钙受体活性化合物 本申请是申请日为1995年10月23日，申请号为95197005.4，发明名称为“钙受体活性化合物”的发明专利申请的分案申请。
【发明领域】
本发明涉及能够调控一种或多种无机离子受体活性的化合物的设计、开发、组成及应用。
【发明背景】
体内某些细胞不仅对化学信号，而且对离子(如细胞外钙离子(Ca2+))产生应答。细胞外Ca2+的浓度(本文记作[Ca2+])的变化改变这些细胞的功能性应答。一种这样的特化细胞是分泌甲状旁腺激素(PTH)的甲状旁腺细胞。PTH是调节血液和细胞外液中Ca2+体内平衡的主要内分泌因子。
PTH通过作用于骨和肾细胞，提高血液中Ca2+水平。这种[Ca2+]的提高作用作为负反馈信号，抑制PTH分泌。[Ca2+]和PTH分泌之间的相互关系形成维持体内Ca2+平衡的主要机制。
细胞外Ca2+直接作用于甲状旁腺细胞，调节PTH分泌。已证实存在一种甲状旁腺细胞表面蛋白，该蛋白可以检测[Ca2+]变化。Brown等，自然，366，574，1993。在甲状旁腺细胞中，该蛋白作为细胞外Ca2+的受体(“钙受体”)检测[Ca2+]变化并引发功能性细胞应答，即PTH分泌。
细胞外Ca2+能作用于不同细胞功能，综述见Nemeth等，细胞钙，11，319，1990。关于副滤泡细胞(C细胞)和甲状旁腺细胞中的胞外Ca2+作用的讨论见Nemeth，细胞钙，11，323，1990。这些细胞表达相似的Ca2+受体。Brown等自然，366，574，1993；Mithal等，骨骼和矿物质研究杂志，9增刊1，282页，1994；Rogers等，骨骼和矿物质研究杂志，9增刊1，409页，1994；Garrett等，骨骼和矿物质研究杂志，9增刊1，409页，1994。关于细胞外Ca2+对骨骼破骨细胞的作用的讨论见Zaidi，生物科学报道，10，493，1990。另外，角化细胞、近肾小球细胞、滋养层、胰β细胞和脂肪细胞均对细胞外钙地变化有响应，这可能反映这些细胞的钙受体的活化。
关于不同化合物体外模拟细胞外Ca2+的能力的讨论见Nemeth等(精胺和亚精胺)《健康与疾病中的钙结合蛋白》1987，学术出版公司，33-35页；Brown等(例如新霉素)内分泌学128，3047，1991；Chen等(diltiazem及其类似物TA-3090)骨骼和矿物质研究杂志，5，581，1990；和Zaidi等(Verapamil)，生化和生物物理研究公报167，807，1990。Nemeth等，PCT/US93/01642，国际出版号WO 94/18959，和Nemeth等，PCT/US92/07152，国际出版号WO 93/04373描述了能够调控无机离子对含有无机离子受体的细胞的作用的各种化合物。
发明背景中提供的参考文献不认为是优先技术。
发明概述
本发明描述能调控一种无机离子受体的一种或多种活性的化合物以及通过调控无机离子受体活性来治疗疾病或失调的方法。优选的化合物能模拟或阻遏细胞外钙对细胞表面钙受体的作用。
可通过调控无机离子受体活性来治疗的疾病或失调包括下列一种或多种类型：(1)其特征在于无机离子体内平衡异常，优选的是钙体内平衡异常的疾病或失调；(2)其特征在于细胞外或细胞内信使数量异常的疾病或失调，所述信使的产生受无机离子受体活性，优选的是钙离子受体活性的影响；(3)其特征在于细胞内或细胞外信使的异常作用(例如一种在种类或数量上不同的作用)，但可被无机离子受体活性，优选的是钙受体活性改善的疾患；(4)调控无机离子受体活性，优选的是钙受体活性，可以起到有益作用的其它疾病或失调，例如这样一种疾病或失调，其中受体活性激发一种细胞内或细胞外信使的产生从而补偿另一信使数量异常。其分泌和/或作用受调控无机离子受体活性影响的细胞外信使包括无机离子、激素、神经递质、生长因子和趋化因子等。细胞内信使的例子包括cAMP，cGMP，IP3和甘油二酯。
因此，本发明的化合物优选地调节钙受体活性并用于治疗可受调控钙受体一种或多种活性影响的疾病或失调。钙受体蛋白使某些特化细胞对细胞外Ca2+浓度产生应答。例如，细胞外Ca2+抑制甲状旁腺细胞分泌甲状旁腺激素，抑制破骨细胞对骨的吸收，以及激发C细胞分泌降钙素。
在优选实施方案中，该化合物被用于治疗其特征在于骨骼和矿物质体内平衡异常，更优选的是钙的体内平衡异常的疾病或失调。细胞外Ca2+受到严格的体内平衡控制并控制多种过程，如血凝、神经和肌肉的可兴奋性和正常的骨骼形成。钙体内平衡异常的特征在于一种或多种下列活性：(1)血清钙的异常增减；(2)钙随尿排出量的异常增减；(3)骨骼钙水平的异常增减，用例如骨骼矿物质密度测量得知；(4)食物中钙的异常吸收；(5)影响血清钙水平的信使如甲状旁腺激素和降钙素的产生和/或释放的异常增减；以及(6)由影响血清钙水平的信使引发的应答的异常变化。钙的体内平衡的这些不同方面的异常增减与一般人群中存在的钙的体内平衡的异常增减相关并且通常与疾病或失调相联系。
其特征为钙的体内平衡异常的疾病或失调可能是由不同的细胞缺陷造成的，如钙受体活性缺陷，钙受体的数量缺陷或是钙受体所影响的细胞内蛋白有缺陷。例如在甲状旁腺细胞中，钙受体与Gi蛋白偶联，后者反过来抑制环腺苷酸的产生。Gi蛋白缺陷可以影响某抑制环腺苷酸产生的能力。
因此，本发明的第一个方面涉及一种调控无机离子受体的化合物及其药用盐和复合物，其具有下式：
结构I
其中Ar1是被0至5个取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基独立地选自低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、N(CH3)2、苯基、苯氧基、苄基、苄氧基、α，α-二甲基苄基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙酰基、亚乙二氧基；
Ar2是被0至5个取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基独立地选自低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN和乙酰氧基；
q是0、1、2或3；
R是H或低级烷基。
本发明的化合物具有优选的立体化学性质。结构I中的CH3位于手性中心，并提供α-(R)-甲基结构。若R是CH3，结构I中的R也位于手性中心，并提供(R)-甲基结构。因此若R是CH3，结构I的化合物有(R，R)立体化学性质。
无机离子受体活性是无机离子受体活化引发的过程。这些过程包括可以作为细胞内或细胞外信使的分子的生产。
调控无机离子受体的化合物包括离子模拟物(ionomimetics)、离子裂解物(ionolyics)、钙模拟物和钙裂解物。离子模拟物是结合无机离子受体并模拟(即激发或加强)无机离子在无机离子受体上的作用。优选地，该化合物影响一种或多种钙受体活性。钙模拟物是影响一种或多种钙受体活性并结合钙受体的离子模拟物。
离子裂解物是结合无机离子受体并阻遏(即抑制或减弱)无机离子在无机离子受体上一种或多种活性的化合物。优选地，该化合物影响一种或多种钙受体活性。钙裂解物是阻遏一种或多种细胞外钙引发的钙受体活性并结合钙受体的离子裂解物。
离子模拟物和离子裂解物可以结合与天然无机离子配体结合的相同受体位点或结合另一位点(例如变构位点)。例如NPS R-467结合钙受体，导致钙受体活性，因此NPS R-467属于钙模拟物。但NPS R-467结合钙受体上的位点与细胞外钙结合位点不同(即变构位点)。
计算该化合物的EC50或IC50可量测该化合物的有效性。EC50是产生最大模拟效应的一半的化合物浓度。IC50是产生最大阻遏效应的一半的化合物浓度。钙受体上化合物的EC50和IC50可通过检测钙受体上细胞外钙的一种或多种活性来确定。用于测量EC50和IC50的检测的例子描述见Nemeth等，PCT/US93/01642，国际出版号WO 94/18959，和Nemeth等，PCT/US92/07175，国际出版号WO 93/04373，(两种出版物均在此引入作为参考)以及下文。这种检测包括卵细胞表达试验和测量钙受体活性引起的细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)增加。优选地，这种试验测量与钙受体活性相关的一种特定激素的释放或抑制。
调控无机离子受体的化合物优选地选择性靶向于特定细胞的无机离子受体活性。例如，某一给定浓度的一种化合物对一种细胞类型的钙受体活性的影响远大于对另一细胞类型的钙受体活性的影响，则实现对钙受体活性的选择性靶向。优选地，体内或体外测得差别效应为10倍或更大。更优选地，差别效应在体内测量，化合物浓度以血浆浓度或细胞外液浓度测量，测量的效应是细胞外信使如血浆降钙素、甲状旁腺激素或血浆钙的产生。例如在优选实施方案中，该化合物选择性地靶向于PTH分泌而非降钙素分泌。
优选地，该化合物是钙模拟物或钙裂解物，用下述试验测得，在钙受体上的EC50或IC50小于等于5μM，更优选地小于等于1μM、100nM、10nM或1nM。更优选地，该试验测量用表达人类甲状旁腺钙受体的核酸转化且加载(load)fura-2的HEK293细胞中胞内Ca2+。EC50或IC50更有利，因为这可以在体内或体外用更低浓度的该化合物。EC50和IC50低的化合物的发现使得设计和合成具有类似或改善的效能、有效性和/或选择性的其它化合物成为可能。
本发明另一方面涉及一种调控无机离子受体的化合物及其药用盐和复合物，它具有下式：
结构II
其中Ar3是被0至5个取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基独立地选自低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、苄基、苄氧基、α，α-二甲基苄基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、N(CH3)2、乙基、亚乙二氧基；
Ar4是被0至5个取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基独立地选自低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN和乙酰氧基；
R8是氢或苯基；
R9是氢或甲基；以及
R10是氢、甲基或苯基。
本发明另一方面涉及一种调控无机离子受体的化合物，其具有下式：
结构III
其中Ar5是被0至5个取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基独立地选自低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、苄基、苄氧基，α，α-二甲基苄基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙酰基、亚乙二氧基、-CH＝CH-苯基；
Ar6是被0至5个取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基独立地选自乙酰基、低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、甲酯基、OCH2C(O)C2H5和乙酰氧基；
R11是氢或甲基；以及
R12是氢或甲基。
本发明另一方面涉及一种药物组合物，它由本文描述的调控无机离子受体的化合物和生理可接受载体组成。“药物组合物”指一种以适于对哺乳动物(优选的是人)给药的形式存在的组合物。优选地，药物组合物含有足够量的适当药物形式的调控钙受体的化合物，能够对人起治疗作用。
对适当给药形式的考虑因素在本领域是已知的，包括毒性、可溶性、给药途径和维持活性。例如，注射入血液中的药物组合物应当可溶。
药物组合物也可配制成药用盐类(例如酸加成盐)及其复合物。这类盐的制备物通过改变化合物的物理特性而不妨碍它发挥生理作用而促进其医药应用。
本发明另一方面涉及用本文描述的调控无机离子受体的化合物调控无机离子受体活性来治疗患者的方法。该方法涉及用含有治疗有效量的调控无机离子受体的化合物的药物组合物对患者给药。在优选实施方案中，用治疗有效量的调控钙受体的化合物对患者给药来调控钙受体活性，从而治疗疾病或失调。
调控无机离子受体的化合物及含有该化合物的组合物可用于治疗患者。“患者”指这样一种哺乳动物，其中调控无机离子受体有有益的效应。需要通过调控无机离子受体来治疗的患者可用医学界已知的标准技术来确定。
优选地，患者是患有以下一种或多种特征的疾病或失调的人：(1)无机离子的体内平衡异常，更优选的是钙的体内平衡异常；(2)其生产或分泌受无机离子受体活性，更优选的是钙受体活性影响的信使水平异常；(3)其功能受无机离子受体活性，更优选的是钙受体活性影响的信使的水平或活性异常。
特征为钙的体内平衡异常的疾病包括甲状旁腺机能亢进、骨质疏松和其它骨骼和矿物质相关功能失调等(描述见例如标准医学课本如《Harrison氏内服药原理》)。用模拟或阻遏细胞外Ca2+在钙受体上一种或多种效应的调控钙受体的化合物，直接或间接影响患者体内蛋白质或其它化合物的水平可治疗这些疾病。
“治疗有效量”指在一定程度上缓解患者疾病或失调的一种或多种症状；或将与疾病或失调相关或有因果关系的一种或多种生理或生化参数部分或全部恢复至正常的化合物量。
在优选实施方案中，患者患有特征为一种或多种钙受体调节的组分水平异常的疾病或失调，并且该化合物在选自下列细胞的细胞钙受体上有活性；甲状旁腺细胞、破骨细胞、近肾小球肾细胞、近端肾小管肾细胞、远端肾小管肾细胞、中枢神经系统细胞、外周神经系统细胞、Henle氏环和/或收集管粗上升支的细胞、表皮的角化细胞、甲状腺中副囊泡细胞(C细胞)、肠道细胞、血小板、血管平滑肌细胞、心房细胞、胃泌素分泌细胞、胰高血糖素分泌细胞、肾小球膜细胞、乳腺细胞、β细胞、脂肪细胞、免疫细胞、胃肠道细胞、皮肤细胞、肾上腺细胞、垂体细胞、下丘脑细胞和后穹窿(subfornical)器官的细胞。
更优选地，细胞选自：甲状旁腺细胞、中枢神经系统细胞、外周神经系统细胞、肾Henle氏环和/或收集管的粗上升支的细胞、甲状腺的副囊泡细胞(C细胞)、肠道细胞、胃肠道细胞、垂体细胞、下丘脑细胞和后穹窿器官的细胞。
在优选实施方案中，化合物是作用于甲状旁腺细胞钙受体并且降低患者血清中甲状旁腺激素水平的钙模拟物。更优选地，该水平降至足以使血浆Ca2+减少的程度。最优选地，甲状旁腺激素水平降至正常个体水平。
在另一优选实施方案中，化合物是作用于甲状旁腺细胞钙受体并且提高患者血清中甲状旁腺激素水平的钙裂解物。更优选地，该水平升至足以导致患者骨矿物质密度升高的程度。
用标准医学技术，如血检或尿检可鉴定需要接受这种治疗的患者。例如通过检测其产生或分泌受无机离子浓度变化影响的蛋白质的缺陷。或通过检测影响无机离子体内平衡的无机离子或激素的水平异常。
本申请通篇用到多个实施例。这些实施例决非用于限制本发明。
从下面的附图、发明详述、实施例和权利要求可明显看出本发明的其它特征与优点。
附图简述
图1a-1r给出不同化合物的化学结构。
图2-131给出本文描述的优表性化合物的物理数据。
优选实施方案描述
本发明涉及能够调控一种或多种无机离子受体活性的化合物，优选地，该化合物能模拟或阻遏细胞外离子对具有无机离子受体的细胞的作用，更优选地，该细胞外离子是Ca2+，该效应作用于含钙受体的细胞上。涉及钙活性、钙受体和/或调控钙受体的化合物的出版物包括：Brown等，自然366：574，1993；Nemeth等，PCT/US93/01642，国际出版号WO94/18959；Nemeth等，PCT/US92/07175，国际出版号WO 93/04373；Shoback和Chen，骨骼和矿物质研究杂志，9：293(1994)；以及Racke等，FEBS快报(FEBS Lett.)333：132，(1993)。这些出版物不被认为是本发明的先有技术。
I.钙受体
钙受体存在于不同细胞类型中，可以在不同细胞类型中有不同功能。下列细胞响应钙后的医药效应与钙受体的存在相一致：甲状旁腺细胞、破骨细胞、近肾小球肾细胞、近端肾小管肾细胞、远端肾小管肾细胞、中枢神经系统细胞、外周神经系统细胞、Henle氏环和/或收集管粗上升支的细胞、表皮的角化细胞、甲状腺的副囊泡细胞(C细胞)、肠道细胞、血小板、血管平滑肌细胞、心房细胞、胃泌素分泌细胞、胰高血糖素分泌细胞、肾小球膜细胞、乳腺细胞、β细胞、脂肪细胞、免疫细胞、胃肠道细胞、皮肤细胞、肾上腺细胞、垂体细胞、下丘脑细胞和后穹窿器官的细胞。另外，物理数据证实钙受体也存在于甲状旁腺细胞、中枢神经系统细胞、外周神经系统细胞、肾Henle环和/或收集管粗上升支的细胞、甲状腺的副囊泡细胞(C细胞)、肠道细胞、胃肠道细胞、垂体细胞、下丘脑细胞和后穹窿器官的细胞。
这些不同细胞类型的钙受体可能不同。也可能一种细胞含有不只一种钙受体。比较不同细胞来源的钙受体活性与氨基酸序列显示存在不同的钙受体类型。例如钙受体可应答许多二价和三价阳离子。甲状旁腺钙受体应答钙和Gd3+，而破骨细胞应答二价阳离子如钙，但不应答Gd3+。因此甲状旁腺钙受体与破骨细胞的钙受体在药理上是不同的。
另一方面，编码甲状旁腺细胞和C细胞的钙受体的核酸序列显示这些受体的氨基酸结构相似。然而钙模拟物在甲状旁腺细胞和C细胞上表现不同的药理性质，调节不同活性。因此，尽管钙受体可能有相似或甚至相同的结构。但其药理特性可能依表达它的细胞或器官类型不同而差别显著。
通常钙受体对细胞外Ca2+的亲和性低(表观Kd通常大于0.5mM)。钙受体可能包括一种自由的或结合的效应子机理，其定义见Cooper、Bloom和Roth，《神经药理学的生化基础》，第四章，因此与细胞内钙受体如钙调蛋白和肌钙蛋白不同。
钙受体响应细胞外钙水平的变化。确切的变化依赖特定受体和含有受体的细胞系。例如钙对甲状旁腺细胞上钙受体的体外效应包括：
1.胞内钙增加。这种增加是由于胞外钙的内流和/或胞内钙的募集。胞内钙增加的特征包括：
(a)快速(到达峰值的时间＜5秒)而暂时性的[Ca2+]i增加，对1μM La3+或1μM Gd3+抑制有抗性，用离子霉素预处理(细胞外Ca2+不存在时)后消除；
(b)增加不受二氢吡啶抑制；
(c)暂时性增加被10mM氟化钠预处理10分钟消除；
(d)暂时性增加被蛋白激酶C(PKC)的激活物如佛波醇十四烷酸乙酯(PMA)，欧亚瑞香脂或(-)-吲哚内酰胺V预处理所减小。蛋白激酶C的整体效应是使钙的浓度响应曲线向右移，而不影响最大响应；以及
(e)用百日咳毒素预处理(100ng/ml大于4小时)不影响该增加。
2.肌醇-1，4，5-三磷酸或甘油二酯形成的快速(＜30秒)增加。用百日咳毒素预处理(100ng/ml＞4小时)不影响该增加；
3.抑制多巴胺和异丙基肾上腺素激发的环AMP形成。该效应被百日咳毒素预处理(100ng/ml＞4小时)阻遏；以及
4.抑制PTH分泌。用百日咳毒素预处理(100ng/ml＞4小时)不影响对PTH分泌的抑制。
用本领域已知技术可方便地确定钙对不同细胞中其它钙受体的效应。这些效应在观察到甲状旁腺细胞中胞内钙增加这一点上相似。但这种效应预计在其它方面，例如引起或抑制不是甲状旁腺激素的一种激素的释放上会有不同。
II.调控无机离子受体的化合物
调控无机离子受体的化合物调控一种或多种无机离子受体活性。优选的调控钙受体的化合物是钙模拟物和钙裂解物。通过筛选依据具有特定活性的化合物(即引导化合物)为模型而构建的一些化合物来鉴定调控无机离子受体的化合物。
测量钙受体活性的优选方法是测量[Ca2+]i的变化。可用不同的技术如利用被表达人甲状旁腺钙受体的核酸转导且载有fura-2的HEK293细胞；以及通过测量用编码钙受体的核酸注射的爪蟾卵细胞中Cl-流来测量[Ca2+]i的变化。(见Nemeth等，PCT/US93/01642，国际出版号WO94/18959。)例如，poly(A)+mRNA可得自表达钙受体的细胞，如甲状旁腺细胞、破骨细胞、近肾小球肾细胞、近端肾小管肾细胞、远端肾小管肾细胞、Henle环和/或收集管的粗上升支的细胞、表皮的角化细胞、甲状腺的副囊泡细胞(C细胞)、肠道细胞、中枢神经细胞、外周神经系统细胞、血小板、血管平滑肌细胞、心房细胞、胃泌素分泌细胞、胰高血糖素分泌细胞、肾小球膜细胞、乳腺细胞、β细胞、脂肪细胞、免疫细胞和胃肠道细胞。优选地，核酸来自甲状旁腺细胞，C细胞或破骨细胞。更优选地，核酸编码钙受体并且位于质粒或载体上。
在优选实施方案中，调控钙受体的化合物是钙模拟物，抑制体内破骨细胞对骨的重吸收作用；抑制体外破骨细胞对骨的重吸收作用；激活C细胞体外或体内的降钙素分泌；抑制甲状旁腺细胞体外分泌甲状旁腺激素和降低体内PTH分泌；提高体内降钙素水平；或阻遏破骨细胞体外对骨的重吸收作用以及抑制体内对骨的重吸收作用。
在另一优选实施方案中调控钙受体的化合物是钙裂解物，激发甲状旁腺细胞体外分泌甲状旁腺激素以及提高体内甲状旁腺激素水平。
优选地，该化合物选择性地靶向于特定细胞中无机离子受体活性，更优选的是钙受体活性。“选择性地”指给定浓度的该化合物对一种细胞类型上无机离子受体活性的作用比对另一种细胞类型上无机离子受体活性的作用大。优选地，差别效应为10倍或更大。优选地，浓度指血浆浓度，测量的效应是细胞外信使如血浆降钙素，甲状旁腺激素或血浆钙的生产。例如在优选实施方案中，化合物选择性地靶向于PTH分泌而非降钙素分泌。
在另一优选实施方案中，该化合物在一种或多种，但非全部下列细胞中的EC50和IC50小于等于5μM：甲状旁腺细胞、破骨细胞、近肾小球肾细胞、近端肾小管肾细胞、远端肾小管肾细胞、中枢神经系统细胞、外周神经系统细胞、Henle环和/或收集管粗上升支的细胞、表皮的角化细胞、甲状腺的副囊泡细胞(C细胞)、肠道细胞、血小板、血管平滑肌细胞、心房细胞、胃泌素分泌细胞、胰高血糖素分泌细胞、肾小球膜细胞、乳腺细胞、β细胞、脂肪细胞、免疫细胞、胃肠道细胞、皮肤细胞、肾上腺细胞、垂体细胞、下丘脑细胞和后穹窿器官的细胞。更优选地，细胞选自甲状旁腺细胞、中枢神经系统细胞、外周神经系统细胞、肾中Henle环和/或收集管粗上升支的细胞、甲状腺的副囊泡细胞(C细胞)、肠道细胞、胃肠道细胞、垂体细胞、下丘脑细胞和后穹窿器官的细胞。物理数据如原位杂交和抗体染色已证实该组细胞中存在钙受体。
优选地，调控无机离子受体的化合物模拟或阻遏具有无机离子受体的细胞，细胞外离子的作用，从而具有医疗作用。调控无机离子受体的化合物对具有不同类型无机离子受体形态的细胞可以具有相同或不同的作用(例如，具有正常无机离子受体，正常数量的无机离子受体，异常无机离子受体，异常数量的无机离子受体的细胞)。
调控钙受体的化合物优选地模拟或阻遏细胞外离子在具有钙受体的细胞上的所有作用。但是钙模拟物不具有细胞外Ca2+的所有生物活性。相似地，钙裂解物不能阻遏细胞外钙造成的所有活性。另外不同的钙模拟物和不同的钙裂解物不一定与细胞外Ca2+结合在钙受体上相同的位点来起作用。
无机调控化合物不需要与天然配体以相同程度或完全相同的形式影响无机受体活性。例如同作用于钙受体的钙相比，钙模拟物可以以不同程度，不同持续时间，结合不同的结合位点或具有不同的亲和性来影响钙受体活性。
A.钙模拟物(Calcimimetic)
1.结构I化合物
能够调控钙受体活性的结构I化合物(及其药用盐及复合物)具有下式：
其中Ar1是被0至5个取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基独立地选自低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、N(CH3)2、苯基、苯氧基、苄基、苄氧基、α，α-二甲基苄基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙基、亚乙二氧基、优选地每个取代基独立选自CH3、CH3O、CH3CH2O、亚甲二氧基、Br、Cl、F、Cl、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CF3CH2O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2、CH3CH2、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和乙酰氧基。更优选地，Ar1是具有1-5个取代基的萘基或苯基。各取代物独立地选自：异丙基、CH3O、CH3S、CF3O、I、Cl、F、CF3、CH3、更优选的是CF3O、I、Cl、F、CF3；
Ar2是被0至5个取代基任意取代的萘基或苯基，各取代基独立地选自：低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN和乙酰氧基，优选地每个取代物独立地选自CH3、CH3O、CH3CH2O、亚甲二氧基、Br、Cl、F、I、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CF3CH2O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2、CH3CH2、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和乙酰氧基。更优选地，Ar2是具有1-5个取代基的萘基或苯基，各取代基独立地选自：异丙基、CH3O、CH3S、CF3O、I、Cl、F、CF3和CH3、更优选的是CF3O、I、Cl、F、CH3O和CF3。q是0、1、2或3；且
R是H或CH3。
“低级烷基”指含有1-4个碳，优选的1-3个碳原子的饱和碳氢化合物，可以是直链或支链。
“低级烷氧基”指“O-低级烷基”。其中“O”是连接到低级烷基上的氧。
“低级硫代氧基”指“S-低级烷基”。其中“S”是连接到低级烷基上的硫。
“低级卤代烷基”指被至少一个卤素取代的低级烷基。优选地仅是低级烷基的末端碳被卤素取代并且有1-3个卤素。更优选地，低级卤代烷基含1个碳。优选地，卤素取代物为Cl或F。
“低级卤代烷氧基”指“O-低级卤代烷基”。其中“O”是连接到低级卤代烷基上的氧。
a.Ar1和Ar2均为任意取代的苯基
在优选实施方案中，Ar1和Ar2均为任意取代的苯基且化合物具有下式：
其中R是氢或甲基，
m和n各自独立地是0、1、2、3、4或5；
每个X独立地选自：低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、N(CH3)2、苯基、苯氧基、苄基、苄氧基、α，α-二甲基苄基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙基、亚乙二氧基。优选地每个X独立地选自CH3、CH3O、CH3CH2O、亚甲二氧基、Br、Cl、F、I、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CF3CH2O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2、CH3CH2、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和乙酰氧基。更优选地，每个X独立地选自异丙基、CH3O、CH3S、CF3O、I、Cl、F、CF3和CH3，更优选的是CF3O、I、Cl、F和CF3；
每个Z独立地选自：低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN和乙酰氧基。优选地每个Z独立地选自CH3、CH3O、CH3CH2O、亚甲二氧基、Br、Cl、F、I、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CF3CH2O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、CH3CH2、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和乙酰氧基。更优选地，每个Z独立地选自异丙基、CH3O、CH3S、CF3O、CF3、I、Cl、F和CH3。
在更优选的实施方案中，至少一个Z取代基在间位。更优选地，该化合物具有下式：
其中R是氢或甲基；
m是0、1、2、3、4或5，优选的是1或2；
每个X独立地选自：低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、N(CH3)2、苯基、苯氧基、苄基、苄氧基、α，α-二甲基苄基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙基、亚乙二氧基，优选地每个取代基独立地选自：CH3、CH3O、CH3CH2O、亚甲二氧基、Br、Cl、F、I、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CF3CH2O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2、CH3CH2、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和乙酰氧基。更优选的是异丙基、CH3O、CH3S、CF3O、CF3、I、Cl、F和CH3。
更优选地，该化合物具有下式：
其中R是氢或甲基；
R1是卤素或氢，优选地，R1是F或氢；
R2是氢、卤素、低级烷基、低级卤代烷基、或低级卤代烷氧基、优选地，R2是氢、CF3、CH3、OCF3、或F，而且
R3的氢、卤素或烷氧基，优选地，R3是Cl、F、氢或甲氧基，更优选的是甲氧基。
在可选的更优选的组合中；R1、R2和R3中至少两个是卤素，优选的是F，且R是氢或CH3；R是氢或CH3，R2是低级卤代烷基或低级卤代烷氧基，优选的是OCF3或CF3，且R1和R3是氢；R是CH3，R3是卤素，优选的是Cl，R1是卤素或氢，优选的是F或氢，R2是氢，低级烷基，低级卤代烷基或低级卤代烷氧基，优选的是氢、CF3、CH3、OCF3或F。
b.Ar2是萘基且q是0
另一优选实施方案中，Ar2是萘基，q是0，化合物具有下式：
其中Ar1是被0至5个取代基任意取代的萘基或苯基，每个取代基独立地选自：低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、N(CH3)2、苯基、苯氧基、苄基、苄氧基、α，α-二甲基苄基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙基、亚乙二氧基，优选地每个取代基独立地选自：CH3、CH3O、CH3CH2O、亚甲二氧基、Br、Cl、F、I、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CH3CH2O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2、CH3CH2、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和乙酰氧基。更优选地，Ar1是具有1-5个取代基的萘基或苯基，每个取代基独立地选自：异丙基、CH3O、CH3S、CF3、CF3O、I、Cl、F和CH3。
更优选地，Ar1是任意取代的苯基，化合物具有下式：
其中Xn表示上述任意取代的苯基的任意取代基(优选的取代基和取代基数目的描述见上)。
更优选地，化合物具有下式：
其中R是CH3或氢；
R4是低级烷基、卤素或烷氧基、优选地是异丙基，氯或甲氧基；且
R5是氢，低级烷基或卤素优选的是甲基、CH3、Br或Cl。
c.Ar2是萘基且q是2
在另一优选实施方案中，Ar1是取代苯基，Ar2是萘基，q是2，化合物具有下式：
其中R是氢或CH3；
n是0、1、2、3、4或5，优选的是1或2；
每个X独立地选自低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、N(CH3)2、苯基、苯氧基、苄基、苄氧基、α，α-二甲基苄基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙基、亚乙二氧基、优选地每个取代基独立选自：CH3、CH3O、CH3CH2O、亚甲二氧基、Br、Cl、F、I、CF3、CHF2、CH2F、CF3O、CF3CH2O、CH3S、OH、CH2OH、CONH2、CN、NO2、CH3CH2、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基和乙酰氧基。更优选的是异丙基、CH3O、CH3S、CF3O、CF3、I、Cl、F和CH3。
更优选地，化合物具有下式：
其中R6是氢，低级卤代烷基或低级卤代烷氧基、优选的是氢，OCF3或CF3，且
R7是卤素或氢，优选的是氯或氢。
在另一实施方案中R，R6和R7如上述(带有上述优选取代基)，条件是R和R6均为氢，R7不是Cl；以及R是CH3，R6和R7如上述(带有上述优选取代基)。
2.结构II化合物
结构II化合物具有下式：
其中Ar3是被0至5个取代基任意取代的萘基或苯基，每个取代基独立地选自：低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、苄基、苄氧基、α，α-二甲基苄基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、N(CH3)2、乙基、亚乙二氧基、优选的是N(CH3)2、低级烷氧基或低级烷基；
Ar4是被0至5个取代基任意取代的萘基或苯基，每个取代基独立地选自低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN和乙酰氧基，优选的是低级烷氧基，更优选的是甲氧基；
R8是氢或苯基，优选的是氢；
R9是氢或甲基；
R10是氢、甲基或苯基，更优选地，当R10是甲基时，其连接的手性碳是(R)立体异构体。
优选地，结构II中的α-甲基是(R)-α-甲基。
3.结构III化合物
结构III化合物具有下式：
其中Ar5是被0至5个取代基任意取代的萘基或苯基，每个取代基独立地选自：低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、乙酰氧基、苄基、苄氧基，α，α-二甲基苄基、NO2、CHO、CH3CH(OH)、乙基、亚乙二氧基、-CH＝CH-苯基，优选的是低级烷基、苯氧基、-CH＝CH-苯基、二甲基苄基、甲氧基、亚甲基或亚乙基；
Ar6是被0至5个取代基任意取代的萘基或苯基，每个取代基独立地选自乙基、低级烷基、卤素、低级烷氧基、低级硫代烷基、亚甲二氧基、低级卤代烷基、低级卤代烷氧基、OH、CH2OH、CONH2、CN、甲酯基、OCH2C(O)C2H5和乙酰氧基，优选的是甲氧基、低级烷基、苯基、卤素、CF3、CN、甲酯基或OCH2C(O)C2H5；
R11是氢或甲基；优选地，当R11是甲基时，其连接的碳是(R)立体异构体；且
R12是氢或甲基，优选地当R12是甲基时，其连接的碳是(R)立体异构体。
4.钙模拟物活性
用本领域已知的方法可确定化合物模拟Ca2+在钙受体上的活性的能力，描述见Nemeth等，PCT/US93/01642，国际出版号WO 94/18959。例如在体外甲状旁腺上检测时，钙模拟物具有一种或多种，优选的是全部下述活性：
1.该化合物导致细胞内钙浓度快速(到达峰值的时间＜5秒)瞬时增加，对1μM La3+或1μM Gd3+的抑制有抗性。[Ca2+]i的增加在细胞外Ca2+不存在时仍存在，但被离子霉素预处理(细胞外Ca2+不存在)消除；
2.该化合物加强了受低于最大浓度的细胞外Ca2+诱发的[Ca2+]i增加；
3.细胞外Ca2+诱发的[Ca2+]i增加不受二氢吡啶抑制；
4.该化合物造成的[Ca2+]i暂时性增加不能被10mM氟化钠预处理10分钟所消除；
5.该化合物造成的[Ca2+]i暂时性增加不能被蛋白激酶C(PKC)的激活剂如佛波醇十四乙酯(PMA)，欧亚瑞香脂或(-)-吲哚内酰胺V的预处理所减少。蛋白激酶C激活物的整体效应是使钙的浓度响应曲线向右移，但不影响最大响应；
6.该化合物导致肌醇-1，4，5-三磷酸和/或甘油二酯形成的快速(＜30秒)增加；
7.该化合物抑制多巴胺或异丙基肾上腺素激发的环AMP形成；
8.该化合物抑制PTH分泌；
9.用百日咳毒素预处理(100ng/ml，＞4小时)阻遏该化合物对环AMP形成的抑制效应，但不影响[Ca2+]i，肌醇-1，4，5-三磷酸，或甘油二酯的增加和PTH分泌的减少；
10.该化合物在注射了牛或人甲状旁腺细胞的poly(A)+富集mRNA的爪蟾卵细胞中引发Cl-流增加，但对注射了水或肝mRNA的爪蟾卵细胞无作用；且
11.相似地，使用来自甲状旁腺细胞的克隆的钙受体，该化合物将在注射了编码受体的特定cDNA或mRNA的爪蟾卵细胞中引发应答。
用已知技术可以测量不同的钙活性。(见Nemeth等，PCT/US93/01642，国际出版号WO 94/18959)。模拟Ca2+在钙响应性细胞(优选的是钙受体)上活性的化合物的平行定义由这里提供的实施例以及Nemeth等，PCT/US93/01642，国际出版号WO 94/18959中显而易见。
优选地，用这里描述的生物试验或根据Nemeth等，PCT/US93/01642，国际出版号WO 94/18959测量，该化合物具有一种或多种，更优选的是所有下述活性：引发内源钙的暂时性增加，持续时间小于30秒(优选地通过募集内源钙)；引发[Ca2+]i快速增加，在30秒内发生；引发[Ca2+]i的持续增加(大于30秒)(优选地通过外源钙内流)；引发肌醇-1，4，5-三磷酸或甘油二酯水平增加，优选地小于60秒中发生；以及抑制多巴胺或异丙基肾上腺素激发的环AMP形成。
[Ca2+]i的暂时性增加优选地被10mM氟化钠预处理细胞10分钟消除，或者用蛋白激酶C的激活物，优选的是佛波醇十四烷酸乙酯(PMA)，欧亚瑞香脂或(-)-吲哚内酰胺V短暂预处理细胞(不超过10分钟)所减小。
C.钙裂解物
用根据本发明公开的标准技术可确定该化合物阻遏细胞外钙在钙受体上的活性的能力。(也见Nemeth等，PCT/US93/01642，国际出版号WO 94/18959。)例如对甲状旁腺细胞应用时，阻遏细胞外钙效应的化合物在体外甲状旁腺细胞上受检验时，具有一种或多种，更优选的是全部下述特征：
1.该化合物部分地或完全地阻遏浓度增大的细胞外Ca2+的如下能力：
(a)增大[Ca2+]i，
(b)募集细胞内Ca2+，
(c)增加肌醇-1，4，5-三磷酸形成，
(d)减少多巴胺或异丙基肾上腺素激发的环AMP形成，和
(e)抑制PTH分泌；
2.该化合物阻遏注射了牛或人甲状旁腺细胞的poly(A)+-mRNA的爪蟾卵细胞中受细胞外Ca2+或钙模拟物化合物引发的Cl-流增加，但注射了水或肝mRNA的爪蟾卵细胞中无这种Cl-流增加；
3.相似地，使用来自甲状旁腺细胞的克隆的钙受体，该化合物将阻遏注射了编码受体的cDNA，mRNA或cRNA的爪蟾卵细胞中受细胞外Ca2+或钙模拟物化合物引发的应答。
阻遏钙在钙响应性细胞(优选的是钙受体)上的作用的化合物的平行定义在本文提供的实施例以及Nemeth等，PCT/US93/01642，国际出版号WO 94/18959中显而易见。
III.疾病或失调的治疗
可通过调控钙受体活性来治疗的疾病或失调在本领域已知。例如根据受钙受体活性调节的细胞的功能性应答可以鉴定能通过调控钙受体活性来治疗的疾病或失调。受钙受体调节的细胞的功能性应答在本领域已知，包括甲状旁腺细胞分泌PTH，C细胞分泌降钙素，破骨细胞的重吸收作用。
这样的功能性应答与不同疾病或失调相联系。例如甲状旁腺功能亢进造成的血浆PTH水平升高。降低血浆PTH水平能有效地治疗甲状旁腺功能亢进。类似地，血浆降钙素水平升高与重吸收作用的抑制相联系。抑制骨重吸收作用能有效治疗骨质疏松。因此，钙受体活性的调控可用来治疗如下疾病如甲状旁腺功能亢进和骨质疏松。
调控无机离子受体活性，优选的是钙受体活性的化合物可用来为患一系列疾病或失调的患者带来良好疗效。例如，骨质疏松是与年龄相关的疾病，其特征在于骨质量减少，骨折危险增大。化合物可被用来直接(例如一种破骨细胞离子模拟化合物)或通过增加内源降钙素水平(例如C细胞钙模拟物)间接地阻遏破骨细胞重吸收作用。可选地，对甲状旁腺细胞钙受体有活性的钙裂解物可以升高甲状旁腺激素的循环水平，刺激骨形成。所有这三种方法均会给骨质疏松患者带来良好疗效。
另外已知间断的低剂量PTH可以造成骨质的同化效应及相应的骨重建。因此引发甲状旁腺激素暂时性增加的化合物及剂量方案(例如用甲状旁腺细胞离子裂解物间断给药)能增加骨质疏松患者的骨质。
其它疾病或失调的鉴定可通过鉴定与某种疾病或失调相联系并受钙受体活性调节的其它细胞功能性应答来进行。用类似方法可鉴定能通过调控其它无机离子受体来治疗的疾病或失调。
本发明的调控无机离子受体的化合物可对一种无机离子受体起作用，产生一种或多种细胞效应，最终产生治疗效果。本发明的调控钙受体的化合物能对钙受体起作用，产生一种或多种细胞效应，最终产生治疗效果。本发明通过靶向于含钙受体的细胞可治疗不同的疾病。
例如原发性甲状旁腺机能亢进(HPT的特征是高血钙和循环PTH水平异常升高。与HPT主要类型相联系的缺陷是甲状旁腺细胞对细胞外Ca2+的负反馈调节敏感性降低。因此在原发性HPT患者的组织中，细胞外Ca2+的“调定点”向右移，需要用高于正常浓度的细胞外Ca2+来抑制PTH分泌。而且在原发性HPT中即使高浓度的细胞外Ca2+经常只能部分地抑制PTH分泌。在继发性(尿毒)HPT中尽管Ca2+抑制PTH分泌的程度正常但观察到细胞外Ca2+的调定点类似地变大。PTH分泌的变化与[Ca2+]i的变化相平行：受细胞外Ca2+诱导的[Ca2+]i增加的调定点向右移且这种增加的数量级减小。
继发性HPT患者也可能患肾病性骨营养不良。钙模拟物看来可用于治疗这些患者的异常PTH分泌与骨营养不良。
模拟细胞外Ca2+活性的化合物可用于长时程控制原发性和继发性HPT。这些化合物提供了抑制PTH分泌需要的但高血钙不能独立实现的附加刺激因而有助于缓解高血钙。效率比细胞外Ca2+高的化合物可能克服甲状旁腺瘤造成的在原发性HPT主要形式中特别麻烦的PTH分泌中看中看来不可抑制的成分。可选地或附加的，这些化合物能抑制PTH的合成，而长期高血钙已显示能抑制牛和人腺瘤的甲状旁腺组织中早前期PTH mRNA的水平。长期高血钙还抑制甲状旁腺细胞的体外增殖，故而钙模拟物也能有效限制继发性HPT中甲状旁腺细胞增生性状。
除甲状旁腺细胞的其它细胞能直接对细胞外Ca2+浓度的生理变化应答。例如甲状腺副囊泡细胞(C细胞)的降钙素分泌受细胞外Ca2+浓度变化调节。
分离的破骨细胞响应细胞外Ca2+浓度的增加，相应的[Ca2+]i增加部分地来自细胞内Ca2+的募集。破骨细胞中[Ca2+]i增加与骨吸收作用的抑制相联系。成骨细胞释放碱性磷酸盐直接受钙激发。
肾中近肾小球细胞分泌肾素同PTH分泌一样被细胞外Ca2+浓度增加所抑制。细胞外Ca2+导致这些细胞中细胞内Ca2+的募集。其它肾细胞对钙的应答如下：Ca2+增多抑制近端肾小管细胞的1，25(OH)2-维生素D的形成，激发远端肾小管细胞中钙结合蛋白的生产，抑制Ca2+和Mg2+的肾小管重吸收和血管紧张素对Henle环粗上升支(MTAL)的作用，减弱血管紧张素对皮质收集管细胞的作用并且影响肾小球血管中血管平滑肌细胞。
钙还促进肠道杯状细胞、乳腺细胞和皮肤细胞的分化；抑制心房分泌心房钠尿肽；减少血小板中cAMP聚集；改变胃泌素和胰高血糖素的分泌；作用于血管平滑肌细胞来修饰血管活性因子的细胞分泌；并且影响中枢神经系统和外周神经系统的细胞。
因此有足够证据显示Ca2+除了有广泛的细胞内信号作用，还可作为细胞外信号调节某些特化细胞的应答。本发明的化合物可用于治疗与这些细胞中受破坏的Ca2+应答相联系的疾病或失调。
可以治疗或预防的特定的疾病或失调，根据受影响的细胞，还包括中枢神经系统疾病或失调如癫痫发作，中风，头部外伤，脊髓损伤，低氧诱导的神经细胞损伤如心搏停止或初生苦痛(neonatal distress)，癫痫，退行性神经疾病如老年痴呆症，杭廷顿氏症和帕金森氏症，痴呆，神经紧张，抑郁，焦虑，恐慌，强迫观念与行为失调，外伤后紧张症，精神分裂症，恶性精神抑制综合症，和图雷特氏综合症；涉及肾过度重吸收水的疾病如异常ADH分泌综合症(SIADH)，肝硬变，充血式心力衰竭和肾炎；高血压，预防和/或降低阳离子抗生素(例如氨糖苷抗生素)的肾毒性；消化道运动疾病如腹泻和大肠痉挛；胃肠道溃疡；过度钙吸收引起的胃肠道疾病如肉样瘤病；和自体免疫疾病及器官移植排斥。
虽然本发明的调控钙受体的化合物典型地用于治疗人，但也可用来治疗其它温血动物的相似或相同疾病，如其它灵长类动物，家畜如猪，牛，禽类；及竞技动物和宠物如马，狗和猫。
IV.给药
本发明描述的不同化合物可用于通过调控无机离子受体活性，尤其是钙受体活性来治疗不同病症。本发明的化合物可被配制为用于多种方式给药，如全身和局部或定位给药。技术与制剂一般可参阅《雷明顿氏医药科学》Mack出版公司，Easton，宾州。离子模拟物和离子裂解物的给药的讨论见Nemeth等，PCT/US93/01642，国际出版号WO 94/18959。
适当的剂量形式部分依赖其应用和给药途径，例如口服、透皮或注射。无论靶细胞在多细胞宿主还是在培养物中，这种剂量形式均应使化合物到达靶细胞。例如注射入血流的药物化合物或组合物应当可溶。其它因素在本领域是已知的，包括毒性及阻止化合物或组合物发挥效力的剂量形式等考虑因素。
化合物也可配制成药用盐类(例如酸加成盐)及其复合物。药用盐是在其给药浓度下无毒的盐。这种盐的制备物可改变化合物的物理特性而不妨碍它行使其生理功能，从而方便其药物应用。物理性质的有用变化包括降低熔点以协助跨粘膜给药，增大可溶性来促进药物的高浓度给药。
药用盐包括酸加成盐如含有硫酸盐、盐酸盐、马来酸盐、磷酸盐、磺胺盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基磺胺盐和奎尼酸盐的酸加成盐。(见例如PCT/US92/03736，在此引入作为参考)。药用盐可得自如下酸如盐酸、马来酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己基氨基磺酸和奎尼酸。
药用盐可用标准技术制备。例如，化合物的游离碱形式溶于含适当酸的合适溶剂，如水或水-酒精溶液，再通过蒸发溶液分离。在另一实施例中通过将游离碱与有机溶剂中的酸反应来制备盐。
载体或赋形剂也可用于协助化合物给药。载体和赋形剂的例子包括碳酸钙，磷酸钙，各种糖如乳糖、葡萄糖、或蔗糖或各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和生理相容性溶剂。组合物或药物组合物可用不同途径给药，包括静脉内、腹膜内、皮下和肌肉内，口服，局部或跨粘膜给药。
全身给药的方式优选为口服。可选地可以注射，例如肌肉内、静脉、腹膜内和皮下注射。为进行注射，将本发明化合物配成溶液，优选地用生理相容性缓冲液如Hank’s液或任氏液。另外，化合物可配成固体形式，使用前重新溶解或悬浮。也可制成冰冻干燥形式。
全身给药也可用跨粘膜或透皮方式，或者将化合物口服。对于跨粘膜或透皮给药，在制剂中用与待渗透的屏障相适应的渗透剂。这种渗透剂一般在本领域已知，包括例如用于跨粘膜给药的胆酸盐和梭链孢酸衍生物。另外去污剂可用来协助渗透。跨粘膜给药可用例如鼻腔喷剂或栓剂。对口服给药，化合物可配成常规的口服剂量形式如胶囊，片剂和液体制剂。
对于局部给药，本发明的化合物可配制成油膏、药膏、凝胶或霜剂，这在本领域是已知的。
本发明的各种化合物的给药量用标准操作方法确定。一般来说，治疗有效量是约1纳摩尔至1微摩尔化合物，优选的是0.1纳摩尔和1微摩尔，这依赖其EC50和IC50及患者的年龄与体形及与患者有关的疾病或失调。通常对接受治疗的动物，该剂量在0.1至50mg/kg之间，优选的是0.01至20mg/kg受治疗的动物。
V.实施例
下面提供实施例以阐明本发明的不同方面与实施方案。这些实施例不是用来限制本发明的。
实施例1：从人甲状旁腺瘤克隆人甲状旁腺钙受体
本实施例描述用pBoPCaR1作杂交探针从人甲状旁腺瘤克隆人甲状旁腺钙受体(见Nemeth等，PCT/US93/01642，国际出版号WO94/18959)。在弱严谨条件下用探针交叉杂交鉴定编码人甲状旁腺钙受体的核酸。
从诊断患有原发性甲状旁腺功能亢进的39岁白种男子取出的人甲状旁腺腺瘤制备信使RNA。用pBoPCaR1作杂交探针Northern印迹分析该mRNA鉴定到约5Kb和约4Kb的钙受体转录物。从该mRNA构建cDNA文库。在琼脂糖凝胶上根据大小选择大于3Kbp的双链cDNA，连到克隆载体λZapII中。用pBoPCaR1的5.2Kbp cDNA插入序列作杂交探针筛选50万个初级重组噬菌体。用[32P]-dCTP随机启动合成来标记pBoPCaR1插入序列至比活为1×109cpm/μg。
筛选文库时的杂交严谨性为38℃400mM Na+，50％甲醛。将噬菌斑提升滤膜(plaque lift filter)用浓度为500,000cmp/ml的探针杂交20小时。然后用1×SSC 40℃洗1小时。
通过与pBoPCaR1杂交初次筛选得大约250个阳性克隆。其中7个经过二次筛选和三次筛选分离到与pBoPCaR1探针杂交的单克隆。这7个克隆作限制酶图谱和Southern印迹分析。3个克隆含约5Kbp的cDNA插入序列，看来对应于5Kb mDNA的全长克隆。2个克隆含约4Kbp的cDNA插入序列，看来对应4Kb mRNA的全长克隆。
两个不同大小插入序列的限制酶图谱显示它们在5′端有相似序列区，但其3′端序列不同。DNA序列分析显示小的插入序列可能是由于在大插入序列所用的多聚腺苷化位点上游的可选多聚腺苷化。
两种大小的代表性cDNA插入序列被亚克隆至质粒载体pBluescript8K。线性化后用T7 RNA聚合酶生产的cRNA转录物作体外转录。将cRNA转录物注射入爪蟾卵细胞(150ng/μl RNA；50nl/卵细胞)作功能分析。温育2-4天后检测卵细胞中是否存在有功能的钙受体。加入适当钙受体激动剂激发钙激活的Cl-流，检测到两种克隆类型均有有功能的钙受体。已知的钙受体激动剂，包括NPS R-467和NPS R-568(见Nemeth等，PCT/US93/01642，国际出版号WO 94/18959)，激活卵细胞表达的受体的浓度与激活天然甲状旁腺受体的有效浓度几乎相同。因此两种克隆均编码有功能的人甲状旁腺钙受体。
将每种大小的插入序列亚克隆至pBluescript中制备得质粒pHuPCaR5.2和pHuPCaR4.0。插入序列的核酸序列和氨基酸序列由SEQID NO：1和2给出。
在两种cDNA插入序列的核酸序列中观察到几处不同。两种cDNA插入序列的序列分析显示在3′非翻译区存在至少两段序列差异，这可能由于可选的多聚腺苷化。另外插入序列5′端有序列差异。这些不同序列对应非翻译区，可能是由于有不同的转录起始和/或拼接。
在cDNA克隆pHuPCaR5.2和pHuPCaR4.0(见SEQ.ID.NO.1和2)的编码区中观察到三处附加的序列差异位点，显示这些cDNA克隆编码不同蛋白。人CaR基因序列分析显示cDNA克隆pHuPCaR5.2比pHuPCaR4.0 cDNA克隆多出的30个碱基对来自不同的mRNA拼接。不同mRNA拼接预示在pHuPCaR5.2 cDNA编码的CaR多肽对应于pHuPCaR4.0 cDNA编码的多肽氨基酸#536和#537位点插入10个附加的氨基酸。另外pHuPCaR4.0在氨基酸#925处编码谷酰胺(Gln)，在990位编码甘氨酸(Gly)，而pHuPCaR5.2在两个等价的位点均编码精氨酸(Arg)。人CaR基因在这些位置分别编码Gln和Arg。pHuPCaR4.0cDNA与人DNA的差异看来代表人类群体中真实的序列多态性，而pHuPCaR5.2中单碱基变化可能反映其克隆时的突变。两种cDNA均编码有功能的钙受体，这通过在测量Cl-电导时注射了由这些cDNA克隆制备的cRNA的爪蟾卵细胞均响应细胞外钙可知。不过也可能这两种受体的功能和/或药理上不同。
实施例2.选择表达钙受体的稳定的重组细胞
分离到稳定表达两种人钙受体和牛钙受体的克隆细胞系。钙受体cDNA被亚克隆到两种不同的可购得的表达载体；pMSG(得自Pharmacia)和Cep 4B(得自Invitrogen)中。第一个载体含有黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)的可选择标记基因，稳定转化的细胞可越过添加2μg/ml氨基喋呤和25μg/ml霉酚酸造成的嘌呤生物合成途径屏障。第二个载体编码潮霉素(200μg/ml)抗性基因。用Not I和Hind III限制酶从母体pBluescript质粒中移出HuPCaR5.2和HuPCaR4.0 cDNA(分别为SEQ ID NO：1和2)，然后直接连接到用Not I+Hind III消化的Cep4B中或用DNA聚合酶的Klenow片段处理后平末端连接至Sma I消化的pMSG中。
如上述含HuPCaR5.2插入序列的pMSG亚克隆被转染至CHO细胞中。筛选出20个抗性克隆，然后表征。如上述，含HuPCaR5.2插入序列的Cep4B亚克隆被转染至HEK293细胞中。用潮霉素筛选得到稳定的克隆库。类似地制备表达HuPCaR4.2受体同功型的克隆。
从潮霉素筛选的HEK 293细胞库中得到的细胞用含HuPCaR5.2插入序列的Cep4B转染，再铺到放在12孔组织培养平板各小孔中的胶原包被的AKlar小块上。2-6天后除去培养基，用平衡的盐溶液和1ml含1μMfura2-AM，1mM CaCL2和0.1％BSA，1mM CaCl2的缓冲液洗细胞。37℃下用荧光光度计测量对钙受体激动物应答的荧光，激发和发射波长分别为340nm和510nm。信号标定时加入离子霉素(40μM)确定Fmax，加入0.3M EGTA，2.5M Tris HCl，pH10确定表观Fmin。作为加入下述钙受体激动物：Ca2+(10mM)，Mg2+(20mM)和NPS R-467后的响应，观察到[Ca2+]i活跃增加。表达有功能的物质K受体的对照细胞不对这些钙模拟物化合物进行应答。
得到用pHuPCaR4.0序列转染的HEK 293细胞的另外的克隆分离物。如上述分离净化其对钙模拟物的应答，只是这些细胞在悬液中受试。
实施例3：用加载fura-2的甲状旁腺细胞测量钙受体活性
本小节描述从牛和人得到甲状旁腺细胞以及用甲状旁腺细胞测量钙受体活性的方法。
从附近屠宰场新宰杀的牛(12-15周大)中得到甲状旁腺，装在含(mM)：NaCl，126；KCl，4；MgCl2，1；Na-HEPES，20；pH7.4；葡萄糖，5.6；和可变量的CaCl2(例如1.25mM)的冰冷甲状旁腺细胞缓冲液(PCB)中运至实验室。从由于原发性或尿素性甲状旁腺功能亢进(尿素HPT)接受甲状旁腺组织手术摘除的患者得到人甲状旁腺，与牛组织一样处理。
将腺体除去多余脂肪和结缔组织，再用小剪刀剪成边长约2-3mm的小方块。用胶原酶消化制备解离的甲状旁腺细胞，然后在Percoll缓冲液中离心纯化。得到的甲状旁腺细胞制备物基本不含血红细胞，脂肪细胞，和毛细组织；检验方法是相差显微法和苏丹黑B染色。解离并纯化的甲状旁腺细胞是含5到20个细胞的小簇(cluster)。用锥虫兰或溴乙锭的排除作标示的细胞存活率通常为95％。
虽然此时细胞可用于实验，但还是应当将细胞培养过夜后确定其生理应答(例如PTH分泌的抑制能力和[Ca2+]i的静息水平)。原代培养物还有一个优点，即细胞用放射性同位素可标记至同位素平衡，这对涉及测量肌醇磷酸盐代谢的研究十分必要。
在Percoll梯度纯化后，用1∶1的补充了50μg/ml链霉素，100U/ml青霉素，5μg/ml庆大霉素的Ham’s F12 Dulbecco’s改性Eagle’s培养基(GIBCO)和ITS+混合物洗几次细胞。ITS+是含有胰岛素，转铁蛋白，硒，和牛血清清蛋白(BSA)-亚麻酸的预混的溶液(CollaborativeResearch，Bedford，麻省)。然后将细胞转移至塑料烧瓶(75或150cm2；Falcon)中，37℃在含5％CO2的潮湿空气中温育过夜。在过夜培养物中不添加血清，因为血清会使细胞附在塑料上增殖并脱分化。上述条件下培养的细胞脱水后可以方便地从烧瓶中取出并且与新鲜制备的细胞有相同的存活力。
将纯化的甲状旁腺细胞重悬于含1μM fura-2-乙酰氧基甲酯的1.25mM CaCl2-2％BSA-PSB中，37℃温育20分钟。然后使细胞沉淀，重悬于缺少酯的相同缓冲液中，37℃再温育15分钟。用含0.5BSA和0.5mM CaCl2的PCB洗两次，保存于室温(约20℃)中。使用前将细胞用预热的0.5mM CaCl2-PCB稀释5倍，得到的BSA的终浓度为0.1％。用于荧光记录的小杯中的细胞浓度为1-2×106/ml。
在37℃下用装备了耐热杯架和磁力搅拌器的荧光光度计(Biomedical Instrumentation Group，宾州大学，费城，宾州)测量加载了指示剂的细胞的荧光激发和发射波长分别为340nm和510nm。该荧光显示细胞液中Ca2+水平。用毛地黄皂苷(50μg/ml，终浓度)标定荧光信号以得到最大荧光(Fmax)，用EGTA(10mM，pH8.3，终浓度)得到最小荧光(Fmin)，以及224nm的离解常数。染料泄漏依赖于温度，大多发生在加热小杯中的细胞后前两分钟。此后染料泄漏增加很慢。为了较正对染料泄漏的标定，将细胞置于小杯后搅拌2-3分钟。然后除去细胞悬液，沉淀细胞，将上清放回清洁的小杯中。用毛地黄皂苷和EGTA处理上清，估计染料泄漏的为全部Ca2+依赖性荧光信号的10-15％。从表观Fimn中减去该估计值。
实施例4：用加载Fura-2的HEK 293/pHuPCaR 4.0
细胞测量钙受体活性
本小节描述用加载Fura-2的HEK 293/pHuPCaR 4.0细胞测量钙受体活性的方法。将pHuPCaR 4.0转染的HEK 293细胞在用含5μM fluo-3/AM的20mM HEPES缓冲的Dulbecco’s改性Eagle’s培养基中室温温育1小时，加载上fura-2。然后用含1mM CaCl2和1mM MgCl2的20mM HEPES缓冲的Hank’s平衡的盐溶液洗涤。再将待检验化合物加到细胞中，测量荧光(激发和发射波长分别为340和510nm)。
实施例5：测量化合物调控钙受体活性的能力
用加载fura-2的被编码pHuPCaR 4.0的核酸转染的HEK293细胞或用加载了fura-2的甲状旁腺细胞检测其中[Ca2+]i增加来检测不同化合物调控钙受体活性的能力。不同实验的结果由表1.a，1.b.1，1.b.2，1.c和2总结。表1.a，1.b.1，1.b.2，1.c总结了根据实施例4的描述(即用加载了fura-2的被编码pHuPCaR 4.0的核酸转染的HEK 293细胞)检测的不同浓度的各化合物对钙受体活性的作用。
表2总结了不同实验的结果，其中EC50对加载了fura-2的甲状旁腺细胞或HEK 293/pHuPCaR 4.0计算。细胞如实施例2(对甲状旁腺细胞)或实施例3(对HEK 293/pHuPCaR 4.0细胞)的描述加载fura-2并试验。
表1.a.在表达人钙受体的HEK 293细胞中在3.3ng/ml时产生
超过40％的应答的钙模拟物化合物
化合物代号 4种浓度下的活性百分比
(ng/mL)
3300 330 33 3.3
参照化合物
R-568 95 69 24
17P 101 86 54
17X 105 93 51
24X 126 109 124 109
24Y 119 120 127 102
17J 116 118 122 102
25A 122 120 114 92
17E 116 110 110 92
24Z 138 138 135 90
14S 116 106 105 88
25E 132 129 122 85
17G 125 128 119 77
14T 126 125 117 77
17H 126 124 111 74
14O 119 119 102 74
25I 119 113 114 74
12J 131 130 113 68
化合物代号 4种浓度下的活性百分比
(ng/mL)
3300 330 33 3.3
12I 115 111 93 68
25G 130 115 99 66
9R 108 101 64
12F 118 110 101 63
12O 110 117 94 62
23Z 129 126 100 61
17M 115 99 59
16V 114 102 58
25O 126 115 96 57
25J 119 123 105 56
16L 146 138 98 56
12N 115 106 102 55
16T 97 88 55
25U 107 107 95 55
17P 101 86 54
16Q 110 88 53
23E 137 113 102 53
17C 113 120 99 52
25L 97 97 85 52
8Z 101 97 52
17X 105 93 51
13R 132 98 51
17O 112 96 51
23Q 122 114 98 51
16X 111 96 51
24V 127 98 71 50
13O 115 94 50
17N 108 86 49
21V 122 116 99 48
24M 132 134 99 48
13U 108 79 47
化合物代号 4种浓度下的活性百分比
(ng/mL)
3300 330 33 3.3
24P 140 138 110 46
17Y 109 94 79 46
11X 100 76 45
25H 115 107 89 45
22J 99 71 45
9C 104 82 45
13S 102 87 45
10Q 103 100 84 44
13P 110 83 44
8K 98 81 44
13N 114 88 43
10N 106 97 77 43
12H 114 115 94 43
25P 90 81 75 41
18A 111 88 40
14L 109 78 40
表1.b.1在表达人钙受体的HEK 293细胞中在33ng/ml时产生
超过40％应答的钙模拟物化合物
化合物代号 4种浓度下的活性百分比
(ng/mL)
3300 330 33 3.3
参照化合物
R-568 95 69 24
17P 101 86 54
17X 105 93 51
12C 134 125 98 39
16I 121 117 96 36
化合物代号 4种浓度下的活性百分比
(ng/mL)
3300 330 33 3.3
17D 108 91 38
17F 111 90 28
24C 116 113 87 32
25K 124 107 86 35
13F 125 122 85 38
21F 109 85 36
21S 132 131 85 34
10F 96 84 27
14R 106 107 84 37
13G 111 128 82 29
14Z 118 103 82 20
16N 122 159 82 8
8U 123 129 82 11
23W 117 97 81 25
12G 139 139 81 35
15G 113 80 32
25M 118 100 79 25
13V 110 79 33
14P 112 103 78 30
6T 123 129 78 15
14Q 101 78 35
17L 111 104 78 31
24K 106 78 30
24U 106 106 78 25
25Q 116 95 77 20
8J 104 77 39
23H 121 114 77 28
21C＝4U 134 114 76 17
25F 97 85 76 28
16R 100 76 25
17I 118 97 76 18
化合物代号 4种浓度下的活性百分比
(ng/mL)
3300 330 33 3.3
24J 103 75 31
21O 109 75 37
24G 109 94 75 22
15I 111 93 75 24
21D 104 75 17
20Y 117 95 74 24
10P 102 74 8
23M 113 97 74 26
14Y 109 73 17
17K 98 97 73 37
12E 117 121 73 23
17Z 99 73 37
16W 102 73 4
23K 106 107 72 24
25X 96 94 72 22
13W 109 71 12
23P 125 99 70 22
18B 111 96 69 26
21Y 100 68 36
17W 92 67 13
23A 103 67 24
23G 127 93 67 13
13M 92 66 15
21U 104 104 66 18
21R 100 66 15
10S/10T 86 65 13
17R 98 65 13
13X 102 65 13
4N 100 65 13
21E 94 64 4
15J 80 75 64 13
化合物代号 4种浓度下的活性百分比
(ng/mL)
3300 330 33 3.3
22Y 114 64 28
21G 88 63 18
24L 105 62 10
10V 99 62 8
10W/10X 98 61 9
17B 92 61 19
23Y 106 87 61 16
11Y 103 61 20
表1.b.2在表达人钙受体的HEK 293细胞中在330ng/ml时产生
超过40％的应答的钙模拟物化合物
化合物代号 4种浓度下的活性百分比
(ng/mL)
3300 330 33 3.3
参照化合物
R568 95 69 24
17P 101 86 54
17X 105 93 51
18C 99 87 60 18
23T 102 74 60 31
4V 93 59
8G 84 59 6
23I 102 58 3
21M 102 58 17
24O 137 114 58 8
3U 89 57
9A 82 56 6
12M 98 86 56 11
12B 130 110 56 4
化合物代号 4种浓度下的活性百分比
(ng/mL)
3300 330 33 3.3
21P 92 56 13
8T 85 55 13
10L/10M 99 55 4
24I 109 84 55 11
14N 89 55 15
23R 104 86 54 13
23S 97 53 3
21T 133 112 53 3
10W/10X 81 53 4
13T 90 53 6
6R 94 52 7
20I 87 52 12
24A 122 85 52 9
12D 128 109 52 5
6X 84 52 10
18T 99 74 52 14
21X 119 101 51 2
23J 102 61 51 29
10Z 96 51 5
16Z 88 51 9
23N 96 50 2
16U 85 50 4
11D 96 50 4
23X 94 49 1
17A 88 49 7
20J 80 48 8
22X 86 48 10
23U 87 48 3
9Z 74 48 4
16J 92 76 47 31
25N 94 73 46 8
4P 81 46 8
化合物代号 4种浓度下的活性百分比
(ng/mL)
3300 330 33 3.3
23O 111 79 46 13
13Q 95 46 5
4G 83 46
12Y 80 46 10
12L 88 45 10
23F 82 45 5
11W 81 44 2
8H 88 44 7
25V 89 59 43 26
25W 95 69 42 8
10R 82 42 7
21N 124 98 42 4
8S 73 42 7
8X 75 40 19
13E 123 94 40 2
表1.c.在表达人钙受体的HEK293细胞中在3.3ng/ml时产生
超过40％应答的钙模拟物化合物
化合物代号 4种浓度下的活性百分比
(ng/mL)
3300 330 33 3.3
参照化合物
R568 95 69 24
17P 101 86 54
17X 105 93 51
7X 85
3H 84
3L 81 28
16O 129 81 21 2
8O/8Q 124 80 14 0
化合物代号 4种浓度下的活性百分比
(ng/mL)
3300 330 33 3.3
14A 98 78 10 7
23L 107 77 37 9
1T 76
7W 76
4H 77 37
8D 75
5M 73 21
4U 72
24E 94 71 35 6
16M 130 68 11 4
4M 68 34
2S 67 29
17V 91 66 27 -1
2X 66 15
23D 91 66 35 13
4P 65 32
5B/5C 65 20
3M 64 19
16K 78 62 36 8
5D 62 18
4D 61 13
24B 76 61 34 11
24H 81 60 32 13
5L 60 16
2Y 59 10
5G 58 16
3V 56 14
2Q 56 4
14B 75 55 11 4
13Z 93 54 22 5
8A 54
24D 87 53 34 39
化合物代号 4种浓度下的活性百分比
(ng/mL)
3300 330 33 3.3
1D 53
13I 85 52 3 1
3B 52 15
8C 51
14H 112 49 5 5
7U 49
5E 48 7
13H 88 48 36 12
13Y 106 47 2 4
4J 47 8
14I 80 45 11 7
4B 45 8
3D 45 4
3R 45 2
3A 41 7
14J 55 41 6 5
4I 40 9
表2图1的芳基烷基胺钙模拟物在体外对甲状旁腺细胞钙受体的活性(EC50≤5μM) 化合物代号 (来自图1) EC50 (μM) 化合物代号 (来自图1) EC50 (μM) NPS R-467 2.0 11X 0.83 NPS R-568 0.60 11Y 2.8 3U 0.64 12L 1.7 3V 1.8 12U 1.2 4A 1.4 12V 0.42 4B 2.0 12W 3.2 4C 2.0 12Y 2.0 4D 4.4 12Z 0.11 4G 1.8 13Q ca.0.8 4H ≥3.0 13R 0.25 4J 2.2 13S ＜0.13 4M 2.1 13U 0.19 4N 0.8 13X ＜0.75 4P 1.6 14L 0.26 4R/6V 4.2 14Q 0.47 4S 3.3 14U 0.13 4T/4U 1.6 14V 1.7 4V 2.5 14Y 0.38 4W 2.3 15G ca.0.5 4Y 1.3 16Q 0.04 4Z/5A 4.4 16R 0.36 5B/5C 2.8 16T 0.04 5W/5Y 3.6 16V ＜0.13 6E 2.7 16W 0.59 6F (R，R-) 0.83 16X 0.10 6R 3.4 17M 0.15 6T 2.9 17O 0.04 6X 2.5 17P 0.04 7W 3.2 17R 0.39 7X 1.1 17W 0.43 8D 2.5 17X 0.02 8J 0.78 20F ＜1.0 8K 1.3 20I ＞1.0 8R 2.6 20J ＞3.0 8S 1.7 20R 2.4 8T 1.8 20S 4.2 8U 0.44 21D 3.0 8X 0.76 21F 0.38 8Z 0.40 21G 1.1 9C 0.60 21O 0.26 9D 1.4 21P 0.43 9R 0.25 21Q 1.4 9S 4.8 21R 0.37 10F 0.89 25C ＞2 11D 1.8 25D 0.019
实施例6-17化合物的合成
本文描述的化合物可用标准技术合成，描述见如Nemeth等，PCT/US93/01642，国际出版号WO 94/18959。下面提供的实施例描述了文中涉及的化合物的代表性合成。
化合物9R，14U和17P的合成是通过将购置的醛或酮用伯胺在氰硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠存在下进行还原性胺化制备的。化合物11Y、12H、12K、12M、14S、14T、16L-0、17E、17G、17J、24X、24Y、25A、25E-25K和25O用类似方法制备。
发现在合成这三种化合物(9R，14U和16P)时用三乙酰氧基硼氢化钠得到需要的非对映异构体，其非对映异构选择性大于氰硼氢化钠。富集的混合物进一步用正相HPLC或从有机溶剂中重结晶而被纯化成单个非对映异构体。
化合物8J、8U、11X、17M和25Y是通过将伯胺与醛或酮在异丁氢基钛(IV)存在下缩合制备的。得到的中间体亚胺被氰硼氢化钠，硼氢化钠或三乙酰氧基硼氢化钠作用而被原位(insitu)还原。化合物8U合成用的中间体enamine用二氢氧化钯在碳上催化还原。
化合物12U，12V和12Z用胺与腈的二异丁基铝氢化物(DIBAL-H)介导的缩合反应制备。得到的中间体亚胺被氰硼氢化钠或硼氢化钠原位还原。中间体链烯(化合物12U和12V)在EtOH中用碳上的钯催化氢化。用游离碱与挥发HCl作用得到白色固体，将化合物转化成其盐酸盐。
这些合成中的胺购自Aldrich化学品公司，Milwaukee，WI或Celgene公司，Warren，N.J.或用标准技术合成。所有其它试剂均购自Aldrich化学品公司。
实施例6：化合物25Y的合成
N-(3-(2-苯基)丙基)-1-(1-萘基)乙胺
室温搅拌3-苯基-1-丙胺(135mg，1mmol)，1′-乙酰萘酮(170mg，1mmol)和异丙氧基钛(IV)(355mg，1.3mmol)的混合物1小时。用1M乙醇化氰硼酸钠(1mL)处理产生反应，室温搅拌16小时。用醚稀释反应物再用水处理(0.1mL)。将反应物离心，除去醚层，浓缩成乳状油。一小部分该物质用含0.1％。异丙胺的二氯甲烷至二氯甲烷中含10％甲醇的梯度HPLC(Phenomenex，1.0×25cm，5μM硅石)纯化。用GC/El-MS测得产物(游离碱)是单一组分(Rt＝10.48分)m/Z(相对强度)289(M+，11)，274(63)，184(5)，162(5)，155(100)，141(8)，115(8)，91(45)，77(5)。
实施例7：化合物8J的合成
N-(3-苯基丙基)-1-(3-硫甲基苯基)乙胺盐酸盐
将3′-氨基乙酰苯(2.7g，20mmol)溶于4mL浓缩HCl，4g冰和8mL水中。溶液冷却至0℃，亚硝酸钠(1.45g，21mmol)溶于3-5ml水，加入溶液中超过5分钟，维持温度低于6℃。将硫代甲醇钠(1.75g，25mmol)溶于5mL水，冷却至0℃。将重氮盐加入该溶液超过10分钟，维持温度低于10℃。将反应物搅拌1小时，温度升至与环境相同。反应混合物合成醚和水层。将醚层分离出来，用碳酸钠和氯化钠洗涤，用硫酸钠干燥。醚挥发后得到74％产率的3′-硫甲基乙酰苯。减压蒸馏纯化粗提物质。
3-苯基丙胺(0.13g，1mmol)，3′-硫甲基乙酰苯(0.17g，1mmol)和异丙醇钛(IV)(0.36g，1.25mol)混合放置4小时。加入乙醇(1mL)和氰硼氢化钠，将反应物搅拌过夜。加入4ml和200μL水引发反应。将混合物旋涡振荡，然后离心分离出固体。醚层从沉淀物中分开，真空除去溶剂。油重新溶于二氯甲烷，用制备型TLC在硅胶上纯化化合物，用3％甲醇/二氯甲烷洗脱得到纯油质的标题化合物：GC/EI-MS(Rt＝7.64分钟)m/Z(相对强度)285(M+，18)，270(90)，180(17)，151(100)，136(32)，104(17)，91(54)，77(13)。
实施例8：化合物8U的合成
N-3-(2-甲氧苯基)-1-丙基-(R)-3-甲氧基-α-甲基苄胺盐酸盐
室温下搅拌(R)-(+)-3-甲氧基-α-甲基苄胺(3.02g，20mmol)，2-甲氧基肉桂醛(3.24g，20mmol)和异丙醇钛(IV)(8.53g，30mmol，1.5Eq.)的混合物2小时，用1M(20mL)乙醇化氰硼氢化钠处理。将反应物搅拌过夜(16小时)，用二乙醚稀释，再用水(1.44mL，80mmol，4Eq.)处理。混合1小时后，将反应混合物离心，去除醚层，浓缩成油。将该物质重溶于冰醋酸，加氢氧化钯摇动，再在室温下60磅氢中氢化。过滤除去催化剂，将得到的溶液浓缩成稠油。该物质重溶于二氯甲烷，用1NNaOH中和。从水相中分离出二氯甲烷溶液，通过无水碳酸钾干燥，浓缩成油。将该物质重溶于醚，用二乙醚中的1M HCl处理。收集得到的沉淀物，用二乙醚清洗，在空气中干燥。该物质(游离碱的GC/EI-MS(Rt＝9.69分钟)显示出单一组分：m/Z(相对强度)299(M+，21)，284(100)，164(17)，150(8)，135(81)，121(40)，102(17)，91(43)，77(18)。
实施例9：化合物9R的合成
(R)-N-(1-(2-萘基)乙基)-(R)-1-(1-萘基)乙胺盐酸盐
(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(10.0g，58mmol)，2′-乙酰萘(9.4g，56mmol)，异丙醇钛(IV)(20.7g，730mmol)和EtOH(无水)(100mL)加热至60℃3小时。然后加入氰硼氢化钠(NaCNBH3)(3.67g，58.4mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。将醚(1L)和H2O(10mL)加入反应混合物，离心除去得到的沉淀。上清在真空下蒸发，用热己烷将粗产品重结晶4次，得到1.5g纯(98+％)非对映异构体。将游离碱溶于己烷，过滤，加入发烟HCl，沉淀产物为白色固体(1.1g，6％产率)，熔点：200-240℃软化(dec.)。
实施例10：化合物11X的合成
N-(4-异丙基苯基)-(R)-1-(1-萘基)乙胺盐酸盐
(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(1.06g，6.2mmol)，4-异丙基苯甲醛(0.92g，6.2mmol)和异丙醇钛(IV)(2.2g，7.7mmol)的混合物加热至100℃5分钟，然后在室温下搅拌4小时。加入氰硼氢化钠(NaCNBH3)(0.39g，6.2mmol)，再加EtOH(1mL)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。将醚(100mL)和H2O(1mL)加入反应混合物中，离心除去得到的沉淀。上清在真空下蒸发，粗提产品在硅胶上层析(50mm×30cm柱)(用1％MeOH(CHCl3)洗脱)，层析后的物质重溶于己烷，加入发烟HCl，沉淀产物为白色固体(0.67g，35％产率)，熔点：257-259℃。
实施例11：化合物12U的合成
N-3-(2-甲基苯基)-1-丙基-(R)-3-甲氧基-α-甲基苄胺盐酸盐
将2-甲基肉桂腈(1.43g，10mmol)在二氯甲烷中(10mL)的溶液冷却至0℃，滴加(15分钟)1M二异丁基铝氢化物(10mL，二氯甲烷)处理。将反应物在0℃下搅拌15分钟，滴加(15分钟)二氯甲烷(10mL)中1M(R)-(+)-3-甲氧基-α-甲基苄胺(1.51g，10mmol)处理。将反应物在0℃下搅拌1小时，倒入含氰硼氢化钠(1g，16mmol)的乙醇(100mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌48小时。反应物用醚稀释，用1N NaOH中和。移去醚层，用无水碳酸钾干燥，浓缩成油。该物质在硅石上用二氯甲烷至二氯甲烷中含5％甲醇的梯度层析。得到不饱和中间体，GC/El-MS(Rt＝10.06分钟)为单一组分。m/Z(相对强度)281(M+，17)，266(59)，176(19)，146(65)，135(73)，131(100)，91(21)，77(13)。
将乙醇化的不饱和中间体在碳披钯存在时在室温下氢化16小时。将该反应的产物用二乙醚中的1M HCl处理，转化成盐酸盐。该物质的GC/El-MS(Rt＝9.31分钟)显示出单一组分：m/Z(相对强度)283(M+，21)，268(100)，164(12)，148(8)，135(85)，121(12)，105(49)，91(23)，77(21)。
实施例12：化合物12V的合成
N-3-(3-甲基苯基)-1-丙基-(R)-3-甲氧基-α-甲基苄胺盐酸盐
该化合物的制备按照实施例11的方法进行，但用的是2-甲基肉桂腈。不饱和中间体用GC/EI-MS(Rt＝10.21分钟)为单一组分：m/Z(相对强度)281(M+，57)，266(86)，146(98)，135(88)，131(100)，115(43)，102(26)，91(43)，77(18)。用实施例11的方法还原该物质并形成盐酸盐，得到产物。该物质(游离碱)的GC/EI-MS(Rt＝9.18分钟)显示为单一组分：m/Z(相对强度)283(M+，19)，268(100)，164(11)，148(8)，135(76)，121(16)，105(45)，91(23)，77(21)。
实施例13：化合物12Z的合成
N-3-(2-氯苯基)-1-丙基-(R)-1-(1-萘基)乙胺盐酸盐
该化合物的制备按照实施例11的方法进行，但用的是10mmol量级的2-氯氢化肉桂腈和(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺。用二氯甲烷至二氯甲烷中含5％甲醇的梯度通过硅石进行层析，得到产物，TLC分析(二氯甲烷中含5％甲醇)为单一组分。用二乙醚中1M HCl处理制备得盐酸盐。
实施例14：化合物14U的合成
(R)-N-(1-(4-甲氧基苯基)乙基)-(R)-1-(1-萘基)乙胺盐酸盐
(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(1.1g，6.2mmol)，4′-甲氧基乙酰苯(0.93g，6.2mmol)，异丙醇钛(IV)(2.2g，7.7mmol)和EtOH(无水的)(1mL)的混合物加热至60℃3小时。然后加入氰硼氢化钠(NaCNBH3)(0.39g，6.2mmol)，将反应混合物在室温下搅拌18小时。将醚(200mL)和H2O(2mL)加入反应混合物中，离心除去得到的沉淀。将上清在真空下蒸发，粗提产品在硅胶上层析(25mm×25cm柱)(用1％MeOH/CHCl3洗脱)。将该物质的一部分用HPLC层析[Selectosil，5μM硅胶；25cm×10.0mm(Torrence，加州)，4mL每分钟；UV检测275nM；12％乙酸乙酯-88％己烷(洗脱时间12.0分钟)]。HPLC纯化的非对映异构体再溶入己烷中，加入发烟HCl，沉淀产物为白色固体(20mg)，熔点：209-210℃(dec.)。
实施例15：化合物17M的制备
N-(3-氯-4-甲氧基苄基)-(R)-1-(1-萘基)乙胺盐酸盐
(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(6.6g，39mmol)，3′-氯-4′-甲氧基苯甲醛(16.6g，39mmol)，和异丙醇钛(IV)(13.8g，48.8mmol)和EtOH(无水)(30mL)的混合物加热至80℃30分钟，然后在室温下搅拌3小时。再加入氰硼氢化钠(NaCNBH3)(2.45g，39mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。将醚(100mL)和H2O(2mL)加入反应混合物，离心除去得到的沉淀。上清在真空下蒸发，粗提产品在硅胶上层析(50mm×30cm柱)(用CH2Cl2洗脱)。层析的物质再溶于己烷(500mL)，用Norit@过滤(0.2μM)脱色，然后加发烟HCl，沉淀产物为白色固体(10.2g，56％产率)，熔点：241-242℃(dec.)。
实施例16：化合物17P的合成
4-甲氧基-3-甲基乙酰苯[17P前体]
4′-羟基-3′-甲基乙酰苯(5.0g，33.3mmol)，碘甲烷(5.7g，40.0mmol)，K2CO3(颗粒状，无水)(23.0g，167mmol)和丙酮(250mL)的混合物回流3小时。将反应混合物冷却至室温，过滤除去无机盐，真空下蒸发，粗提产品溶于醚(100mL)，用H2O(2×20mL)洗。将有机相干燥(Na2SO4)后蒸发得4.5g，82.4％产率。该酮用于下述反应，不需进一步纯化。
(R)-N-(1-(4-甲氧基-3-甲基苯基)乙基)-(R)-1-(1-萘基)乙胺盐酸盐[化合物17P]
(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(4.24g，24.8mmol)，4′-甲氧基-3′-甲基乙酰苯(4.06g，24.8mmol)，异丙醇钛(IV)(8.8g，30.9mmol)和EtOH(无水)(1mL)的混合物加热至100℃2小时。加入异丙醇(45mL)，将反应物冰浴冷却至10℃。然后分若干部分加入三乙酰氧硼氢化钠(NaHB(O2CCH3)3)(10.5g，49.5mmol)共15分钟。再将反应混合物加热至70℃18小时。将混合物冷却至室温，加入醚(400mL)。离心悬浮液，收集上清，用醚(400mL)洗涤沉淀物。混合的有机洗涤液在真空下蒸发。残余物重溶入醚(400mL)中，用1N NaOH(4×50mL)和H2O(2×50mL)洗涤。将有机层干燥(Na2SO4)，过滤，真空蒸发。将EtOH(无水)加入湿的残余物中，然后旋转蒸发器彻底干燥得到油状物。将混合物在硅胶上层析(50mm×30cm)[用(1％MeOH：1％IPA：CHCl3洗脱)。得48g油]。
所需的非对映异构体进一步用HPLC层析纯化[SUPELCOSILTM PLC-S：，18μM硅胶；25cm×21.2mm(Supelco，Inc.Bellefonte，宾州)，7mL每分钟；UV检测275nM；20％EtOAc-80％己烷(洗脱时间9.5-11.0分钟；UV检测275nM；20％EtOAc-80％己烷(洗脱时间9.5-11.0分钟)]。该混合物(洗脱剂中100mg/mL溶液)的注射(800μL等分试样)给出65mg所需异构体。多次HPLC注射得到1.0g纯化物质。HPLC层析的物质溶于己烷(50mL)，用发烟HCl沉淀得到盐酸盐。用烧结玻璃收集该盐，用己烷洗涤，得到1.0g白色固体，熔点：204-205℃。
实施例17：化合物17X的合成
3-氯-4-甲氧基苯甲醛
3-氯-4-羟基苯甲醛(25g，160mmol)，碘甲烷(27.25g，192mmol)，K2CO3(颗粒状，无水)(110.6g，800mmol)和丙酮(300mL)的混合物回流3小时。反应混合物然后被冷却至室温。加入二乙醚(500mL)，用纸将混合物过滤除去无机盐。滤过物减压蒸发，溶于二乙醚(800mL)，用0.1N NaOH(3×100mL)洗。将有机层干燥(Na2SO4)后真空蒸发得到24g，92％产率的粗提产物。将该物质进一步用硅胶(50mm×30cm)层析纯化(用己烷-EtOAc，5∶1洗脱)得到15.02g，56％产率的白色固体：TLC(己烷-EtOAc，5∶1)Rf＝0.24；GC Rt＝4.75分钟；MS(EI)m/Z 170(M+)，172(M+2)。
1-甲基-(3′-氯-4′-甲氧基苄基)乙醇
将3-氯-4-甲氧基苯甲醛(13g，76.5mmol)，甲基氯化镁(52g，153mmol)和THF(300mL)的混合物回流3小时。将反应混合物冷却至室温。滴加NH4Cl(饱和溶液，6mL)再加入二乙醚(500mL)，用纸将混合物过滤除去无机盐。将滤过物减压蒸发，得到的固体溶于二乙醚(300mL)，水洗(4×25mL)。将有机层干燥(Na2SO4)，真空下蒸发，得到11.3g，80％产率的粗提产物。该物质进一步用硅胶(50mm×30cm)层析(用CH2CH2洗脱)纯化得11.3g，63％产率的油；TLC(CH2Cl2)Rf＝0.25；GC Rt＝5.30分钟；MS(EI)m/Z 186(M+)，188(M+2)。
3′-氯-4′-甲氧基乙酰苯
1-甲基-(3′-氯-4′-甲氧基苄基)乙醇(7.6g，41mmol)，氯铬酸吡啶(PCC)(13.16g，61.5mmol)和CH2Cl2(300mL)的混合物在室温下搅拌2小时。加入二乙醚(1000mL)，得到的混合物置于硅胶层析柱(50mm×30cm)(用二乙醚洗脱)得到7.3g，97％产率的粗固体产物。该物质的GC分析显示其纯度为99％，用于下列反应时无需进一步纯化。TLC(二乙醚)Rf＝1.0；GC Rt＝5.3分钟；MS(EI)m/Z 184(M+)，184(M+2)。
(R，R)-N-(1-乙基-4′-甲氧基-3′-氯苯基)-1-(1-萘基乙基)胺
将3′-氯-4′-甲氧基乙酰苯(5.3g，29mmol)，(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺(4.98g，29mmol)，异丙醇钛(IV)(10.2g，36mmol)和异戊醇的混合物加热至100℃3小时。三乙酰氧基硼氢化钠(NaB(O2CCH3)3；12.29g，58mmol)分若干部分加入10分钟。反应混合物加热回流30分钟然后在室温下搅拌18小时。将混合物倒入二乙醚(500mL)；加入H2O(2mL)，离心悬浮液除去钛盐的微小沉淀物。收集上清，用醚洗沉淀(500mL)。混合有机层干燥(Na2SO4)后真空蒸发得到6.81g，70％产率的粗提产品。
将该物质用硅胶(50mm×30cm)层析(用3％MeOH-97％CH2Cl2洗脱)进一步纯化得到2.01g油。通过重结晶进一步纯化该非对映异构体。用发烟HCl将游离碱(1.98g)转化成其HCl盐。该盐溶于热的异丙醇(65mL)，用纸将溶液过滤。将滤过物真空干燥，得到的固体溶于异丙醇(30mL)。室温放置18小时后，收集结晶固体，用冷异丙醇(20mL)洗，干燥得到0.87g，40％(来自游离碱)的非对映异构体的纯盐酸盐：熔点：236-2371/2℃(dec)；TLC(MeOH-CH2Cl2[99:1])Rf＝0.25；GC Rt＝11.06分钟；FTIR(KBr沉淀，cm-1)3433，2950，2931，2853，2803，2659，2608，2497，1604，1595，1504，1461，1444，1268，1260，1067，1021，802，781，733；MS(EI)m/Z 339(M+)，341(M+2)。
实施例18：另外的合成方案
22Z和23A的制备
向二甲基甲酰胺(100mL)中氢化钠(2.173g，在油中60％，54.325mmol)的搅拌溶液中滴加磷酸三乙酯(12.47g，55.65mmol)，室温下搅拌30分钟。然后滴加二甲基甲酰胺(50ml)中m-三氟甲氧基苯甲醛(10.0g，52.6mmol)溶液，然后将溶液在室温下搅拌30分钟，100℃搅拌30分钟。加入水淬灭反应，用二乙醚(500mL)转移到另一漏斗中。醚溶液用饱和氯化铵(4×500ml)洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩得油状乙基m-三氟甲氧基肉桂酸酯；m/Z(相对强度)260(M+，19)，232(16)，215(100)，187(21)，101(28)。
将乙醇(100ml)中的乙酯用催化量(10％重量)的氢氧化钯在60磅氢中还原。还原(2小时室温下)后，将反应物过滤，浓缩得到油状乙基m-三氟甲氧基氢化肉桂酸：m/Z(相对强度)262(M+，16)，217(7)，188(100)，175(28)，103(31)，91(18)，77(23)。
将饱和乙酯在室温下在乙醇-10M氢氧化钠(1∶1)溶液中水解16小时。然后酸化溶液，将产物抽提进二乙醚。醚溶液在无水磷酸镁上干燥，浓缩得到固体m-三氟甲氧基氢化肉桂酸m/Z(相对强度)234(M+，46)，188(100)，174(65)，103(27)，91(12)，77(17)。
在过量巯基氯(thionyl chloride)中在室温下搅拌酸4小时。减压(100℃)蒸发过量的巯基氯，得到油状m-三氟甲氧基氢化肉桂基氯。产物无需进一步纯化即可使用。
将四氢呋喃中m-三氟甲氧基氢化肉桂基氯(9.8g，39mmol)的溶液冷却至-78℃，滴加溴化甲基镁(39mmol)溶液(3M 13mL，在四氢呋喃中)。将反应物在-78℃下搅拌4小时，在室温下搅拌8小时，然后用稀HCl淬灭。反应混合物用二乙醚抽提。将醚用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩成油。用己烷至丙酮的梯度对该物质用硅石层析得到油状4-(3-三氟甲氧基苯基)-2-丁酮；m/Z(相对强度)232(M+，68)，217(7)，189(59)，175(31)，103(28)，43(100)。
将4-(3-三氟甲氧基苯基)-2-丁酮(2.32g，10mmol)，(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺(1.51g，10mmol)和异丙醇钛(IV)(3.55g，12.5mmol)的溶液在室温下搅拌4小时。反应混合物用乙醇化的氰硼氢化钠(10mmol)溶液(10ml，1M)处理后在室温下搅拌16小时。将该反应物用二乙醚稀释(50ml)并用水(0.72ml，40mmol)处理。彻底混合后，将溶液离心，醚层脱水浓缩得到油状固体。固体悬浮于二乙醚，用0.45μM CR PTFE Acrodisc过滤，浓缩得到澄清的油。用氯仿中的5％甲醇重复性制备型薄层层析得到两个非对映异构体(S，R)-N-[4-(3-三氟甲氧基苯基)-2-丁基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，22Z[m-/Z(相对强度)367(M+，3)，352(20)，232(4)，178(47)，135(100)，105(14)，91(10)；77(11)]和(R，R)-N-[4-(3-三氟甲氧基苯基)-2-丁基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，23A；m/Z(相对强度)367(M+，3)，352(19)，232(7)，178(43)，135(100)，105(19)，91(10)，77(11)。
22X和22Y的制备
以相似的方式将等摩尔量的4-(3-三氟甲氧基苯基)-2-丁酮，(R)-1-(1-萘基)乙胺和1.25当量的异丙醇钛(IV)混合，用乙醇化的氰硼氢化钠还原中间体亚胺。用氯仿中5％甲醇分离净化(work-up)和重复性制备型薄层层析得到(S，R)-N-[4-(3-三氟甲氧基苯基)-2-丁基]-1-(1-萘基)乙胺，22X；m/Z(相对强度)387(M+，3)，372(15)，198(15)，176(12)，155(100)，128(8)，115(6)，109(4)，103(5)，77(8)和(R，R)-N-[4-(3-1三氟甲氧基苯基)-2-丁基]-1-(1-萘基)乙胺，22Y；m/Z(相对强度)387(M+，2)，372(12)，198(16)，176(11)，155(100)，128(8)，115(6)，109(4)，103(5)，77(8)。
4T的制备
以相似的方式将等摩尔量的4-(2-氯苯基)-2-丁酮，制备自O-氯苯甲醛，(R)-1(3-甲氧基苯基)乙胺和1.25当量的异丙醇钛(IV)混合，用乙醇化的氰硼氢化钠还原中间体亚胺。用氯仿中的5％甲醇分离净化和重复性制备型薄层层析得到(R，R)-N-[4-(2-氯苯基)-2-丁基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，4T；m/Z(相对强度)317(M+，3)，302(16)，178(62)，135(100)，125(15)，105(10)，91(6)，77(8)。
21Y的制备
以相似的方式将等摩尔量的4-(3-三氟甲基苯基)-2-丁酮，制备自m-三氟甲基苯甲醛，(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺和1.25当量的异丙醇钛(IV)混合，用乙醇化的氰硼氢化钠还原中间体亚胺。用氯仿中的5％甲醇的分离净化和用重复性制备型薄层层析得到(R，R)-N-[4-(3-三氯甲基苯基)-2-丁基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，21Y[M/Z(相对强度)351(M+，2)，336(18)，216(4)，202(3)，178(45)，135(100)，105(13)，91(9)，77(8)]和(S，R)-N-[4-(3-三氟甲基苯基)-2-丁基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，21X。
25C和25D的制备
以相似的方式将等摩尔量的4-(3-三氟甲基苯基)-2-丁酮，(R)-1-(1-萘基)乙胺和1.25当量的异丙醇钛(IV)混合，用乙醇化的氰硼氢化钠还原中间体亚胺。用氯仿中的5％甲醇的分离净化和重复性制备型薄层层析得到(S，R)-N-[4-(3-三氯甲基苯基)-2-丁基]-1-(1-萘基)乙胺，25C[m/Z(相对强度)37(M+，3)，356(16)，198(15)，155(100)，129(8)，115(5)，109(3)，77(2)]和(R，R)-N-[4-(3-三氟甲基苯基)-2-丁基]-1-(1-萘基)乙胺，25D；m/Z(相对强度)371(M+，3)，356(16)，198(15)，155(100)，129(8)，115(5)，109(3)，77(2)。
21D的制备
以相似的方式将等摩尔量的4-苯基-2-丁酮(Aldrich化学品公司)，(R)-1-(3-甲氯基苯基)乙胺和1.25当量的异丙醇钛(IV)混合，用乙醇化的氰硼氢化钠还原中间体亚胺。用氯仿中的5％甲醇的分离净化和重复性制备型薄层层析得到(R，R)-N-(4-苯基-2-丁基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，21D[m/Z(相对强度)283(M+，4)，268(13)，178(45)，135(100)，105(15)，91(43)，77(11)]和(S，R)-N-(4-苯基-2-丁基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，21E。
21F的制备
以相似的方式将等摩尔量的4-苯基-2-丁酮(Aldrich化学品公司)，(R)-1-(1-萘基)乙胺和1.25当量的异丙醇钛(IV)混合，用乙醇化的氰硼氢化钠还原中间体亚胺。用氯仿中的5％甲醇的分离净化和重复性制备型薄层层析得到(R，R)-N-(4-苯基-2-丁基)-1-(1-萘基)乙胺，21F；[m/Z(相对强度)303(M+，6)，288(14)，198(22)，155(100)，129(8)，115(5)，91(19)，77(4)。
12Z的制备
将二氯甲烷中的2-氯氢化肉桂腈(Aldrich化学品公司，1.66g，10mmol)的搅拌溶液冷却至-78℃，滴加二异丁基铝氢化物(1.42g，10mmol)处理。将反应物在室温下搅拌1小时，冷却至-78℃，用二氯甲烷(25ml)中的1-(1-萘基)乙胺(1.71g，10mmol)的溶液处理。将反应物移至冰浴，搅拌2小时。然后将反应物直接倒入乙醇中硼氢化钠(50ml，0.2M，10mmol)的搅拌溶液中。将混合物室温搅拌30分钟，加10％HCl淬灭过量的硼氢化钠。加10N NaOH将溶液调至碱性，移至分离漏斗，用二乙醚(300ml)洗涤。除去水相，用1N NaOH(3×100mL)洗剩下的有机层。有机层用无水硫酸镁干燥，浓缩成油。用氯仿至10％甲醇-氯仿梯度将该物质硅胶层析得到2.34g(72％产率)澄清油状(R)-N-[3-(2-氯苯基)丙基)-1-(1-萘基)乙胺，12Z；m/Z(相对强度)323(M+，2)，308(63)，288(7)，196(5)，184(5)，155(100)，125(24)，115(8)，103(4)，91(3)，77(7)。
12B的制备
以相似的方式用二异丁基铝氢化物处理2-甲基肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺处理中间体铝-亚胺复合物。用乙醇化的硼氢化钠处理中间体亚胺。分离净化和层析得到澄清无色油状的(R)-N-[3-(2-甲基苯基)丙-2-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，12B；m/Z(相对强度)281(M+，6)，266(5)，176(27)，146(75)，135(63)，131(100)，115(25)，105(21)，91(21)，77(21)。
12C的制备
以相似的方式用二异丁基铝氢化物处理2-甲基肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺处理中间体铝-亚胺复合物。用乙醇化的硼氢化钠处理中间体亚胺。分离净化和层析得到澄清无色油状的(R)-N-[3-(2-甲基苯基)丙-2-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，12C；m/Z(相对强度)281(M+，4)，266(15)，176(18)，146(62)，135(58)，131(100)，115(23)，105(19)，91(38)，77(17)。
12D的制备
以相似的方式用二异丁基铝氢化物处理2，4，6-三甲基肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺处理中间体铝-亚胺复合物。用乙醇化的硼氢化钠处理中间体亚胺。分离净化和电泳得到澄清无色油状的(R)-N-[3-(2，4，6-三甲基苯基)丙-2-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，12D；m/Z(相对强度)309(M+，8)，294(25)，174(82)，159(100)，135(52)，129(29)，105(21)，91(17)，77(14)。
12E的制备
以相似的方式用二异丁基铝氢化物处理4-异丙基肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺处理中间体铝-亚胺复合物。用乙醇化的硼氢化钠处理中间体亚胺。分离净化和层析得到澄清无色油状的(R)-N-[3-(4-异丙基苯基)丙-2-烯基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，12E；m/Z(相对强度)309(M+，9)，294(7)，174(98)，159(22)，135(80)，177(100)，105(35)，91(37)，77(19)。
12F的制备
以相似的方式用二异丁基铝氢化物处理2，4-二甲基肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺处理中间体铝-亚胺复合物。用乙醇化的硼氢化钠处理中间体亚胺。分离净化和层析得到澄清无色油状的(R)-N-[3-2，4-二甲基苯基)丙-2-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，12F；m/Z(相对强度)295(M+，8)，294(15)，174(29)，160(75)，145(100)，135(68)，117(21)，105(30)，91(26)，77(19)。
12G的制备
以相似的方式用二异丁基铝氢化物处理3-甲基肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺处理中间体铝-亚胺复合物。用乙醇化的硼氢化钠处理中间体亚胺。分离净化和层析得到澄清无色油状的(R)-N-[3-(3-甲氧基苯基)丙-2-烯基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，12G；m/Z(相对强度)281(M+，5)，266(9)，176(24)，146(71)，135(62)，131(100)，115(23)，105(19)，91(41)，77(18)。
25E的制备
以相似的方式用二异丁基铝氢化物处理肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺处理中间体铝-亚胺复合物。用乙醇化的硼氢化钠处理中间体亚胺。分离净化和层析得到澄清无色油状的(R)-N-(3-苯基丙-2-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，25E；m/Z(相对强度)267(M+，3)，252(14)，176(17)，135(62)，117(100)，105(28)，91(56)，77(33)。
25G的制备
以相似的方式用二异丁基铝氢化物处理α-甲基肉桂腈，用(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺处理中间体铝-亚胺复合物。用乙醇化的硼氢化钠处理中间体亚胺。分离净化和层析制得澄清无色油状的(R)-N-(2-甲基-3-苯基丙-2-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，25G；m/Z(相对强度)281(M+，5)，266(18)，190(12)，146(78)，135(82)，131(100)，115(21)，105(21)，91(62)，77(19)。
6X的制备
用二甲基甲酰胺(50ml)中的磷酸二乙基氰甲酯(13.3g，75mmol)溶液处理二甲基甲酰胺(150ml)中氢化钠(1.8g，75mmol)的搅拌的溶液。将反应物在室温下搅拌30分钟。然后将反应物用3-氯苯甲(10.54g，75mmol)处理，室温搅拌1小时。60℃搅拌30分钟。然后加入水(200ml)淬灭反应。将反应混合物用二乙醚转移到分离漏斗，用水(5×300ml)和盐溶液洗涤得到的有机相。有机层用无水碳酸钾干燥，浓缩得到固体3-氯肉桂腈(11.06g)。将固体溶于四氢呋喃(50ml)用过量二硼烷处理，室温下搅拌30分钟。将反应物倒入冰/10％HCl中。用二乙醚(2×200ml)洗酸性水相。加10N NaOH调水相成碱性，用二乙醚(200ml)抽提。醚抽提物用无水碳酸钾干燥，浓缩得到油状3-(3-氯苯基)丙胺(0.6g，354mmol)。将3-(3-氯苯基)丙胺(0.6g，354mmol)，3′-甲氧基乙酰苯(0.53g，354mmol)和1.25摩尔当量的异丙醇钛(IV)(1.26g，443mmol)室温搅拌4小时，用乙醇化的氰硼氢化钠(5ml，1M，5mmol)处理中间体亚胺。将反应物在室温下搅拌16小时，用二乙醚(50ml)稀释，用水(0.32ml，17.7mmol)处理。充分混合后将溶液离心，使醚层浓缩成牛奶状固体。该物质悬浮于二乙醚中，用0.45μM CR PTFE Acrodisc过滤。醚洗液浓缩成油。用3％甲醇-二氯甲烷(含0.1％异丙胺层析该物质(硅石，制备型薄层层析)得到N-[3-(3-氯苯基)丙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，6X；m/Z(相对强度)303(M+，3)，288(40)，196(3)，164(8)，135(100)，126(46)，103(26)，91(29)，77(29)。
6V的制备
在室温下将等摩尔量的3-(4-氯苯基)丙胺(如上以相似方式制备自4-氯苯甲醛，3′-甲氧基乙酰苯和1.25摩尔当量的异丙醇钛(IV)混合4小时，用乙醇化的氰硼氢化钠(5ml，1M，5mmol)处理中间体亚胺。分离净化和层析得到油状N-[3-(4-氯苯基)丙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，6V；m/Z(相对强度)303(M+，8)，288(91)，196(4)，164(10)，135(100)，125(61)，103(21)，91(21)，77(18)。
20A的制备
以相似的方式，将等摩尔量的1-(1-甲氧基苯基)丙胺，4-叔丁基乙酰苯和1.25摩尔当量的异丙醇钛(IV)在室温下混合4小时，用乙醇化的氰硼氢化钠(5ml，1M，5mmol)处理中间体亚胺。分离净化和层析得到油状(R)-N-[1-(4-叔丁基苯基)乙基]-1-(1-萘基)乙胺，20A，m/Z(相对强度)331(M+，12)，316(29)，161(70)，155(100)，131(14)，127(31)，115(10)，105(6)，91(10)，77(10)。
25H和25I的制备
以相似的方式在室温下将等摩尔量的(R)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，反-4-苯基-3-丁烯-2-酮和1.25摩尔当量的异丙醇钛(IV)混合4小时，用乙醇化的氰硼氢化钠(5ml，1M，5mmol)处理中间体亚胺。分离净化和层析得到油状(R，R)-N-(2-甲基-4-苯基J-3-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，25H；m/Z(相对强度)283(M+，4)，268(13)，178(40)，135(100)，105(15)，91(47)，77(13)和油状(S，R)-N-(2-甲基-4-苯基J-3-烯基)-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，25I；m/Z(相对强度)283(M+，4)，268(13)，178(40)，135(100)，105(15)，91(47)，77(13)。
16L和16M的制备
以相似的方式在室温下将等摩尔量的(R)-1-(3-甲氧基苯基)-乙胺，3-甲氧基乙酰苯和1.25摩尔当量的异丙醇钛(IV)混合4小时，用乙醇化的氰硼氢化钠(5ml，1M，5mmol)处理中间体亚胺。分离净化和层析得到油状(R，R)-N-[1-(4-甲氧基苯基)乙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，16L；m/Z(相对强度)284(M-1，1)，270(85)，150(83)，135(100)，120(12)，105(28)，91(25)，77(23)。和油状(S，R)-N-[1-(4-甲氧基苯基)乙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，16M；m/Z(相对强度)284(M-1，1)，270(53)，150(98)，135(100)，120(11)，105(33)，91(25)，77(23)。
5R/5C的制备
以相似的方式用4-氯乙酰苯制备3-甲基-3-(4-氯苯基)肉桂腈。该腈被催化还原(氢氧化钯，乙酸，60磅氢气2小时)生成3-甲基-3-(4-氯苯基)丙胺。在室温下将等摩尔量该胺，3′-甲氧基乙酰苯和1.25摩尔当量的异丙醇钛(IV)混合4小时，用乙醇化的氰硼氢化钠(5ml，1M，5mmol)处理中间体亚胺。分离净化和层析得到油状N-(3-甲基-3-(4-氯苯基)丙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，5B/5C；m/Z(相对强度)317(M+，12)，302(74)，210(2)，182(4)，164(12)，135(100)，121(25)，103(40)，91(19)，77(28)。
4Z/5A的制备
以相似的方式用3-氯乙酰苯制备3-甲基-3-(3-氯苯基)肉桂腈。该腈被催化还原(氢氧化钯，乙酸，60磅氢气2小时)生成3-甲基-3-(3-氯苯基)丙胺。在室温下将等摩尔量的该胺，3′-甲氧基乙酰苯和1.25摩尔当量的异丙醇钛(IV)混合4小时，用乙醇化的氰硼氢化钠(5ml，1M，5mmol)处理中间体亚胺。分离净化和层析得到油状N-[3-甲基-3-(3-氯苯基)丙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，4Z/5A；m/Z(相对强度)283(M+，17)，268(71)，164(13)，135(100)，121(21)，105(27)，91(26)，77(14)。
4Y的制备
以相似的方式用2-氯乙酰苯制备3-甲基-3-(2-氯苯基)肉桂腈。该腈被催化还原(氢氧化钯，乙酸，60磅氢气2小时)生成3-甲基-3-(2-氯苯基)丙胺。在室温下将等摩尔量的该胺，3′-甲氧基乙酰苯和1.25摩尔当量的异丙醇钛(IV)混合4小时，用乙醇化的氰硼氢化钠(5m1，1M，5mmol)处理中间体亚胺。分离净化和层析得到油状N-[3-甲基-3-(2-氯苯基)丙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，4Y；m/Z(相对强度)283(M+，17)，268(71)，164(13)，135(100)，121(21)，105(27)，91(26)，77(4)。
6T的制备
将二氯甲烷中的NPS R-568(30.3g，100mmol)溶液在-78℃用三溴化硼(50g，200ml)逐滴处理。在室温下搅拌反应物1小时，将其倒在冰上。用氯仿从水相中抽提氢溴酸。溶于氯仿的物质用50％HCl洗(4×100ml)。氯仿洗液用无水硫酸镁干燥，浓缩得到(R)-N-[3-(2-氯苯基)丙基]-1-(3-羟基苯基)乙胺盐酸盐固体。二甲基甲酰胺中的氢化钠(0.48g，20mmol)溶液用(R)-N-[3-(2-氯苯基)丙基]-1-(3-羟基苯基)乙胺盐酸盐(3.25g，10mmol)处理，将反应物在室温下搅拌1小时。将反应用碘乙烷(1.17g，11mmol)处理，室温搅拌16小时。分离净化和用氯仿中3％甲醇硅石层析得到油状(R)-N-[3-(2-氯苯基)丙基]-1-(3-乙氧基苯基)乙胺，6T；m/Z(相对强度)316(M+，1)，302(100)，282(11)，196(5)，178(7)，149(74)，121(34)，103(25)，91(28)，77(29)。
6R的制备
以相似的方式用NPS R-467制备油状(R)-N-(3-苯基丙基)-1-(3-乙氧基苯基)乙胺，6R；m/Z(相对强度)283(M+，10)，268(74)，178(11)，162(8)，149(100)，121(30)，103(16)，91(86)，77(29)。
3U的制备
在室温下将等摩尔量的3，3-二苯基丙胺(2.11g，10mmol)，1′-乙酰萘酮(1.70g，10mmol)和1.25当量的异丙醇钛(IV)(3.55g，12.5mmol)搅拌4小时，然后将反应混合物用乙醇化的氰硼氢化钠(12.5ml，12.5mmol)的1M溶液处理，在室温下搅拌16小时。反应用二乙醚(50ml)稀释，用水(0.72ml，40mmol)处理。充分混合后将混合物离心，使醚层脱水，浓缩成牛奶状油。将该油悬浮于二乙基醚，用0.45μM CR PTFE Acrodisc过滤。将二乙醚滤过物浓缩，得到澄清无色油状N-(3，3-二苯基丙基)-1-(1-苯基)乙胺，3U；m/Z(相对强度)365(M+，17)，350(19)，181(23)，155(100)，141(25)，115(11)，91(13)，77(6)。
6F的制备
以相似的方式如上处理等摩尔量的1-(3-甲氧基苯基)乙胺(1.51g，10mmol)，2′-乙酰萘酮(1.70g，10mmol)和1.25当量的异丙醇钛(IV)(3.55g，12.5mmol)。分离净化得到澄清无色油状的N-[1-(2-萘基)乙基]-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，6F；m/Z(相对强度)305(M+，1)，290(35)，170(49)，155(100)，135(55)，115(28)，105(10)，91(9)，77(10)。
4G的制备
以相似的方式将等摩尔量的(R)-1-苯基乙胺，1′-乙酰萘酮和1.25当量的异丙醇钛(IV)混合，用乙醇化的氰硼氢化钠还原所得到的中间体亚胺。分离净化和层析得到澄清无色油状的N-[1-(1-萘基)乙基]-1-苯基乙胺，4G；m/Z(相对强度)275(M+，16)，260(79)，155(100)，127(27)，105(70)，77(32)。
4H的制备
以相似的方式将等摩尔量的(R)-1-苯基乙胺，2′-乙酰萘酮和1.25当量的异丙醇钛(IV)混合，用乙醇化的氰硼氢化钠还原所得到的中间体亚胺。分离净化和层析得到澄清无色油状的N-[1-(2-萘基)乙基]-1-苯基乙胺，4H；m/Z(相对强度)275(M+，1)，260(61)，155(100)，120(36)，105(55)，77(15)。
6E的制备
以相似的方式将等摩尔量的(1-(3-甲氧基苯基)乙胺，1′-乙酰萘酮和1.25当量的异丙醇钛(IV)混合，用乙醇化的氰硼氢化钠还原所得到的中间体亚胺。分离净化和层析得到澄清无色油状的N-1-(1-萘基)乙基-1-(3-甲氧基苯基)乙胺，6E；m/Z(相对强度)305(M+，10)，290(30)，170(43)，155(100)，135(69)，115(9)，105(15)，91(14)，77(18)。
实施例19：药物制剂
适于对病人给药的药物制剂由表3给出。
表3成分 mg/胶囊 g/典型的5000胶囊批量NPS R-568 56.0 280.0预明胶化的淀粉NF 134.0 670.0微晶化纤维素NF 34.0 170.0胶体二氧化硅 1.0 5.0总量 225mg 1125g
其它NPS(R)-568盐酸盐制剂和剂量形式的例子包括适于用标准技术持续或延续释药的那些。
用标准技术也可以确定适当的剂量。例如在一组实验中，NPS(R)-568盐酸盐的10-400mg口服剂量在受试人中显示出药理活性。口服NPS(R)-568盐酸盐后在人血浆中观察到显著水平的17Q(NPS(R)-568的一种主要代谢物)的O-葡糖苷结合物。因此17Q的O葡糖苷结合物可能产生有益效果。
用标准技术可确定NPS(R)-568的其它适当剂量范围。
根据本申请所提供的技术，本领域专业人员也可确定本文描述的其它化合物的适当剂量范围、制剂和剂量形式。
其它实施方案在下述权利要求的范围内，因此虽然只给出并描述了几个实施方案，在不偏离本发明的实质与范围的条件下，对本发明可有不同的改进。
序列表
(1)一般资料：
(i)申请人：NPS Pharmaceuticals，Inc.
(ii)发明名称：钙受体活性化合物
(iii)序列数：2
(iv)相关地址：
(A)收信人：Lyon&Lyon
(B)街道：First Interstate World
Center，Suite 4700
633 West Fifth Street
(C)城市：Los Angeles
(D)州：California
(E)国家：USA
(F)邮编：90017
(v)计算机可读形式：
(A)介质类型：3.5时盘，1.44Mb存贮量
(B)计算机：IBM PC兼容型
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：FastSeq
(vi)当前申请资料：
(A)申请号：
(B)提交日期：
(C)分类：
(vii)在先申请资料：
全部在先申请包括下述申请：2
(A)申请号：U.S.08/353,784
(B)提交日期：1994年12月8日
(A)申请号：PCT/US/94/12117
(B)提交日期：1994年10月21日
(viii)律师/代理人资料：
(A)姓名：Heber，Sheldon O.
(B)注册号：38，179
(C)参考/登记号：215/304
(ix)远程通讯资料：
(A)电话：(213)489-1600
(B)电传：(213)955-0440
(C)电报：67-3510
(2)SEQ ID NO：1的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：5006个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA to mRNA
(ix)特性：
(A)名称/关键词CDS
(B)位置：436...3699
(D)其它资料：
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
GCTGCTGTGG CCGGACCCGA AGGCGGGCGC CGGGAGCGCA 40
GCGAGCCAGA CGCGCCTCTC CAAGACCGTG ACCTTGGCAT 80
AGGGAGCGGG GCTGCGCGCA GTCCTGAGAT CAGACCAGAG 120
CTCATCCTCG TGGAGACCCA CGGCCGAGGG GCCGGAGCTG 160
CCTCTGTGCG AGGGAGCCCT GGCCGCGGCG CAGAAGGCAT 200
CACAGGAGGC CTCTGCATGA TGTGGCTTCC AAAGACTCAA 240
GGACCACCCA CATTACAAGT CTGGATTGAG GAAGGCAGAA 280
ATGGAGATTC AAACACCACG TCTTCTATTA TTTTATTAAT 320
CAATCTGTAG ACATGTGTCC CCACTGCAGG GAGTGAACTG 360
CTCCAAGGGA GAAACTTCTG GGAGCCTCCA AACTCCTAGC 400
TGTCTCATCC CTTGCCCTGG AGAGACGGCA GAACC 435
ATG GCA TTT TAT AGC TGC TGC TGG GTC CTC TTG GCA 471
Met Ala Phe Tyr Ser Cys Cys Trp Val Leu Leu Ala
1 5 10
CTC ACC TGG CAC ACC TCT GCC TAC GGG CCA GAC CAG 507
Leu Thr Trp His Thr Ser Ala Tyr Gly Pro Asp Gln
15 20
CGA GCC CAA AAG AAG GGG GAC ATT ATC CTT GGG GGG 543
Arg Ala Gln Lys Lys Gly Asp Ile Ile Leu Gly Gly
25 30 35
CTC TTT CCT ATT CAT TTT GGA GTA GCA GCT AAA GAT 579
Leu Phe Pro Ile His Phe Gly Val Ala Ala Lys Asp
40 45
CAA GAT CTC AAA TCA AGG CCG GAG TCT GTG GAA TGT 615
Gln Asp Leu Lys Ser Arg Pro Glu Ser Val Glu Cys
50 55 60
ATC AGG TAT AAT TTC CGT GGG TTT CGC TGG TTA CAG 651
Ile Arg Tyr Asn Phe Arg Gly Phe Arg Trp Leu Gln
65 70
GCT ATG ATA TTT GCC ATA GAG GAG ATA AAC AGC AGC 687
Ala Met Ile Phe Ala Ile Glu Glu Ile Asn Ser Ser
75 80
CCA GCC CTT CTT CCC AAC TTG ACG CTG GGA TAC AGG 723
Pro Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr Leu Gly Tyr Arg
85 90 95
ATA TTT GAC ACT TGC AAC ACC GTT TCT AAG GCC TTG 759
Ile Phe Asp Thr Cys Asn Thr Val Ser Lys Ala Leu
100 105
GAA GCC ACC CTG AGT TTT GTT GCT CAA AAC AAA ATT 795
Glu Ala Thr Leu Ser Phe Val Ala Gln Asn Lys Ile
110 115 120
GAT TCT TTG AAC CTT GAT GAG TTC TGC AAC TGC TCA 831
Asp Ser Leu Asn Leu Asp Glu Phe Cys Asn Cys Ser
125 130
GAG CAC ATT CCC TCT ACG ATT GCT GTG GTG GGA GCA 867
Glu His Ile Pro Ser Thr Ile Ala Val Val Gly Ala
135 140
ACT GGC TCA GGC GTC TCC ACG GCA GTG GCA AAT CTG 903
Thr Gly Ser Gly Val Ser Thr Ala Val Ala Asn Leu
145 150 155
CTG GGG CTC TTC TAC ATT CCC CAG GTC AGT TAT GCC 939
Leu Gly Leu Phe Tyr Ile Pro Gln Val Ser Tyr Ala
160 165
TCC TCC AGC AGA CTC CTC AGC AAC AAG AAT CAA TTC 975
Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ser Asn Lys Asn Gln Phe
170 175 180
AAG TCT TTC CTC CGA ACC ATC CCC AAT GAT GAG CAC 1011
Lys Ser Phe Leu Arg Thr Ile Pro Asn Asp Glu His
185 190
CAG GCC ACT GCC ATG GCA GAC ATC ATC GAG TAT TTC 1047
Gln Ala Thr Ala Met Ala Asp Ile Ile Glu Tyr Phe
195 200
CGC TGG AAC TGG GTG GGC ACA ATT GCA GCT GAT GAC 1083
Arg Trp Asn Trp Val Gly Thr Ile Ala Ala Asp Asp
205 210 215
GAC TAT GGG CGG CCG GGG ATT GAG AAA TTC CGA GAG 1119
Asp Tyr Gly Arg Pro Gly Ile Glu Lys Phe Arg Glu
220 225
GAA GCT GAG GAA AGG GAT ATC TGC ATC GAC TTC AGT 1155
Glu Ala Glu Glu Arg Asp Ile Cys Ile Asp Phe Ser
230 235 240
GAA CTC ATC TCC CAG TAC TCT GAT GAG GAA GAG ATC 1191
Glu Leu Ile Ser Gln Tyr Ser Asp Glu Glu Glu Ile
245 250
CAG CAT GTG GTA GAG GTG ATT CAA AAT TCC ACG GCC 1227
Gln His Val Val Glu Val Ile Gln Asn Ser Thr Ala
255 260
AAA GTC ATC GTG GTT TTC TCC AGT GGC CCA GAT CTT 1263
Lys Val Ile Val Val Phe Ser Ser Gly Pro Asp Leu
265 270 275
GAG CCC CTC ATC AAG GAG ATT GTC CGG CGC AAT ATC 1299
Glu Pro Leu Ile Lys Glu Ile Val Arg Arg Asn Ile
280 285
ACG GGC AAG ATC TGG CTG GCC AGC GAG GCC TGG GCC 1335
Thr Gly Lys Ile Trp Leu Ala Ser Glu Ala Trp Ala
290 295 300
AGC TCC TCC CTG ATC GCC ATG CCT CAG TAC TTC CAC 1371
Ser Ser Ser Leu Ile Ala Met Pro Gln Tyr Phe His
305 310
GTG GTT GGC GGC ACC ATT GGA TTC GCT CTG AAG GCT 1407
Val Val Gly Gly Thr Ile Gly Phe Ala Leu Lys Ala
315 320
GGG CAG ATC CCA GGC TTC CGG GAA TTC CTG AAG AAG 1443
Gly Gln Ile Pro Gly Phe Arg Glu Phe Leu Lys Lys
325 330 335
GTC CAT CCC AGG AAG TCT GTC CAC AAT GGT TTT GCC 1479
Val His Pro Arg Lys Ser Val His Asn Gly Phe Ala
340 345
AAG GAG TTT TGG GAA GAA ACA TTT AAC TGC CAC CTC 1515
Lys Glu Phe Trp Glu Glu Thr Phe Asn Cys His Leu
350 355 360
CAA GAA GGT GCA AAA GGA CCT TTA CCT GTG GAC ACC 1551
Gln Glu Gly Ala Lys Gly Pro Leu Pro Val Asp Thr
365 370
TTT CTG AGA GGT CAC GAA GAA AGT GGC GAC AGG TTT 1587
Phe Leu Arg Gly His Glu Glu Ser Gly Asp Arg Phe
375 380
AGC AAC AGC TCG ACA GCC TTC CGA CCC CTC TGT ACA 1623
Ser Asn Ser Ser Thr Ala Phe Arg Pro Leu Cys Thr
385 390 395
GGG GAT GAG AAC ATC AGC AGT GTC GAG ACC CCT TAC 1659
Gly Asp Glu Asn Ile Ser Ser Val Glu Thr Pro Tyr
400 405
ATA GAT TAC ACG CAT TTA CGG ATA TCC TAC AAT GTG 1695
Ile Asp Tyr Thr His Leu Arg Ile ser Tyr Asn Val
410 415 420
TAC TTA GCA GTC TAC TCC ATT GCC CAC GCC TTG CAA 1731
Tyr Leu Ala Val Tyr Ser Ile Ala His Ala Leu Gln
425 430
GAT ATA TAT ACC TGC TTA CCT GGG AGA GGG CTC TTC 1767
Asp Ile Tyr Thr Cys Leu Pro Gly Arg Gly Leu Phe
435 440
ACC AAT GGC TCC TGT GCA GAC ATC AAG AAA GTT GAG 1803
Thr Asn Gly Ser Cys Ala Asp Ile Lys Lys Val Glu
445 450 455
GCG TGG CAG GTC CTG AAG CAC CTA CGG CAT CTA AAC 1839
Ala Trp Gln Val Leu Lys His Leu Arg His Leu Asn
460 465
TTT ACA AAC AAT ATG GGG GAG CAG GTG ACC TTT GAT 1875
Phe Thr Asn Asn Met Gly Glu Gln Val Thr Phe Asp
470 475 480
GAG TGT GGT GAC CTG GTG GGG AAC TAT TCC ATC ATC 1911
Glu Cys Gly Asp Leu Val Gly Asn Tyr Ser Ile Ile
485 490
AAC TGG CAC CTC TCC CCA GAG GAT GGC TCC ATC GTG 1947
Asn Trp His Leu Ser Pro Glu Asp Gly Ser Ile Val
495 500
TTT AAG GAA GTC GGG TAT TAC AAC GTC TAT GCC AAG 1983
Phe Lys Glu Val Gly Tyr Tyr Asn Val Tyr Ala Lys
505 510 515
AAG GGA GAA AGA CTC TTC ATC AAC GAG GAG AAA ATC 2019
Lys Gly Glu Arg Leu Phe Ile Asn Glu Glu Lys Ile
520 525
CTG TGG AGT GGG TTC TCC AGG GAG CCA CTC ACC TTT 2055
Leu Trp Ser Gly Phe Ser Arg Glu Pro Leu Thr Phe
530 535 540
GTG CTG TCT GTC CTC CAG GTG CCC TTC TCC AAC TGC 2091
Val Leu Ser Val Leu Gln Val Pro Phe Ser Asn Cys
545 550
AGC CGA GAC TGC CTG GCA GGG ACC AGG AAA GGG ATC 2127
Ser Arg Asp Cys Leu Ala Gly Thr Arg Lys Gly Ile
555 560
ATT GAG GGG GAG CCC ACC TGC TGC TTT GAG TGT GTG 2163
Ile Glu Gly Glu Pro Thr Cys Cys Phe Glu Cys Val
565 570 575
GAG TGT CGT GAT GGG GAG TAT AGT GAT GAG ACA GAT 2199
Glu Cys Pro Asp Gly Glu Tyr Ser Asp Glu Thr Asp
580 585
GCC AGT GCC TGT AAC AAG TGC CCA GAT GAC TTC TGG 2235
Ala Ser Ala Cys Asn Lys Cys Pro Asp Asp Phe Trp
590 595 600
TCC AAT GAG AAC CAC ACC TCC TGC ATT GCC AAG GAG 2271
Ser Asn Glu Asn His Thr Ser Cys Ile Ala Lys Glu
605 610
ATC GAG TTT CTG TCG TGG ACG GAG CCC TTT GGG ATC 2307
Ile Glu Phe Leu Ser Trp Thr Glu Pro Phe Gly Ile
615 620
GCA CTC ACC CTC TTT GCC GTG CTG GGC ATT TTC CTG 2343
Ala Leu Thr Leu Phe Ala Val Leu Gly Ile Phe Leu
625 630 635
ACA GCC TTT GTG CTG GGT GTG TTT ATC AAG TTC CGC 2379
Thr Ala Phe Val Leu Gly Val Phe Ile Lys Phe Arg
640 645
AAC ACA CCC ATT GTC AAG GCC ACC AAC CGA GAG CTC 2415
Asn Thr Pro Ile Val Lys Ala Thr Asn Arg Glu Leu
650 655 660
TCC TAC CTC CTC CTC TTC TCC CTG CTC TGC TGC TTC 2451
Ser Tyr Leu Leu Leu Phe Ser Leu Leu Cys Cys Phe
665 670
TCC AGC TCC CTG TTC TTC ATC GGG GAG CCC CAG GAC 2487
Ser Ser Ser Leu Phe Phe Ile Gly Glu Pro Gln Asp
675 680
TGG ACG TGC CGC CTG CGC CAG CCG GCC TTT GGC ATC 2523
Trp Thr Cys Arg Leu Arg Gln Pro Ala Phe Gly Ile
685 690 695
AGC TTC GTG CTC TGC ATC TCA TGC ATC CTG GTG AAA 2559
Ser Phe Val Leu Cys Ile Ser Cys Ile Leu Val Lys
700 705
ACC AAC CGT GTC CTC CTG GTG TTT GAG GCC AAG ATC 2595
Thr Asn Arg Val Leu Leu Val Phe Glu Ala Lys Ile
710 715 720
CCC ACC AGC TTC CAC CGC AAG TGG TGG GGG CTC AAC 2631
Pro Thr Ser Phe His Arg Lys Trp Trp Gly Leu Asn
725 730
CTG CAG TTC CTG CTG GTT TTC CTC TGC ACC TTC ATG 2667
Leu Gln Phe Leu Leu Val Phe Leu Cys Thr Phe Met
735 740
CAG ATT GTC ATC TGT GTG ATC TGG CTC TAC ACC GCG 2703
Gln Ile Val Ile Cys Val Ile Trp Leu Tyr Thr Ala
745 750 755
CCC CCC TCA AGC TAC CGC AAC CAG GAG CTG GAG GAT 2739
Pro Pro Ser Ser Tyr Arg Asn Gln Glu Leu Glu Asp
760 765
GAG ATC ATC TTC ATC ACG TGC CAC GAG GGC TCC CTC 2775
Glu Ile Ile Phe Ile Thr Cys His Glu Gly Ser Leu
770 775 780
ATG GCC CTG GGC TTC CTG ATC GGC TAC ACC TGC CTG 2811
Met Ala Leu Gly Phe Leu Ile Gly Tyr Thr Cys Leu
785 790
CTG GCT GCC ATC TGC TTC TTC TTT GCC TTC AAG TCC 2847
Leu Ala Ala Ile Cys Phe Phe Phe Ala Phe Lys Ser
795 800
CGG AAG CTG CCG GAG AAC TTC AAT GAA GCC AAG TTC 2883
Arg Lys Leu Pro Glu Asn Phe Asn Glu Ala Lys Phe
805 810 815
ATC ACC TTC AGC ATG CTC ATC TTC TTC ATC GTC TGG 2919
Ile Thr Phe Ser Met Leu Ile Phe Phe Ile Val Trp
820 825
ATC TCC TTC ATT CCA GCC TAT GCC AGC ACC TAT GGC 2955
Ile Ser Phe Ile Pro Ala Tyr Ala Ser Thr Tyr Gly
830 835 840
AAG TTT GTC TCT GCC GTA GAG GTG ATT GCC ATC CTG 2991
Lys Phe Val Ser Ala Val Glu Val Ile Ala Ile Leu
845 850
GCA GCC AGC TTT GGC TTG CTG GCG TGC ATC TTC TTC 3027
Ala Ala Ser Phe Gly Leu Leu Ala Cys Ile Phe Phe
855 860
AAC AAG ATC TAC ATC ATT CTC TTC AAG CCA TCC CGC 3063
Asn Lys Ile Tyr Ile Ile Leu Phe Lys Pro Ser Arg
865 870 875
AAC ACC ATC GAG GAG GTG CGT TGC AGC ACC GCA GCT 3099
Asn Thr Ile Glu Glu Val Arg Cys Ser Thr Ala Ala
880 885
CAC GCT TTC AAG GTG GCT GCC CGG GCC ACG CTG CGC 3135
His Ala Phe Lys Val Ala Ala Arg Ala Thr Leu Arg
890 895 900
CGC AGC AAC GTC TCC CGC AAG CGG TCC AGC AGC CTT 3171
Arg Ser Asn Val Ser Arg Lys Arg Ser Ser Ser Leu
905 910
GGA GGC TCC ACG GGA TCC ACC CCC TCC TCC TCC ATC 3207
Gly Gly Ser Thr Gly Ser Thr Pro Ser Ser Ser Ile
915 920
AGC AGC AAG AGC AAC AGC GAA GAC CCA TTC CCA CGG 3243
Ser Ser Lys Ser Asn Ser Glu Asp Pro Phe Pro Arg
925 930 935
CCC GAG AGG CAG AAG CAG CAG CAG CCG CTG GCC CTA 3279
Pro Glu Arg Gln Lys Gln Gln Gln Pro Leu Ala Leu
940 945
ACC CAG CAA GAG CAG CAG CAG CAG CCC CTG ACC CTC 3315
Thr Gln Gln Glu Gln Gln Gln Gln Pro Leu Thr Leu
950 955 960
CCA CAG CAG CAA CGA TCT CAG CAG CAG CCC AGA TGC 3351
Pro Gln Gln Gln Arg Ser Gln Gln Gln Pro Arg Cys
965 970
AAG CAG AAG GTC ATC TTT GGC AGC GGC ACG GTC ACC 3387
Lys Gln Lys Val Ile Phe Gly Ser Gly Thr Val Thr
975 980
TTC TCA CTG AGC TTT GAT GAG CCT CAG AAG AAC GCC 3423
Phe Ser Leu Ser Phe Asp Glu Pro Gln Lys Asn Ala
985 990 995
ATG GCC CAC AGG AAT TCT ACG CAC CAG AAC TCC CTG 3459
Met Ala His Arg Asn Ser Thr His Gln Asn Ser Leu
1000 1005
GAG GCC CAG AAA AGC AGC GAT ACG CTG ACC CGA CAC 3495
Glu Ala Gln Lys Ser Ser Asp Thr Leu Thr Arg His
1010 1015 1020
CAG CCA TTA CTC CCG CTG CAG TGC GGG GAA ACG GAC 3531
Gln Pro Leu Leu Pro Leu Gln Cys Gly Glu Thr Asp
1025 1030
TTA GAT CTG ACC GTC CAG GAA ACA GGT CTG CAA GGA 3567
Leu Asp Leu Thr Val Gln Glu Thr Gly Leu Gln Gly
1035 1040
CCT GTG GGT GGA GAC CAG CGG CCA GAG GTG GAG GAC 3603
Pro Val Gly Gly Asp Gln Arg Pro Glu Val Glu Asp
1045 1050 1055
CCT GAA GAG TTG TCC CCA GCA CTT GTA GTG TCC AGT 3639
Pro Glu Glu Leu Ser Pro Ala Leu Val Val Ser Ser
1060 1065
TCA CAG AGC TTT GTC ATC AGT GGT GGA GGC AGC ACT 3675
Ser Gln Ser Phe Val Ile Ser Gly Gly Gly Ser Thr
1070 1075 1080
GTT ACA GAA AAC GTA GTG AAT TCA TAAAATGGAA 3709
Val Thr Glu Asn Val Val Asn Ser
1085
GGAGAAGACT GGGCTAGGGA GAATGCAGAG AGGTTTCTTG 3749
GGGTCCCAGG GATGAGGAAT CGCCCCAGAC TCCTTTCCTC 3789
TGAGGAAGAA GGGATAATAG ACACATCAAA TGCCCCGAAT 3829
TTAGTCACAC CATCTTAAAT GACAGTGAAT TGACCCATGT 3869
TCCCTTTAAA ATTAAAAAAA AGAAGAGCCT TGTGTTTCTG 3909
TGGTTGCATT TGTCAAAGCA TTGAGATCTC CACGGTCAGA 3949
TTTGCTGTTC ACCCACATCT AATGTCTCTT CCTCTGTTCT 3989
ATCCCACCCA ACAGCTCAGA GATGAAACTA TGGCTTTAAA 4029
CTACCCTCCA GAGTGTGCAG ACTGATGGGA CATCAAATTT 4069
GCCACCACTA GAGCTGAGAG TCTGAAAGAC AGAATGTCAC 4109
CAGTCCTGCC CAATGCCTTG ACAACAGACT GAATTTTAAA 4149
TGTTCACAAC ATAAGGAGAA TGTATCTCCT CCTATTTATG 4189
AAAACCATAT GATATTTTGT CTCCTACCTG CTGCTGCTAT 4229
TATGTAACAT CCAGAAGGTT TGCACCCCTC CTATACCATA 4269
TGTCTGGTTC TGTCCAGGAC ATGATACTGA TGCCATGTTT 4309
AGATTCCAGG ATCACAAGAA TCACCTCAAA TTGTTAGGAA 4349
GGGACTGCAT AAACCAATGA GCTGTATCTG TAATTAATAT 4389
TCCTATATGT AGCTTTATCC TTAGGAAAAT GCTTCTGTTG 4429
TAATAGTCCA TGGACAATAT AAACTGAAAA ATGTCAGTCT 4469
GGTTTATATA AGGCAGTATT ATTGAGCTCT ATTTCCCCAC 4509
CCCACTATCC TCACTCCCAT AAGCTAAGCC TTATGTGAGC 4549
CCCTTCAGGG ACTCAAGGGT CCAGAAGTCC CTCCCATCTC 4589
TACCCCAAAG AATTCCTGAA GCCAGATCCA CCCTATCCCT 4629
GTACAGAGTA AGTTCTCAAT TATTGGCCTG CTAATAGCTG 4669
CTAGGGTAGG AAAGCGTGGT TCCAAGAAAG ATCCACCCTC 4709
AAATGTCGGA GCTATGTTCC CTCCAGCAGT GGTATTAATA 4749
CTGCCGGTCA CCCAGGCTCT GGAGCCAGAG AGACAGACCG 4789
GGGTTCAAGC CATGGCTTCG TCATTTGCAA GCTGAGTGAC 4829
TGTAGGCAGG GAACCTTAAC CTCTCTAAGC CACAGCTTCT 4869
TCATCTTTAA AATAAGGATA ATAATCATTC CTTCCCCTCA 4909
GAGCTCTTAT GTGGATTAAA CGAGATAATG TATATAAAGT 4949
ACTTTAGCCT GGTACCTAGC ACACAATAAG CATTCAATAA 4989
ATATTAGTTA ATATTAT 5006
(2)SEQ ID NO：2的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：3809个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA to mRNA
(ix)特性：
(A)名称/关键词CDS
(B)位置：373...3606
(D)其它资料：
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
CAACAGGCAC CTGGCTGCAG CCAGGAAGGA CCGCACGCCC 40
TTTCGCGCAG GAGAGTGGAA GGAGGGAGCT GTTTGCCAGC 80
ACCGAGGTCT TGCGGCACAG GCAACGCTTG ACCTGAGTCT 120
TGCAGAATGA AAGGCATCAC AGGAGGCCTC TGCATGATGT 160
GGCTTCCAAA GACTCAAGGA CCACCCACAT TACAAGTCTG 200
GATTGAGGAA GGCAGAAATG GAGATTCAAA CACCACGTCT 240
TCTATTATTT TATTAATCAA TCTGTAGACA TGTGTCCCCA 280
CTGCAGGGAG TGAACTGCTC CAAGGGAGAA ACTTCTGGGA 320
GCCTCCAAAC TCCTAGCTGT CTCATCCCTT GCCCTGGAGA 360
GACGGCAGAA CC ATG GCA TTT TAT AGC TGC TGC TGG 396
Met Ala Phe Tyr Ser Cys Cys Trp
1 5
GTC CTC TTG GCA CTC ACC TGG CAC ACC TCT GCC TAC 432
Val Leu Leu Ala Leu Thr Trp His Thr Ser Ala Tyr
10 15 20
GGG CCA GAC CAG CGA GCC CAA AAG AAG GGG GAC ATT 468
Gly Pro Asp Gln Arg Ala Gln Lys Lys Gly Asp Ile
25 30
ATC CTT GGG GGG CTC TTT CCT ATT CAT TTT GGA GTA 504
Ile Leu Gly Gly Leu Phe Pro Ile His Phe Gly Val
35 40
GCA GCT AAA GAT CAA GAT CTC AAA TCA AGG CCG GAG 540
Ala Ala Lys Asp Gln Asp Leu Lys Ser Arg Pro Glu
45 50 55
TCT GTG GAA TGT ATC AGG TAT AAT TTC CGT GGG TTT 576
Ser Val Glu Cys Ile Arg Tyr Asn Phe Arg Gly Phe
60 65
CGC TGG TTA CAG GCT ATG ATA TTT GCC ATA GAG GAG 612
Arg Trp Leu Gln Ala Met Ile Phe Ala Ile Glu Glu
70 75 80
ATA AAC AGC AGC CCA GCC CTT CTT CCC AAC TTG ACG 648
Ile Asn Ser Ser Pro Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr
85 90
CTG GGA TAC AGG ATA TTT GAC ACT TGC AAC ACC GTT 684
Leu Gly Tyr Arg Ile Phe Asp Thr Cys Asn Thr Val
95 100
TCT AAG GCC TTG GAA GCC ACC CTG AGT TTT GTT GCT 720
Ser Lys Ala Leu Glu Ala Thr Leu Ser Phe Val Ala
105 110 115
CAA AAC AAA ATT GAT TCT TTG AAC CTT GAT GAG TTC 756
Gln Asn Lys Ile Asp Ser Leu Asn Leu Asp Glu Phe
120 125
TGC AAC TGC TCA GAG CAC ATT CCC TCT ACG ATT GCT 792
Cys Asn Cys Ser Glu His Ile Pro Ser Thr Ile Ala
130 135 140
GTG GTG GGA GCA ACT GGC TCA GGC GTC TCC ACG GCA 828
Val Val Gly Ala Thr Gly Ser Gly Val Ser Thr Ala
145 150
GTG GCA AAT CTG CTG GGG CTC TTC TAC ATT CCC CAG 864
Val Ala Asn Leu Leu Gly Leu Phe Tyr Ile Pro Gln
155 160
GTC AGT TAT GCC TCC TCC AGC AGA CTC CTC AGC AAC 900
Val Ser Tyr Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ser Asn
165 170 175
AAG AAT CAA TTC AAG TCT TTC CTC CGA ACC ATC CCC 936
Lys Asn Gln Phe Lys Ser Phe Leu Arg Thr Ile Pro
180 185
AAT GAT GAG CAC CAG GCC ACT GCC ATG GCA GAC ATC 972
Asn Asp Glu His Gln Ala Thr Ala Met Ala Asp Ile
190 195 200
ATC GAG TAT TTC CGC TGG AAC TGG GTG GGC ACA ATT 1008
Ile Glu Tyr Phe Arg Trp Asn Trp Val Gly Thr Ile
205 210
GCA GCT GAT GAC GAC TAT GGG CGG CCG GGG ATT GAG 1044
Ala Ala Asp Asp Asp Tyr Gly Arg Pro Gly Ile Glu
215 220
AAA TTC CGA GAG GAA GCT GAG GAA AGG GAT ATC TGC 1080
Lys Phe Arg Glu Glu Ala Glu Glu Arg Asp Ile Cys
225 230 235
ATC GAC TTC AGT GAA CTC ATC TCC CAG TAC TCT GAT 1116
Ile Asp Phe Ser Glu Leu Ile Ser Gln Tyr Ser Asp
240 245
GAG GAA GAG ATC CAG CAT GTG GTA GAG GTG ATT CAA 1152
Glu Glu Glu Ile Gln His Val Val Glu Val Ile Gln
250 255 260
AAT TCC ACG GCC AAA GTC ATC GTG GTT TTC TCC AGT 1188
Asn Ser Thr Ala Lys Val Ile Val Val Phe Ser Ser
265 270
GGC CCA GAT CTT GAG CCC CTC ATC AAG GAG ATT GTC 1224
Gly Pro Asp Leu Glu Pro Leu Ile Lys Glu Ile Val
275 280
CGG CGC AAT ATC ACG GGC AAG ATC TGG CTG GCC AGC 1260
Arg Arg Asn Ile Thr Gly Lys Ile Trp Leu Ala Ser
285 290 295
GAG GCC TGG GCC AGC TCC TCC CTG ATC GCC ATG CCT 1296
Glu Ala Trp Ala Ser Ser Ser Leu Ile Ala Met Pro
300 305
CAG TAC TTC CAC GTG GTT GGC GGC ACC ATT GGA TTC 1332
Gln Tyr Phe His Val Val Gly Gly Thr Ile Gly Phe
310 315 320
GCT CTG AAG GCT GGG CAG ATC CCA GGC TTC CGG GAA 1368
Ala Leu Lys Ala Gly Gln Ile Pro Gly Phe Arg Glu
325 330
TTC CTG AAG AAG GTC CAT CCC AGG AAG TCT GTC CAC 1404
Phe Leu Lys Lys Val His Pro Arg Lys Ser Val His
335 340
AAT GGT TTT GCC AAG GAG TTT TGG GAA GAA ACA TTT 1440
Asn Gly Phe Ala Lys Glu Phe Trp Glu Glu Thr Phe
345 350 355
AAC TGC CAC CTC CAA GAA GGT GCA AAA GGA CCT TTA 1476
Asn Cys His Leu Gln Glu Gly Ala Lys Gly Pro Leu
360 365
CCT GTG GAC ACC TTT CTG AGA GGT CAC GAA GAA AGT 1512
Pro Val Asp Thr Phe Leu Arg Gly His Glu Glu Ser
370 375 380
GGC GAC AGG TTT AGC AAC AGC TCG ACA GCC TTC CGA 1548
Gly Asp Arg Phe Ser Asn Ser Ser Thr Ala Phe Arg
385 390
CCC CTC TGT ACA GGG GAT GAG AAC ATC AGC AGT GTC 1584
Pro Leu Cys Thr Gly Asp Glu Asn Ile Ser Ser Val
395 400
GAG ACC CCT TAC ATA GAT TAC ACG CAT TTA CGG ATA 1620
Glu Thr Pro Tyr Ile Asp Tyr Thr His Leu Arg Ile
405 410 415
TCC TAC AAT GTG TAC TTA GCA GTC TAC TCC ATT GCC 1656
Ser Tyr Asn Val Tyr Leu Ala Val Tyr Ser Ile Ala
420 425
CAC GCC TTG CAA GAT ATA TAT ACC TGC TTA CCT GGG 1692
His Ala Leu Gln Asp Ile Tyr Thr Cys Leu Pro Gly
430 435 440
AGA GGG CTC TTC ACC AAT GGC TCC TGT GCA GAC ATC 1728
Arg Gly Leu Phe Thr Asn Gly Ser Cys Ala Asp Ile
445 450
AAG AAA GTT GAG GCG TGG CAG GTC CTG AAG CAC CTA 1764
Lys Lys Val Glu Ala Trp Gln Val Leu Lys His Leu
455 460
CGG CAT CTA AAC TTT ACA AAC AAT ATG GGG GAG CAG 1800
Arg His Leu Asn Phe Thr Asn Asn Met Gly Glu Gln
465 470 475
GTG ACC TTT GAT GAG TGT GGT GAC CTG GTG GGG AAC 1836
Val Thr Phe Asp Glu Cys Gly Asp Leu Val Gly Asn
480 485
TAT TCC ATC ATC AAC TGG CAC CTC TCC CCA GAG GAT 1872
Tyr Ser Ile Ile Asn Trp His Leu Ser Pro Glu Asp
490 495 500
GGC TCC ATC GTG TTT AAG GAA GTC GGG TAT TAC AAC 1908
Gly Ser Ile Val Phe Lys Glu Val Gly Tyr Tyr Asn
505 510
GTC TAT GCC AAG AAG GGA GAA AGA CTC TTC ATC AAC 1944
Val Tyr Ala Lys Lys Gly Glu Arg Leu Phe Ile Asn
515 520
GAG GAG AAA ATC CTG TGG AGT GGG TTC TCC AGG GAG 1980
Glu Glu Lys Ile Leu Trp Ser Gly Phe Ser Arg Glu
525 530 535
GTG CCC TTC TCC AAC TGC AGC CGA GAC TGC CTG GCA 2016
Val Pro Phe Ser Asn Cys Ser Arg Asp Cys Leu Ala
540 545
GGG ACC AGG AAA GGG ATC ATT GAG GGG GAG CCC ACC 2052
Gly Thr Arg Lys Gly Ile Ile Glu Gly Glu Pro Thr
550 555 560
TGC TGC TTT GAG TGT GTG GAG TGT CCT GAT GGG GAG 2088
Cys Cys Phe Glu Cys Val Glu Cys Pro Asp Gly Glu
565 570
TAT AGT GAT GAG ACA GAT GCC AGT GCC TGT AAC AAG 2124
Tyr Ser Asp Glu Thr Asp Ala Ser Ala Cys Asn Lys
575 580
TGC CCA GAT GAC TTC TGG TCC AAT GAG AAC CAC ACC 2160
Cys Pro Asp Asp Phe Trp Ser Asn Glu Asn His Thr
585 590 595
TCC TGC ATT GCC AAG GAG ATC GAG TTT CTG TCG TGG 2196
Ser Cys Ile Ala Lys Glu Ile Glu Phe Leu Ser Trp
600 605
ACG GAG CCC TTT GGG ATC GCA CTC ACC CTC TTT GCC 2232
Thr Glu Pro Phe Gly Ile Ala Leu Thr Leu Phe Ala
610 615 620
GTG CTG GGC ATT TTC CTG ACA GCC TTT GTG CTG GGT 2268
Val Leu Gly Ile Phe Leu Thr Ala Phe Val Leu Gly
625 630
GTG TTT ATC AAG TTC CGC AAC ACA CCC ATT GTC AAG 2304
Val Phe Ile Lys Phe Arg Asn Thr Pro Ile Val Lys
635 640
GCC ACC AAC CGA GAG CTC TCC TAC CTC CTC CTC TTC 2340
Ala Thr Asn Arg Glu Leu Ser Tyr Leu Leu Leu Phe
645 650 655
TCC CTG CTC TGC TGC TTC TCC AGC TCC CTG TTC TTC 2376
Ser Leu Leu Cys Cys Phe Ser Ser Ser Leu Phe Phe
660 665
ATC GGG GAG CCC CAG GAC TGG ACG TGC CGC CTG CGC 2412
Ile Gly Glu Pro Gln Asp Trp Thr Cys Arg Leu Arg
670 675 680
CAG CCG GCC TTT GGC ATC AGC TTC GTG CTC TGC ATC 2448
Gln Pro Ala Phe Gly Ile Ser Phe Val Leu Cys Ile
685 690
TCA TGC ATC CTG GTG AAA ACC AAC CGT GTC CTC CTG 2484
Ser Cys Ile Leu Val Lys Thr Asn Arg Val Leu Leu
695 700
GTG TTT GAG GCC AAG ATC CCC ACC AGC TTC CAC CGC 2520
Val Phe Glu Ala Lys Ile Pro Thr Ser Phe His Arg
705 710 715
AAG TGG TGG GGG CTC AAC CTG CAG TTC CTG CTG GTT 2556
Lys Trp Trp Gly Leu Asn Leu Gln Phe Leu Leu Val
720 725
TTC CTC TGC ACC TTC ATG CAG ATT GTC ATC TGT GTG 2592
Phe Leu Cys Thr Phe Met Gln Ile Val Ile Cys Val
730 735 740
ATC TGG CTC TAC ACC GCG CCC CCC TCA AGC TAC CGC 2628
Ile Trp Leu Tyr Thr Ala Pro Pro Ser Ser Tyr Arg
745 750
AAC CAG GAG CTG GAG GAT GAG ATC ATC TTC ATC ACG 2664
Asn Gln Glu Leu Glu Asp Glu Ile Ile Phe Ile Thr
755 760
TGC CAC GAG GGC TCC CTC ATG GCC CTG GGC TTC CTG 2700
Cys His Glu Gly Ser Leu Met Ala Leu Gly Phe Leu
765 770 775
ATC GGC TAC ACC TGC CTG CTG GCT GCC ATC TGC TTC 2736
Ile Gly Tyr Thr Cys Leu Leu Ala Ala Ile Cys Phe
780 785
TTC TTT GCC TTC AAG TCC CGG AAG CTG CCG GAG AAC 2772
Phe Phe Ala Phe Lys Ser Arg Lys Leu Pro Glu Asn
790 795 800
TTC AAT GAA GCC AAG TTC ATC ACC TTC AGC ATG CTC 2808
Phe Asn Glu Ala Lys Phe Ile Thr Phe Ser Met Leu
805 810
ATC TTC TTC ATC GTC TGG ATC TCC TTC ATT CCA GCC 2844
Ile Phe Phe Ile Val Trp Ile Ser Phe Ile Pro Ala
815 820
TAT GCC AGC ACC TAT GGC AAG TTT GTC TCT GCC GTA 2880
Tyr Ala Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Val Ser Ala Val
825 830 835
GAG GTG ATT GCC ATC CTG GCA GCC AGC TTT GGC TTG 2916
Glu Val Ile Ala Ile Leu Ala Ala Ser Phe Gly Leu
840 845
CTG GCG TGC ATC TTC TTC AAC AAG ATC TAC ATC ATT 2952
Leu Ala Cys Ile Phe Phe Asn Lys Ile Tyr Ile Ile
850 855 860
CTC TTC AAG CCA TCC CGC AAC ACC ATC GAG GAG GTG 2988
Leu Phe Lys Pro Ser Arg Asn Thr Ile Glu Glu Val
865 870
CGT TGC AGC ACC GCA GCT CAC GCT TTC AAG GTG GCT 3024
Arg Cys Ser Thr Ala Ala His Ala Phe Lys Val Ala
875 880
GCC CGG GCC ACG CTG CGC CGC AGC AAC GTC TCC CGC 3060
Ala Arg Ala Thr Leu Arg Arg Ser Asn Val Ser Arg
885 890 895
AAG CGG TCC AGC AGC CTT GGA GGC TCC ACG GGA TCC 3096
Lys Arg Ser Ser Ser Leu Gly Gly Ser Thr Gly Ser
900 905
ACC CCC TCC TCC TCC ATC AGC AGC AAG AGC AAC AGC 3132
Thr Pro Ser Ser Ser Ile Ser Ser Lys Ser Asn Ser
910 915 920
GAA GAC CCA TTC CCA CAG CCC GAG AGG CAG AAG CAG 3168
Glu Asp Pro Phe Pro Gln Pro Glu Arg Gln Lys Gln
925 930
CAG CAG CCG CTG GCC CTA ACC CAG CAA GAG CAG CAG 3204
Gln Gln Pro Leu Ala Leu Thr Gln Gln Glu Gln Gln
935 940
CAG CAG CCC CTG ACC CTC CCA CAG CAG CAA CGA TCT 3240
Gln Gln Pro Leu Thr Leu Pro Gln Gln Gln Arg Ser
945 950 955
CAG CAG CAG CCC AGA TGC AAG CAG AAG GTC ATC TTT 3276
Gln Gln Gln Pro Arg Cys Lys Gln Lys Val Ile Phe
960 965
GGC AGC GGC ACG GTC ACC TTC TCA CTG AGC TTT GAT 3312
Gly Ser Gly Thr Val Thr Phe Ser Leu Ser Phe Asp
970 975 980
GAG CCT CAG AAG AAC GCC ATG GCC CAC GGG AAT TCT 3348
Glu Pro Gln Lys Asn Ala Met Ala His Gly Asn Ser
985 990
ACG CAC CAG AAC TCC CTG GAG GCC CAG AAA AGC AGC 3384
Thr His Gln Asn Ser Leu Glu Ala Gln Lys Ser Ser
995 1000
GAT ACG CTG ACC CGA CAC CAG CCA TTA CTC CCG CTG 3420
Asp Thr Leu Thr Arg His Gln Pro Leu Leu Pro Leu
1005 1010 1015
CAG TGC GGG GAA ACG GAC TTA GAT CTG ACC GTC CAG 3456
Gln Cys Gly Glu Thr Asp Leu Asp Leu Thr Val Gln
1020 1025
GAA ACA GGT CTG CAA GGA CCT GTG GGT GGA GAC CAG 3492
Glu Thr Gly Leu Gln Gly Pro Val Gly Gly Asp Gln
1030 1035 1040
CGG CCA GAG GTG GAG GAC CCT GAA GAG TTG TCC CCA 3528
Arg Pro Glu Val Glu Asp Pro Glu Glu Leu Ser Pro
1045 1050
GCA CTT GTA GTG TCC AGT TCA CAG AGC TTT GTC ATC 3564
Ala Leu Val Val Ser Ser Ser Gln Ser Phe Val Ile
1055 1060
AGT GGT GGA GGC AGC ACT GTT ACA GAA AAC GTA GTG 3600
Ser Gly Gly Gly Ser Thr Val Thr Glu Asn Val Val
1065 1070 1075
AAT TCA TAAAATGGAA GGAGAAGACT GGGCTAGGGA 3636
Asn Ser
GAATGCAGAG AGGTTTCTTG GGGTCCCAGG GATGAGGAAT 3676
CGCCCCAGAC TCCTTTCCTC TGAGGAAGAA GGGATAATAG 3716
ACACATCAAA TGCCCCGAAT TTAGTCACAC CATCTTAAAT 3756
GACAGTGAAT TGACCCATGT TCCCTTTAAA AAAAAAAAAA 3796
AAAAAGCGGC CGC 3809