
病毒株CC-16：分类命名：柯萨奇A16型病毒，于2013年6月13日 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC No.7752。
实施例2：本发明所述二联手足口灭活疫苗的制备
(1)疫苗制备：取长满单层的转瓶培养的非洲绿猴肾细胞(Vero)， 经0.25％胰蛋白酶(含EDTA)消化，按一定细胞数接种生物反应器，培 养3-5天，取EV71或CA16毒株工作种子批毒种经适当稀释，接种生物 反应器中的Vero细胞，35℃±0.5℃培养72～120小时，收获病毒培养液， 置-20℃冷库冻融，经0.1μm～0.5μm孔径滤器过滤去除细胞碎片，300KD 截留分子量的超滤膜浓缩50倍，在无菌条件下加入终浓度为1∶4000的 甲醛37℃灭活10天，将灭活后的病毒液，用0.02mol/L PB缓冲液(pH 5.0～7.0)平衡后，采用阴离子交换层析纯化，用0.02mol/L PBS缓冲液 (pH 7.0)洗脱，收集病毒峰，为粗纯化的病毒液；再用0.01mol/L PBS缓 冲液(pH 7.0)平衡后，应用分子筛凝胶过滤的方法精制纯化，用 0.01mol/L PBS缓冲液(pH 7.0)洗脱，收集病毒峰，为精制纯化病毒液， 再经0.2μm滤膜除菌过滤。根据病毒抗原性滴度水平做适当稀释，使 EV71、CA16病毒蛋白的终含量在5μg～10μg之间、按体积比1:1的比例 将两种病毒液混合、吸附氢氧化铝佐剂即得。进一步检定合格后，将 半成品分装于无菌的西林瓶中或预充式注射器，制成成品疫苗。
(2)制备的二联手足口病灭活疫苗成分：小于10μg/mL的EV71、CA16 病毒抗原，0.6mg/mL氢氧化铝，0.1mol/L氯化钠，0.1mol/L磷酸氢二钠， 0.1mol/L磷酸二氢钠，葡萄糖。
(3)疫苗检测：无菌试验、支原体、异常毒性试验按2010版药典规定 进行检定；牛血清白蛋白残留量、宿主细胞蛋白残留量和宿主细胞DNA 残留量的检测标准参考其他Vero细胞疫苗产品的国家标准进行检定。 制备的二联手足口灭活疫苗经检定，无菌试验、异常毒性试验等检定 项目均合格，均符合要求；牛血清白蛋白残留量、宿主蛋白残留、宿 主DNA残留、内毒素含量均低于现行其他Vero细胞培养工艺疫苗的检 定标准，氢氧化铝吸附后EV71、CA16病毒无解离。
实施例3：本发明所述二联手足口灭活疫苗的制备
取长满单层的转瓶培养的非洲绿猴肾细胞(Vero)，经0.25％胰蛋白 酶消化，按一定细胞数接种40层的细胞工厂，培养3天，取EV71或CA16 毒株工作种子批毒种经适当稀释，接种细胞工厂中的Vero细胞，35℃ ±0.5℃培养72～96小时，收获病毒培养液，置-20℃冷库冻融，经 0.1μm～0.5μm孔径滤器过滤去除细胞碎片，300KD截留分子量的超滤膜 浓缩50倍，在无菌条件下加入终浓度为1∶4000的β-丙内酯4℃灭活4天， 将灭活后的病毒液，用0.02mol/L PB缓冲液(pH 5.0～7.0)平衡后，采用 阴离子交换层析纯化，用0.02mol/L PBS缓冲液(pH 7.0)洗脱，收集病 毒峰，为粗纯化的病毒液；再用0.01mol/L PBS缓冲液(pH 7.0)平衡后， 应用分子筛凝胶过滤的方法精制纯化，，用0.01mol/L PBS缓冲液(pH 7.0)洗脱，收集病毒峰，为精制纯化病毒液，再经0.2μm滤膜除菌过滤。 根据病毒抗原性滴度水平做适当稀释，使EV71、CA16病毒蛋白的终含 量在5μg～10μg之间，然后分别吸附氢氧化铝佐剂，按体积比1:2的比例 将两种病毒液混合即得。进一步检定合格后，将半成品分装于无菌的 西林瓶中，制成成品疫苗。
(2)疫苗检测：无菌试验、支原体、异常毒性试验按2010版药典规定 进行检定；牛血清白蛋白残留量、宿主细胞蛋白残留量和宿主细胞DNA 残留量的检测标准参考其他Vero细胞疫苗产品的国家标准进行检定。 制备的二联手足口灭活疫苗经检定，无菌试验、异常毒性试验等检定 项目均合格，均符合要求；牛血清白蛋白残留量、宿主蛋白残留、宿 主DNA残留、内毒素含量均低于现行其他Vero细胞培养工艺的检定标 准，氢氧化铝吸附后EV71、CA16病毒无解离。
实施例4：本发明所述二联手足口病灭活疫苗免疫原性测定
将本发明的实施例2、实施例3制备的二联手足口灭活疫苗成品进 行小鼠免疫原性试验，计算相应抗体的中和效价，观察对应病毒的免 疫原性。
取雌性ICR小鼠，体重16-18g，随机分组。试验分为4组，每组 20只，阴性对照组：注射氢氧化铝疫苗稀释剂；试验苗1组和试验苗 2组：分别注射实施例2和实施例3制备的疫苗，用疫苗稀释剂将试 验苗进行系列稀释，每只小鼠腹腔注射0.5mL，免疫3周后，非处死 取血，离心分离血清，-20℃保存备用。2天后相同剂量加强免疫，处 死取血，离心分离血清，-20℃保存备用。采用固定病毒，稀释血清方 法检测病毒中和抗体效价，按照Reed-Muench法计算中和抗体效价。
将试验苗1组和试验苗2组所采集的血清进行中和抗体检测，具 体步骤如下：
1)中和实验方法：病毒感染敏感细胞后，引起细胞形态学变化，出现 致细胞病变效应(CPE)，特异性中和抗体与病毒结合后，可是病毒颗 粒失去感染性，抑制CPE出现。
2)病毒中和抗体测定的操作步骤：
(1)将待测血清56℃灭活30分钟，用无菌PBS按2倍系列稀释，分别 为1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024；
(2)根据病毒滴度，将病毒稀释为100CCID50/50μL；
(3)将上述血清及病毒各50μL加入96孔板，每个血清稀释度至少做8 个复孔；
(4)放入37℃CO2孵箱中孵育2小时；
(5)同时做细胞对照孔，血清对照孔及病毒对照孔；
(6)用消化液消化细胞，准备细胞悬液，细胞悬液的浓度为2×105个 /mL；
(7)孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔和病毒对照孔和细胞对照 孔分别加入0.1mL细胞悬液，放入37℃CO2孵箱中孵育培养；
(8)使用倒置显微镜每天观察CPE，并记录病毒滴定结果，以不产生细 胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。当100CCID50/0.05mL的 病毒对照孔出现完全病变时，判定最终结果(7～10d)；注意：如果病毒 对照结果不在32～320CCID50/0.05mL的范围内，实验无效，就要重复 实验。
(9)结果判定：当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一 孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数即计为该血清标本的中和抗体效 价；当最高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则 两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻 稀释度血清中均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者 平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。检测结果见表1。
表1 疫苗免疫原性测定

由表1结果可见两组试验性灭活疫苗加强免疫后，试验组动物阳 转率均为100％，并针对EV71、CA16病毒均产生了较高的中和抗体， 具有很高的体液免疫原性，能很好的预防手足口病毒流行传播。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出 若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。