修饰的卵磷脂 - 胆固醇酰基转移酶 发明领域 本发明一般涉及医药领域， 更具体地说， 涉及用于治疗冠心病、 动脉粥样硬化、 炎 性病症和血栓形成相关病症的组合物和方法。
发明背景
有超过 5000 万的美国人存在心血管问题， 并且许多其他国家也面临着高且不断 增加的心血管病发病率。其是美国和大多数欧洲国家的第一位死亡和残疾原因。到心脏问 题被检测出来时， 根本的原因——动脉粥样硬化通常是相当晚期了， 已经发展了几十年。
动脉粥样硬化是一种哺乳动物多基因复杂疾病， 具有在动脉壁 ( 主动脉、 冠状动 脉和颈动脉 ) 中脂类和其他血液衍生物的沉积物或斑块的特征。根据过程进展， 这些斑块 可在更大或更小程度上钙化。 它们还与主要由动脉中的胆固醇酯组成的脂肪沉积物的累积 相关。 胆固醇累积在动脉壁泡沫细胞中， 从而使管腔变窄并减少血流量。 伴随而来的是动脉 壁的增厚， 带有平滑肌肥大， 泡沫细胞出现以及纤维组织累积。因此， 高胆固醇血症可引起 非常严重的心血管病理例如梗塞、 外周血管病、 中风、 猝死、 心脏失代偿、 大脑血管意外等。
胆固醇为血液中不同的脂蛋白所携带， 这些脂蛋白包括极低密度脂蛋白 (VLDL)、 低密度脂蛋白 (LDL) 和高密度脂蛋白 (HDL)。VLDL 在肝脏中合成并在血液中被转化为 LDL， 使之有可能供给外周组织以胆固醇。与此相反， HDL 从外周组织中捕获胆固醇分子并 将它们转运到肝脏， 在肝脏中胆固醇分子被转化为胆汁酸并分泌。动脉粥样硬化发展和冠 心病 (CHD) 风险与血清中 HDL 水平逆相关。Gordon 等 (1989)N.Engl.J.Med.321 ： 1311 ； Goldbourt 等 (1997)Thromb Vasc.Biol.17 ： 107。低 HDL 胆固醇通常出现在向心性肥胖、 糖 尿病和其他代谢综合征特征的背景下。Goldbourt 等， 出处同上。已提出低 HDL 胆固醇水平 与增加的 CHD 风险相关， 而高浓度的 HDL 则对早发动脉粥样硬化发展具有保护效应。 Gordon 等 (1986)Circulation 74 ： 1217。有研究表明在男性中随着血浆中 HDL 浓度每增加 1mg/dL 发展为临床动脉粥样硬化的风险就下降 2-3％。 Gordon 等 (1989)N.Engl.J.Med.321 ： 1311。 已确认可通过用他汀类药物， 即胆固醇生物合成酶 3- 羟基 -3- 甲基戊二酰辅酶 A 还原酶的 抑制剂治疗可以降低 LDL 胆固醇的浓度， 因此在主要指征为高 LDL 水平的情况下， 该治疗已 被用作一种成功的方法用于降低动脉粥样硬化风险。然而， 尚不清楚他汀类药物对主要脂 类异常是低 HDL 胆固醇的患者是否有益。
卵磷脂 - 胆固醇酰基转移酶 (LCAT) 是一种通过将酰基从磷脂酰胆碱转移到胆固 醇的 3- 羟基上， 形成胆固醇酯和溶血磷脂酰胆碱， 从而催化游离胆固醇酯化的酶。McLean 等 (1986)Proc.Natl.Acad Sci.83 ： 2335 和 McLean 等 (1986)Nucleic Acids Res.14(23) ： 9397。 LCAT 在肝脏中合成并分泌入血浆中， 在血浆中其与 HDL 相结合， 称为抗动脉粥样硬化 脂蛋白。这些 HDL 颗粒具有容纳过量胆固醇的能力， 所述胆固醇随后为 HDL 颗粒中 LCAT 所 酯化。HDL 颗粒中的胆固醇酯分子或直接通过 SR-BI 受体被转运到肝脏中， 或者通过 CETP 介导被转移到包括极低密度脂蛋白 (VLDL) 和 LDL 的含 apoB 脂蛋白， 然后通过 LDL- 受体途 径转运到肝脏中。 此称为反向胆固醇转运的机制 (Glomset(1968)J.LipidRes.9 ： 155) 容许 从体内去除过量的胆固醇， 因而涉及阻止动脉粥样硬化形成。LCAT 通过在质膜和循环的脂
蛋白之间产生游离胆固醇梯度在该过程中起关键作用。
本发明提供了具有增加的酶活性和 / 或稳定性的修饰的 LCAT 蛋白以及使用这些 修饰的 LCAT 蛋白治疗冠心病、 动脉粥样硬化、 炎性病症和血栓形成相关病症的方法。
发明概述
在此提供的是在野生型 LCAT 蛋白氨基酸序列中包含氨基酸取代的修饰的 LCAT 蛋 白。在一个方面中， 修饰的 LCAT 蛋白较该修饰的 LCAT 蛋白所来源于的野生型 LCAT 蛋白 酶活性更强。在另一个方面中， 修饰的 LCAT 蛋白较该修饰的 LCAT 蛋白所来源于的野生型 LCAT 蛋白增加高密度脂蛋白 (HDL) 水平至更大的程度。 在另一个方面中， 修饰的 LCAT 蛋白 在体内更稳定， 或较其所来源于的野生型蛋白免疫原性更低。
在一个实施方案中， 修饰的 LCAT 蛋白包含在 SEQ ID NO ： 1 中第 31 位处或在直向 同源野生型 LCAT 蛋白氨基酸序列中相应于 SEQ IDNO ： 1 中第 31 位的位置处的氨基酸残基 取代。在多个方面中， 修饰的 LCAT 蛋白来源于野生型人、 兔、 猴、 仓鼠、 小鼠或大鼠 LCAT 蛋 白。
在另一个实施方案中， 修饰的 LCAT 蛋白来源于 SEQ ID NO ： 1 所示的野生型 LCAT 氨基酸序列， 并包括在位置 F1、 L3、 L4、 N5、 L7、 C31、 N384 或 E416 处的取代。在多个方面中， 该取代是 F1A、 F1G、 F1I、 F1L、 F1M、 F1P、 F1V、 F1C、 F1Y、 F1T、 F1Q、 F1N、 F1H 或 F1D。在其他方 面中， 该取代是 L3I、 L3F、 L3C、 L3W 或 L3Y。还在其他方面中， 该取代是 L4A、 L4I、 L4M、 L4F、 L4V、 L4W、 L4Y、 L4T、 L4Q 或 L4R。还在其他方面中， 该取代是 N5A、 N5M、 N5H、 N5K、 N5D 或 N5E。 仍在其他方面中， 该取代是 L7M、 L7F 或 L7E。在其他方面中， 该取代是 C31A、 C31I、 C31M、 C31F、 C31V、 C31W、 C31Y、 C31T、 C31R 或 C31H。还在其他方面中， 该取代是 N384C、 N384Q 或 E416C。
在其他的实施方案中， 修饰的 LCAT 蛋白包含在 SEQ ID NO ： 1 中第 C31 位的取代以 及在氨基酸残基第 F1、 L4、 N5、 V28、 P29、 G30、 L32、 G33 或 N34 位的取代。在多个方面中， 该 取代是 F1A、 L4F、 N5E、 N5Q、 N5D、 N5A、 V28A、 V28I、 V28C、 V28T、 V28R、 P29G、 P29F、 P29T、 G30A、 G301、 L32A、 L32I、 L32M、 L32F、 L32C、 L32W、 L32Y、 L32T、 L32S、 L32N、 L32H、 L32E、 G33I、 G33M、 G33F、 G33S、 G33H、 N34A、 N34C、 N34S 或 N34R。在其他方面中， 在第 C31 位的取代是 C31A、 C31I、 C31M、 C31F、 C31V、 C31W、 C31Y、 C31T、 C31R 或 C31H。在一个方面中， 修饰的 LCAT 蛋白 包含 C31Y 取代和额外的取代 F1、 L4、 L32 或 N34， 以及在某些方面中， 这些取代是 F1S、 F1W、 L4M、 L4K、 N34S、 L32F 或 L32H。
还在其他的实施方案中， 在此描述的修饰的 LCAT 蛋白进一步包括运载体， 以及在 多个方面中， 运载体是免疫球蛋白恒定 (Fc) 区或水溶性聚合物， 或更具体地说， 水溶性聚 合物是聚乙二醇。
在其他的实施方案中， 在此所提供的修饰的 LCAT 包括是重复的且共价连接至修 饰的 LCAT 蛋白的末端的野生型 LCAT 蛋白氨基端氨基酸序列的一个区域。在一个方面中， 野生型 LCAT 蛋白氨基端氨基酸序列的该区域长度为 10-15 个氨基酸。在其他方面中， 该野 生型 LCAT 蛋白氨基酸序列的该区域是重复的且共价连接至修饰的 LCAT 蛋白的氨基端、 修 饰的 LCAT 蛋白的羧基端或两者。
还提供了包含在此提供的修饰的 LCAT 蛋白和药学可接受的载体的药物组合物。
还提供了治疗 LCAT 相关病症的方法， 包括以有效治疗所述病症的量施用在此提供的修饰的 LCAT 蛋白的步骤。在不同的实施方案中， 修饰的 LCAT 是静脉内施用或通过快 速浓注施用。在治疗方法的多个方面中， LCAT 相关病症是动脉粥样硬化、 炎症、 血栓形成、 冠心病、 高血压、 LCAT 缺陷综合征、 阿尔茨海默病、 角膜浑浊、 代谢综合征、 血脂异常、 心肌梗 塞、 中风、 临界性肢体缺血 (critical limb ischemia) 和 / 或心绞痛。
还提供了用于增加受试者中 HDL 胆固醇的方法， 包括向受试者施用治疗有效量的 在此提供的修饰的 LCAT 蛋白的步骤。
本发明进一步提供了用于预防受试者中胆固醇累积的方法， 包括施用治疗有效量 的在此提供的修饰的 LCAT 蛋白。
附图描述
图 1 提供了能用于产生修饰的 LCAT 蛋白的野生型 LCAT 蛋白的 Genbank 登记号。
发明详述
I. 定义
当在本文中使用时， 术语 “LCAT” 或 “卵磷脂 - 胆固醇酰基转移酶” 指一种催化由 磷脂酰胆碱和存在于脂蛋白中未酯化的胆固醇合成胆固醇酯和溶血卵磷脂的野生型糖蛋 白酶。该酶主要由肝脏产生并在血液中循环， 与脂蛋白可逆结合。人 LCAT(SEQ ID NO ： 1； GenBank 登记号 AAB34898) 具有 49kDa 的多肽质量， 或带有附加的碳水化合物质量后大约 67kDa 的多肽质量。用于获得在本发明中有用的修饰的 LCAT 蛋白的多种 LCAT 氨基酸序列 示于图 1 中。 人 LCAT(SEQ ID NO ： 1； GenBank 登记号 AAB34898)
FWLLNVLFPP HTTPKAELSN HTRPVILVPG CLGNQLEAKL DKPDVVNWMC
YRKTEDFFTI WLDLNMFLCL GVDCWIDNTR VVYNRSSGLV SNAPGVQIRV
PGFGKTYSVE YLDSSKLAGY LHTLVQNLVN NGYVRDETVR AAPYDWRLEP
GQQEEYYRKL AGLVEEMHAA YGKPVFLIGH SLGCLHLLYF LLRQPQAWKD
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RSTELCGLWQ GRQPQPVHLL PLHGIQHLNM VFSNLTLEHI NAILLGAYRQ
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术语 “修饰的 LCAT” 指如上定义的卵磷脂 - 胆固醇酰基转移酶， 其中野生型 LCAT 蛋白中的一个或更多个氨基酸被另外的氨基酸取代， 或者一个或更多个氨基酸被添加到该 修饰的 LCAT 蛋白所来源于的野生型 LCAT 的任一末端或中间。考虑的修饰的 LCAT 蛋白与 该修饰的 LCAT 蛋白所来源于的野生型 LCAT 蛋白相比具有改善的药代动力学特性。更具体 地说， 修饰的 LCAT 蛋白具有 (i) 如在相同的体外测定条件中所测定的， 与该修饰的 LCAT 蛋 白所来源于的野生型 LCAT 蛋白相比增加的酶活性， (ii) 与该修饰的 LCAT 蛋白所来源于的 野生型 LCAT 蛋白相比增加的在体内增加 HDL 水平的能力， (iii) 与该修饰的 LCAT 蛋白所 来源于的野生型 LCAT 蛋白的血浆稳定性相比， 增加的血浆稳定性或半衰期， 即增加的循环 半衰期， 和 / 或 (iv) 与该修饰的 LCAT 蛋白所来源于的野生型 LCAT 蛋白相比减少的免疫原 性 ( 即引起更少的免疫应答 )。用于测定 LCAT 酶活性的测定法包括例如使用 apoAI- 脂质 体测定法以及使用血浆 LCAT 活性测定法， 它们分别在人工系统和生理学相关系统中测定
胆固醇酯化速度。 用于测定体内 LCAT 稳定性的测定法包括 ELISA， 其测定 LCAT 蛋白施用后 血液中重组 LCAT 蛋白的半衰期。考虑修饰的 LCAT 蛋白的生物活性片段达到这样的程度， 即该片段包括在野生型 LCAT 氨基酸序列中导入的氨基酸改变。
术语 “衍生化” 、 “衍生物” 或 “衍生的” 包括过程以及所得到的修饰的 LCAT 蛋白， 其中例如以及不受限制， (1) 化合物具有环部分 ； 例如在化合物中的半胱氨酰残基之间的 交联 ； (2) 化合物是交联的或具有交联位点 ； 例如， 化合物具有半胱氨酰残基并因此在培养 物中或在体内形成交联的二聚体 ； (3) 一个或多个肽基键为非肽基键所取代 ； (4)N- 末端 为如下所取代 ： -NRR1、 NRC(O)R1、 -NRC(O)OR1、 -NRS(O)2R1、 -NHC(O)NHR、 琥珀酰亚胺基、 或取 代的或未取代的苄氧基羰基 -NH-， 其中 R 和 R1 以及环取代基如下文中所定义 ； (5)C- 末端 为 -C(O)R2 或 -NR3R4 所取代， 其中 R2、 R3 和 R4 如下文中所定义 ； 和 (6) 其中单个氨基酸部分 通过用能与所选择的侧链或末端残基反应的试剂处理而被修饰的化合物。 除了衍生化包括 在修饰的 LCAT 蛋白氨基酸序列的羧基端、 修饰的 LCAT 蛋白氨基酸序列的氨基端、 或修饰的 LCAT 蛋白氨基酸序列的羧基端和氨基端添加一个或更多个氨基酸残基， 对修饰的 LCAT 蛋 白进行衍生化不会进一步改变修饰的 LCAT 蛋白氨基酸序列。此外， 可通过对氨基酸残基进 行侧链修饰而对修饰的 LCAT 蛋白进行衍生化， 前提是野生型人 LCAT 序列中第 31 位处半胱 氨酸以及如通过包括必需空位的氨基酸序列比对所鉴定的人同系物和直向同源蛋白中相 应的半胱氨酸残基处的侧链修饰被排除出本发明的范围。此外， 应当理解在本文中无论何 时提及 “修饰的 LCAT 蛋白” ， 对于所描述的本发明的方面还考虑到修饰的 LCAT 蛋白衍生物。 术语 “药理学活性的” 意指如此描述的物质被确定为具有影响医学参数 ( 例如血 压、 血细胞计数、 胆固醇水平 ) 或疾病状况 ( 例如动脉粥样硬化、 炎性病症和血栓形成病症 ) 的活性。
术语 “生理学可接受的盐” 包含任何已知或随后发现为药学可接受的盐。 某些具体 的实例是 ： 乙酸盐 ； 三氟乙酸盐 ； 氢卤化物， 例如盐酸化物和氢溴化物 ； 硫酸盐 ； 柠檬酸盐 ； 酒石酸盐 ； 羟乙酸盐 ； 和草酸盐。
当提到本发明的制剂时， 在本文中使用的 “基本上同质的” 意指该制剂包括在制剂 中全部治疗分子的制备中可检测的单种类的治疗化合物， 除非另外说明全部治疗分子的特 定百分数。 一般而言， 基本上同质的制剂同质至足以展示该同质制剂的优点， 例如在临床应 用中批间药代动力学容易预测。
“生物效力 (bioefficacy)” 指产生期望生物效应的能力。不同化合物、 或相同化 合物的不同剂量、 或相同化合物的不同施用的生物效力通常被归一化为化合物的量以容许 进行适当的比较。
“动脉粥样硬化” 指以由动脉壁内粥样斑块累积所引起的动脉硬化和 / 或缩窄为特 征的状况。该粥样斑块分成三种成分， (1) 粥样斑， 即一种处于大斑块中心的软薄片状物质 的结节性累积， 包含最接近动脉腔的巨噬细胞 ； (2) 在下面的胆固醇晶体区 ； (3) 在更晚期 病变的外部基质处的钙化。 动脉粥样硬化的指征包括例如动脉中斑块的发展， 它们的钙化， 苏丹 IV 染色所能确定的程度或动脉中泡沫细胞的发展。可通过冠状动脉血管成形术、 超高 速 CT 或超声测定动脉的缩窄。
“炎症” 或 “炎性病症” 指由组织损伤或破坏引起的局限性、 保护性反应， 其可用于 破坏、 稀释或分隔 ( 隔绝 ) 有害因子和损伤的组织。当在本文中使用时， 术语 “炎性疾病”
或 “炎性状况” 意指任何其中过量或不受调节的炎症反应导致过度炎性症状、 宿主组织损伤 或组织功能损失的疾病。此外， 当在本文中使用时， 术语 “自身免疫病” 意指任何下组病症 ： 其中组织损伤与对身体自身成分的体液或细胞介导的应答相关。当在本文中使用时， 术语 “变应性疾病” 意指任何由变态反应引起的症状、 组织损害或组织功能丧失。当在本文中使 用时， 术语 “关节炎疾病” 意指任何一种特征在于可归因于多种病因学的关节炎性病变的一 大类疾病。当在本文中使用时， 术语 “皮炎” 意指任何一种特征在于可归因于多种病因学的 皮肤炎症的一大类皮肤疾病。当在本文中使用时， 术语 “移植排斥” 意指任何直接针对移植 组织 ( 包括器官和细胞 ( 例如骨髓 )) 的免疫反应， 特征在于移植和周围组织的功能丧失、 疼痛、 肿胀、 白细胞增多以及血小板减少。
“血栓形成” 和 “血栓形成相关病症” 指导致血管堵塞以及与这样的堵塞相关的状 况的异常血栓形成。血管在作为血流剪切速度的函数的相当大的切应力下工作。经常地， 对小血管和毛细血管有损害。当这些血管受损时， 触发止血以停止流血。在通常的情况下， 这样的损伤通过通常称为 “血栓形成” 的系列事件得以应对。血栓形成取决于血小板粘附、 活化和聚集以及在可溶性纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白凝块中得以结束的凝血级联。 在创伤部位处血栓形成阻止了血液成分的外渗。随后， 发生伤口愈合和血块溶解并恢复血 管完整性和流动。 术语 “HDL” 指高密度脂蛋白。
当在本文中使用时， 术语 “LDL” 指低密度脂蛋白。
术语 “VLDL” 指极低密度脂蛋白。
术语 “治疗” 或 “处理” 包括向需要的受试者施用药理学活性量的本发明的修饰的 LCAT 蛋白， 其抑制、 减缓或逆转例如病理性动脉粥样硬化、 炎性病症或血栓形成相关病症的 发展。 在另一个方面中， 当在本文中使用时， 治疗意指向有需要的受试者施用在动脉粥样硬 化方面会增加 HDL 胆固醇水平的量的本发明的化合物。在抑制动脉粥样硬化方面， “抑制” 意指预防、 减缓、 稳定或逆转动脉粥样斑块的形成或生长、 炎性病症或血栓形成相关病症。 在此， 疾病和病症的治疗也意在包括将本发明的修饰的 LCAT 蛋白 ( 或其药用盐、 衍生物或 前药 ) 或包含该修饰的 LCAT 蛋白的药物组合物治疗性施用于认为需要对疾病或病症， 例如 炎性病症、 血栓形成病症、 冠心病、 高血压、 LCAT 缺陷综合征、 阿尔茨海默病、 角膜浑浊、 代谢 综合征、 血脂异常、 心肌梗塞、 中风、 临界性肢体缺血、 心绞痛等进行治疗的受试者。处理还 包括向未被诊断为具有该需要的受试者施用修饰的 LCAT 蛋白或药物组合物， 即对受试者 的预防性施用， 用于预防状况或病症。一般而言， 受试者最初通过执业医师和 / 或经授权的 医学从业者进行诊断， 并建议、 推荐或处方用于经由施用本发明的修饰的 LCAT 蛋白或组合 物的预防性和 / 或治疗性 ( 急性或慢性 ) 处理的方案。
短语 “治疗有效量” 是会达到改善病症严重程度以及发病频率目的的本发明的化 合物的量。病症严重程度的改善包括例如在动脉粥样硬化方面， 阻止血管壁中胆固醇的累 积， 增加 HDL 胆固醇的血液水平， 逆转动脉粥样硬化， 以及缓解动脉粥样硬化的进展， 预防 或治疗炎性病症， 以及预防或治疗血栓形成相关病症。
当在本文中使用时， 术语 “受试者” 意指显示动脉粥样硬化、 炎性病症或血栓形成 相关病症或有发展上述疾病的风险的人或其他哺乳动物。这样的个体可具有例如以下状 况： 如炎症、 血栓形成、 冠心病、 高血压、 LCAT 缺陷综合征、 阿尔茨海默病、 角膜浑浊、 代谢综
合征、 血脂异常、 心肌梗塞、 中风、 临界性肢体缺血、 心绞痛等或有发展上述病症的风险。这 些病症的预后和临床指征都是本领域已知的。
II. 修饰的 LCAT 蛋白
A. 测定法
用于测定 LCAT 酶活性、 血浆稳定性 ( 血浆中的酶半衰期 ) 或血浆 LCAT 蛋白水平 的测定法是本领域已知的。可按 Albers J. 等 (1986)Methods in Enzymol.129 ： 763-783 ； Dobiasova M. 等 (1983)Adv.LipidRes.20 ： 107-194 中所描述的测定血清中的绝对 LCAT 活 性和内源性胆固醇酯化速度。在一个方面中， 可通过在 LCAT 和含 Apo A-I 的放射性标记的 LCAT 底物温育后测量放射性标记的胆固醇到胆固醇酯的转化， 从而测定 LCAT 活性。 可测量 胆固醇酯化速度 (CER， nmol CE/mL/ 小时 )， 所述测量是通过测定在经痕量放射性胆固醇进 行了放射性标记的血浆温育后， 标记的胆固醇到胆固醇酯的转化速度而进行的， 所述放射 14 性标记是通过在 4℃下用 [ C] 胆固醇 - 白蛋白混合物平衡而进行的。内源性胆固醇酯化 速度 ( 如使用血浆 LCAT 活性测定法测定的 ) 不但反映了 LCAT 的质量， 还反映了血清中存 在的 LCAT 底物和辅因子的特性和量， 并因此提供了更好的治疗性 LCAT 活性的量度。
用于测量血液中 LCAT 稳定性 ( 半衰期 ) 和血浆 LCAT 蛋白浓度的测定法也是本领 域已知的。在施用后， 可通过使用 JR Crowther ： ELISAtheory and practice， methods in molecular Biology 第 42 卷 ) 描述的 ELISA 测定血浆中的重组 LCAT 蛋白水平。用于测定 LCAT 稳定性和蛋白浓度的试剂包括抗 -LCAT 抗体， 其市售自几家销售商。如下给出使用该 测定法来测定修饰的 LCAT 的活性和 / 或稳定性的实例。
B. 氨基酸修饰
提供了在野生型 LCAT 蛋白氨基酸序列中包含氨基酸取代的修饰的 LCAT 蛋白。由 于野生型 LCAT 蛋白中的氨基酸序列通过一个或更多个氨基酸的取代被修饰， 因此在一个 方面中， 该修饰的 LCAT 蛋白是非天然存在的蛋白。 修饰的 LCAT 蛋白来源于任何野生型 LCAT 蛋白， 图 1 中列出了示范性的野生型 LCAT 蛋白。
对于本发明包括治疗起因于 LCAT 相关病症的人状况的方面， 本发明提供了修饰 的 LCAT 蛋白， 其中人 LCAT 蛋白被修饰以包括一个或更多个氨基酸取代， 或一个或更多个 氨基酸添加， 以及在一个方面中， 野生型人 LCAT 氨基酸序列示于 SEQ ID NO ： 1 中。在 SEQ ID NO ： 1 所示的人 LCAT 蛋白序列中特定氨基酸的讨论中， 本领域技术人员应当理解， 考虑 并包括在其他人 LCAT 氨基酸序列 ( 即等位变体或其他天然存在的 LCAT 序列 ) 或直向同源 LCAT 氨基酸序列中相同或相应的氨基酸残基处的相同或相似的修饰。关于 SEQ ID NO ： 1， 考虑了在如下位置处的氨基酸取代 ( 使用单字母氨基酸名称， 继之以蛋白序列中的位置， 即 “F1” 指在 SEQ ID NO ： 1 中第 1 位的苯丙氨酸 ) ： F1、 W2、 L3、 L4、 N5、 V6、 L7、 F8、 P9、 P10、 H11、 T12、 T13、 P14、 K15、 A16、 E17、 L18、 S19、 N20、 H21、 T22、 R23、 P24、 V25、 I26、 L27、 V28、 P29、 G30、 C31、 L32、 G33、 N34、 Q35、 L36、 E37、 A38、 K39、 L40、 D41、 K42、 P43、 D44、 V45、 V46、 N47、 W48、 M49、 C50、 Y51、 R52、 K53、 T54、 E55、 D56、 F57、 F58、 T59、 I60、 W61、 L62、 D63、 L64、 N65、 M66、 F67、 L68、 C69、 L70、 G71、 V72、 D73、 C74、 W75、 I76、 D77、 N78、 T79、 R80、 V81、 V82、 Y83、 N84、 R85、 S86、 S87、 G88、 L89、 V90、 S91、 N92、 A93、 P94、 G95、 V96、 Q97、 I98、 R99、 V100、 P101、 G102、 F103、 G104、 K105、 T106、 Y107、 S108、 V109、 E110、 Y111、 L112、 D113、 S114、 S115、 K116、 L117、 A118、 G119、 Y120、 L121、 H122、 T123、 L124、 V125、 Q126、 N127、 L128、 V129、 N130、N131、 G132、 Y133、 V134、 R135、 D136、 E137、 T138、 V139、 R140、 A141、 A142、 P143、 Y144、 D145、 W146、 R147、 L148、 E149、 P150、 G151、 Q152、 Q153、 E154、 E155、 Y156、 Y157、 R158、 K159、 L160、 A161、 G162、 L163、 V164、 E165、 E166、 M167、 H168、 A169、 A170、 Y171、 G172、 K173、 P174、 V175、 F176、 L177、 I178、 G179、 H180、 S181、 L182、 G183、 C184、 L185、 H186、 L187、 L188、 Y189、 F190、 L191、 L192、 R193、 Q194、 P195、 Q196、 A197、 W198、 K199、 D200、 R201、 F202、 I203、 D204、 G205、 F206、 I207、 S208、 L209、 G210、 A211、 P212、 W213、 G214、 G215、 S216、 I217、 K218、 P219、 M220、 L221、 V222、 L223、 A224、 S225、 G226、 D227、 N228、 Q229、 G230、 I231、 P232、 I233、 M234、 S235、 S236、 I237、 K238、 L239、 K240、 E241、 E242、 Q243、 R244、 I245、 T246、 T247、 T248、 S249、 P250、 W251、 M252、 F253、 P254、 S255、 R256、 M257、 A258、 W259、 P260、 E261、 D262、 H263、 V264、 F265、 I266、 S267、 T268、 P269、 S270、 F271、 N272、 Y273、 T274、 G275、 R276、 D277、 F278、 Q279、 R280、 F281、 F282、 A283、 D284、 L285、 H286、 F287、 E288、 E289、 G290、 W291、 Y292、 M293、 W294、 L295、 Q296、 S297、 R298、 D299、 L300、 L301、 A302、 G303、 L304、 P305、 A306、 P307、 G308、 V309、 E310、 V311、 Y312、 C313、 L314、 Y315、 G316、 V317、 G318、 L319、 P320、 T321、 P322、 R323、 T324、 Y325、 I326、 Y327、 D328、 H329、 G330、 F331、 P332、 Y333、 T334、 D335、 P336、 V337、 G338、 V339、 L340、 Y341、 E342、 D343、 G344、 D345、 D346、 T347、 V348、 A349、 T350、 R351、 S352、 T353、 E354、 L355、 C356、 G357、 L358、 W359、 Q360、 G361、 R362、 Q363、 P364、 Q365、 P366、 V367、 H368、 L369、 L370、 P371、 L372、 H373、 G374、 I375、 Q376、 H377、 L378、 N379、 M380、 V381、 F382、 S383、 N384、 L385、 T386、 L387、 E388.H389、 I390、 N391、 A392、 I393、 L394、 L395、 G396、 A397、 Y398、 R399、 Q400、 G401、 P402、 P403、 A404、 S405、 P406、 T407、 A408、 S409、 P410、 E411、 P412、 P413、 P414、 P415 和 / 或 E416。 在这些位置中的一个或更多个位置处的氨基酸为任何天然存在的或非天然存 在的氨基酸所取代。例如以及不受限制， 修饰的 LCAT 包含 C31Y 取代和在氨基酸残基 F1、 L4、 L32 和 N34 中一个或更多个残基处的取代。在一个方面中， 该第二取代是 F1S、 F1W、 L4M、 L4K、 N34S、 L32F 和 / 或 L32H。
在多个方面中， 提供了具体的取代。例如以及不受限制， 脂肪族氨基酸残基 (G、 A、 V、 L 或 I) 为另外的脂肪族氨基酸残基所取代， 芳香族氨基酸残基 (F、 Y 或 W) 为另外的芳香 族残基所取代， 脂肪族羟基侧链残基 (S 或 T) 为另外的脂肪族羟基侧链残基所取代， 碱性残 基 (K、 R 或 H) 为另外的碱性氨基酸残基所取代， 酸性残基 (D 或 E) 为另外的酸性氨基酸残 基所取代， 酰胺侧链残基 (N 或 Q) 为另外的酰胺侧链残基所取代， 疏水残基 ( 正亮氨酸、 M、 A、 V、 L 或 I) 为另外的疏水残基所取代， 中性氨基酸残基 (C、 S、 T、 N 或 Q) 为另外的中性残 基所取代， 影响链取向的残基 (G 或 P) 为另外的影响链取向的残基所取代， 和 / 或含硫侧链 残基 (C 或 M) 为另外的含硫侧链残基所取代。
在其他方面中， 同样不受限制， 保守取代被导入野生型 LCAT 氨基酸序列中。
表1
原始残基 示范性的保守取代
A G， S
R K
N Q， H
D E
C SQ N E D G A， P H N， Q I L， V L I， V K R， Q， E M L， Y， I F M， L， Y S T T S W Y Tyr W， F Val I， L 同样不受限制， 预期的其他修饰包括那些在下表 2 中所列的修饰。 表2 原始残基 A R N D C Q E G H I L 示范性的取代 V， L， I K， Q， N Q E S， A N D P， A N， Q， K， R L， V， M， A， F， 正亮氨酸 正亮氨酸， I， V， M， A， F11101855344 A CN 101855346说原始残基 K M F P S T W Y V明书9/39 页示范性的取代 R， 1， 4 二氨基 - 丁酸， Q， N L， F， I L， V， I， A， Y A T， A， C S Y， F W， F， T， S I， M， L， F， A， 正亮氨酸C. 衍生物
除上述修饰的 LCAT 蛋白之外， 考虑修饰的 LCAT 蛋白的其他 “衍生物” 可替代上述 修饰的 LCAT 蛋白。这样的衍生物可改善化合物的溶解度、 吸收、 生物半衰期等。该部分能 替代地消除或削弱化合物的任何不期望的副作用等。
这样的修饰的 LCAT 蛋白的衍生物包括其中如下的那些衍生物 ：
1. 修饰的 LCAT 蛋白或其某些部分是环状的。 例如， 肽部分可被修饰以包含两个或 更多个半胱氨酸残基 ( 例如在接头中 )， 其通过二硫键形成可环化。
2. 修饰的 LCAT 蛋白交联或使之能在分子间交联。 例如， 肽部分可被修饰以包含一 个半胱氨酸残基并因此能与类似的分子形成分子间二硫键。蛋白还可通过其 C- 末端被交 联。
3. 一个或更多个肽基 [-C(O)NR-] 连接 ( 键 ) 为非肽基连接取代。示范性的非肽 基连接是 -CH2- 氨基甲酸酯 [-CH2-OC(O)NR-]、 膦酸酯、 -CH2- 磺酰胺 [-CH2-S(O)2NR-]、 脲 [-NHC(O)NH-]、 -CH2- 仲胺和烷基化肽 [-C(O)NR6- 其中 R6 是低级烷基 ]。
4.N- 末端被衍生化。 通常， N- 末端可被酰化或被修饰成取代的胺。 示范性的 N- 末 1 1 1 1 端衍生物基团包括 -NRR ( 除 -NH2 以外 )、 -NRC(O)R 、 -NRC(O)OR 、 -NRS(O)2R 、 -NHC(O)NHR1、 琥珀酰亚胺或苄氧基羰基 -NH-(CBZ-NH-)， 其中 R 和 R1 各自独立地是氢或低级烷基， 前提是 1 R 和 R 不都是氢以及其中苯环可用选自如下的 1-3 个取代基取代 ： C1-C4 烷基、 C1-C4 烷氧基、 氯和溴 ； 修饰成琥珀酰亚胺基 ； 修饰成苄氧基羰基 -NH-(CBZ-NH-) 基 ； 以及其中游离 C 末端 3 4 3 被衍生化为 -C(O)R2 的肽， 其中 R2 选自低级烷氧基和 -NR R ， 其中 R 和 R4 独立地选自氢和 低级烷基。 “低级” 意指具有 1-6 个碳原子的基团。
5.C- 末端被衍生化。通常， C- 末端被酯化或酰胺化。例如， 可使用本领域中描述
的方法将 (NH-CH2-CH2-NH2)2 添加在本发明的化合物的 C- 末端。同样地， 可使用本领域中 描述的方法将 -NH2 添加在本发明的化合物的 C- 末端。示范性的 C- 末端衍生基团包括例 如 -C(O)R2， 其中 R2 是低级烷氧基， 或 --NR3R4， 其中 R3 和 R4 独立地是氢或 C1-C8 烷基 ( 或 C1-C4 烷基 )。
6. 用 另 一 例 如 更 稳 定 的 交 联 部 分 ( 例 如 亚 烷 基 ) 取 代 二 硫 键。 参 见 例 如 Bhatnagar 等 (1996)， J.Med.Chem.39 ： 3814-9 ； Alberts 等 (1993)Thirteenth Am.Pep. Symp.， 357-9。
7. 一个或更多个单独的氨基酸残基被修饰。如下文所详述的， 已知多种衍生剂与 所选择的侧链或末端残基特异性反应。
此外， 可通过将蛋白的目标氨基酸残基与能与所选择的侧链或末端残基反应的有 机衍生试剂反应， 将单个氨基酸的修饰导入修饰的 LCAT 氨基酸序列中。示例如下。
赖氨酰和氨基端残基可与琥珀酸或其它羧酸酐类反应。使用这些试剂的衍生化 具有逆转赖氨酰残基电荷的作用。其他适合于衍生含 α- 氨基残基的试剂包括亚氨酸酯 类例如甲基吡啶亚胺甲酯 (methylpicolinimidate) ； 磷酸吡哆醛 ； 吡哆醛 ； 氯硼氢化物 (chloroborohydride) ； 三硝基苯磺酸 ； O- 甲基异脲 ； 2， 4 戊二酮 ； 和转氨酶催化的与乙醛 酸的反应。
可通过与包括苯甲酰甲醛、 2， 3- 丁二酮、 1， 2- 环己二酮和茚三酮的一种或几种常 规试剂反应而修饰精氨酰残基。 由于胍官能团的高 pKa， 因此精氨酸残基的衍生化要求反应 在碱性条件下进行。此外， 这些试剂可与赖氨酸基团以及精氨酸胍基起反应。
已广泛地研究了酪氨酰残基自身的特异性修饰， 特别感兴趣的是通过与芳香族重 氮化合物或四硝基甲烷反应， 将光谱标记导入酪氨酰残基中。最通常地， N- 乙酰咪唑和四 硝基甲烷可用于分别形成 O- 乙酰基酪氨酰种类和 3- 硝基衍生物。
羧基侧基 ( 天冬氨酰或谷氨酰 ) 可通过与碳二亚胺类 (R′ -N ＝ C ＝ N-R′ ) 例 如 1- 环己基 -3-(2- 吗啉基 -(4- 乙基 ) 碳二亚胺或 1- 乙基 -3-(4- 氨鎓 -4， 4- 二甲基戊 基 ) 碳二亚胺反应而被选择性修饰。此外， 天冬氨酰和谷氨酰残基可通过与铵离子反应被 转化为天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。
谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基常被脱酰胺成相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。 可选 地， 在温和的酸性条件下这些残基可被脱酰胺。这些残基的任何一种形式都落入本发明的 范围内。
在除第 31 位残基之外的位置上的半胱氨酰残基可被氨基酸残基或其它部分取 代以消除二硫键， 或相反地稳定交联。参见例如 Bhatnagar 等 (1996)， J.Med.Chem.39 ： 3814-9。
利用双功能试剂的衍生化具有将肽或它们的功能性衍生物与水不溶性的支持物 基质或其他大分子载体相交联的用途。通常使用的交联剂包括， 例如 1， 1- 双 ( 重氮乙酰 基 )-2- 苯乙烷、 戊二醛、 N- 羟基琥珀酰亚胺酯类， 例如， 带有 4- 叠氮水杨酸的酯类， 同双官 能亚氨酸酯， 包括双琥珀酰亚胺酯类例如 3， 3′ - 二硫双 ( 琥珀酰亚胺基丙酸酯 ) 和双功 能马来酰亚胺类例如双 -N- 马来酰亚胺基 -1， 8- 辛烷。衍生试剂例如甲基 -3-[( 对 - 叠 氮苯基 ) 二硫代 ] 丙亚氨酸酯 (propioimidate) 产生光可活化的中间体， 其能在光存在 下形成交联。可选地， 反应性水不溶性基质例如溴化氰活化的碳水化合物和美国专利号3,969,287 ； 3,691,016 ； 4,195,128 ； 4,247,642 ； 4,229,537 ； 和 4,330,440 中描述反应性底 物可用于蛋白固定化。
其他可能的修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化， 丝氨酰或苏氨酰残基的羟基 的磷酸化， 半胱氨酸中硫原子的氧化， 赖氨酸、 精氨酸和组氨酸侧链 α- 氨基的甲基化 (Creighton， T.E.， Proteins ： Structure and MoleculeProperties， W.H.Freeman & Co.， San Francisco， pp.79-86(1983))， N- 末端胺的乙酰化， 以及在某些情况下， C- 末端羧基的 酰胺化。
这样的衍生化的部分优选改良本发明化合物的一种或更多种特征， 包括酶活性、 溶解度、 吸收、 生物半衰期等。替代地， 衍生化的部分得到与未被衍生化的化合物具有相同 或基本上相同的特征和 / 或性质的化合物。该部分能替代地消除或减弱化合物的任何不期 望的副作用等。
碳水化合物 ( 寡糖 ) 基团可方便地连接到已知是蛋白中糖基化位点的位点上。一 般而言， 当它们是序列 Asn-X-Ser/Thr 的一部分时， O- 连接的寡糖被连接到丝氨酸 (Ser) 或 苏氨酸 (Thr) 残基， 而 N- 连接的寡糖则被连接到天冬酰胺 (Asn) 残基， 其中 X 可以是除脯 氨酸之外的任何氨基酸。X 优选是除脯氨酸之外的 19 种天然存在的氨基酸的一种。N- 连 接的和 O- 连接的寡糖的结构以及在每一种中所见的糖残基是不同的。通常在两者上都所 见的一种类型的糖是 N- 乙酰神经氨酸 ( 称为唾液酸 )。唾液酸通常是 N- 连接的和 O- 连接 的寡糖的末端残基， 并且， 由于其负电荷， 可给糖基化化合物赋予酸性特性。这样的位点可 掺入本发明化合物的接头中， 并优选在多肽化合物的重组生产过程中由细胞糖基化 ( 例如 在哺乳动物细胞如 CHO、 BHK、 COS 中 )。然而， 这样的位点可通过本领域已知的合成或半合 成方法得以进一步糖基化。
本发明的修饰的 LCAT 蛋白同样可在 DNA 水平上进行改变。该化合物任何部分的 DNA 序列可被改变为与所选择的宿主细胞更加相容的密码子。在一个方面中， 对于宿主细 胞——大肠杆菌， 优化的密码子是本领域已知的。密码子可被取代以消除限制酶切位点或 以包括沉默的限制酶切位点， 其可有助于在所选择的宿主细胞中 DNA 的加工。运载体、 接头 和肽 DNA 序列可被修饰以包括任何前述序列改变。
另一组有用的衍生物是缀合于毒素、 示踪剂或放射性同位素的上述分子。这样的 缀合尤其可用于包含结合肿瘤细胞或病原体的肽序列的分子。这样的分子可用作治疗剂 或用作手术助剂 ( 例如放射免疫导向手术或 RIGS) 或用作诊断剂 ( 例如放射免疫诊断或 RID)。
作为治疗剂， 这些缀合的衍生物具有诸多优势。它们便利了毒素和放射性同位素 ( 如果没有肽序列提供的特异性结合， 它们应当是有毒性的 ) 的使用。 它们还可通过促进缀 合配偶体的更低有效剂量， 减少伴随着使用放射和化学治疗的副作用。
有用的缀合配偶体包括 ： 131 225
·放射性同位素， 例如 90Y、 I、 Ac 和 213Bi ；
·蓖麻毒蛋白 A 毒素、 微生物来源的毒素例如假单胞菌内毒素 ( 例如 PE38、 PE40) 等；
·捕捉系统中的配偶体分子 ( 参见下文 ) ；
·生物素、 链霉抗生物素蛋白 ( 在捕捉系统中用作配偶体分子或用作示踪剂， 尤其用于诊断应用 ) ； 和
·细胞毒剂 ( 例如阿霉素 )。
这些缀合的衍生物的一种有用的适用是在捕捉系统中使用。在这样的系统中， 本 发明的分子应当包含良性捕捉分子。 该捕捉分子应当能特异性结合包含例如毒素或放射性 同位素的分离的效应分子。运载体缀合的分子和效应分子两者都应当被施用于患者。在这 种系统中， 除了当与运载体缀合的捕捉分子结合时， 效应分子应当具有短半衰期， 因此使得 任何毒副作用减至最小。运载体 - 缀合的分子应当具有相对长的半衰期， 但应当是良性且 无毒的。这两个分子的特异性结合部分可以是已知的特异性结合对 ( 例如生物素、 链霉抗 生物素蛋白 ) 的一部分或可由肽生成方法例如在此描述的方法所产生。
可通过本领域已知的方法制备这样的缀合的衍生物。就蛋白效应分子 ( 例如假 单胞菌内毒素 ) 而言， 这样的分子可自相关的 DNA 构建体表达为融合蛋白。可例如根据对 BEXA 抗体 (Coulter) 所描述的， 制备放射性同位素缀合的衍生物。可例如根据对 BR96 抗 体 (Bristol-Myers Squibb) 所描述的， 制备包含细胞毒剂或微生物毒素的衍生物。可例如 根据来自 NeoRx 的专利、 专利申请以及出版物所描述的， 制备捕捉系统中使用的分子。用于 RIGS 和 RID 的分子可例如根据来自 NeoProbe 的专利、 专利申请和出版物进行制备。 D. 运载体 / 载体部分
本 发 明 的 化 合 物 还 可 与 载 体 分 子 例 如 线 性 聚 合 物 ( 例 如 聚 乙 二 醇、 聚赖氨 酸、 葡 聚 糖 等 )、 支 链 聚 合 物 ( 参 见 例 如 美 国 专 利 4,289,872 ； 美 国 专 利 5,229,490 ； WO 93/21259) ； 脂类 ； 胆固醇基团 ( 例如类固醇 ) ； 或碳水化合物或寡糖共价或非共价地缔合。 其他可能的载体包括抗体部分， 以及特别是来源于抗体的恒定区。其他还可能的载体包括 一种或更多种水溶性聚合物连接物， 例如聚乙二醇或聚丙二醇， 如美国专利号 ： 4,640,835， 4,496,689， 4,301,144， 4,670,417， 4,791,192 和 4,179,337 中所描述。本领域已知的其他 有用的聚合物包括单甲氧基 - 聚乙二醇、 葡聚糖、 纤维素或其他糖基聚合物、 聚 -(N- 乙烯基 吡咯烷酮 )- 聚乙二醇、 丙二醇均聚物、 聚环氧丙烷 / 环氧乙烷共聚物、 聚氧乙基化多元醇 ( 例如甘油 ) 和聚乙烯醇， 以及这些聚合物的混合物。
1. 免疫球蛋白恒定区运载体 / 载体
在一个方面中， 本发明的修饰的 LCAT 蛋白包括至少一个通过 N- 末端、 C- 末端或氨 基酸残基之一的侧链连接至蛋白的运载体。在一个实施方案中， Fc 区是运载体。因此， Fc 区可融合至肽的 N 或 C 末端或 N 和 C 两末端。如在此所示范的， 也可使用多个运载体 ； 例如 在每一末端处的 Fc 或在一个末端处的 Fc 及在另一个末端或侧链处的 PEG 基团。
在多个实施方案中， Fc 部分是天然 Fc 或 Fc 变体。例如以及不受限制， Fc 部分 是人免疫球蛋白 IgG1 重链的 Fc 区或其生物学活性片段、 衍生物或二聚体， 参见 Ellison， J.W. 等， Nucleic Acids Res.10 ： 4071-4079(1982)。然而， 应当理解供本发明使用的 Fc 区 可来源于来自任何物种的 IgG、 IgA、 IgM、 IgE 或 IgD。天然 Fc 区由可通过共价 ( 即二硫键 ) 和 / 或非共价缔合连接成二聚体或多聚体形式的单体多肽组成。天然 Fc 分子的单体亚基 间的分子间二硫键数目根据 ( 例如 IgG、 IgA、 IgE) 或亚类 ( 例如 IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgA1、 IgGA2) 在 1-4 个之间变化。天然 Fc 的一个实例是由 IgG 的木瓜蛋白酶消化所产生的二硫 键合的二聚体 ( 参见 Ellison 等 (1982)， Nucleic Acids Res.10 ： 4071-9)。
在多个方面中， 考虑 Fc 序列包括那些本领域已知的序列， 例如 FcIgG1(GenBank
登 记 号 P01857)、 Fc IgG2(GenBank 登 记 号 P01859)、 FcIgG3(GenBank 登 记 号 P01860)、 Fc IgG4(GenBank 登 记 号 P01861)、 FcIgA1(GenBank 登 记 号 P01876)、 Fc IgA2(GenBank 登 记 号 P01877)、 FcIgD(GenBank 登 记 号 P01880)、 Fc IgM(GenBank 登 记 号 P01871) 和 FcIgE(GenBank 登记号 P01854)。
可通过例如制备多种残基或序列的取代而构建 Fc 部分的变体、 类似物或衍生物。 在一个方面中， 掺入的 Fc 变体包含人源化自非人天然 Fc 的分子或序列。 可选地， Fc 变体包 含缺少一个或更多个天然 Fc 位点或残基的分子或序列， 所述天然 Fc 位点或残基影响或参 与 (1) 二硫键形成， (2) 与所选择的宿主细胞不相容， (3) 在所选择的宿主细胞中表达时的 N- 末端异质性， (4) 糖基化， (5) 与补体相互作用， (6) 结合除补救受体外的 Fc 受体或 (7) 抗 体依赖性细胞毒作用 (ADCC)， 其中每一项都详细描述于美国专利申请号 20040087778 中， 其公开内容以其整体在此并入作为参考。
变体 ( 或类似物 )Fc 多肽部分包括任何插入变体， 其中一个或更多个氨基酸残基 补充 Fc 氨基酸序列。插入可位于蛋白的任一末端或两末端， 或可位于 Fc 氨基酸序列的内 部区域。 在任一末端或两末端具有额外的残基的插入变体可包括例如融合蛋白和包括氨基 酸标志或标记的蛋白。例如， Fc 分子可任选地包含 N- 末端 Met， 尤其当该分子在细菌细胞 例如大肠杆菌中重组表达时。 在 Fc 缺失变体中， Fc 多肽中的一个或更多个氨基酸残基被除去。可在 Fc 多肽的 一个末端或两个末端进行缺失， 或在 Fc 氨基酸序列中除去一个或更多个残基。因此， 缺失 变体包括 Fc 多肽序列的所有片段。
在 Fc 取代变体中， Fc 多肽的一个或更多个氨基酸残基被除去并用另外的残基取 代。 在一个方面中， 取代是自然界中保守的取代以及该类型的保守取代是本领域熟知的。 可 选地， 本发明还包含非保守取代。
例如， 半胱氨酸残基可被缺失或用其他的氨基酸取代以阻止 Fc 序列的某些或所 有的二硫化物交联的形成。每个半胱氨酸残基可被除去和 / 或用其他的氨基酸例如 Ala 或 Ser 取代。 作为另一个实例， 还可进行修饰以导入氨基酸取代， 从而 (1) 消除 Fc 受体结合位 点； (2) 消除补体 (C1q) 结合位点 ； 和 / 或 (3) 消除抗体依赖性细胞毒作用 (ADCC) 位点。 这 样的位点是本领域已知的， 并且任何已知的取代皆落入在此使用的 Fc 的范围内。 关于 IgG1 中 ADCC 位点， 例如参见 Molecular Immunology， Vol.29， No.5,633-639(1992)。
同样地， 一个或更多个酪氨酸残基可用苯丙氨酸残基取代。 此外， 还考虑了其他变 体氨基酸插入、 缺失和 / 或取代， 并且处于本发明的范围内。在一个方面中， 这些可以是保 守的氨基酸取代。此外， 改变可以是改变的氨基酸的形式， 例如肽模拟物或 D- 氨基酸。
如上所述， 天然 Fc 和 Fc 变体都是在本发明范围内使用的合适的 Fc 结构域。天 然 Fc 可被广泛地修饰以形成 Fc 变体， 前提是与补救受体的结合要被保持 ； 参见例如 WO 97/34631 和 WO 96/32478。在这样的 Fc 变体中， 可除去提供不是本发明的融合分子必需的 结构特征或功能活性的天然 Fc 的一个或更多个位点。可通过例如取代或缺失残基、 插入残 基到位点中， 或截去包含该位点的部分， 从而除去这些位点。 插入或取代的残基还可以是改 变的氨基酸， 例如肽模拟物或 D- 氨基酸。 期望 Fc 变体可能有多种原因， 几个原因描述如下。 示范性的 Fc 变体包括分子和序列， 其中 ：
1. 除去参与二硫键形成的位点。 这样的除去可避免与用于产生本发明分子的宿主
细胞中存在的其他含半胱氨酸蛋白的反应。为了该目的， 可截去 N- 末端处含半胱氨酸片段 或可缺失半胱氨酸残基或用其他氨基酸 ( 例如丙氨酰、 丝氨酰 ) 取代。即使在半胱氨酸残 基被除去的情况下， 单链 Fc 区仍能形成非共价结合的二聚 Fc 区。
2. 修饰天然 Fc 以使之与所选择的宿主细胞更相容。 例如， 可除去接近典型的天然 Fc 的 N- 末端的 PA 序列， 该序列可为大肠杆菌中的消化酶如脯氨酸亚氨基肽酶所识别。还 可添加 N- 末端甲硫氨酸残基， 尤其是当该分子在细菌细胞如大肠杆菌中重组表达时。
3. 当在所选择的宿主细胞中表达时， 除去天然 Fc 的 N- 末端部分以阻止 N- 末端异 质性。为了该目的， 可缺失 N- 末端前 20 个氨基酸残基的任何一个， 特别是处于第 1、 2、 3、 4 和 5 位的那些残基。
4. 除去一个或更多个糖基化位点。 通常糖基化的残基 ( 例如天冬酰胺 ) 可赋予细 胞溶解反应。这样的残基可缺失或用非糖基化残基 ( 例如丙氨酸 ) 取代。
5. 除去参与与补体的相互作用的位点， 例如 Clq 结合位点。 例如， 可缺失或取代人 IgG1 的 EKK 序列。对于本发明的分子而言， 补体募集可能不是有利的， 因此可用这样的 Fc 变体来避免。
6. 除去影响结合除补救受体外的 Fc 受体的位点。 天然 Fc 可具有用于与某些白细 胞相互作用的位点， 其并非本发明的融合分子所必需的， 因此可以除去。
7. 除去 ADCC 位点。ADCC 位点是本领域中已知的 ； 关于 IgG1 中的 ADCC 位点， 参见 例如 Molec.Immunol.29(5) ： 633-9(1992)。对于本发明的融合分子， 这些位点同样是不需 要的， 因此可被除去。
8. 当天然 Fc 来源于非人抗体时， 该天然 Fc 可被人源化。通常， 为了人源化天然 Fc， 可用在人天然 Fc 中通常所见的残基取代非人天然 Fc 中所选择的残基。用于抗体人源 化的技术是本领域熟知的。
应当注意到除非存在阻止通过二硫键形成而二聚化的特定条件， 当存在合适的半 胱氨酸残基时， Fc 单体会自发地二聚化。即使除去或用其他残基取代在 Fc 二聚体中正常 形成二硫键的半胱氨酸残基， 该单链都通常会通过非共价相互作用形成二聚体。术语 “Fc” 在此用于意指如下这些形式的任何一种 ： 天然的单体、 天然的二聚体 ( 二硫键连接的 )、 修 饰的二聚体 ( 二硫键和 / 或非共价连接的 ) 以及修饰的单体 ( 即衍生物 )。
Fc 序列还可被衍生化， 即具有不同于氨基酸残基插入、 缺失或取代的修饰。 在一个 方面中， 该修饰在性质上是共价的， 并且包括例如与聚合物、 脂类、 其他有机和无机部分的 化学键接。然而， 还可考虑到非共价修饰。可制备本发明的衍生物以增加循环半衰期， 或可 设计本发明的衍生物以改善多肽对期望细胞、 组织或器官的靶向能力。
例如在题名为 “具有增加的半衰期的改变的多肽” 的 WO 96/32478 中所描述的， 还 有可能使用完整的 Fc 分子的补救受体结合域作为本发明化合物的 Fc 部分。在此被称为 Fc 的分子类的额外成员是那些在题为 “具有增加的半衰期的免疫球蛋白样结构域” 的 WO 97/34631 中所描述的成员。
2. 水溶性聚合物运载体
如上所述， 还考虑到聚合物运载体。用于连接用作运载体的化学部分的各种手段 是普遍可得到的， 参见例如题为 “N- 末端化学修饰的蛋白组合物和方法” 的国际公开号 WO 96/11953， 其整体在此并入作为参考。该 PCT 出版物披露了将水溶性聚合物选择性连接到蛋白的 N- 末端上及其它内容。
因此， 本发明考虑到包含水溶性聚合物 (WSP) 的化合物。适宜地， 临床上可接受的 WSP 包括不限于 PEG、 聚乙二醇丙醛、 乙二醇 / 丙二醇共聚物、 单甲氧基 - 聚乙二醇、 羧甲基 纤维素、 聚缩醛、 聚乙烯醇 (PVA)、 聚乙烯吡咯烷酮、 聚 -1， 3- 二氧戊环、 聚 -1， 3， 6- 三噁烷、 乙烯 / 马来酸酐共聚物、 聚 -β- 氨基酸 ( 均聚物或无规共聚物 )、 聚 (n- 乙烯基吡咯烷酮 ) 聚乙二醇、 丙二醇均聚物 (PPG) 和其他聚环氧烷、 聚环氧丙烷 / 环氧乙烷共聚物、 聚氧乙基 化多元醇 (POG)( 例如甘油 ) 和其他聚氧乙基化多元醇、 聚氧乙基化山梨糖醇、 或聚氧乙基 化葡萄糖、 colonic acids 或其他碳水化合物聚合物、 Ficoll 或葡聚糖和它们的混合物。 事实上， 提供了任何形式的已用于衍生化其它蛋白的 PEG， 例如且不限于单 -(C1-C10) 烷氧 基 - 或芳氧基 - 聚乙二醇。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性， 因此在制造中具有优势。
PEG 基团可以是任何适宜的分子量并且可以是线性或支链的。考虑用于本发明的 PEG 的平均分子量为约 2kDa- 约 100kDa， 约 5kDa- 约 50kDa， 约 5kDa- 约 10kDa。在另一个 方面中， PEG 部分具有约 6kDa- 约 25kDa 的分子量。通过在 PEG 部分上的反应基 ( 例如醛、 氨基、 硫醇或酯基 ) 与目标肽或蛋白上的反应基 ( 例如醛、 氨基或酯基 )， PEG 基团通常经酰 化或还原性烷基化被连接到肽或蛋白上。使用在此描述的方法， 可以制备聚合物 / 肽缀合 物分子的混合物， 并且， 在此所提供的优势在于选择包含于混合物中的聚合物 / 肽缀合物 的比例的能力。因此， 必要时， 可以预定的聚合物 / 蛋白缀合物比例制备肽与所连接的多个 聚合物部分 ( 即 0、 1 或 2 个 ) 的混合物。
一种用于合成肽的聚乙二醇化的有效策略由如下组成 ： 通过在溶液中形成缀合连 接， 结合各自带有相互反应性的特定官能度的肽和 WSP(PEG) 部分。该肽可容易地用常规固 相合成制备。用适当的官能团在特定的位点上 “预活化” 该肽。纯化前体并在与 PEG 部分 反应前进行充分表征。肽与 PEG 的连接通常发生在水相中并可通过反相分析 HPLC 而容易 地得到监测。 该聚乙二醇化肽可容易地通过制备 HPLC 纯化并通过分析 HPLC、 氨基酸分析和 激光解吸质谱鉴定。
多糖聚合物是另一类可用于蛋白修饰的 WSP。葡聚糖是由主要通过 1-6 键连接的 各个葡萄糖亚基组成的多糖聚合物。在许多分子量范围内的葡聚糖自身是可得到的， 并且 在约 1kD- 约 70kD 的分子量范围内是容易得到的。葡聚糖是一种单独或与另外的运载体 ( 例如 Fc) 结合用于本发明作为运载体的合适的水溶性聚合物。参见例如 WO 96/11953 和 WO 96/05309。 已报道了缀合至治疗或诊断免疫球蛋白的葡聚糖的应用 ； 参见例如欧洲专利 公开号 0 315 456。当根据本发明将葡聚糖用作运载体时， 优选约 1kD- 约 20kD 的葡聚糖。
分子的 WSP 部分可以是分支的或无支链的。为了最终产物制剂的治疗应用， 聚合 物是药学可接受的。一般而言， 基于以下考虑来选择期望的聚合物 ： 聚合物缀合物是否在 治疗上使用， 以及如果这样， 期望的剂量、 循环时间、 对蛋白水解的抗性和其他考虑因素。 在 多个方面中， 每个 WSP 的平均分子量为约 2kDa- 约 100kDa、 约 5kDa- 约 50kDa、 约 12kDa- 约 40kDa 和约 20kDa- 约 35kDa。在又一个方面中， 每个聚合物的分子量为约 6kDa- 约 25kDa。 当在此以及通篇使用时， 术语 “约” 指在水溶性聚合物制备中， 某些分子称重会高于、 有时低 于所指出的分子量。一般而言， 分子量越高或更多支链， 则聚合物 / 蛋白比率就更高。可使 用其他大小， 这取决于期望的治疗谱， 包括例如， 持续释放的持续时间 ； 如果存在， 对生物活 性的影响 ； 操作容易程度 ； 抗原性程度或缺乏抗原性以及其他已知的水溶性聚合物对治疗蛋白的影响。
考虑到对肽或蛋白的功能或抗原结构域的影响， WSP 应当被连接到蛋白上。 一般而 言， 可在任何用于让蛋白与活化的聚合物分子起反应的合适的条件下进行化学衍生化。可 用于将水溶性聚合物与一个或多个蛋白连接的活化基团包括不限于砜、 马来酰亚胺、 巯基、 硫醇、 三氟甲磺酸酯 (triflate)、 三氟乙磺酸酯 (tresylate)、 azidirine、 环氧乙烷和 5- 吡 啶基。 如果通过还原性烷基化连接到肽上， 则所选择的聚合物应当具有单个反应醛， 使得聚 合程度可控。
3. 可选的运载体
可选的运载体包括能结合补救受体的蛋白、 多肽、 肽或小分子 ( 例如肽模拟物化 合物 )。例如， 如美国专利号 5,739,277 中所描述的多肽可用作运载体。还可通过用于结合 FcRn 补救受体的噬菌体展示来选择肽。这样的补救受体结合化合物也包括在 “运载体” 的 含义中并处于本发明的范围内。应该选择这样的运载体， 以得到增加的半衰期 ( 例如通过 避免序列为蛋白酶所识别 ) 和降低的免疫原性 ( 例如通过有利于非免疫原性序列， 如在抗 体人源化中所披露的 )。
III. 修饰的 LCAT 蛋白的生产 / 制备方法
A. 多核苷酸
在此描述的蛋白主要可使用重组 DNA 技术在转化的宿主细胞中制备。为了这样 做， 制备编码肽的重组 DNA 分子。制备这样的 DNA 分子的方法是本领域熟知的。例如， 可使 用合适的限制性内切酶从 DNA 中切离编码肽的序列。或者， DNA 分子可使用化学合成技术 合成， 例如氨基磷酸酯法。同样， 可利用这些技术的组合。
本发明还包括能在合适的宿主中表达肽的载体。 该载体包含可操作地连接合适的 表达控制序列的编码肽的 DNA 分子。在 DNA 分子插入载体前后实现该可操作连接的方法是 熟知的。 表达控制序列包括启动子、 激活子、 增强子、 操纵子、 核糖体结合位点、 起始信号、 终 止信号、 帽信号、 聚腺苷酸化信号和其他涉及转录或翻译控制的信号。
将所得到的其中具有 DNA 分子的载体用于转化合适的宿主。该转化可使用本领域 熟知方法来进行。
任何大量可获得且熟知的宿主细胞皆可用于本发明的实践中。 特定宿主的选择依 赖于本领域所公认的多种因素。 这些因素包括例如与所选择的表达载体的相容性、 DNA 分子 编码的肽的毒性、 转化速度、 肽回收的容易程度、 表达特性、 生物安全性和成本。根据理解， 不是所有的宿主都同等有效地表达特定的 DNA 序列， 因此这些因素的平衡必然受到冲击。 在这些一般指南中， 有用的微生物宿主包括培养中的细菌 ( 例如大肠杆菌 )、 酵母 ( 例如啤 酒糖酵母 ) 和其他真菌， 昆虫、 植物、 哺乳动物 ( 包括人 ) 细胞， 或本领域已知的其他宿主。
接着， 培养转化的宿主并纯化。宿主细胞可在常规发酵条件下培养以便表达期望 的化合物。这样的发酵条件是本领域熟知的。最后， 通过本领域熟知的方法从培养物中纯 化肽。
修 饰 的 LCAT 蛋 白 还 可 通 过 合 成 法 制 造。 例 如， 可 使 用 固 相 合 成 技 术。 合 适 的 技 术 是 本 领 域 熟 知 的， 并 包 括 那 些 在 Merrifield(1973)， Chem.Polypeptides， pp.335-61(Katsoyannis 和 Panayotis 编 ) ； Merrifield(1963)， J.Am.Chem.Soc.85 ： 2149 ； Davis 等 (1985)， Biochem.Intl.10 ： 394-414 ； Stewart 和 Young(1969)， Solid PhasePeptide Synthesis ； 美国专利号 3,941,763 ； Finn 等 (1976)， The Proteins( 第 3 版 )2 ： 105-253 ； 以及 Erickson 等 (1976)， The Proteins( 第 3 版 )2 ： 257-527 中描述的技术。固 相合成是一种被考虑的制造单个肽的技术， 因为其是最具成本效益的制造小肽的方法。
B. 载体
为了重组蛋白表达， 本发明提供了能在合适的宿主中表达的编码修饰的 LCAT 蛋 白的载体。这样的载体包含可操作地连接合适的表达控制序列、 带有或不带有运载体修饰 的编码修饰的 LCAT 蛋白的多核苷酸。在 DNA 分子插入载体前后实现可操作的连接的方法 是本领域熟知的。表达控制序列包括启动子、 激活子、 增强子、 操纵子、 核糖体结合位点、 起 始信号、 终止信号、 帽信号、 多腺苷酸化信号和 / 或其他涉及转录或翻译控制的信号。本领 域技术人员会理解可利用这些控制序列的不同组合， 这取决于例如要表达修饰的 LCAT 蛋 白的宿主细胞的选择。使用本领域熟知的方法将所得到的载体转化入合适的宿主中。
C. 宿主细胞
许多可得到且熟知的宿主细胞中的任何一种用于表达修饰的 LCAT 蛋白 . 宿主的 选择取决于多种因素， 包括例如且不限于与所选择的表达载体的相容性、 表达的由转化的 多核苷酸编码的修饰的 LCAT 蛋白的毒性、 转化速度、 回收表达的修饰的 LCAT 蛋白的容易程 度、 表达特性、 糖基化的程度和类型、 ( 如果需要 ) 生物安全性和成本。根据理解， 不是所有 的宿主细胞对特定修饰的 LCAT 蛋白的表达都是同等有效的， 因此这些因素的平衡必然受 到冲击。取决于所使用的宿主细胞， 修饰的 LCAT 表达产物可用哺乳动物或其他真核生物碳 水化合物糖基化， 或其可以是非糖基化的。如果在例如细菌宿主细胞中表达， 修饰的 LCAT 表达产物还可包括起始甲硫氨酸氨基酸残基 ( 在氨基酸残基第 -1 位处 )。 在这些一般指南 中， 有用的宿主细胞包括培养中的细菌、 酵母和其他真菌， 昆虫、 植物、 哺乳动物 ( 包括人 ) 细胞， 或其他本领域已知的宿主细胞。在本领域熟知的常规发酵条件下培养宿主细胞以容 许期望化合物的表达， 并使用本领域也已知的技术纯化修饰的 LCAT 表达产物。
取决于用于表达修饰的 LCAT 蛋白的宿主细胞， 碳水化合物 ( 寡糖 ) 基团可方便地 连接到蛋白中已知的糖基化位点上。一般而言， 当它们是序列 Asn-X-Ser/Thr 的一部分时， O- 连接的寡糖被连接到丝氨酸 (Ser) 或苏氨酸 (Thr) 残基上， 而 N- 连接的寡糖则被连接到 天冬酰胺 (Asn) 残基上， 在此 X 可以是除脯氨酸之外的任意氨基酸。 X 优选是除脯氨酸之外 的 19 种天然存在的氨基酸的一种。 N- 连接的和 O- 连接的寡糖的结构以及在每一种中所见 的糖残基是不同的。通常在两者上都所见的一种类型的糖是 N- 乙酰神经氨酸 ( 称为唾液 酸 )。唾液酸通常是 N- 连接的和 O- 连接的寡糖的末端残基， 并且由于其负电荷， 可给糖基 化的化合物赋予酸性特性。这样的位点可掺入本发明化合物的接头中， 并优选在多肽化合 物的重组生产过程中通过细胞得以糖基化 ( 例如在哺乳动物细胞如 CHO、 BHK、 COS 中 )。然 而， 这样的位点可通过本领域已知的合成或半合成法得以进一步糖基化。
D. 修饰的 LCAT 蛋白的运载体修饰
取决于所选择的 WSP 连接方法， 连接到靶蛋白分子上的 WSP 分子的比例会随着它 们在反应混合物中的浓度而改变。一般而言， 最佳比值 ( 依据反应效率， 即不存在过量的未 反应蛋白或聚合物 ) 为所选择的 WSP 的分子量所决定。此外， 当使用包括非特异性连接以 及随后期望种类的纯化的方法时， 比值可取决于可利用的反应基 ( 通常是氨基 ) 的数目。
一般而言， 通过 WSP 上的反应基 ( 即醛、 氨基、 酯、 硫醇、 α- 卤乙酰基、 马来酰亚胺基或肼基 ) 与靶上的反应基， 经酰基化、 还原性烷基化、 迈克尔加成、 硫醇烷基化或其他化 学选择性缀合 / 连接方法， 将 WSP 添加到修饰的 LCAT 蛋白上。
因此， 还考虑用于制备缀合衍生物的方法。因此， 本发明的一个方面是一种方法， 包含通过在此描述的任何一种方法或本领域已知的其他方法制备包含至少一个运载体的 修饰的 LCAT 试剂。举例来说且不受限， 可利用还原性烷基化化学修饰操作方法。使用了描 述于 Francis 等， 在： Stability of protein pharmaceuticals 中 ： in vivo pathways of degradation andstrategies for protein stabilization( 编辑 .Ahern.， T. 和 Manning， M.C.)Plenum， N.Y.， 1991 中的用于 WSP 修饰的替代方法。在又一个方面中， 该方法描述于 Delgado 等，″ Coupling of PEG to Protein By ActivationWith Tresyl Chloride， Applications In Immunoaffinity Cell Preparation″， 在： Fisher 等， 编， Separations Using Aqueous Phase Systems， ApplicationsIn Cell Biology and Biotechnology， Plenum Press， N.Y.， N.Y.， 1989pp.211-213 中， 其 涉 及 使 用 三 氟 乙 磺 酰 氯 (tresyl chloride)， 其在 WSP 部分和修饰的 LCAT 蛋白之间不产生连接基团。然而， 该替代方法可能 难以用来产生治疗产物， 因为使用三氟乙磺酰氯可产生有毒的副产物。 在其他方面中， 如本 领域熟知的， 通过使用羧甲基甲氧基聚乙二醇的 N- 羟基琥珀酰亚胺酯实现 WSP 的连接。
1. 还原性烷基化
在一个方面中， 通过如在此所提供的还原性烷基化化学修饰方法实施 WSP 与修饰 的 LCAT 蛋白的共价连接， 以选择性修饰 N- 末端 α- 氨基， 并检测所得到产物的期望生物学 特性， 例如通过在此提供的生物活性测定法。
用于将 WSP 与蛋白或肽进行连接的还原性烷基化利用了在特定蛋白中可用于衍 生化的不同类型伯氨基 ( 例如赖氨酸对 N- 末端 ) 的不同的反应性。在合适的反应条件下， 使用含羰基聚合物， 在 N- 末端处实现了蛋白的基本上选择性的衍生化。
利用还原性烷基化， 还原剂应当是在水溶液中稳定的并优选仅能还原在还原性烷 基化的起始过程中形成的席夫碱。 还原剂选自且不限于硼氢化钠、 氰基硼氢化钠、 硼酸二甲 胺、 硼酸三甲胺和硼酸吡啶。
反应 pH 影响聚合物与要被使用的蛋白的比率。一般而言， 如果反应 pH 低于靶反 应基的 pKa， 则对于蛋白需要较大过量的聚合物。如果 pH 高于靶 pKa， 则聚合物∶蛋白比率 无需较大 ( 即更多的反应基可利用， 因此需要更少的聚合物分子 )。
因此， 在一方面中反应在容许利用赖氨酸残基的 ε- 氨基和蛋白 N- 末端残基的 α- 氨基之间的 pKa 差异的 pH 下进行。通过这样的选择性衍生化， 得以控制水溶性聚合物 与蛋白的连接 ； 与聚合物的缀合主要发生在蛋白的 N- 末端， 并且其他反应基例如赖氨酸侧 链氨基没有发生明显的修饰。
因此， 在一个方面中， 提供了用于将 WSP 与目标修饰的 LCAT 蛋白共价连接的方法， 该方法在使用其它化学修饰化学方法所必需的进一步广泛纯化不存在的情况下提供了基 本上同质的 WSP/ 蛋白缀合物分子制备物。更具体地说， 如果使用聚乙二醇， 所描述的方法 容许产生缺少可能的抗原连接基团的 N- 末端聚乙二醇化蛋白， 即聚乙二醇部分直接偶联 到蛋白部分上， 没有潜在毒性的副产品。
E.WSP- 修饰的化合物的纯化
在一个方面中， 获得基本上同质的 WSP-LCAT 蛋白制备物的方法是通过从具有处于修饰的 LCAT 蛋白序列中不同位置的多种 WSP 附着物的修饰的 LCAT 种类的混合物中纯化 具有附着的 WSP 部分的占优势单种修饰的 LCAT。举例来说， 首先通过离子交换层析分离基 本上同质的修饰的 LCAT 种类以获得具有单种类的电荷特性的物质 ( 即使可存在具有相同 的表观电荷的其他种类 )， 然后使用大小排阻层析分离期望的种类。 报道了其他方法并为本 发明所考虑， 包括例如 WO 90/04606， 其描述了一种用于分级分离 PEG- 蛋白加合物混合物 的方法， 包括在含 PEG 水性两相系统中分配 PEG/ 蛋白加合物。这样的分离系统可被修改用 于具有其它 ( 即非 -PEG) 附着物的修饰的 LCAT 蛋白。
因此， 本发明的一个方面是用于 WSP- 修饰的 LCAT 缀合物制备的方法， 包括 (a) 在 还原烷基化条件下， 于适于选择性活化蛋白部分氨基端的 α- 氨基使得所述水溶性聚合物 选择性连接到所述 α- 氨基上的 pH 下， 将具有多于 1 个氨基的修饰的 LCAT 蛋白与水溶性 聚合物部分反应 ； 和 (b) 获得反应产物。任选地， 以及特别对于治疗产物， 将反应产物与未 反应部分相分离。
IV. 包含修饰的 LCAT 的药物组合物和施用方法
虽然可能单独施用本发明的化合物， 但是在所描述的方法中， 被施用的化合物通 常是作为期望的剂量单位制剂， 例如包含常规药学可接受的载体的药学可接受的组合物中 的活性成分而存在的。 因此， 在本发明的另一个方面中， 提供了包含与药学可接受的载体组 合的本发明的化合物的药物组合物。可接受的药用载体通常包括如本文中所描述的稀释 剂、 赋形剂、 佐剂等。 本发明的药物组合物可包含有效量的本发明的化合物或有效剂量的本发明的化 合物。本发明的化合物的有效剂量包括小于、 等于或大于该化合物有效量的量。例如， 其 中两个或更多个单位剂量的药物组合物如片剂、 胶囊剂等是施用有效量的该化合物所必需 的， 或者可选地， 多剂量药物组合物如粉剂、 液体等， 其中有效量的化合物可通过施用该组 合物的一部分而施用。 “单位剂量” 定义为分散在合适的容器中的治疗组合物的离散量。如 通过良好的医疗实践和个体患者的临床状况所决定的， 本领域技术人员会容易地优化有效 剂量和施用方案。
药物组合物可通常通过将一种或更多种修饰的 LCAT 蛋白与一种或更多种药学 可接受的载体、 赋形剂、 粘合剂、 佐剂、 稀释剂、 防腐剂、 增溶剂、 乳化剂等混合而得以制备， 以形成期望的可施用制剂来治疗或改善多种疾病。这样的组合物包括各种缓冲内容物 ( 例如 Tris-HCl、 醋酸盐、 磷酸盐 )、 pH 和离子强度的稀释剂 ； 添加剂例如去污剂和增溶剂 ( 例如吐温 80、 Polysorbate 80)， 抗氧化剂 ( 例如抗坏血酸、 焦亚硫酸钠 )， 防腐剂 ( 例 如 Thimersol、 苯甲醇 ) 和填充物质 ( 例如乳糖、 甘露糖醇 ) ； 将物质掺入聚合物例如聚乳 酸、 聚乙醇酸等的颗粒制剂中或掺入脂质体中。还可使用透明质酸， 因为其可具有延长循 稳定性、 体 环中持续时间的作用。这样的组合物可影响本发明蛋白和衍生物的物理状态、 内释放速度和体内清除速度。参见例如 Remington′ s Pharmaceutical Sciences， 第 18 版 .(1990， Mack Publishing Co.， Easton， PA 18042) 第 1435-1712 页， 其在此并入作为参 考。组合物可以液体形式制备， 或可以干粉形式例如冻干形式存在。由于是经皮制剂， 因此 还考虑了可植入的持续释放制剂。
药物组合物可进行常规制药操作例如杀菌和 / 或可包含常规佐剂， 例如防腐剂、 稳定剂、 润湿剂、 乳化剂、 缓冲剂等。本发明的药学活性的化合物可依据配药学常规方法进
行加工以产生药剂以施用于患者包括人和其他哺乳动物。
可通过本领域熟知的方法制造药物组合物， 例如常规的造粒、 混合、 溶解、 包囊、 冻 干、 乳化或水磨方法等。 组合物可以例如粒剂、 粉剂、 片剂、 胶囊剂、 糖浆剂、 栓剂、 注射剂、 乳 剂、 酏剂、 悬液或溶液的形式存在。本发明的组合物可配制用于不同的施用途径， 例如通过 口服施用， 通过跨粘膜施用 ( 包括肺和鼻施用 )， 肠胃外施用 ( 包括皮下施用 )， 经皮 ( 局部 ) 施用或通过直肠施用， 以及鞘内、 静脉内、 肌内、 腹膜内、 鼻内、 眼内或脑室内注射。 本发明的 一种化合物或多种化合物还可以局部而非全身方式施用， 例如作为持续释放制剂注射。
除 那 些 在 此 描 述 的 代 表 性 剂 型 之 外， 药学可接受的赋形剂和载体是通常为 本领域技术人员所知的， 并且因此包括在本发明中。这样的赋形剂和载体描述于例 如 ″ Remingtons Pharmaceutical Sciences ″ Mack Pub.Co.， New Jersey(2000) ； 和″ Pharmaceutics The Science of Dosage FormDesign， 第 2 版 (Aulton， 编 )Churchill Livingstone(2002) 中。给出下列剂型用作举例但不应视为限制本发明。
A. 口服施用
为了口服、 颊和舌下施用， 粉剂、 悬液、 粒剂、 片剂、 丸剂、 胶囊剂、 软胶囊、 锭剂 或糖锭、 扁囊剂、 丹剂和囊片是作为固体剂型 ( 和单位剂型 ) 可接受的， 并通常描述于 Remington′ s Pharmaceutical Sciences(1990)， 第 18 版， Mack Publishing Co.Easton PA 18042 的 第 89 章 中。 固 体 剂 型 还 包 括 脂 质 体 或 类 蛋 白 包 囊 ( 例 如， 美国专利号 4,925,673 中报道的类蛋白微球体 )。可使用脂质体包封， 并且脂质体可用多种聚合物来衍 生化 ( 例如美国专利号 5,013,556)。 在由 G.S.Banker 和 C.T.Rhodes 所编的 Marshall， K.， Modern Pharmaceutics(1979) 的第 10 章中给出了用于治疗的可能的固体剂型的描述。一 般而言， 制剂包括修饰的 LCAT 蛋白， 以及用于抵御胃环境并在肠中释放生物活性物质的惰 性成分。
必要时， 对化合物进行化学修饰以增加口服送递的生物有效性。一般而言， 考虑 的化学修饰是连接至少一个部分到化合物分子自身上， 其中所述部分容许 (a) 抑制蛋白水 解； 和 (b) 从胃或肠摄取入血流中。还期望的是增加化合物的总稳定度和增加体内循环时 间。在本发明中用作共价连接的运载体的部分也可用于该目的。这样的部分的实例包括 ： PEG、 乙二醇和丙二醇的共聚物、 羧甲基纤维素、 葡聚糖、 聚乙烯醇、 聚乙烯吡咯烷酮和聚脯 氨酸以及其他在此描述的部分。 还参见例如 Abuchowski 和 Davis， Soluble Polymer-Enzyme Adducts， Enzymes as Drugs(1981)， Hocenberg 和 Roberts， 编， Wiley-Interscience， New York， NY， pp 367-83 ； Newmark， 等 (1982)， J.Appl.Biochem.4 ： 185-9。其他可使用的聚合 物是聚 -1， 3- 二氧戊环和聚 -1， 3， 6- 三氧戊环 (tioxocane)。 在一个方面中， 如上所示提供 了用于制药使用的 PEG 部分。
对于口服送递剂型， 还有可能使用修饰的脂族氨基酸的盐类， 例如 N-(8-[2- 羟基 苯甲酰基 ] 氨基 ) 辛酸钠 (SNAC)， 作为载体来增加本发明治疗化合物的吸收。使用 SNAC 的 肝素制剂的临床功效业已在由 EmisphereTechnologies 进行的 II 期试验中得以证实。参 见美国专利号 5,792,451， “口服药物送递组合物和方法” 。
本发明的化合物可以粒径约 1mm 的颗粒或小丸的形式作为精细多颗粒包含在制 剂中。用于胶囊施用的材料的制剂还可以是粉剂、 轻轻压缩的扁块或甚至作为片剂。可通 过压制来制备治疗剂。可例如通过将一种或更多种本发明的化合物与至少一种添加剂或赋形剂例如淀 粉或其他添加剂混合并制片、 包囊或制成其他期望的用于常规施用的形式， 制备预期的口 服药物组合物。合适的添加剂或赋形剂是蔗糖、 乳糖、 纤维素糖、 甘露糖醇、 麦牙糖醇、 葡聚 糖、 山梨糖醇、 淀粉、 琼脂、 海藻酸盐、 几丁质、 脱乙酰壳多糖、 果胶、 黄蓍胶、 阿拉伯树胶、 明 胶、 胶原、 酪蛋白、 白蛋白、 合成或半合成聚合物或甘油酯、 甲基纤维素、 羟丙甲基纤维素和 / 或聚乙烯吡咯烷酮。任选地， 口服剂型可包含其他成分以帮助施用， 例如无活性稀释剂， 或 润滑剂如硬脂酸镁， 或防腐剂如对羟基苯甲酸酯或山梨酸， 或抗氧化剂例如抗坏血酸、 生育 酚或半胱氨酸、 崩解剂、 粘合剂、 增稠剂、 缓冲剂、 甜味剂、 调味剂或芳香剂。此外， 可添加染 料或色素用于辨识。片剂和丸剂可进一步用本领域已知的合适的包衣材料进行处理。
用于口服施用的液体剂型可以药学可接受的乳剂、 糖浆剂、 酏剂、 悬液、 浆状物和 溶液的形式存在， 其可包含无活性稀释剂， 例如水。利用无菌液体， 例如但不限于油、 水、 乙 醇和这些的组合， 药物制剂可制备为液体悬液或溶液。 对于口服或肠胃外施用， 可添加药学 适合的表面活性剂、 助悬剂、 乳化剂等。
更具体地说， 口服药物组合物的多个方面包括一种或更多种下列添加剂。
着色剂和调味剂可都包括在内。例如， 蛋白 ( 或衍生物 ) 可被配制 ( 例如通过脂 质体或微球包囊 )， 然后进一步包含于可食用产品中， 例如含着色剂和调味剂的冷冻饮料。
可用惰性材料稀释或增加本发明化合物的体积。这些稀释剂可包括碳水化合物， 尤其是甘露糖醇、 乳糖、 无水乳糖、 纤维素、 蔗糖、 改性葡聚糖和淀粉。还可使用某些无机盐 作为填充剂， 包括三磷酸钙、 碳酸镁和氯化钠。某些市售稀释剂是 Fast-Flo、 Emdex、 STA-Rx 1500、 Emcompress 和 Avicell。
崩解剂可包括在固体剂型的治疗制剂中。用作崩解剂的材料包括但不限于淀粉， 包括基于淀粉的商业崩解剂 Explotab。羟乙酸淀粉钠、 安伯莱特 (Amberlite)、 羧甲基纤维 素钠、 超支链淀粉 (ultramylopectin)、 海藻酸钠、 明胶、 橙皮、 酸性羧甲基纤维素、 天然海绵 和皂土可都被使用。另一类型的崩解剂是不溶性阳离子交换树脂。粉状树胶可用作崩解剂 以及粘合剂， 这些可包括粉状树胶例如琼脂、 刺梧桐树胶 (Karaya) 或黄蓍胶。海藻酸及其 钠盐也可用作崩解剂。
粘合剂可用于将治疗剂保持在一起以形成硬片剂并包括来自天然产物的材料例 如阿拉伯树胶、 黄蓍胶、 淀粉和明胶。 其他粘合剂包括甲基纤维素 (MC)、 乙基纤维素 (EC) 和 羧甲基纤维素 (CMC)。 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 和羟丙基甲基纤维素 (HPMC) 都可用于醇溶液 中来对治疗剂进行制粒。
润滑剂可包括在治疗剂制剂中以阻止配制过程期间的粘附。 润滑剂可被用作为治 疗剂和模具壁之间的层， 并且这些润滑剂可包括但不限于硬脂酸包括其镁和钙盐、 聚四氟 乙烯 (PTFE)、 液体石蜡、 植物油和蜡。还可使用可溶性润滑剂例如十二烷基硫酸钠、 十二烷 基硫酸镁、 各种分子量的聚乙二醇、 Carbowax 4000 和 6000。
可添加能在配制期间改善药物流动特性并在压制期间帮助重排的助流剂。 助流剂 可包括淀粉、 滑石、 热解硅胶和含水硅铝化合物。
为帮助将本发明的化合物溶解在含水环境中， 可添加表面活性剂作为润湿剂。表 面活性剂可包括阴离子去污剂， 例如十二烷基硫酸钠、 琥珀酸二辛酯磺酸钠和二辛基磺酸 钠 (dioctyl sodium sulfonate)。 可使用阳离子去污剂并可包括苯扎氯铵或苄索氯铵。 可包括在制剂中作为表面活性剂的可能的非离子去污剂的列表是 lauromacrogol 400， 硬脂 酸 -40- 聚羟氧基酯， 聚氧乙烯氢化蓖麻油 10、 50 和 60， 单硬脂酸甘油酯， polysorbate 40、 60、 65 和 80， 蔗糖脂肪酸酯、 甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可单独或作为不 同比率的混合物存在于蛋白或衍生物的制剂中。
添加剂还可包括在制剂中以增加化合物的摄取。 可能具有该特性的添加剂是例如 脂肪酸油酸、 亚油酸和亚麻酸。
控释制剂可能是所希望的。 本发明的化合物可掺入允许通过扩散或沥滤机制进行 释放的惰性基质例如树胶中。慢退化基质亦可掺入制剂中， 例如海藻酸盐、 多糖。其他类型 的本发明的化合物的控释是通过基于 Oros 治疗系统 (Alza Corp.) 的方法， 即将药物包封 入半透膜中， 由于渗透效应， 该半透膜容许水进入并将药物通过单个小的开口挤出。 某些肠 溶衣也具有延迟释放作用。
其他包衣可被用于制剂。这些包括多种可在包衣锅中应用的糖类。治疗剂还可 以薄膜包衣片的形式给予， 并且在这种情况下所使用的材料分成 2 组。第一组是非肠道材 料并包括甲基纤维素、 乙基纤维素、 羟乙基纤维素、 甲基羟乙基纤维素、 羟丙基纤维素、 羟丙 基甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠、 聚维酮碘 (providone) 和聚乙二醇。第二组由肠道材料组 成， 通常是酞酸酯。
材料混合物可用于提供最佳的薄膜包衣。薄膜包衣可在包衣机 (pancoater) 或流 化床中进行或通过压制包衣实施。
B. 肺部送递形式
在 此 还 考 虑 到 的 是 本 发 明 蛋 白 ( 或 其 衍 生 物 ) 的 肺 部 送 递。 蛋 白 ( 或 衍 生 物 ) 被送递至哺乳动物的肺， 与此同时被吸入并跨越肺上皮被覆层到血流中。肺部送递 的 其 他 报 告 包 括 Adjei 等， Pharma.Res.(1990)7 ： 565-9 ； Adjei 等 (1990)， Internatl. J.Pharmaceutics 63 ： 135-44( 醋 酸 亮 丙 瑞 林 ) ； Braquet 等 (1989)， J.Cardiovasc. Pharmacol.13(suppl.5) ： s.143-146( 内皮缩血管肽 -1) ； Hubbard 等 (1989)， Annals Int. Med.3 ： 206-12(1- 抗 胰 蛋 白 酶 ) ； Smith 等 (1989)， J.Clin.Invest.84 ： 1145-6(1- 蛋 白 酶)； Oswein 等 (March 1990)，″ Aerosolization of Proteins″ Proc.Symp.Resp.Drug Delivery II， Keystone， Colorado( 重组人生长激素 ) ； Debs 等 (1988)， J.Immunol.140 ： 3482-8( 干扰素 - 和肿瘤坏死因子 ) 以及 Platz 等， 美国专利号 5,284,656( 粒细胞集落刺 激因子 )。
考虑用于本发明实施的是各种设计用于治疗产品肺部送递的机械装置， 包括但不 限于喷雾器、 计量吸入器和干粉吸入器， 所有这些装置都是本领域技术人员所熟悉的。 适合 于本发明实施的市售装置的某些具体实例是 Mallinckrodt， Inc.， St.Louis， Missouri 制 造的 Ultravent 喷雾器 ； Marquest Medical Products， Englewood， Colorado 制造的 Acorn II 喷雾器 ； Glaxo Inc.， Research Triangle Park， North Carolina 制造的 Ventolin 计量 吸入器 ； 和 Fi sons Corp.， Bedford， Massachusetts 制造的 Spinhaler 干粉吸入器。
所有这些装置都需要使用适合于分配本发明化合物的制剂。通常， 每种制剂是特 异于所使用的装置的类型， 并且除在治疗中使用的稀释剂、 佐剂和 / 或载体之外可涉及使 用合适的推进剂物质。
为了最有效地送递至远端肺， 本发明的化合物应当最有利地以具有小于 10m( 或微米 )， 最优选 0.5-5m 的平均粒度的颗粒形式制备。
用于肺部送递的药学可接受的载体包括碳水化合物例如海藻糖、 甘露糖醇、 木糖 醇、 蔗糖、 乳糖和山梨糖醇。其他用于制剂中的成分可包括 DPPC、 DOPE、 DSPC 和 DOPC。可使 用天然或合成表面活性剂。可使用 PEG( 甚至除其在衍生蛋白或类似物的应用之外 )。可使 用葡聚糖例如环葡聚糖 (cyclodextran)。 可使用胆盐和其他相关增强剂。 可使用纤维素和 纤维素衍生物。可使用氨基酸， 例如在缓冲液制剂中使用。
同样， 考虑了使用脂质体、 微胶囊或微球体、 包合络合物、 或其他类型的载体。
适用于喷雾器 ( 喷射或超声 ) 的制剂通常包含以约 0.1ulations 的浓度溶解于水 中的本发明的化合物， 可以是喷雾或气溶胶， 其中包含合适的溶剂和任选的其他化合物例 如不限于稳定剂、 抗微生物剂、 抗氧化剂、 pH 调节剂、 表面活性剂、 生物可利用度调节剂和这 些的组合。 用于气溶胶制剂的推进剂可包括压缩空气、 氮气、 二氧化碳或基于烃类的低沸点 溶剂。合宜地， 本发明的一种或更多种化合物以来自喷雾器等的气溶胶喷射形式送递。
D. 肠胃外施用
用于肠胃外施用的可注射的剂型通常包括水混悬液或油混悬液， 其可使用合适的 分散剂或润湿剂和助悬剂进行制备。 可注射的剂型可以溶液相或适合于重配为溶液的粉末 存在。两者都用溶剂或稀释剂来制备。可接受的溶剂或赋形剂包括无菌水、 林格氏溶液或 等渗盐水溶液。或者， 无菌油可用作溶剂或助悬剂。通常， 油或脂肪酸是非挥发性的， 包括 天然或合成油、 脂肪酸、 甘油一酯、 甘油二酯或甘油三酯。 为了注射， 制剂可任选地包含稳定 剂、 pH 调节剂、 表面活性剂、 生物利用度调节剂和这些的组合。化合物可被配制用于通过注 射进行肠胃外施用， 例如通过快速浓注或连续输注。用于注射的单位剂型可处于安瓿或多 剂量容器中。
E. 直肠施用
为了直肠施用， 药物制剂可以栓剂、 软膏剂、 灌肠剂、 片剂或霜剂的形式存在， 用于 将化合物释放入肠、 乙状结肠曲和 / 或直肠中。通过将一种或更多种本发明的化合物、 或该 化合物的药学可接受的盐或互变异构体与可接受的赋形剂混合而制备直肠栓剂， 所述赋形 剂例如可可脂或聚乙二醇， 其在室温下是固相的， 但在适合于释放药物于体内例如于直肠 中的那些温度下则是液相的。如本领域技术人员所熟知的， 多种其他试剂和添加剂可用于 栓剂的制备。
F. 药物制剂和剂量
如下所述， 本发明的制剂可被设计成短效、 快速释放、 长效以及持续释放的制剂。 因此， 药物制剂还可被配制用于控释或缓释。 本发明的组合物还可包含例如胶束或脂质体， 或某些其它包囊的形式， 或可以延长释放的形式施用以提供延长的贮存和 / 或送递效果。 因此， 药物制剂可压制成小丸或圆柱体并可作为贮存注射剂或作为植入物例如支架而肌内 或皮下植入。这样的植入物可使用已知的惰性材料例如聚硅氧烷和生物可降解聚合物。
可取决于受试者的疾病状况、 年龄、 体重、 一般健康状况、 性别和饮食、 服药间隔、 施用途径、 排泄速度和药物组合而调节具体的剂量。任何上述包含有效量的剂型都充分地 落入常规试验的范围内， 并因此充分地落入本发明的范围内。
治疗有效剂量可随施用途径和剂型而改变。通常， 本发明的一种化合物或多种化 合物被选择以提供具有高治疗指数的制剂。治疗指数是毒性和疗效之间的剂量比， 其可表示为 LD50 和 ED50 之间的比。LD50 是对人群的 50％致死的剂量， ED50 是在人群的 50％中治疗 有效的剂量。在动物细胞培养物或实验动物中通过标准的药物程序测定 LD50 和 ED50。
使用修饰的 LCAT 蛋白和 / 或组合物治疗在此描述 LCAT- 介导的疾病和其他病症 的剂量方案是基于多种因素， 包括患者的疾病类型、 年龄、 体重、 性别、 医学状况、 病症的严 重程度、 施用途径和所使用的具体化合物。因此， 剂量方案可广泛改变， 但可使用标准方法 常规确定。对于在此披露的所有使用方法， 约 0.01mg-30mg/ 公斤体重 / 天的数量级， 例如 约 0.1mg-10mg/kg， 或约 0.25mg-1mg/kg 的剂量水平是有效的。一般而言， 每日方案应当在 0.1-1000μg 化合物 /kg 体重的范围内， 优选 0.1-150μg/kg。
1. 口服剂量
为了口服施用， 药物组合物可以例如胶囊剂、 片剂、 悬液或液体的形式存在。药物 组合物可以包含给定量的活性成分的剂量单位的形式制备。 例如， 这些可包含约 1-2000mg， 例如约 1-500mg， 或约 5-150mg， 或 10-100mg 量的活性成分。对于人或其它哺乳动物， 合适 的日剂量取决于患者状况和其它因素可广泛改变， 但是同样可使用常规方法确定。
2. 可注射的剂量
活性成分还可与合适的载体包括盐水、 葡萄糖、 或水作为组合物通过注射施 用。每日肠胃外剂量方案应为约 0.1- 约 30mg/kg 总体重， 例如约 0.1- 约 10mg/kg， 或约 0.25mg-1mg/kg。 3. 局部剂量
适合于局部施用的制剂包括适合于穿透皮肤的液体或半液体制剂 ( 例如擦剂、 洗 剂、 软膏剂、 霜剂或糊剂 ) 以及适合于眼、 耳或鼻施用的滴剂。
本发明化合物的合适的活性成分局部剂量为 0.1mg-150mg， 每日施用 1-4 次， 例如 每日 1-2 次。为了局部施用， 活性成分可占制剂重量的 0.001％ -10％ w/w， 例如 1％ -2％ w/w， 尽管其可包含多达 10 ％ w/w， 但通常不大于 5 ％ w/w。在一个方面中， 浓度为制剂的 0.1％ -1％。
G. 施用方案
组合物的施用可以是全身性或局部的， 并可包含治疗有效量的修饰的 LCAT 蛋白 组合物的单一部位注射或输注。 任何本领域技术人员已知用于本发明的治疗组合物施用的 途径都被考虑到， 包括例如静脉内、 肌内、 皮下或用于长期施用的导管。 或者， 考虑到的是治 疗组合物可在多个部位送递给患者。多重施用可同时施用或可在一段时间内施用。在某些 情况下， 提供治疗组合物的连续流动可能是有益的。附加的治疗可在一段时间的基础上给 予， 例如每日、 每周或每月。在某些实施方案中， 修饰的 LCAT 多肽被局部提供至再灌注部 位。
V. 处理方法
A. 动脉粥样硬化、 心血管病或相关疾病
在一个方面中， 本发明的处理方法是治疗性的， 并且本发明的化合物和组合物被 施用于已患有动脉粥样硬化、 心血管病或相关疾病的受试者。 在另一个方面中， 处理方法是 预防性的， 并且化合物和组合物被施用于那些有发展动脉粥样硬化的风险的受试者。为确 定是否受试者有例如动脉粥样硬化的风险， 可评价致动脉粥样化脂蛋白谱。例如， 5∶1或 更高的血清胆固醇与 HDLs 的比率表明与发展动脉粥样硬化的平均风险相比， 其风险更高。
其它因素包括 240mg/dL 或更高的血清胆固醇水平、 35mg/dL 或更低的 HDL 水平、 190mg/dL 或更高的 LDL 水平， 低于正常值的血浆 LCAT 蛋白水平 ( ＜ 5μg/ml) 和减少的血浆胆固醇 酯化速度 ( ＜ 60nmol/ml/hr)。
能有效减少胆固醇积聚的修饰的 LCAT 蛋白的量取决于几个因素， 包括种类、 施用 方式、 受试者的一般健康、 需要的结果 ( 例如预防或治疗处理 ) 和开处方医师的判断。 例如， 从业者可判定对于心脏病什么样的风险水平指示预防性处理， 以及什么样的修饰的 LCAT 蛋白的靶浓度指示治疗业已患动脉粥样硬化的人。
在人中， 正常的胆固醇酯化速度为约 60nmol/ml/hr- 约 130nmol/mL/hr。 在人中动 脉粥样硬化的有效治疗可包括施用本发明的组合物以达到约 200nmol/ml/hr 的胆固醇酯 化速度。
本发明提供了用于治疗、 预防或控制心血管病的方法。当在本文中使用时， 术语 “心血管病” 指心脏和循环系统的疾病。本发明的组合物用于预防或治疗的心血管病包括但 不限于动脉硬化 ； 动脉粥样硬化 ； 中风 ； 局部缺血 ； 内皮功能障碍， 尤其是那些影响血管弹 性的功能障碍 ； 外周血管病 ； 冠心病 ； 心肌梗塞、 脑梗塞和再狭窄、 血栓形成、 高血压和心绞 痛。在一个方面中， 本发明包括施用本发明的化合物和组合物用于慢性治疗的方法。在另 一个方面中， 本发明考虑了急性治疗。
本发明的组合物用于预防或治疗的其他疾病包括 LCAT 缺陷综合征、 阿尔茨海默 病、 角膜浑浊、 代谢综合征、 血脂异常、 心肌梗塞、 中风、 临界性肢体缺血。
B. 炎性状况
本发明的方法、 化合物和组合物可用于抑制炎性细胞活化。 当在本文中使用时， 术 语 “炎性细胞活化” 意指炎性细胞 ( 包括但不限于单核细胞、 巨噬细胞、 T 淋巴细胞、 B 淋巴 细胞、 粒细胞、 多形核白细胞、 肥大细胞、 嗜碱性细胞、 嗜酸性粒细胞、 树突细胞和内皮细胞 ) 中通过增殖性细胞应答的刺激物 ( 包括但不限于细胞因子、 抗原或自身抗体 ) 的诱导， 可溶 性介质 ( 包括但不限于细胞因子、 氧自由基、 酶、 前列腺素类或血管活性胺 ) 的产生， 或新或 增加数量的介质 ( 包括但不限于主要组织相容性抗原或细胞粘附分子 ) 的细胞表面表达。 本领域技术人员应当理解， 在这些细胞中这些表型中的一种或这些表型的组合的活化可有 助于起动、 维持或加重炎性状况。
本发明的方法、 化合物和组合物用于治疗例如如下的疾病 ： 关节炎疾病 ( 例如类 风湿性关节炎 )， 骨关节炎、 痛风性关节炎， 脊柱炎， 甲状腺相关的眼病， 贝切特病， 脓毒病， 脓毒性休克， 内毒素性休克， 革兰氏阴性脓毒病， 革兰氏阳性脓毒病， 中毒性休克综合征， 哮 喘， 慢性支气管炎， 变应性鼻炎， 变应性结膜炎， 春季结膜炎， 嗜酸性肉芽肿， 成人 ( 急性 ) 呼吸窘迫综合征 (ARDS)， 慢性肺部炎性疾病 ( 例如慢性阻塞性肺病 )， 矽肺， 肺肉样瘤病， 心肌再灌注损伤， 由于微小创伤所致的脑或四肢、 脑或脊髓损伤， 纤维化包括囊性纤维化， 瘢痕疙瘩形成， 疤痕组织形成， 动脉粥样硬化， 自身免疫病例如系统性红斑狼疮 (SLE) 和 移植排斥病症 ( 例如移植物抗宿主 (GvH) 反应和异体移植排斥 )， 慢性肾小球肾炎， 炎性 肠病， 例如克隆氏病和溃疡性结肠炎， 增殖性淋巴细胞疾病， 例如白血病 ( 例如慢性淋巴 细胞白血病 ； CLL)( 参 见 Munoz 等， J.Exp.Med.172 ： 95-103(1990) ； Mentz 等， Blood 88 ： 2172-2182(1996)) 和炎性皮肤病， 例如特应性皮炎、 牛皮癣或荨麻疹。
C. 血栓形成相关状况还考虑到本发明的化合物、 组合物和方法用于治疗多种其中需要预防或治疗血栓 形成以及随后减小或丧失血流的病症。血栓形成病症的实例包括但不限于动脉粥样硬化、 心肌梗塞、 中风和肾缺血以及在哺乳动物身体的任何部位的血栓形成。本发明的组合物还 被用于预防和治疗微血管病， 其中微血栓的形成或 von Willebrand 因子 (VWF) 与血小板的 结合导致血小板和 / 或 VWF 的过量消耗， 引起随后的出血素质。后一病症的实例包括但不 限于血栓性血小板减少性紫癜、 II 型和血小板型血管性血友病 (VWD)。本发明的化合物或 联合治疗方法抑制 VWF- 依赖的血小板粘附和聚集。化合物、 组合物和方法还用于延长哺乳 动物出血时间， 因此在治疗和预防方法中用作抗血栓形成剂。因此， 这些化合物、 组合物和 方法被用作抗凝剂和 / 或抗血小板剂。此外， 本发明提供了用于治疗血栓形成和其他需要 及增加血流量或减少血管阻塞的心血管系统病症的化合物、 组合物和方法。
化合物、 组合物和方法也用于治疗任何目前使用抗凝疗法治疗的病症。这样的病 症包括肺动脉栓塞、 不稳定型心绞痛、 心肌梗塞、 深静脉血栓形成、 具有栓塞的房颤、 急性和 慢性凝血病 ( 弥漫性血管内凝血 )、 用于阻止动脉和心脏外科手术中的凝血、 用于预防和治 疗外周动脉栓塞。化合物、 组合物和方法亦用于治疗血栓性血小板减少性紫癜、 VWF 和血 小板之间的自发相互作用所介导的其他类型微血管病、 其中 VWF 与血小板的结合增加 ( 由 GPIb 或 VWF 缺陷引起的 ) 的血小板型或 IIb 型血管性血友病。在此描述的化合物、 组合物 和方法在输血、 体外循环、 透析操作以及用于实验室操作的取血样中可用作抗血小板剂。 化 合物、 组合物和方法还用于维持留置的静脉穿刺装置的开放， 该装置用于间歇注射或输注 治疗或取血样。化合物、 组合物和方法特别可用于外科操作中阻止血块形成。对于要减少 血栓栓塞并发症的风险的正在进行腹部外科手术的患者， 在置换操作期间或之后的膝或髋 关节置换治疗的患者， 以及在随后阶段一般的预防以阻止血块形成， 这样的适应症是特别 期望的。该化合物、 组合物和方法可进一步用于治疗处于由于严格受限的可动性例如在急 性疾病期间所引起的血栓栓塞并发症风险中的受试者。 任何这样的病症可容易地通过在此 描述的组合物进行治疗。适当时， 治疗方法包括医学治疗和 / 或预防施用。
当在本文中使用时， 术语 “抑制血小板聚集” 包括其通常接受的含义， 其包括阻止、 减缓或减少血小板聚集的严重性或程度。 这样的抑制可作为给定样品凝固所需时间的函数 得以测定。在其他的实施方案中， 血栓形成的动物模型。确定药剂功效的方法包括凝血试 验、 检测出血时间、 测定动物的血红蛋白水平等。
VI. 联合治疗
本发明进一步提供了联合治疗， 其中本发明的化合物和 / 或组合物与一种或更多 种附加药剂一起施用。 一般而言， 在治疗多种病状中治疗方法、 组合物和化合物还可与其他 治疗剂组合使用， 附加药剂与本发明的组合物同时或序贯施用。
A. 细胞因子
用于这样的共同施用的示范性的细胞因子或造血因子包括 IL-1α、 IL-1β、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-11、 集落刺激因子 -1(CSF-1)、 M-CSF、 SCF、 GM-CSF、 粒细胞集 落刺激因子 (G-CSF)、 EPO、 干扰素 -α(IFN-α)、 共有干扰素、 IFN-β、 IFN-γ、 IFN-ω、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-10、 IL-12、 IL-13、 IL-14、 IL-15、 IL-16、 IL-17、 IL-18、 IL-19、 IL-20、 IL-21、 IL-22、 IL-23、 IL-24、 IL-31、 IL-32α、 IL-33、 促血小板生成素 (TPO)、 血管生成素 (angiopoietin) 例 如 Ang-1、 Ang-2、 Ang-4、 Ang-Y、 人 血 管 生 成 素 样 多 肽 ANGPTL1-7、 玻连蛋白、 血管内皮生长因子 (VEGF)、 血管生成素 (angiogenin)、 激活蛋白 A、 激活蛋白 B、 激活蛋白 C、 骨形态发生蛋白 -1、 骨形态发生蛋白 -2、 骨形态发生蛋白 -3、 骨形态发生蛋 白 -4、 骨形态发生蛋白 -5、 骨形态发生蛋白 -6、 骨形态发生蛋白 -7、 骨形态发生蛋白 -8、 骨形态发生蛋白 -9、 骨形态发生蛋白 -10、 骨形态发生蛋白 -11、 骨形态发生蛋白 -12、 骨形态发生蛋白 -13、 骨形态发生蛋白 -14、 骨形态发生蛋白 -15、 骨形态发生蛋白受体 IA、 骨形态发生蛋白受体 IB、 骨形态发生蛋白受体 II， 脑来源的神经营养因子、 心营养素 (cardiotrophin)-1、 睫状神经营养因子、 睫状神经营养因子受体、 cripto、 cryptic、 细胞 因子诱导的中性粒细胞趋化因子 1、 细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子 2α、 细胞因子 诱导的中性粒细胞趋化因子 2β、 β 内皮细胞生长因子、 内皮缩血管肽 1、 表皮生长因子、 epigen、 表皮调节素 (epiregulin)、 上皮来源的中性粒细胞引诱剂、 成纤维细胞生长因子 4、 成纤维细胞生长因子 5、 成纤维细胞生长因子 6、 成纤维细胞生长因子 7、 成纤维细胞生长 因子 8、 成纤维细胞生长因子 8b、 成纤维细胞生长因子 8c、 成纤维细胞生长因子 9、 成纤维细 胞生长因子 10、 成纤维细胞生长因子 11、 成纤维细胞生长因子 12、 成纤维细胞生长因子 13、 成纤维细胞生长因子 16、 成纤维细胞生长因子 17、 成纤维细胞生长因子 19、 成纤维细胞生 长因子 20、 成纤维细胞生长因子 21、 酸性成纤维细胞生长因子、 碱性成纤维细胞生长因子、 神经胶质细胞系来源的神经营养因子受体 α1、 神经胶质细胞系来源的神经营养因子受体 α2、 生长相关蛋白、 生长相关蛋白 α、 生长相关蛋白 β、 生长相关蛋白 γ、 肝素结合表皮生 长因子、 肝细胞生长因子、 肝细胞生长因子受体、 肝细胞瘤来源的生长因子、 胰岛素样生长 因子 I、 胰岛素样生长因子受体、 胰岛素样生长因子 II、 胰岛素样生长因子结合蛋白、 角质 形成细胞生长因子、 白血病抑制因子、 白血病抑制因子受体 α、 神经生长因子、 神经生长因 子受体、 神经生成素 (neuropoietin)、 神经营养蛋白 -3、 神经营养蛋白 -4、 制瘤素 M(OSM)、 胎盘生长因子、 胎盘生长因子 2、 血小板来源的内皮细胞生长因子、 血小板来源的生长因子、 血小板来源的生长因子 A 链、 血小板来源的生长因子 AA、 血小板来源的生长因子 AB、 血小板 来源的生长因子 B 链、 血小板来源的生长因子 BB、 血小板来源的生长因子受体 α、 血小板来 源的生长因子受体 β、 前 -B 细胞生长刺激因子、 干细胞因子 (SCF)、 干细胞因子受体、 TNF， 包括 TNF0、 TNF1、 TNF2、 转化生长因子 α、 转化生长因子 β、 转化生长因子 β1、 转化生长因 子 β1.2、 转化生长因子 β2、 转化生长因子 β3、 转化生长因子 β5、 潜伏转化生长因子 β1、 转化生长因子 β 结合蛋白 I、 转化生长因子 β 结合蛋白 II、 转化生长因子 β 结合蛋白 III、 胸腺间质淋巴细胞生成素 (TSLP)、 肿瘤坏死因子受体 I 型、 肿瘤坏死因子受体 II 型、 尿激酶 型纤溶酶原激活物受体、 血管内皮生长因子以及它们的嵌合蛋白和生物学或免疫学活性片 段。
B. 动脉粥样硬化药物
当用于治疗以及预防动脉粥样硬化或控制胆固醇， 或相关病症例如心血管病时， 额外的活性剂可与修饰的 LCAT 蛋白以互补或协同方式起作用。
在一个方面中， 本发明的化合物可与他汀类一起使用。他汀类是竞争性抑制 3- 羟 基 -3- 甲基戊二酰辅酶 A 还原酶 “HMG-CoA 还原酶” 的药物， 该 HMG-CoA 还原酶是催化胆固醇 生物合成中早期、 限速步骤的酶。Hebert 等， JAMA 1997， 278 ： 313-21。该组合， 除升高 HDL 水平并降低 LDL 水平以外， 还可降低甘油三酯及减缓炎症。据信该组合可具有额外的疗效， 例如， 该组合可降低血压 ； 抗心脏病， 例如通过减少平滑肌增殖， 减少心脏病发作， 减少血小板聚集以及减少中风和外周动脉病 ( 腿部动脉堵塞 )。
本发明的他汀类的实例包括但不限于美伐他汀、 匹伐他汀、 罗舒伐他汀、 喷司 他汀 制 霉 菌 素、 洛伐他汀 氟伐他汀 阿托伐他汀 辛伐他汀 西立伐他汀 普伐他汀或它们的组合。适用于本发明的组合物和方法的他汀类还披露于美国专利号 4,681,893 ； 5,273,995 ； 5,356,896 ； 5,354,772 ； 5,686,104 ； 5,969,156 和 6,126,971 中。 由 于 某 些 他汀类可以无活性形式存在， 例如内酯 ( 如辛伐他汀 )， 因此本发明包含使用它们的活 性形式 ( 例如 b- 羟酸形式 )。参见 Physicians Desk Reference， 54.sup.thEd.(2000) pp.1917-1920。
贝特类或纤维酸 (fibric acid) 衍生物尽管它们的主要作用是减少血清甘油三 酯， 但是它们还倾向于减少 LDL- 胆固醇和增高 HDL- 胆固醇， 因此被视为广谱脂类调节剂。 据信本发明的化合物和贝特类的组合使用可通过加速体内循环的富含甘油三酯的脂蛋白 的化学破坏 ( 即分解代谢 )， 降低具有低 HDL- 胆固醇或具有增高的甘油三酯的人群中冠心 病事件的风险。 贝特类包括但不限于苯扎贝特、 环丙贝特、 非诺贝特、 吉非贝齐、 氯贝丁酯或它们 的组合。 适合于包含在本发明的组合物或在本发明的方法中施用的贝特类披露于美国专利 号 4,895,762 ； 6,074,670 ； 和 6,277,405 中。
用于本发明的组合物和方法中的双胍类包括但不限于二甲双胍、 苯乙二胍、 丁 二胍或它们的组合。适用于本发明的组合物或方法中的双胍类也披露于美国专利号 6,303,146 中。组合使用本发明的化合物和双胍可通过增强肝和肌肉中的胰岛素敏感性改 善血糖控制。该组合可减少或避免心血管危险因素例如血脂异常、 升高的纤溶酶原激活物 抑制剂 1 水平、 其他的纤溶异常、 高胰岛素血症、 胰岛素抗性， 并且是一种有效且安全的用 于治疗 2 型糖尿病的治疗剂。
在另一个方面中， 本发明的化合物可与可增加肌肉中的葡萄糖摄取并减少内源 性葡萄糖产生的格列酮类组合使用。格列酮类包括 5-((4-(2-( 甲基 -2- 吡啶基氨基 ) 乙氧基 )- 苯基 ) 甲基 )-2， 4- 四氢噻唑烷二酮、 曲格列酮、 吡格列酮、 环格列酮、 WAY-120， 744、 恩格列酮、 AD 5075、 达格列酮、 罗格列酮， 它们的组合或药学可接受的盐、 溶剂合物、 包 合物、 多晶型物、 前药或它们的药理学活性代谢物。适合用于本发明的组合物或方法中的 格列酮类披露于美国专利号 4,687,777 ； 5,002,953 ； 5,741,803 ； 5,965,584 ； 6,150,383 ； 6,150,384 ； 6,166,042 ； 6,166,043 ； 6,172,090 ； 6,211,205 ； 6,271,243 ； 6,288,095 ； 6,303,640 ； 和 6,329,404 中。
包含本发明的修饰的 LCAT 蛋白以及磺酰脲或其衍生物的组合物可增加胰岛素由 胰腺的释放， 并可通过降低激素的肝清除而增加胰岛素水平。用于本发明的组合物和方法 的基于磺酰脲的药物包括但不限于格列派特 (glisoxepid)、 格列本脲、 醋酸己脲、 氯磺丙 脲、 格列波脲 (glibomuride)、 甲苯磺丁脲、 妥拉磺脲、 格列吡嗪、 格列齐特、 格列喹酮、 格列 己脲、 苯磺丁脲、 甲磺环己脲， 它们的组合， 或药学可接受的盐、 溶剂合物或包合物。
组 合 的 组 合 物 还 可 包 括 抑 制 CETP 的 药 剂。 这 样 的 药 剂 是 例 如 Torcetrapib 和 S-(2[([1-(2- 乙 基 丁 基 ) 环 己 基 ] 羰 基 ) 氨 基 ] 苯 基 )2- 硫 代 丙 酸 甲 酯 (methylpropanethioate)。
附加的活性剂还包括心血管药。用于与本发明的化合物相结合来预防或治疗心 血管病的心血管药包括外周抗肾上腺药、 中枢作用的抗高血压药 ( 例如甲基多巴、 甲基多 巴 HCl)、 抗高血压直接血管扩张剂 ( 例如二氮嗪、 肼苯哒嗪 HCl)、 影响肾素 - 血管紧张素 系统的药物、 周围血管扩张药、 酚妥拉明、 抗心绞痛药、 强心甙类、 正性肌力 - 血管扩张药 (inodilators)( 例如氨力农、 米力农、 依诺昔酮、 甲硫咪唑酮、 伊马唑旦、 硫马唑 )， 抗心律 失常药、 钙内流阻断剂、 雷尼替丁 (ranitine)、 波生坦和曲格列酮片剂。
取决于所要治疗的病症， 本发明的化合物和组合物在联合治疗与其他实现特定生 物效应的治疗剂一起使用。
1. 降胆固醇药物
多种药物可降低血胆固醇水平。它们可单独或与其他药物组合开处方。某些常 见类型的降胆固醇药物包括他汀类、 树脂和烟酸 ( 尼克酸 )、 吉非贝齐和氯贝丁酯。因此， 联合治疗考虑到使用例如氯贝丁酯 (Atromid-S， 其增高 HDL 胆固醇水平并降低甘油三酯 水平 )， 吉非贝齐 (Lopid， 其增高 HDL 胆固醇水平 )， 烟酸 ( 其通过影响血脂产生而在肝中 起作用并用于降低甘油三酯和 LDL 胆固醇， 以及增高 HDL(“好的” ) 胆固醇 )， 树脂 ( 其 也称为胆汁酸结合药物并通过促进增加胆固醇处理从而在肠中起作用 )， 包括考来烯胺 (Questran， Prevalite， Lo-Cholest)、 考来替泊 (Colestid) 和考来维仑 (WelChol)， 以及他 汀类药物包括阿托伐他汀 (Lipitor)、 氟伐他汀 (Lescol)、 洛伐他汀 (Mevacor)、 普伐他汀 (Pravachol)、 瑞舒伐他汀钙 (Crestor) 和辛伐他汀 (Zocor)。 用于升高 LDL 胆固醇的首选药物是 HMG CoA 还原酶抑制剂， 例如阿托伐他汀、 氟伐 他汀、 洛伐他汀、 普伐他汀、 罗舒伐他汀和辛伐他汀。他汀类药物有效地用于降低 LDL 胆固 醇水平， 具有很少的直接短期副作用， 容易施用， 具有高的患者接受性以及具有很少的药物 间相互作用。
另一类用于降低 LDL 的药物是胆汁酸螯合剂 - 考来维仑、 来烯胺和考来替泊 - 以 及烟酸 ( 尼克酸 )， 其在对照临床试验中已显示能降低冠心病风险。 这两类药物都似乎不存 在严重的副作用。 但两者都可能具有讨厌的副作用并且需要大量的患者教育以实现坚持用 药。烟酸可用于具有超过 250mg/dL 的甘油三酯水平的患者， 因为胆汁酸螯合剂倾向于升高 甘油三酯水平。
2.ACE 抑制剂
血管紧张素 II 导致血管收缩并因此使血管缩窄。血管的缩窄增加了血管中的 压力并可导致高的血压 ( 高血压 )。血管紧张素 II 由血中的血管紧张素 I 通过酶——血 管紧张素转化酶 (ACE) 形成。ACE 抑制剂减少了血管紧张素 II 的产生。结果， 血管扩大 贝那普利 或膨胀， 血压得以降低。在美国可获得的 ACE 抑制剂包括卡托普利 (Capoten)、 (Lotensin)、 依那普利 (Vasotec)、 赖诺普利 (Prinivil， Zestril)、 福辛普利 (Monopril)、 雷米普利 (Altace)、 培哚普利 (Aceon)、 喹那普利 (Accupril)、 莫昔普利 (Univasc) 和群多 普利 (Mavik)。
C. 抗炎药物
在预防和治疗炎症中， 考虑与如下药物进行联合治疗， 例如乙酰水杨酸 (Aspirin， Ecotrin)、 水杨酸胆碱镁 (Trilisate)、 双氯芬酸 (Voltaren、 Cataflam、 Voltaren-XR)、 二 氟尼柳 (Dolobid)、 依托度酸 (Lodine)、 非诺洛芬 (Nalfon)、 氟比洛芬 (Ansaid)、 布洛芬
(Advil、 Motrin、 Medipren、 Nuprin)、 吲哚美辛 (Indocin、 Indocin-SR)、 酮洛芬 (Orudis、 Oruvail)、 甲氯灭酸盐 (Meclomen)、 萘丁美酮 (Relafen)、 萘普生 (Naprosyn、 Naprelan、 Anaprox、 Aleve)、 奥沙普秦 (Daypro)、 苯基丁氮酮 (Butazolidine)、 吡罗昔康 (Feldene)、 双水杨酯 (Disalcid、 Salflex)、 托美丁 (Tolectin)、 伐地考昔 (Bextra) 以及 COX-2 选择 性非甾体抗炎药 (NSAIDs) 包括 Bextra、 西乐葆 (Celebrex)、 萘普生 (Naproxen) 和万络 (Vioxx)。处方 NSAIDs 包括布洛芬 (Brufen)、 醋氯芬酸 (Preservex)、 阿西美辛 (Emflex)、 阿 扎 丙 宗 (Rheumox)、 塞 来 考 昔 (Celebrex)、 右 酮 洛 芬 (Keral)、 环 氟 拉 嗪 (Voltarol、 Diclomax、 Arthrotec)、 二氟尼柳 (Dolobid)、 依托度酸 (Lodine)、 芬布芬 (Lederfen)、 非诺 洛芬 (Fenopron)、 氟比洛芬 (Froben)、 吲哚美辛、 酮洛芬 (Orudis、 Oruvail)、 甲灭酸、 美洛 昔康 (Mobic)、 萘丁美酮 (Relifex)、 美洛昔康 (Naprosyn、 Synflex)、 保泰松 (Butacote)、 吡 罗昔康 (Feldene)、 舒林酸 (Clinoril)、 替诺昔康 (Mobiflex) 和噻洛芬酸 (Surgam)。
D. 抗血栓形成药物
在用于预防和治疗血栓形成相关状况的方法中， 考虑了与抗血栓形成药例如抗 凝药的联合治疗， 该抗凝药抑制血液凝结成块或凝固的能力并包括达肝素 (Fragmin)、 达 那 肝 素 (Orgaran)、 依 诺 肝 素 (Lovenox)、 肝 素 (various)、 亭 扎 肝 素 (Innohep)、 华法林 (Coumadin) 和来匹卢定 (Refludan)， 以及抗血小板药例如阿司匹林、 噻氯匹定 (Ticlid)、 氯吡格雷 (Plavix)、 替罗非班 (Aggrastat) 和依替巴肽 (Integrilin)。其他方法包括使用 比伐卢定 ( 凝血酶的选择性和可逆抑制剂 )、 阿加曲班 ( 凝血酶的可逆抑制剂 ) 和低分子 量肝素 (LMWHs)， 包括依诺肝素 (Lovenox)、 达肝素 (Fragmin)、 阿地肝素钠 (Normiflo)、 磺 达肝素和 idraparinux。其他考虑用于本发明的方法中的抗血栓形成药物包括法安明 ( 达 肝素钠注射液 )， 依诺肝素 ( 依诺肝素钠 )， Normiflo( 阿地肝素钠 )， Orgaran( 达那肝素 钠 )， 间接的 ( 抗凝血酶 - 依赖的 )FXa 抑制剂例如磺达肝素 和 idraparinux， 直 地 美 接 ( 抗凝血酶 - 不依赖的 )FXa 抑制剂例如 BAY 59-7939[Bayer]、 DPC-423[Bristol-Myers Squibb]、 DX-9065a[Daiichi]、 LY517717、 razaxaban(DPC906)， 来匹卢定 西卢定 拉加群和希美加群 应当理解， 本发明的组合物可治疗的病症仅受到病症需要抑制血小板聚集的治 疗干预的事实的限制。对于每一受试者药物剂量可进行更改。对于施用途径和使用的具 体指导， 本领域技术人员可参考用于药剂的制剂、 施用途径和患者监测的概括性描述的医 师案头参考 (Physician ′ sDesk Reference)， 所述药剂例如 AggrastatTM( 参见例如在 1933-1937 页条目， PDR， 第 57 版， 2003)、 AggrenoxTM( 参见例如在 1023-1026 页条目， PDR， 第 TM TM 57 版， 2003)、 Agrylin ( 参见例如在 3142-3143 页条目， PDR， 第 57 版， 2003)、 Flolan ( 参 TM 见例如在 1516-1521 页条目， PDR， 第 57 版， 2003)、 Integrilin ( 参见例如在 2138-2142 TM 页条目， PDR， 第 57 版， 2003)、 Presantine ( 参见例如在 1052-2053 页条目， PDR， 第 57 版， TM TM 2003)、 Plavix ( 参见例如在 1098-1101 页条目， PDR， 第 57 版， 2003)、 Pletal ( 参见例如在 TM 2780-2782 页条目， PDR， 第 57 版， 2003)、 REoPro ( 参见例如在 1866-1870 页条目， PDR， 第 TM TM 57 版， 2003)、 Coumdin ( 参见例如在 1074-1079 页条目， PDR， 第 57 版， 2003)、 Fragmin ( 参 TM 见例如在 2750-2754 页条目， PDR， 第 57 版， 2003)、 Hep-Lock ( 参见例如在 1284-1288 页 TM 条目， PDR， 第 57 版， 2003)、 Lovenox ( 参见例如在 739-744 页条目， PDR， 第 57 版， 2003)、
33比伐卢定阿加曲班101855344 A CN 101855346说明书31/39 页MiradonTM( 参见例如在 3051-3052 页条目， PDR， 第 57 版， 2003)。提供这些 PDR 中的条目以 表明与配制和使用作为抗凝药和抗血小板剂的组合物相关的领域的技术水平。
E. 抗糖尿病药物
还考虑到使用降低血糖水平的抗糖尿病药物的联合治疗。除胰岛素、 依泽那太 (exenatide) 和普兰林肽以外， 抗糖尿病药物口服施用并因此也称为口服降糖剂或口服抗 高血糖剂。抗糖尿病药物分成六类 ： 胰岛素、 磺酰脲类、 α- 葡糖苷酶抑制剂、 双胍类、 氯茴 苯酸类 (meglitinides) 和噻唑烷二酮类。
胰岛素 ( 优泌林 (Humulin)， 诺和灵 (Novolin)) 控制血糖水平。剂型包括低精蛋 白胰岛素 (isophane Insulin) 悬浮液、 胰岛素锌悬浮液， 以及其他延长胰岛素作用持续时 间的制剂。还考虑了使用吸入形式的胰岛素。
磺酰脲类增加胰腺 β 细胞的胰岛素释放， 并包括氯磺丙脲 [Diabinese]、 妥拉磺 脲 [Tolinase]、 格列吡嗪 [ 利糖妥片 (Glucotrol)]、 格列美脲 (Amaryl)、 甲苯磺丁脲 ( 甲 糖宁 (Orinase))、 乙酰苯磺酰环己脲 (Dymelor)、 格列本脲 (Diabeta、 Micronase、 Glynase) 和甲磺吡脲 ( 达美康 (Diamicron))。
α- 葡糖苷酶抑制剂抑制二糖和复杂碳水化合物转化为葡萄糖， 并被用于与磺酰 脲类或其它降糖药的联合治疗中。该类抗糖尿病剂包括阿卡波糖 [Precose] 和米格列醇 [Glyset]。
上述提及的双胍类化合物减少了肝葡萄糖产生， 减少了葡萄糖的肠吸收并增加外 周葡萄糖摄取和利用。
氯茴苯酸类化合物刺激胰岛素产生并可用于与二甲双胍相组合。 该类包括瑞格列 奈 (Prandin) 和那格列奈 ( 唐力 (Starlix))。
噻唑烷二酮类药物减少肝中葡萄糖产生并增加肌细胞的胰岛素依赖性葡萄糖 摄取。这些药剂可与二甲双胍或磺酰脲相组合， 并包括罗格列酮 (Avandia) 和吡格列酮 (Actos).
还考虑到与抗糖尿病肽类似物的联合治疗。这样的类似物包括肠降血糖素， 其 是胰岛素促分泌剂， 包括胰高血糖素样肽 -1(GLP-1) 和肠抑胃肽 ( 也称为葡糖依赖性促 胰岛素肽或 GIP)。GLP-1 和 GIP 都为二肽基肽酶 -4(DPP-4) 所灭活。其他肽包括依泽那 太 (Exenatide)( 也称为 Exendin-4， 作为 Byetta 出售 )， 其是一种 GLP 激动剂并对 DPP-4 降解作用更具抗性 ； 二肽基肽酶 -4(DPP-4) 抑制剂， 其通过抑制二肽基肽酶 -4(DPP-4) 的 降解作用维持 GLP-1 的血液浓度， 这类肽包括 vildagliptin 和 sitagliptin， 以及胰淀素 (amylin) 激动剂类似物， 其减缓胃排空并抑制胰高血糖素， 该类包括普兰林肽。
考虑到在此所包含的教导， 应当理解本发明对特定问题或情况的教导的应用落在 具有本领域普通技术的人员的能力范围之内。本发明的产品和用于它们分离、 使用和制造 的代表性方法的实例呈现于下。
实施例 1
修饰的 LCAT 蛋白的制备
从人肝 cDNA 文库克隆编码野生型人 LCAT 蛋白 (SEQ ID NO ： 1) 的多核苷酸。使用 本领域熟知且常规使用的 Quickchange 定点诱变试剂盒 (Stratagene) 诱变编码野生型人 LCAT 蛋白的 DNA。简言之， 将包含的所设计的突变的引物对掺入新合成的 DNA 分子中。在编码的蛋 白的 C- 末端用编码人 Fc 片段的多核苷酸标记新合成的 LCAT 编码序列。用 Dpn I 核酸内 切酶消化亲本模板。将带切口的含期望突变的载体 DNA 转化入 XL1-Blue 大肠杆菌中。从 转化的大肠杆菌中回收编码突变 LCAT 的质粒。通过 DNA 测序分析证实质粒中突变的存在， 并使用基于 DHFR 的载体组和化学成分确定的培养基将突变的 LCAT-Fc 构建体转染入 CHO 细胞中用于蛋白表达。从转染的 CHO 细胞的培养基中分离重组人 LCAT-Fc(rhLCAT-Fc) 融 合突变蛋白 ( 即修饰的 LCAT 蛋白 )。生产 ( 即发酵 ) 涉及转染的 CHO 细胞在具有分泌到培 养基中的 rhLCAT-Fc 的摇瓶或生物反应器容器中的生长。
Fc- 融合修饰的人 LCAT 蛋白的纯化进行如下。 通常在蛋白生产 4-6 天后收获培养 物， 并对于摇瓶和生物反应器生产分别经离心或中空纤维过滤将粗上清液与细胞相分离。 然后将粗混合物直接加载在 mAbSelectSure 树脂 (GE Biosciences) 上或浓缩 10x-20x 并缓 冲液交换到 20mM 磷酸钠， pH7.2， 300mM NaCl， 0.05％叠氮化物中后， 加载在 mAbSelect Sure 树脂 (GE Biosciences) 上。 然后用相同的高盐磷酸缓冲液洗涤树脂 5-10 次， 并用 300mM 柠 檬酸盐， pH3.4 洗脱结合的蛋白。用 1M Tris 缓冲液， pH8.0 中和洗脱的级分。为了富集蛋 白 A 亲和纯化的物质至大于 90％全长蛋白， 使用了高分辨率疏水相互作用层析 (HIC)。pH 中和的汇集物直接加载在预装填的 Biosuite Phenyl HIC 柱 (Waters) 上， 导致大部分的截 短种类穿过， 而大部分的全长蛋白则附着于柱上。通过至 100％ Milli-Q H2O 的线性梯度 洗脱修饰的 LCAT-Fc 蛋白。通过 N- 末端序列 (NTS) 分析级分的全长 LCAT 的百分比， 并相 应地汇集。然后将 HIC 汇集物浓缩并通过制备大小排阻层析 (SEC) 进一步纯化， 其中使用 了 PBS， pH7.2， 10％甘油， 50μM EDTA 作为流动相。如果需要， 将非聚集的 SEC 产物浓缩至 5mg/mL， 等分并快速冷冻。
实施例 2
筛选修饰的 LCAT 蛋白
LCAT 酶活性
通过测量 3H- 标记的胆固醇 (FC) 到胆固醇酯 (CE) 的转化速度的改变， 测定修饰 的 LCAT 蛋白的活性。在血浆 LCAT 活性测定 (CER) 中， 在 4℃下用痕量放射标记胆固醇平衡 人血浆样品， 并在 37℃下温育后通过薄层色谱 (TLC) 分析测量胆固醇酯化速度 (Dobiasova 和 Frohlich， PhysiolRes.1996 ； 45， 65-73)。
对于使用 apoAI- 脂质体测定法形式测量化合物活性， 在 CHO 细胞中表达修饰的 LCAT 蛋白， 并在无血清培养基中收获从稳定转染的细胞中分泌的酶。使用通过标准的胆酸 盐 - 透析方法 (Chen 等 (1982)J.LipidRes.23 ： 680-691) 制备的 apoAI- 脂质体底物测定培 养基中修饰的 LCAT 酶的活性。最初的混合物包含卵磷脂酰胆碱 (PC)(Sigma)、 /3H- 未酯化 的胆固醇 / 人 apoAI(250 ∶ 12.5 ∶ 0.8 的摩尔比 )。在透析后， 用修饰的 LCAT 蛋白掺入脂 蛋白体。通过测量放射标记的胆固醇到胆固醇酯的转化， 测定 LCAT 活性并以 nmol CE/mL/ 小时表示。除用特异性识别重组蛋白的 Fc 融合片段的标准的蛋白 A- 亲和柱或用特异性识 别重组蛋白的 His 标记的亲和树脂纯化重组 LCAT 蛋白之外， 使用相同的测定法测量以纯化 形式存在的修饰的 LCAT 酶的活性。纯化的样品的 LCAT 活性以 nmolCE/μg/ 小时表示。
示范性的修饰的 LCAT 蛋白的活性范围概括于表 3 中。
表335101855344 A CN 101855346
说明书LCAT 活性 (nmol/h/μg) + ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++33/39 页位置 野生型F1L3L4修饰的 LCAT 蛋白 野生型序列 在第一个氨基酸前添加 Q 在氨基酸 1 和 2 之间添加 P 使用小鼠 κ 链信号肽 使用 IgG1 信号肽 N- 末端人 IgG1Fc- 融合 在 N- 末端添加 FWLLNV 在 N- 末端添加 FWLLNVLFPP 在 C- 末端添加 FWLLNVLFPP F1A F1G F1I F1L F1M F1P F1V F1C F1W F1Y F1T F1S F1Q F1N F1H F1D L3I L3F L3C L3W L3Y L4A L4I L4M L4F L4V L4W L4Y36101855344 A CN 101855346
说L4T L4Q L4R N5A N5M N5M N5H N5K N5D N5E L7M L7F L7E C31A C31I C31M C31F C31V C31C C31W C31Y C31T C31R C31H N384C N384Q E416C F1A-C31Y L4F-C31Y N4E-C31Y N5Q-C31Y N5D-C31Y N5A-C31Y V28A-C31I V28I-C31I V28C-C31I V28T-C31I V28R-C31I P29GC31-I明书34/39 页N5V6L7C31T246N N384 W2-C31 N5-C31 L4-C31 N5-C31++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ +++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++37101855344 A CN 101855346
说P29F-C31I P29T-C31I G30A-C31I G30I-IC31 C21I-L32A IC31-IL32 C31I-L32M C31I-L32F C31I-L32C C31I-L32W C31I-L32Y C31I-L32T C31I-L32S C31I-L32N C31I-L32H C31I-L32E C31I-G33I C31I-G33M C31I-G33F C31I-G33S C31I-G33H C31I-N34A G30A-C31I G30I-IC31 C21I-L32A IC31-IL32 C31I-L32M C31I-L32F C31I-L32C C31I-L32W C31I-L32Y C31I-L32T C31I-L32S C31I-L32N C31I-L32H C31I-L32E C31I-G33I C31I-G33M C31I-G33F明++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ ++ ++ ++38书35/39 页V28-C31P29-C31G30-C31 C31-L32C31-GC31I-G33S ++
C31I-G33H ++
C31-N34 C31I-N34A ++
C31I-N34C ++
C31I-N34S
C31I-N34R++ +++
当在本文中使用时， “+” 是野生型蛋白的活性 ； “++” -LCAT 酶活性在野生型蛋白活 性的 -20％ -+50％范围内 ； “+++” - 如在相同的实验设定中所测定的， LCAT 活性较野生型蛋 白高至少 50％。 “-“指活性低于可检测的水平。
为了测定修饰的 LCAT 蛋白的 N- 末端序列， 较大规模纯化具有较野生型 LCAT 蛋白 高至少 20％酶活性的修饰的 LCAT 蛋白。 对保持完整的 N- 末端序列而无任何截短的修饰的 LCAT 蛋白进行进一步的体内稳定性和功效评价。
修饰的 LCAT 蛋白实体的体内功效和稳定性
在包括小鼠、 仓鼠和兔的动物模型中评价修饰的 LCAT 蛋白分子。体内评价的读数 包括增加血浆 HDL- 胆固醇 (HDL-C) 水平的功效和稳定性 (PK)。用单剂量或多剂量的修饰 的 LCAT 蛋白处理所选择的动物， 在持续最多达 255 小时的时间段中， 从动物分离血浆样品 并进行测定。
如在 HDL-C plus 第 3 代试剂盒， cobas， ( 产品目录号 04713311 190) 手册中所描 述的， 并使用自动分析仪 Roche/Hitachi904/911/912/MODULAR 分析仪 CAN 435， 利用聚乙 二醇 (PGE)- 修饰的酶和硫酸葡聚糖酶促测定 HDL-C。
PK 测定如下。简言之， 用于测定重组 LCAT-Fc 蛋白浓度的测定法是 Amgen 开发的 夹心 ELISA 法。 将小鼠抗 -LCAT 克隆 9B14A12 稀释于磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中， 然后包被在 96- 孔微量滴定板 (Maxisorp， Nunc) 的孔上， 并在 5° ±3℃下温育过夜。用 1X KPL 洗涤缓 冲液洗涤平板 3 次。 将包含溶于 PBS+0.05％ Tween-20(PBST) 中的 10％脱脂奶粉 (NFDM) 的 封闭缓冲液分散到孔中。 在不带搅拌的最短 1 小时室温 (ART) 温育后， 从孔中除去封闭缓冲 液。 接着， 将 LCAT-Fc 测定标准物， 即 NSB， 以及质量控制样品 (QCs)( 其在 100％新西兰白兔 血清中制备并于 PBST+10％ NFDM 中在 50 的稀释因数下预处理 ) 连同也在 PBST+10％ NFDM 中预处理的兔血清样品一起添加到平板中。在带搅拌的 1 小时 ART 温育后， 用 1X KPL 洗涤 缓冲液洗涤平板 6 次， 然后将对人血清蛋白具有最小交叉反应性的辣根过氧化物酶标记的 山羊抗 - 兔 Fc(Jackson ； #111-035-046) 在含 2％混合兔血清的 10％ NFDM 中以 25,000 的 稀释因数稀释， 并添加到孔中用于检测 LCAT-Fc。 在 1 小时带搅拌的 ART 温育后， 洗涤平板并 用 TMB 底物溶液 (1 ∶ 1N- 四甲基联苯胺和过氧化物， Kirkegaard & Perry Laboratories) 显影。在 10 分钟 ART 温育后用 1+9 磷酸 (VWR ； #VW3346-1) 猝灭所产生的比色反应， 并在 450-650nm 的波长下测定光密度 (ODs)。为了 QCs 将 OD 值转化为浓度， 并通过 Watson 软件 介导的与同时分析的标准曲线的比较获得未知样品浓度， 该标准曲线是根据具有加权因子 为 1 的四参数对数模型回归的。
结果显示测试的修饰的 LCAT 蛋白与野生型 LCAT 蛋白相比具有改善的稳定性， 并 且以剂量依赖方式强烈地增加了 HDL。在临床前动脉粥样硬化模型中对在升高血浆 HDL-C 水平中显示功效以及可接受的体内稳定性的修饰的 LCAT 蛋白分子进行进一步的分析。动脉粥样硬化动物模型
该研究涉及使用野生型新西兰白 (NZW) 兔。用致动脉粥样化 ( 高胆固醇 ) 饮食处 理动物 4 个月以诱导动脉粥样硬化， 然后为了消退动脉粥样硬化使用修饰的 LCAT 处理。将 动物分成 4 组用于处理 ： 分别为 a) 赋形剂 ； b) 低 rLCAT 剂量和 c) 高 rLCAT 剂量 ； 以及 d) 不处理但为了斑块损害的基线处死 (terminating) 动物。处理持续时间设定为 8-16 周， 取 决于是否在该过程中发生不良反应。处理结束时评估粥样硬化病变。用于评估动脉粥样硬 化斑块的方法如下。
简言之， 使用戊巴比妥麻醉动物， 然后进行盐水灌注， 接着用低聚甲醛固定。通过 除去所有附着器官和脂肪组织并从远端到近侧撕开从而分离主动脉。 然后将主动脉钉在蜡 板上并用苏丹 IV 染色。光学显微镜照片用于定量斑块损害面积并使用 Image-Pro 软件分 析染色。
实施例 3
具有双突变的重组 LCAT 蛋白
鉴于上述用不同的 LCAT 突变所观察到的活性测量值， 如下所示， 制备多种包含 C31Y 取代和额外的取代的双突变体， 并通过如前所述的将放射性标记的胆固醇 (FC) 转化 为胆固醇酯 (CE) 的能力评价活性。
双突变体与野生型蛋白及单突变体 C31Y LCAT 蛋白相比的结果示于下表 4 中。 当在表 4 中使用时， “-” 指酶活性低于检出水平 ； “+” 显示为野生型 LCAT 蛋白活性 ； “++” 指酶活性在野生型蛋白活性的 -20 ％ -+50 ％范围内 ； “+++” 指活性在野生型蛋白活性的 +100％ -+500％范围内 ； 并且 “++++” 指酶活性大于野生型 LCAT 活性的 +500％。
表4
LCAT 蛋白 野生型 C31Y C31Y， F1S C31Y， F1W C31Y， L4M C31Y， L4K C31Y， N34S C31Y， L32F C31Y， L32HLCAT 活性 (nmol/h/μg) + +++ +++ ++++ ++ + +++ +++ +++40101855344 A CN 101855346说LCAT 蛋白 C31Y， L7N明书38/39 页LCAT 活性 (nmol/h/μg) -
实施例 4 野生型和修饰的 LCAT 蛋白的体内比较 为了与野生型 LCAT 单独地比较， 单独地评估修饰的 LCAT 蛋白的体内活性， 进行如下实验。 在稳定转染的 CHO 细胞中表达重组野生型 LCAT 蛋白和包含 C31Y 取代的修饰的 LCAT。C31Y 修饰的 LCAT 被表达为 Fc 融合蛋白， Fc 运载体来源于人或兔 -IgG。野生型人 蛋白与羧基端组氨酸 (His) 标记一起表达并用特异性结合该标记的亲和珠纯化。使用蛋白 A 亲和珠纯化 C31Y 修饰的 LCAT-Fc 蛋白。两种形式的纯化的 rLCAT 蛋白都溶解于含 PBS pH7.2， 50μM EDTA 和 10％甘油的缓冲液中。
野生型小鼠在研究前饲喂正常食物。 通过静脉注射以 10mg/kg 给动物 (n ＝ 4/ 组 ) 施用单剂量的野生型或修饰的蛋白， 并在随后两周期间的某些时间点收集血样。使用标准 的 ELISA 评价来自每一样品的血清的野生型或修饰的 LCAT 蛋白含量。通过放射性标记的 胆固醇 (FC) 到胆固醇酯 (CE) 的转化评价蛋白活性。使用临床用分析仪测定血浆脂类 - 总 胆固醇 (TC)、 高密度脂蛋白 C(HDL-C) 和甘油三酯。
结果显示分离自 CHO 细胞培养基的野生型 LCAT 蛋白具有 70kD 的分子量和 20nmol CE/hr/μg 的活性。野生型蛋白显示具有小于 30 分钟的半衰期， 以及在施用后 2 小时内血 浆 LCAT 活性增加 30-40％。在整个研究期间没有检测到血浆 HDL-C 水平的改变。
相比之下， 重组人 C31Y 修饰的 LCAT 蛋白分离自宿主细胞培养基， 具有 95kD 的分 子量 ( 单体 ) 并显示 200nmol CE/hr/μg 的活性。施用后该蛋白的半衰期被测定为大约 3 天， 并且在施用后 3 天内， 血浆 LCAT 活性增加最高达 400％。此外， 施用后 24 小时血浆 HDL-C 水平显示大约 3.5 倍增加， 并在回到基线水平前持续约 3 天。
实施例 5
修饰的 LCAT 活性评价
设计实验以评估修饰的 LCAT 蛋白在 LCAT- 敲除小鼠 ( 如在出版物 The Journal of Biological Chemistry， 1997 ； 272 ： 15777-15781 中所描述的产生 LCAT 敲除小鼠 ) 中恢 复 ApoA-I 和 HDL-C 水平的能力。
简言之， 在研究前用正常食物饲喂一组野生型和 LCAT- 敲除小鼠 (n ＝ 4/ 组 )。然 后通过以 10mg/kg 静脉注射修饰的重组人 LCAT 蛋白 [rhLCAT(C31Y)-huFc] 或等体积的赋 形剂缓冲液 (PBS pH7.2， 50μMEDTA， 10％甘油 ) 处理动物。注射后大约 24 小时， 处死动物 并收集血样。从血中分离血清样品。通过使用 apoAI- 脂蛋白体作为底物的放射性标记的 胆固醇 (FC) 到胆固醇酯 (CE) 的转化， 测定血浆 LCAT 活性。通过使用抗小鼠 apoAI 抗体的 蛋白质印迹法测定血浆 apoA-I 蛋白水平。通过临床用分析仪测定血浆脂类 (TC、 HDL-C 和 TG)。
结果显示用修饰的 rhLCAT 蛋白处理增加野生型小鼠中的血浆 LCAT 活性并恢复 LCAT- 敲除小鼠中的血浆 LCAT 活性。 此外， 如使用蛋白质印迹法所测定的， 用修饰的 rhLCAT 蛋白处理， 恢复 LCAT- 敲除小鼠中血浆 apoAI 蛋白水平至大约正常水平 ( 即野生型小鼠水
平 )。此外， 如用临床用分析仪检测所指示的， 用修饰的 rhLCAT 蛋白处理， 恢复 LCAT- 敲除 小鼠中血浆 HDL-C 水平至大约野生型小鼠水平。最后， 同样如所测定的， 用修饰的 rhLCAT 蛋白处理抑制了 LCAT- 敲除小鼠中升高的 TG 水平， 至与使用相同处理的野生型小鼠水平相 同。
实施例 6
修饰的 LCAT 活性的额外的体内评价
在另一系列实验中， 评价体内修饰的 rhLCAT 活性以确定其对兔中 HDL-C 水平的影 响。
简言之， 在研究前用正常食物饲喂新西兰白兔 ( 每只体重约 2kg)。然后将动物随 机分成三组， 每组 (n ＝ 4) 接受赋形剂缓冲液 (PBS pH7.2， 50μM EDTA， 10％甘油 )、 或分别 为 1.0mg/kg 或 10.0mg/kg 剂量的重组兔 LCAT(C31Y)-rab Fc 蛋白处理。在所示的时间点， 收集血样用于分析。从血中分离血清样品。通过使用 apoAI- 脂蛋白体作为底物的放射性 标记的胆固醇 (FC) 到胆固醇酯 (CE) 的转化， 测定血浆 LCAT 活性。通过临床用分析仪测定 血浆脂类 (TC、 HDL-C 和 TG)。来自同一组动物的汇集的血清样品用于 FPLC 分级分离， 通过 临床用分析仪测定每一级分中的胆固醇和 TG 含量。
结果显示用修饰的 rLCAT 蛋白处理以时间和剂量依赖方式快速增加了血浆 LCAT 活性， 并且还同样以时间和剂量依赖方式强烈地增加了血浆 HDL-C 水平。此外， 如用 FPLC 分析所指示的， 修饰的 rLCAT 蛋白以剂量依赖和可逆方式调节 HDL 颗粒， 而不增加血浆 LDL 或 VLDL 水平。
实施例 7
免疫原性研究
为了确定修饰的 LCAT 蛋白序列是否会在人中引发不利的免疫应答， 进行免疫原 性研究。
简言之， 通过计算机辅助 (in silico) 方法评价两种 LCAT 蛋白肽诱导免疫应答的 能力。一种肽长度为 33 个残基， 具有野生型 LCAT 氨基酸序列。另一种肽长度也是 33 个氨 基酸， 但包括野生型 LCAT 序列的 C16Y 修饰， 该 C16Y 突变相应于 C31Y LCAT 序列突变。
结果显示野生型肽诱导低免疫应答。令人惊奇地， 即使突变 C16Y 肽被预测能诱导 较高的免疫应答， 但是发现实际的免疫应答是相当低的。鉴于该结果， 相信当体内施用时， 修饰的 C31Y LCAT 蛋白不太可能诱导抗治疗应答。
结合该实施例和本文其他实施例中的数据显示虽然野生型 LCAT 蛋白较不可能诱 导免疫应答， 但是修饰的 LCAT 蛋白的活性更高， 并且对于修饰的蛋白而言， 诱导免疫应答 的低能力使得该修饰的 LCAT 蛋白成为替代野生型蛋白的非常合乎需要的治疗剂。
尽管为了清楚理解的目的， 通过例示和实例业已相当详细地描述了前述发明， 但 是对于本领域技术人员而言， 应当容易地理解， 考虑到本发明的教导， 可对其进行某些改变 和修饰而不背离所附权利要求的精神或范围。