增强β-葡糖苷酶产生的 遗传构建物和遗传修饰的微生物 发明背景
1．发明领域
本发明涉及遗传修饰微生物以增强工业上重要的β-葡糖苷酶的生产。本发明还涉及遗传构建物，所述遗传构建物明显增加由包含所述构建物的微生物产生的β-葡糖苷酶量。
2．相关技术背景
由于可获得大量纤维素原料、客观需要避免焚烧或掩埋所述材料以及洁净乙醇燃料，由纤维素生产乙醇的可能性受到极大关注。在Atlantic Monthly的1996年4月刊的封面报道中描述了这样一种方法对社会的好处。
用于这样一种方法的天然纤维素原料被称为“生物质(biomass)”。许多类型的生物质已经被认为是乙醇生产的原料，其中包括木材、农业残余物、草本作物和城市固体垃圾。这些材料主要包含纤维素、半纤维素和木质素。本发明可以应用于将纤维素转化为乙醇。
纤维素是葡萄糖单糖通过β-1,4键连接而成的聚合物。纤维素极其耐受酸、酶或微生物的降解或解聚作用。一旦将纤维素转化为葡萄糖，用酵母可以容易地将得到的糖发酵为乙醇。这种方法中困难的问题是将纤维素转化为葡萄糖。
研究纤维素转化为葡萄糖的最古老的方法是建立在酸水解的基础上(Grethlein综述于，“纤维素材料地化学分解”，J.Appl.Chem.Biotechnol.28:296-308(1978))。该方法涉及使用浓酸或稀酸。浓酸法产生高产量的纤维素，但酸的回收、所需构造的特殊材料以及使系统中的水最小化的需要是该方法的严重缺陷。稀酸法使用低浓度酸解决了需要回收化合物的问题。然而，最大的葡萄糖产量仅是纤维素的约55％，并且降解产物的高水平产生可以抑制酵母发酵产生乙醇。这些问题阻止酸水解方法达到商业化。
为克服酸水解方法的问题，最近，纤维素转化方法集中于使用纤维素酶的酶水解。纤维素的酶水解如下进行：混合底物和水，获得含5％到12％纤维素的淤浆，然后以每克纤维素5到50国际单位(IU)加入纤维素酶。通常水解在35-60℃,pH 4-6条件下进行12到150小时。
许多微生物产生水解纤维素的酶，包括木腐真菌木霉菌属(Trichoderma)，堆肥细菌高温单孢菌属(Thermomonospora)、芽孢杆菌属(Bacillus)和纤维单胞菌属(Cellulomonas)；链霉菌属(Streptomyces)；以及真菌腐质霉属(Humicola)、曲霉属(Aspergillus)和镰孢霉属(Fusarium)。这些微生物产生的酶是蛋白的混合物，所述蛋白在纤维素到葡萄糖的转化中有三种有用的作用类型：内切葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶。EG和CBH酶统称为“纤维素酶”。
EG酶在随机位点切割纤维素聚合物，解开纤维素使之受到CBH酶的攻击。例如，木霉菌属菌株产生至少四种各不相同的EG酶，被称为EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ和EGⅤ。
随后，CBH酶从纤维素聚合物的末端释放纤维二糖分子。纤维二糖是葡萄糖的水溶性β-1,4键连接二聚物。木霉菌属主要产生两种CBH酶，即CBHⅠ和CBHⅡ。
β-葡糖苷酶水解纤维二糖成为葡萄糖。木霉菌属产生一种β-葡糖苷酶。
由β-葡糖苷酶催化的纤维素水解的最后一个步骤是重要的，因为葡萄糖可以容易地被多种酵母发酵成为乙醇，而纤维二糖就不是这样。任何在所述水解结束时剩余的纤维二糖都意味着乙醇产量的损失。更重要的是，纤维二糖是CBH酶和EG酶极其有效的抑制物。仅仅在3.3g/L的浓度，纤维二糖就降低木霉菌属CBH酶和EG酶的水解速度达50％。水解速度的降低使得有必要加入更高水平的纤维素酶，这对总体工艺经济产生负面影响。因此，在水解过程中纤维二糖的积累对于乙醇生产来说是特别不希望的。
因为木霉菌属以及其它产生纤维素酶的微生物产生非常少的β-葡糖苷酶，所以纤维二糖的积累已经成为酶水解中的主要问题。木霉菌属产生的总体蛋白中有少于1％的蛋白是β-葡糖苷酶。β-葡糖苷酶的低含量导致缺乏水解纤维二糖成为葡萄糖的能力以及水解过程中积累10到20 g/L的纤维二糖。高水平的纤维二糖使需要的纤维素酶的量较存在足量β-葡糖苷酶时所需的量的增加10倍。
已经提出几种方法以克服纤维素酶中β-葡糖苷酶的缺乏。
一种方法是使用产生少量纤维素酶的微生物产生β-葡糖苷酶，并将这种β-葡糖苷酶外源性加入纤维素酶中以增强水解。最成功的这样产生β-葡糖苷酶的微生物是黑曲霉(Aspergillus niger)和海枣曲霉(Aspergillus phoenicis)。来自这些微生物的β-葡糖苷酶可以商业获得Novo Nordisk的Novozym 188。然而，所需的量对于生物质商业化为乙醇的操作来说太过昂贵了。
第二种克服β-葡糖苷酶缺乏的方法是在纤维素水解的同时用酵母发酵葡萄糖，即所谓的同步糖化及发酵(simultaneoussaccharification and fermentation)(SSF)法。在SSF系统中，葡萄糖的发酵将葡萄糖从溶液中除去。葡萄糖是β-葡糖苷酶的有效抑制物，因此SSF是增加β-葡糖苷酶效率的一种尝试。然而，SSF目前在商业上仍然不可行，因为酵母的工作温度28℃对于纤维素酶所要求的50℃环境太低了；而在折衷的温度37℃下操作是无效率的，并且易于发生微生物污染。
第三种克服β-葡糖苷酶缺乏的方法是使用遗传工程以使木霉菌属菌过量表达该酶并增加它的产量。Barnett,Berka和Fowler,在“从Trichoderma reesei中克隆和扩增编码细胞外β-葡糖苷酶的基因：改善纤维素底物的糖化作用速率的证据,”Bio/Technology,第9卷，1991年6月，第562-567页(本文中称为”Barnett等”)；以及Fowler,Barnett和Shoemaker在WO 92/10581,“通过克隆和扩增Trichoderma reesei的β-葡糖苷酶基因改善纤维素的糖化作用”(本文中称为”Fowler等”)中采用了这种方法。
Barnett等和Fowler等都描述了在Trichoderma reesei菌株P40中插入多拷贝β-葡糖苷酶基因。两个研究小组都构造了质粒pSASβ-glu,即一种包含基因组T.reesei β-葡糖苷酶基因和amdS选择标记的转化载体。amdS基因得自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，编码乙酰胺酶，该酶使转化细胞能在乙酰胺作为唯一氮源时生长。T.reesei不含有amdS基因的有功能的等价物，因此不能利用乙酰胺作为氮源。转化细胞包含10到15个拷贝β-葡糖苷酶基因，其产生的β-葡糖苷酶是未转化的细胞产生的β-葡糖苷酶的5.5倍。
由Barnett等和Fowler等获得的β-葡糖苷酶产量增加不足以缓解纤维素水解的β-葡糖苷酶缺乏。例如由天然木霉菌属菌株产生的β-葡糖苷酶的量，必须增加至少10倍才能满足纤维素水解的需要。
当在木霉菌属中过量表达蛋白时，一种策略是将目的基因直接与cbh1启动子或cbh1分泌信号连接。由于CBH1是在诱导纤维素酶的条件下木霉菌属产生的最丰富的蛋白，因此cbh1启动子和分泌信号被认为能非常有效地指导在遗传构建物中位于它们之后的基因所编码的蛋白的转录和分泌。这样一种策略已经成功地用来由木霉菌属和其它微生物过量表达蛋白(Margolles-Clark,Hayes,Harman和Penttila,1996,“通过在Trichoderma reesei中表达提高Trichodermaharzianum内切壳多糖酶的产量”，Appl.Environ.Microbiol.62(6):2145-2151；Joutsjouki,Torkkeli和Nevalainen,1993,“用Hormoconisresinae葡糖淀粉酶P(gamP)基因转化Trichoderma reesei:Trichodermareesei产生异源葡糖淀粉酶”，Curr.Genet.24:223-228；Karhunen,Mantyla,Nevalainen和Souminen,1993,“在Trichoderma reesei中高频率一步基因取代1.过量产生内切葡聚糖酶Ⅰ”,Mol.Gen.Genet.241:515-522)。
尽管进行了大量的研究努力，但目前还没有产生足够高水平β-葡糖苷酶的方法。这样一种方法将是由纤维素生产乙醇燃料中的一大进步。
发明概述
本发明人发现能够以比目前可获得水平高得多的水平产生β-葡糖苷酶。高水平的β-葡糖苷酶提高了酶水解纤维素为葡萄糖的效率。其导致对酶要求的降低、纤维素转化增加、水解时间减少或这些优势的组合，降低了转化纤维素成为乙醇的总体工艺成本。
本发明人已经发现了遗传构建物，所述遗传构建物使表达所述构建物的重组微生物的β-葡糖苷酶产量增加。完成这项任务的遗传构建物包含编码成熟β-葡糖苷酶和木聚糖酶分泌信号的DNA序列。
就本发明人所知，以前还没有将木聚糖酶分泌信号与成熟β-葡糖苷酶连接增加β-葡糖苷酶产量的报道。此外，本发明人还未了解到以前有将木聚糖酶分泌信号与任何非木聚糖酶成熟蛋白连接增加所述蛋白产生的报道。本发明人已经发现了这个惊人并且未经报道的结果。更令人吃惊的是，使用木聚糖酶分泌信号比使用cbh1分泌信号产生更高水平的β-葡糖苷酶。由于木聚糖酶在木霉菌属产生的总体蛋白中占的比例比CBH1小得多(分别是5％和60％)，人们预计cbh1分泌序列应该更有效。将木聚糖酶分泌信号与成熟β-葡糖苷酶连接后增加β-葡糖苷酶产量的原因还未知，但可能与β-葡糖苷酶分泌信号和木聚糖酶分泌信号在长度上的相似性有关，或者与木聚糖酶更低的丰富性、而重组β-葡糖苷酶必须与之竞争以分泌出细胞有关。然而，本发明的实践并不受到这些或其它任何特定原因的限制。
Barnett等人和Fowler等人各自公开了通过重组方法增强β-葡糖苷酶的表达，但都没有预计到本发明。Barnett等人和Fowler等人的遗传构建物包含β-葡糖苷酶的启动子、编码区和分泌信号。Barnett等人和Fowler等人所使用的方法不如本发明人所认识的方法有效，并且没有预计到本发明的遗传构建物。
在本发明的一个方面，用于产生β-葡糖苷酶的遗传修饰微生物包含β-葡糖苷酶构建物，其中在衍生所述遗传修饰的微生物的未转化微生物中并不存在所述β-葡糖苷酶构建物，所述β-葡糖苷酶构建物包含启动子、木聚糖酶分泌信号以及成熟β-葡糖苷酶编码区，所述遗传修饰的微生物选自：木霉菌属、腐质霉属、镰孢霉属、链霉菌属、高温单孢菌属、芽孢杆菌属、纤维单胞菌属和曲霉属，并且与所述未转化的微生物相比，所述遗传修饰的微生物使β-葡糖苷酶的产量至少增加到10倍。
另一方面，本发明包括β-葡糖苷酶遗传构建物，该遗传构建物包含启动子、木聚糖酶分泌信号以及成熟β-葡糖苷酶编码区，其中当将所述β-葡糖苷酶遗传构建物引入未转化的微生物宿主并在其中表达时，使β-葡糖苷酶的产量与所述未转化的微生物相比至少增加到10倍，其中所述未转化的微生物宿主选自：木霉菌属、腐质霉属、镰孢霉属、链霉菌属、高温单孢菌属、芽孢杆菌属、纤维单胞菌属和曲霉属。
在本发明的又一方面，产生β-葡糖苷酶的遗传修饰的木霉菌属微生物包含在未转化的木霉菌属微生物中不存在的β-葡糖苷酶构建物，所述β-葡糖苷酶构建物包含启动子、木聚糖酶分泌信号以及成熟β-葡糖苷酶编码区，其中与所述未转化的木霉菌属微生物相比，所述遗传修饰的木霉菌属使β-葡糖苷酶的产量至少增加到10倍。
在本发明的再一方面，产生β-葡糖苷酶的遗传修饰的Trichoderma reesei微生物包含在未转化的Trichoderma reesei微生物中不存在的β-葡糖苷酶构建物，所述β-葡糖苷酶构建物包含启动子、木聚糖酶分泌信号以及成熟β-葡糖苷酶编码区，其中与所述未转化的微生物相比，所述遗传修饰的Trichoderma reesei微生物使β-葡糖苷酶产量至少增加到10倍。
在本发明的又一方面，β-葡糖苷酶构建物包含启动子、木聚糖酶分泌信号以及成熟β-葡糖苷酶编码区，其中当将所述β-葡糖苷酶遗传构建物引入木霉菌属微生物并在其中表达时，使β-葡糖苷酶产量与未转化的木霉菌属微生物相比至少增加到10倍。
在本发明的再一方面，β-葡糖苷酶构建物包含启动子、木聚糖酶分泌信号以及成熟β-葡糖苷酶编码区，其中当将所述β-葡糖苷酶遗传构建物引入Trichoderma reesei微生物并在其中表达时，使β-葡糖苷酶的产量与未转化的Trichoderma reesei微生物相比至少增加到10倍。
根据下面的优选实施方案和附图的详细描述，本发明的其它方面将得到更好的理解，本发明的优势将更为明显。
附图简述
图1：载体pCBG1-TV的限制酶图谱以及CBH1分泌信号/成熟β-葡糖苷酶连接处的氨基酸序列。
图2：载体pXBG1-TV的限制酶图谱以及木聚糖酶Ⅱ分泌信号/成熟β-葡糖苷酶连接处的氨基酸序列。
图3：载体pC/XBG(Xba1)-TV的限制酶图谱以及木聚糖酶Ⅱ分泌信号/成熟β-葡糖苷酶连接处的氨基酸序列。
图4：从T.reesei菌株RutC30和M2C38分离的基因组DNA的DNA印迹分析，使用包含M2C38木聚糖酶启动子和分泌信号的标记DNA片段探测。
图5：从T.reesei菌株RutC30和M2C38分离的基因组DNA的DNA印迹分析，使用包含M2C38成熟β-葡糖苷酶编码区的标记DNA片段探测。
优选实施方案的详细描述
描述本发明的优选实施方案时，首先定义下面的术语。
β-葡糖苷酶(beta-glucosidase)是水解葡萄糖二聚体纤维二糖成为葡萄糖的酶。许多微生物产生β-葡糖苷酶，并且这些酶的性质各不相同，所述性质包括结构(分子量、三维取向、氨基酸组成和活性部位)和催化活性(纤维二糖水解的速率和动力学以及作用于其它底物的能力)。然而，在所有的情况下，β-葡糖苷酶均可以水解纤维二糖成为葡萄糖。当所述有活性的酶不含有β-葡糖苷酶分泌信号肽时，也可以称为成熟的β-葡糖苷酶。
为实施本发明而优选的β-葡糖苷酶是木霉菌属产生的β-葡糖苷酶。该β-葡糖苷酶的分子量为74,000(接SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定)，等电点为8.3(接非变性等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳测定)。
β-葡糖苷酶基因是编码β-葡糖苷酶的产生的DNA区。所有产生β-葡糖苷酶的微生物具有至少一个β-葡糖苷酶基因。天然的β-葡糖苷酶基因包含β-葡糖苷酶启动子、分泌信号、编码区以及转录终止子。不产生β-葡糖苷酶的微生物通常不包含有活性或有功能的β-葡糖苷酶基因。
β-葡糖苷酶分泌信号是编码β-葡糖苷酶分泌信号肽的DNA序列。
β-葡糖苷酶分泌信号肽是存在于编码的β-葡糖苷酶氨基末端的肽序列，随后在成熟β-葡糖苷酶转运出微生物细胞外的过程中被除去。所述分泌信号可以包含前肽(pro-peptide)、原肽(pre-peptide)或二者都有。
成熟β-葡糖苷酶编码区包含编码有功能的β-葡糖苷酶所必需的DNA序列，但不包含编码β-葡糖苷酶分泌信号的DNA序列，所述有功能的β-葡糖苷酶就如从细胞外培养物滤液所分离的一样。
木聚糖酶是水解木聚糖成为木糖的酶。许多微生物产生木聚糖酶，并且这些酶的性质各不相同，包括结构(分子量、三维取向、氨基酸组成和活性部位)和催化活性(木聚糖水解的速率和动力学以及作用于其它底物的能力)。然而，在所有的情况下，木聚糖酶均可以水解木聚糖成为木糖。当所述有活性的酶不含有木聚糖酶分泌信号肽时，也可以称为成熟的木聚糖酶。
一些最重要的商业化木聚糖酶被归类称为木聚糖酶家族11。如果一种木聚糖酶包含家族11所共有的氨基酸，包括两个作为主要催化残基的谷氨酸残基，那么这种木聚糖酶就被归类于家族11中。根据Trichoderma reesei木聚糖酶Ⅱ编号，上述残基是氨基酸86和177。木聚糖酶家族11所共有的氨基酸描述在Wakarchuck等人，ProteinScience 3:467-475(1994)中。
木聚糖酶基因是编码木聚糖酶产生的DNA区。所有产生木聚糖酶的微生物包含至少一个木聚糖酶基因。天然的木聚糖酶基因包含木聚糖酶启动子、分泌信号、编码区和转录终止子。不产生木聚糖酶的微生物通常不包含有活性或有功能的木聚糖酶基因。
木聚糖酶分泌信号是编码木聚糖酶分泌信号肽的DNA序列。
木聚糖酶分泌信号肽是存在于编码的木聚糖酶氨基末端的肽序列，随后在成熟木聚糖酶转运到微生物细胞外的过程中被除去。所述分泌信号可以包含前肽(pro-peptide)、原肽(pre-peptide)或二者都有。
纤维素酶是水解纤维素成为短的葡萄糖β-1,4键连接寡聚物的酶，所述短的葡萄糖β-1,4键连接寡聚物包括纤维四糖、纤维三糖和纤维二糖。许多微生物产生一种或多种常常被归类为纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶的纤维素酶。这些酶的性质各不相同，所述性质包括结构(分子量、三维取向、氨基酸组成和活性部位)和催化活性(木聚糖水解的速率和动力学以及作用于其它底物的能力)。然而，在所有的情况下，纤维素酶均可以水解纤维素成为短的葡萄糖β-1,4键连接寡聚物，包括纤维四糖、纤维三糖和纤维二糖。
β-葡糖苷酶遗传构建物是指包含产生β-葡糖苷酶所必需元件的基因。这些元件包括：a．成熟β-葡糖苷酶的编码区。
在优选的实施方案中，成熟β-葡糖苷酶的编码区包含木霉菌属基因的成熟β-葡糖苷酶的编码区。在Barnett等人的图1中可以发现来自Trichoderma reesei的成熟β-葡糖苷酶编码区的DNA序列。
本领域内的技术人员知道，可以通过一个或多个核酸的置换、取代、添加或去除而修饰天然结构区但不改变它的功能。本发明的实践包括对成熟β-葡糖苷酶编码区进行这样的改变，同时又不受限于这样的改变。b．木聚糖酶分泌信号。
在优选的实施方案中，所述木聚糖酶分泌信号包含木聚糖酶家族11的基因的木聚糖酶分泌信号。
在更优选的实施方案中，木聚糖酶家族11的基因是木霉菌属木聚糖酶基因。
在甚至更优选的实施方案中，所述木糖酶分泌信号包括木霉菌属木聚糖酶Ⅰ(xln1)基因或木聚糖酶Ⅱ(xln2)基因的木聚糖酶分泌信号。木霉菌属xln1和xln2分泌信号的DNA序列可以在Torronen,Mach,Messner,Gonzalez,Kalkkinen,Harkki和Kubicek,“来自Trichodermareesei的两种主要木聚糖酶：两种酶和基因的特征鉴定，”Bio/Technology 10:1461-1465,1992的图3和图2(公开出版的图例中的基因标识是颠倒的)中可以分别发现。
本领域内的技术人员知道，可以通过一个或多个核酸的置换、取代、添加或去除而修饰天然分泌信号但不改变它的功能。本发明的实践包括木聚糖酶分泌信号的这样的改变，同时又不受这样的改变所限制。c．启动子
本发明的实践并不受遗传构建物中启动子的选择限制。然而，优选的启动子是木霉菌属cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1和xln2启动子。Trichoderma reesei cbh1的DNA序列保藏于GenBank中，其保藏号为D86235。
本领域内的技术人员知道，可以通过一个或多个核苷酸的置换、取代、添加或去除而修饰天然启动子但不改变它的功能。本发明的实践包括启动子的这样的改变，同时又不受这样的改变限制。d．在木聚糖酶分泌信号和成熟β-葡糖苷酶编码区之间添加的序列
实施例5、6和7中所述的遗传构建物包含如图1-3所示的DNA序列的九个添加的碱基对；前三个碱基对编码在Trichoderma reesei木聚糖酶Ⅱ基因的分泌信号之后的谷胺酰胺残基，其余六个碱基对产生自独特限制位点的插入和/或修饰，所述独特限制位点的插入和/或修饰用于连接木聚糖酶分泌信号到成熟β-葡糖苷酶编码区。这些DNA序列使得在木聚糖酶分泌信号肽和成熟β-葡糖苷酶之间存在添加的氨基酸。这些DNA序列可以是天然的或合成的，可以编码对应于所述构建物编码的木聚糖酶分泌信号的成熟木聚糖酶的一个或多个氨基酸，或者可以来自连接木聚糖酶分泌信号肽和成熟β-葡糖苷酶所需的限制酶位点的添加。本发明的实践包括但不限于在木聚糖酶分泌信号和成熟β-葡糖苷酶编码区之间存在添加的DNA序列。e．其它元件
所述遗传构建物紧接在成熟β-葡糖苷酶编码区的下游包含一个转录终止子。本发明的实践不受转录终止子选择的限制，并可以包括足以指导RNA聚合酶终止转录的在任何已知编码区的终止密码子下游(即在3′末端)的DNA。在实施例5-7所述的遗传构建物中，存在于所述成熟β-葡糖苷酶编码区下游的转录终止子包含3′到木霉菌属cbh2基因终止密码子的1.9kb DNA。
在Chen,Gritzali和Stafford,“Trichoderma reesei的纤维二糖水解酶Ⅱ的核苷酸序列和推定的一级结构，”Bio/Technology 5:274-278,1987的图2中可以发现位于紧接在TAA终止密码子下游(或3′)的Trichoderma reesei cbh2转录终止子的前553个碱基对的DNA序列。
所述遗传构建物包含一个选择标记，该选择标记可以在同一个质粒载体上存在于所述遗传构建物的上游或下游(即在所述构建物的5′或3′末端)，或可以与存在于一个单独的载体上的所述构建物共转化。选择标记是本领域内的技术人员非常熟悉的，包括赋予转化细胞利用代谢物(该代谢物通常不被所述微生物代谢)的能力(如构巢曲霉amdS基因编码乙酰胺酶并赋予在乙酰胺作为唯一氮源时生长的能力)，或赋予对抗生素的抗性(如大肠杆菌hph基因编码潮霉素b磷酸转移酶并赋予对潮霉素的抗性)的基因。如果宿主菌株缺乏所选定标记的有功能的基因，那么该基因可以用作选择标记。这样的标记的例子包括trp、pyr4、pyrG、argB、leu等等。因此，相应的宿主菌株必须缺乏对应于选定标记的有功能的基因，即trp、pyr、arg、leu等等。在实施例5-7中所述的在遗传构建物中使用的选择标记是从木霉菌属磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子表达的大肠杆菌hph基因。
在Gritz和Davies,“质粒编码的潮霉素B抗性：潮霉素B磷酸转移酶基因的序列及其在大肠杆菌和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的表达,”Gene 25:179-188,1983的图4中可以发现大肠杆菌hph基因的DNA序列；在Vanhanen,Saloheimo,Ilmen,Knowles和Penttila,“Trichoderma reesei 3-磷酸甘油酸激酶编码基因(pgk1)的启动子结构和表达,”Gene 106:129-133,1991的图2中可以发现Trichoderma reesei pgk启动子的DNA序列。
本发明一个优选的实施方案包含迄今所描述的β-葡糖苷酶遗传构建物。本发明的实践不受制造所述构建物的方法的限制，所述方法可以包括但不限制于标准的分子生物学技术，如通过碱裂解从大肠杆菌分离质粒DNA、用限制性内切核酸酶消化质粒DNA、通过琼脂糖凝胶电泳分开和分离DNA片段、用T4 DNA连接酶连接DNA片段、通过聚合酶链反应或添加寡聚核苷酸接头在DNA片段的末端插入独特的限制位点、以及使用T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的克列诺片段平端化DNA片段。
实施例1-7描述了制造这类遗传构建物的方法。
在本发明另一个优选的实施方案中，将所述β-葡糖苷酶遗传构建物引入微生物宿主并在其中表达，以产生遗传修饰的微生物。与未转化的微生物宿主相比，得到的遗传修饰的微生物产生的β-葡糖苷酶增加。与未转化的微生物宿主相比，所述遗传修饰的微生物产生β-葡糖苷酶的水平最好增加到至少约10倍，更优选与未转化的微生物宿主相比增加到至少约40倍，最优选与未转化的微生物宿主相比增加到至少约120倍。
本发明包括本领域内的技术人员所熟悉的将β-葡糖苷酶遗传构建物引入所述微生物宿主的任何方法，所述方法包括但不限于：对细菌细胞或真菌原生质体进行氯化钙处理以削弱细胞膜、加入聚乙二醇以使细胞膜融合、通过电穿孔去极化细胞膜或用粒子枪将DNA借助微粒轰击射穿细胞壁和细胞膜。
实施例8描述了使用粒子枪将β-葡糖苷酶遗传构建物引入木霉菌属孢子的方法。
与未转化微生物宿主相比，β-葡糖苷酶产量增强到10倍说明明显高于所述菌株的天然变异并且具有商业意义。通过这种方法增加β-葡糖苷酶的程度已经高达126倍并且可以达到1000倍以上。通过使培养物生长并测量β-葡糖苷酶活性，测量β-葡糖苷酶产量增加的程度，如实施例11中所述。据信本发明的遗传构建物将产生10倍以上的任何水平的所述酶产量。
本领域技术人员知道，可以通过降低酶混合物中纤维素酶和其它蛋白的量而增加酶混合物的β-葡糖苷酶比活(单位是IU/mg蛋白)。可以通过物理和机械分离所述酶混合物而做到这一点，或者通过重组方法去除纤维素酶或其它基因而做到这一点。这样的方法对微生物的β-葡糖苷酶实际产量有很少或没有影响。然而，这些方法可以可选地包括在本发明的实践中。
在优选的实施方案中，所述微生物宿主是木霉菌属、腐质霉属、镰孢霉属、曲霉属、链霉菌属、高温单孢菌属、芽孢杆菌属或纤维单胞菌属的物种的其中之一。这些物种除了产生β-葡糖苷酶外，还产生纤维素酶，所以非常合适。此外，已经公开了将DNA构建物引入产生纤维素酶的以下菌株的方法：木霉菌属(Lorito,Hayes,DiPietro和Harman,1993,“使用质粒DNA和基因组DNA生物发射(biolistic)转化Trichoderma harzianum和绿粘帚霉(Gliocladium virens),”Curr.Genet.24:349-356；Goldman,VanMontagu和Herrera-Estrella,1990,“通过高压电脉冲转化Trichoderma harzianum”,Curr.Genet.17:169-174；Penttila,Nevalainen,Ratto,Salminen和Knowles,1987,“纤维素分解真菌Trichoderma reesei的一种通用转化系统”，Gene 6:155-164)、曲霉属(Yelton,Hamer和Timberlake,1984,“使用trpC质粒转化构巢曲霉，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474)、镰孢霉属(Bajar,Podila和Kolattukudy,1991,“鉴定由植物信号通过磷酸化的反式作用因子诱导的真菌角质酶启动子，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8202-8212)、链霉菌属(Hopwood等人，1985,“链霉菌属的遗传操作：实验室手册，”The John Innes Foundation,Norwich,UK)和芽孢杆菌属(Brigidi,DeRossi,Bertarini,Riccardi和Matteuzzi,1990,“通过电穿孔对枯草芽孢杆菌完整细胞的遗传转化，”FEMS Microbiol.Lett.55:135-138)。
在这些公开的转化方法中使用的遗传构建物与实施例5-7中描述的那些构建物相似，因为它们包含连接到蛋白编码区(该编码区可以编码一个选择标记)的一个启动子和一个转录终止子。在大多数情况下，所述遗传构建物与一个选择标记基因连接。
虽然还没有转化腐质霉属、高温单孢菌属或纤维单胞菌属的公开的方法，但借助于这些物种与其它已经公开了转化方法的物种在形态学和生理学上的相似，相信可以优化针对其它丝状真菌或细菌的转化方法以应用于腐质霉属、高温单孢菌属或纤维单胞菌属菌株。此外，如电穿孔和粒子轰击之类的转化方法已经用于将DNA引入许多不同的细胞类型，其中包括哺乳动物细胞和植物细胞、细菌细胞、酵母细胞和真菌细胞。
在优选的实施方案中，木聚糖酶分泌信号对于衍生所述遗传修饰的微生物的微生物宿主来说是天然的(即所述木聚糖酶分泌信号的来源是与衍生所述遗传修饰微生物的微生物宿主属于同一类型的微生物宿主)。
在一个更优选的实施方案中，所述微生物宿主是木霉菌属。
在一个更优选的实施方案中，所述微生物宿主是Trichodermareesei。
实施例
实施例1描述从Trichoderma reesei菌株RutC30、M2C38、BTR48以及这些菌株的遗传修饰衍生物中分离基因组DNA。实施例2-7描述基因组DNA文库的构建、不同基因的克隆以及几个来自Trichoderma reesei菌株M2C38的遗传构建物。实施例9和11-15描述在Trichoderma reesei菌株M2C38、BTR48和RutC30中β-葡糖苷酶遗传构建物的转化和表达。
Trichoderma reesei菌株M2C38和BTR48是Iogen公司的专利菌株，由Trichoderma reesei RutC30(ATCC 56765,Montenecourt和Eveleigh,1979,“T.reesei高产量产生纤维素酶的突变体的选择性分离”,Adv.Chem.Ser.181:289-301)衍生得到，而Trichoderma reeseiRutC30又从Trichoderma reesei Qm6A(ATCC 13631 Mandels和Reese,1957 “受到碳源和金属影响的绿色木霉(Trichoderma viride)中纤维素酶的诱导”，J.Bacteriol.73:269-278)衍生得到。
在实施例1和随后的实施例中，限制性内切核酸酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的克列诺片段购自Gibco/BRL、New England Biolabs、Boehringer Mannheim或Pharmacia并按照厂家建议使用。在所有的聚合酶链反应(PCR)中都按照厂家的方法使用具有校正活性的Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim)。潮霉素B购自CalBiochem。
实施例1
分离Trichoderma reesei基因组DNA
为分离基因组DNA，将用无菌接种环从Potato Dextrose Agar平板上收集的T.reesei孢子接种到50ml Potato Dextrose Broth(Difco)。所述培养物在28℃、200rpm振荡培养2-3天。将菌丝过滤到无菌GFA玻璃微纤维滤膜(Whatman)上，并用冷的去离子水洗。将真菌饼(fungal cake)在液氮中冷冻，然后用预冷的研钵和研杵压碎成粉末；将0.5g粉末状的生物质悬浮于5ml 100mM Tris,50mM EDTA,pH 7.5加1％十二烷基硫酸钠(SDS)中。离心裂解液(4℃,5000g 20分钟)以沉淀细胞碎片。为去除可溶性蛋白，上清液先用1体积含饱和苯酚的缓冲液(10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0)提取，再用1体积含饱和苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的缓冲液提取。加入0.1体积的3M醋酸钠，pH 5.2和2.5体积的冷的95％乙醇，从所述溶液沉淀DNA。在-20℃温育至少1小时，离心(4℃,5000g离心20分钟)沉淀DNA，然后用10ml 70％乙醇冲洗，风干并重悬浮于1ml 10mM Tris,1mMEDTA,pH8.0中。加入核糖核酸酶A(Boehringer Mannheim)至0.1mg/ml的终浓度并在37℃温育1小时，消化RNA。顺序用1体积含饱和苯酚的缓冲液和1体积含饱和苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的缓冲液提取，从所述DNA溶液中去除核糖核酸酶。加入0.1体积的3M醋酸钠，pH 5.2和2.5体积的冷的95％乙醇，再次沉淀DNA，离心沉淀，然后用70％乙醇冲洗，风干并重悬浮于50μl 10mM Tris,1mM EDTA,pH8.0中。通过在260nm处测定所述溶液的吸光度(Sambrook,Fritsch和Maniatis,“分子克隆：实验室手册，第二版”，ColdSpring Harbor Press 1989第C1页，下文称为Sambrook等人)，测定DNA的浓度。
实施例2
构建T.reesei基因组文库
使用从T.reesei菌株M2C38分离的基因组DNA构建两个质粒文库和一个噬菌体文库。如下在载体pUC119(Viera和Messing,“单链质粒DNA的分离”，Methods Enzymol.153:3,1987)中构建质粒文库：在100μl的体积中，用2单位/μg HindⅢ、BamHⅠ或EcoRⅠ限制酶于37℃消化10μg基因组DNA 20小时。在0.75％琼脂糖凝胶的0.04M Tris-乙酸盐，1mM EDTA上，分离所消化的DNA，然后用溴化乙锭染色。切下对应于目的基因大小(根据已公布的信息和DNA印迹分析)的凝胶片，用电洗脱处理以回收DNA片段(Sambrook等人，第6.28-6.29页)。为建立基因文库，将这些DNA的富集组份在连接反应中连接进pUC119中，其中所述连接反应在10-15μl的总体积中包含20-50μg/ml DNA(载体：插入DNA的摩尔比为2∶1)、1mM ATP和5单位T4 DNA连接酶，4℃下反应16小时。使用CellPorator系统(Gibco/BRL)，按照生产厂家的方法用连接反应的产物电穿孔大肠杆菌菌株HB101，并在含有70μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上筛选转化子。
如下在λ载体λDASH(Stratagene,Inc.)中构建噬菌体文库：用2、1、0.5和0.2单位/μg BamHⅠ在37℃消化基因组DNA(3μg)1小时，产生9-23kB大小的片段。用1体积含饱和苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的Tris提取，然后用10μl 3M醋酸钠，pH5.2和250μl95％乙醇(-20℃)沉淀，纯化得自每次消化的DNA。微量离心沉淀所消化的DNA，用0.5ml冷的70％乙醇冲洗，风干，然后重悬浮于10μl无菌去离子水中。通过琼脂糖凝胶电泳(在0.04M Tris-乙酸盐，1mM EDTA中的0.8％琼脂糖)确认富集了9-23kB大小的DNA片段。在一个反应中，将消化的DNA(0.4μg)连接到1μg用BamHⅠ(Stratagene)预消化的λDASH臂(arm)中，所述反应在5μl的总体积中包含2单位T4 DNA连接酶和1mM ATP,4℃下反应过夜。使用GigaPackⅡGold包装提取物(Stratagene)，按照生产厂家的方法将所述连接混合物包装进噬菌体颗粒中。使用大肠杆菌宿主菌株XL1-Blue MRA(P2)滴定该文库，发现该文库包含3×105个独立的克隆。
实施例3
从pUC119文库中分离纤维二糖水解酶Ⅰ(cbh1)、
纤维二糖水解酶Ⅱ(cbh2)和β-葡糖苷酶(bgl1)基因的
T.reesei M2C38克隆
通过集落转移杂交(colony lift hybridization)鉴定来自重组pUC119-HindⅢ、-BamHⅠ或-EcoRⅠ文库的带有chb1、cbh2或bgl1克隆的大肠杆菌HB101转化子：将1-3×104个集落转移到HyBondTM尼龙膜(Amersham)上；有集落的面朝上，将膜放置到用0.5M NaOH,1M NaCl饱和的印迹纸(VWR 238)上5分钟，裂解细菌细胞并变性DNA；然后有克隆的面朝上，将所述膜放置到用1.5M Tris,pH7.5加1M NaCl饱和的印迹纸(VWR 238)上5分钟，使膜中和；使所述膜风干30分钟，然后通过在80℃烘烤2小时，将DNA固定到膜上。
在标记反应中，分别由HindⅢ、BamHⅠ或EcoRⅠ片段的富集池PCR扩增bgl1、cbh1和cbh2编码区的短片段(0.7-1.5kB)，制备32P标记探针，其中所述标记反应在20μl的总体积中包含10-50ng靶DNA、0.2mM每种d(GCT)TP、0.5μM dATP、20-40μCiα-32P-dATP、10皮摩尔寡聚核苷酸引物和0.5单位Taq聚合酶。所述反应扩增(95℃,2分钟；56℃,1.5分钟；70℃,5分钟)6-7个循环。加入0.5ml 10％(w/v)三氯乙酸和0.5mg酵母tRNA，沉淀扩增的32P标记DNA。微量离心沉淀DNA，用1ml 70％乙醇洗涤两次，风干并重悬浮于1M TrispH7.5,1mM EDTA中。
将其上已经固定有重组pUC119质粒的尼龙膜在热封口的袋子中在1M NaCl,1％SDS,50 mM Tris,1mM EDTA pH7.5中与100μg/ml变性剪切过的鲑鱼精子DNA在60-65℃下预杂交1小时。在热封口的袋子中，在仅含有50μg/ml失活的剪切过的鲑鱼精子DNA和5×106-5×107cpm变性bhl1、cbh1或cbh2探针的同样缓冲液中，在60-65℃下进行杂交16-20小时。将膜用1M NaCl,0.5％SDS在60℃洗涤15分钟一次，用0.3M NaCl,0.5％SDS在60℃洗涤两次，每次15分钟，用0.03M NaCl,0.5％SDS在55℃洗15分钟一次。将膜再次放置在热封口的袋子中，于-70℃下对Kodak RP X-射线底片曝光16-48小时。按照厂家的方法显影X射线底片。挑出显示强或弱信号的集落并在添加70μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基中培养。使用碱裂解法(Sambrook等人，第1.25-1.28页)从这些培养物中分离质粒DNA并通过限制酶切消化、DNA杂交(Sambrook等人，第9.38-9.44页)和PCR分析(Sambrook等人，第14.18-14.19页)进行分析。
使用1.0kb bgl1探针，通过对pUC119-HindⅢ文库(实施例2)的集落转移杂交鉴定带有bgl1基因的克隆，其中所述探针使用设计来扩增已公开的bgl1序列(Barnett等人)第462-1403碱基对的寡核苷酸引物制备。分离了包含一个6.0kb HindⅢ片段的bgl1克隆pJEN200，其中所述HindⅢ片段相当于于启动子、结构基因和终止序列。使用0.7kb cbh1探针，通过对pUC119-BamHⅠ文库的集落转移杂交鉴定带有cbh1基因的克隆，其中所述探针使用设计来扩增已公开的cbh1序列(Shoemaker,Schweikart,Ladner,Gelfand,Kwok,Myambo和Innis,“得自Trichoderma reesei菌株L27的外纤维二糖水解酶1的分子克隆”，Bio/Technology 1:691-696,1983,下文称为Shoemaker等人)的第597-1361碱基对的寡核苷酸引物制备。分离包含一个5.7kb BamHⅠ片段的cbh1克隆pCOR132，其中所述BamHⅠ片段相当于启动子(4.7kb)和1kb cbh1结构基因。由此，将包含cbh1启动子(2.1kb)和cbh1编码区5′末端(0.4kb)的2.5kb EcoRⅠ片段亚克隆进pUC119，产生pCB152。使用1.5kb cbh2探针，通过对pUC119-EcoRⅠ文库进行集落转移杂交鉴定带有cbh2基因的克隆，其中所述探针使用设计来扩增已公开的cbh2序列(Chen,Gritzali和Stafford,“来自Trichoderma reesei的纤维二糖水解酶Ⅱ的核苷酸序列以及推定的一级结构”，Bio/Technology 5:274-278,1987,下文称为Chen等人)的第580-2114碱基对的寡核苷酸引物制备。分离包含一个4.8kb EcoRⅠ片段的cbh2克隆pZUK600，其中所述EcoRⅠ片段相当于启动子(600bp)、结构基因(2.3kb)和终止子(1.9kbp)。
实施例4
克隆T.reesei M2C38 cbh1终止子、木聚糖酶Ⅱ(xln2)基因、
磷酸甘油酸激酶启动子(pgk p)
使用DIG标记和检测试剂盒(Boehringer Mannheim)，按照厂家的方法，通过随机激活(prime)标记从PCR扩增的cbh1、xln2和pgk基因编码区制备洋地黄毒苷(digoxigen)-11-dUTP标记探针。通过对λDASH文库的噬菌斑转移杂交，鉴定包含cbh1、xln2和pgk基因的基因组克隆。对于每种目的基因，将1×104集落转移到Nytran(Schleicher和Schull)尼龙膜上。裂解噬菌体颗粒，并将含有噬菌斑的一面朝上，将膜放置在用0.5M NaOH,1M NaCl饱和的印迹纸(VWR238)上变性噬菌体DNA 5分钟；然后含有噬菌斑的一面朝上，将膜放置在用1.5M Tris,pH7.5加1M NaCl饱和的印迹纸(VWR238)上中和5分钟；使膜风干30分钟，并通过在80℃烘烤2小时，将DNA固定到膜上。所述膜在热封口的袋子中，在6×SSPE,5×Denhardt’s,1％SDS加100μg/ml变性剪切过的鲑鱼精子DNA的溶液中，65℃下预杂交2小时。然后在热封口的袋子中，所述膜在含有50μg/ml已变性剪切过的鲑鱼精子DNA和0.5μg洋地黄毒苷-dUTP标记的探针的相同溶液中，于65℃杂交过夜。所述膜在2×SSPE,0.1％SDS中于室温下洗两次，每次15分钟，在0.2×SSPE,0.1％SDS中于65℃下洗涤两次，每次15分钟，然后在2×SSPE中洗涤一次5分钟。按照厂家的方法，通过与抗洋地黄毒苷/碱性磷酸酶抗体缀和物、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐和4-硝基蓝四唑氯化物(4-nitro blue tetrazoliumchloride)(Boehringer Mannheim)的反应，鉴定阳性杂交克隆。通过用洋地黄毒苷-dUTP标记的探针进行第二轮筛选，进一步纯化阳性杂交克隆。分离单个克隆，并如Sambrook等人(1989)第2.118-2.121页所述，但用1体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和1体积氯仿∶异戊醇(24∶1)提取来取代CsCl梯度步骤，纯化噬菌体DNA。用0.1体积3M醋酸钠，pH5.2和2.5体积冷的95％乙醇沉淀DNA。用0.5ml冷的70％乙醇洗涤沉淀的噬菌体DNA，风干并重悬浮于50μl 10mMTris,1mm EDTA pH8.0中。通过对所纯化的噬菌体DNA的限制酶切消化，以及DNA印迹杂交(Sambrook等人，第9.38-9.44页)鉴定包含目的基因的限制片段，其中DNA印迹杂交使用与筛选λDASH文库时所用的相同洋地黄毒苷-dUTP标记探针。使用与噬菌斑转移相同的方法，使膜杂交并显示阳性杂交片段。一旦鉴定了来自每个λDASH克隆的所需限制片段，重复限制酶切消化，将所述片段在TAE中的0.8％琼脂糖凝胶上分离，并切下所需的带。使用Sephaglas BandPrep试剂盒(Pharmacia)，按照厂家的方法从所述凝胶切片洗脱出DNA。
使用包含已公开的cbh1序列(Shoemaker等人)第45-2220碱基对的cbh1探针对λDASH文库(实施例2)的集落转移杂交，鉴定带有cbh1基因的克隆。通过对由一个λDASH cbh1克隆纯化的噬菌体DNA的限制酶切消化，分离了一个包含cbh1编码区3′末端(0.5kb)和cbh1终止子(1.3kb)的1.8kb BamHⅠ片段。将该片段亚克隆进大肠杆菌质粒载体pUC119的BamHⅠ位点，产生质粒pCB1Ta。使用包含已公开的xln2序列(Saarelainen,Paloheimo,Fagerstrom,Suominen和Nevalainen,“Trichoderma reesei内木聚糖酶Ⅱ(pI9)基因xln2的克隆、测序和增强表达”,Mol.Gen.Genet.241:497-503,1993,下文称为Saarelainen等)第100-783碱基对的xln2探针对λDASH文库(实施例2)进行集落转移杂交，鉴定带有xln2基因的克隆。通过对由一个λDASH xln2克隆纯化的噬菌体DNA的限制酶切消化，分离了一个包含cbh1基因的启动子(2.3kb)、编码区(0.8kb)和终止子(2.6kb)的5.7kb KpnⅠ片段。将该片段亚克隆进pUC119的KpnⅠ位点，产生质粒pXYN2K-2。使用包含已公开的pgk序列(Vanhanen,Penttila,Lehtovaara和Knowles,“从丝状真菌Trichoderma reesei分离和鉴定3-磷酸甘油酸激酶基因(pgk)”,Curr.Genet.15:181-186,1989)第4-1586碱基对的pgk1探针对λDASH文库(实施例2)进行集落转移杂交，鉴定带有pgk基因的克隆。通过对由一个λDASH pgk克隆纯化的噬菌体DNA的限制酶切消化，分离了一个包含pgk基因的启动子(2.9kb)、编码区(1.6kb)和终止子(0.5kb)的5.0kb EcoRⅠ片段。将该片段亚克隆入pUC119的EcoRⅠ位点，产生质粒pGK5.0。
实施例5
构建β-葡糖苷酶超量表达载体pCBG1-TV
本实施例描述了包含木霉菌属纤维二糖水解酶Ⅰ启动子和分泌信号以及成熟β-葡糖苷酶编码区的载体的构建。
使用与已公开的bgl1序列同源、包含编码的β-葡糖苷酶的Sph1位点5′到Val32或是KpnⅠ位点3′到bgl1终止密码子的引物，用Pwo聚合酶由pJEN200模板通过PCR扩增包含bgl1编码区但不含β-葡糖苷酶分泌信号的DNA片段(第474-2679碱基对)。扩增的片段用SphⅠ和KpnⅠ消化并插入用SphⅠ和KpnⅠ消化的pCB219N，产生pBgstrf。为制备pCB219N，使用与已公开的cbh2基因(Chen等人，1987)3′不翻译区第2226-2242碱基对同源的引物和pUC正向引物(目录号1224,New England Biolabs)，由pZUK600模板扩增cbh2终止子片段，其中所述cbh1基因3′不翻译区的第2226-2242碱基对在5′端包含KpnⅠ位点，所述pUC正向引物退火结合pZUK600上cbh2 3′端EcoRⅠ位点的下游。将该片段在工程KpnⅠ和EcoRⅠ位点消化并插入pUC119的相应位点以产生pCB219。将EcoRⅠ-NotⅠ连接物(目录号35310-010,Gibco/BRL)插入pCB219的唯一EcoRⅠ位点，产生pCB219N。使用cbh1特异性引物(已公开的cbh1序列的第249-284碱基对，Shoemaker等，1983)和pUC正向引物(目录号1224,New England Biolabs)由pCB152扩增包含cbh1启动子和分泌信号的片段，其中所述cbh1特异性引物包含编码的CBH1的SphⅠ位点3′到Ser19，所述pUC正向引物退火结合pCB152中cbh15′端EcoRⅠ位点的上游。将cbh1启动子+分泌信号PCR产物用SphⅠ和EcoRⅠ消化并插入pBR322L(pBR322的衍生物，其中在SphⅠ和SalⅠ之间的区被SphⅠ-NotⅠ-SalⅠ接头取代)中的相应位点，产生pBR322LCS。为制备表达盒，从pBgstrf分离作为4.1kb SphⅠ/NotⅠ片段的bgl1编码区和cbh2终止子，并插入用SphⅠ和NotⅠ消化的pBR322LCS中。为维持在cbh1分泌信号和成熟β-葡糖苷酶连接处的正确读框，将得到的质粒pCBGstrf在唯一SphⅠ位点线性化，并用T4 DNA聚合酶平端化SphⅠ位点。然后通过加入XhoⅠ接头(目录号1073,New England Biolabs)，将cbh2终止子3′末端的单一NotⅠ位点转换为单一XhoⅠ位点，进一步修饰得到的质粒pCBG1。最终的质粒pCBG1-Xho是表达盒质粒。
用Pwo聚合酶从质粒pVU1005(Van den Elzen,Townsend,Lee和Bedbrook,“在植物细胞中作为选择标记的嵌合潮霉素抗性基因”，Plant Mol.Biol.5:299-302,1989)扩增用作T.reesei的选择标记的大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶基因(hph)。引物设计成为在hph编码区(已公开的hph序列的第211-1236碱基对，Gritz和Davies,“质粒编码的潮霉素b抗性：潮霉素B磷酸转移酶基因的序列以及它在大肠杆菌和酿酒酵母中的表达”Gene 25:179-188,1983)的5′和3′末端分别引入SphⅠ位点和KpnⅠ位点。PCR产物用SphⅠ和KpnⅠ消化并插入pUC119的多接头区内的相应位点。得到的质粒pHT100用作构建选择盒的起始质粒。将两个新的接头区引入该质粒以促进所述启动子和终止子片段的克隆。将HindⅢ-XbaⅠ-XhoⅠ-SphⅠ接头插入HindⅢ位点和SphⅠ位点之间，并将XpnⅠ-NotⅠ-SacⅠ接头插入保留在pHPT100中pUC119多接头的KpnⅠ位点和SacⅠ位点之间。该构建物被命名为pHPT102。用于扩增pgk启动子(Vanhanen,Saloheimo,Ilmen,Knowles和Penttila,“Trichoderma reesei的3-磷酸甘油酸激酶基因(pgk1)的启动子结构和表达”,Gene 106:129-133,1991)的引物设计用于在启动子的-970位和+1位分别引入XhoⅠ位点和SphⅠ位点。这些位点随后用于将pgk启动子插入pHPT102的XhoⅠ位点和SphⅠ位点以产生pHPT115。使用退火结合cbh1 3′不翻译区(已公开的cbh1序列的第1864-1899碱基对)的引物和pUC反向引物(目录号18432-013,Gibco/BRL)，用Pwo聚合酶由pCB1Ta扩增1.3kb cbh1终止子片段，其中所述退火结合cbh1 3′不翻译区的引物包含位于第1877-1882碱基对的KpnⅠ位点，所述pUC反向引物退火结合pCB1Ta中cbh1终止子3′末端EcoRⅠ位点下游。将cbh1终止子PCR产物用KpnⅠ消化并插入pHPT115的唯一KpnⅠ位点，产生选择盒质粒pHPT136。
为制备转化载体，得自pCBG1-Xho的表达盒作为5.6kb XbaⅠ/XhoⅠ片段分离并插入pHPT136的表达盒上游的单一XbaⅠ位点和XhoⅠ位点之间。如下面的实施例9所述，将最终的转化载体pCBG1-TV(如图1所示)通过微粒轰击作为环状质粒引入T.reeseiM2C38。
实施例6
构建β-葡糖苷酶超量表达载体pXBG1-TV
本实施例描述了包含木霉菌属木聚糖酶Ⅱ启动子和分泌信号以及成熟β-葡糖苷酶编码区的载体的构建
使用引物，用Pwo聚合酶由基因组bgl1克隆pJEN200扩增β-葡糖苷酶编码区，其中所述引物在已公开的bgl1序列(Barnett等人)第474碱基对的直接下游插入一个XbaⅠ位点，在第2680碱基对的直接下游引入一个KpnⅠ位点。将平端化的PCR产物插入pUC118的SamⅠ位点，产生名为pBGm.s的质粒。由于XbaⅠ位点被工程化到Val32以紧接在成熟β-葡糖苷酶起点的上游，因此所述克隆片段并不包括β-葡糖苷酶分泌信号。用XbaⅠ和KpnⅠ消化质粒pBGm.s,分离包含bgl1编码区但不含分泌信号的2.2kb片段，并将其插入质粒pCB219N中cbh2终止子上游的XbaⅠ和KpnⅠ位点(如上文实施例5所述)，产生质粒pBG2X。使用xln2特异性引物和pUC反向引物(目录号18432-013,Gibco/BRL)，用Pwo聚合酶由基因组xln2亚克隆pXYN2K-2扩增包含xln2基因的启动子和分泌信号(第-2150到第+99碱基对，其中+1指示ATG起始密码子)的2.3kb片段，其中所述xln2特异性引物包含位于已公开的xln2序列(Saarelainen等人)第103碱基直接下游的NheⅠ位点，所述pUC反向引物退火结合xln2基因5′末端KpnⅠ位点的上游。该xln2 PCR产物用EcoRⅠ(作为pUC119多接头的一部分由pXYN2K-2扩增)和NheⅠ消化并插入质粒pBR322L(在上面的实施例5中所描述)，产生pBR322LXN。然后用克列诺片段平端化pBR322LXN的EcoRⅠ位点，加入SpeⅠ接头(目录号1086,New England Biolabs)，产生pBR322SpXN。用XbaⅠ和NotⅠ切割pBG2X质粒，分离一个4.2kb的片段，该片段包含其后连接cbh2终止子的bgl1编码区。将该片段插入用NheⅠ和NotⅠ(NheⅠ和NotⅠ具有可配对的突出端)切割的质粒pBR322SpXN。该克隆导致木聚糖酶分泌信号直接融合到成熟β-葡糖苷酶上，产生完整的表达盒pXBG-2。
用包含xln2转录终止子的2.6kb KpnⅠ片段取代上面实施例5所述的在选择盒质粒pHPT136中的cbh1终止子。使用在已公开的xln2序列(Saarelainen等人)第780碱基对的直接下游引入KpnⅠ位点的引物和pUC正向引物(目录号18431-015,Gibco/BRL)，用Pwo聚合酶由基因组亚克隆pXYN2K-2扩增xln2终止子，其中所述pUC正向引物退火结合pXYN2K-2中xln2基因3′末端下游。该xln2终止子PCR产物用KpnⅠ消化并连接到pUC119中来自pHPT136包含pgk启动的hph基因的5.1kb KpnⅠ片段，产生选择盒质粒pHPT136X。
转化载体的构建涉及在来自选择盒的pgk启动子的直接下游插入表达盒。用NotⅠ消化表达盒质粒pXBG2，用克列诺片段使末端平端化，然后用SpeⅠ消化。以相似方法制备选择盒pHPT136X：用XhoⅠ消化，然后进行补平反应(fill in reaction)以产生平头末端，随后用XbaⅠ消化。进行这两个片段的平端-粘端连接以将来自pXBG2的6.5kb SpeⅠ/平端化的NotⅠ片段连接入pHPT136X的XbaⅠ/平端化的XhoⅠ片段(SpeⅠ和XbaⅠ有可配对的突出端)。在如下面实施例9所述通过微粒轰击将最终的转化载体pXBG-TV(如图2所示)转化T.reesei之前，在它的单一NotⅠ处线性化。
实施例7
构建β-葡糖苷酶超量表达载体pC/XBG(Xba1)-TV
本实施例描述了包含木霉菌属纤维二糖水解酶1启动子、木聚糖酶Ⅱ分泌信号和成熟β-葡糖苷酶编码区的载体的构建。
进行本实施例以测试cbh1启动子和xln2分泌信号对bgl表达的联合效应。使用包含cbh1启动子的质粒pBR322LCS(实施例5)作为模板，通过PCR扩增包含cbh1启动子第-1399到-204碱基对的1.2kbHindⅢ片段，以便在第-1393到-1388碱基对插入一个单一XbaⅠ位点。用HindⅢ消化该修饰的cbh1启动子片段，用其取代pXBG1(实施例6)中xln2启动子的第-1400到-121碱基对，产生新的表达盒质粒pC/XBG1。分离来自pC/XBG1的6.4kb表达盒：用NotⅠ消化，然后用克列诺片段将NotⅠ位点平端化，随后用SpeⅠ消化。然后通过平端/粘端连接将该片段插入pHPT136X中hph选择盒的上游，其中所述pHPT136X已经用XhoⅠ消化、用克列诺片段在XhoⅠ位点平端化并用XbaⅠ消化。在如下面实施例9所述，通过微粒轰击将最终的转化载体pC/XBG(Xba1)-TV(保藏号209613，保藏日期1998年2月3日，美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852美国)(如图3所示)转化T.reesei M2C38之前，在cbh1启动子5′末端和xln2终止子3′末端的唯一XbaⅠ位点和NotⅠ位点线性化。
实施例8
从T.reesei菌株RutC30和M2C38分离的基因组DNA
的DNA印迹分析
如实施例1所述从每个菌株分离基因组DNA。为进行DNA印迹分析，用3-10单位限制性内切核酸酶在37℃消化1μg DNA至少2小时，在0.04M Tris-乙酸盐，1mm EDTA中的0.8％琼脂糖凝胶上分离消化产物。通过毛细管转移(Sambrook等人，第9.38-9.44页)用尼龙膜(Boehringer Mannheim)转移DNA。在图4和图5中，泳道2、4、6、8、10和12含有消化的M2C38 DNA，泳道3、5、7、9、11和13含有消化的RutC30 DNA。使用的限制性内切核酸酶是BamHⅠ(泳道2和3)、EcoRⅠ(泳道4和5)、XbaⅠ(泳道6和7)、HindⅢ(泳道8和9)、SstⅠ(泳道10和11)以及KpnⅠ(泳道12和13)。在两个图中，泳道1含有λHindⅢ分子大小标准(Gibco/BRL，目录号15612-013)，泳道14含有1ng用来制备探针的未标记片段。用DIG标记和检测试剂盒(Boehringer Mannheim)制备的洋地黄毒苷-11-dUTP标记的随机引发探针杂交，进行DNA印迹分析。图4中所用探针的模板是包含T.reesei xln2启动子和分泌信号(Saarelainen等人)的2.3kb片段。图5中所用探针的模板是包含T.reesei bgl1成熟编码区(Barnett等人)第574-2679碱基对的2.1kb片段。杂交后冲洗后，通过与抗洋地黄毒苷碱性磷酸酶缀合物(Boehringer Mannheim)温育，然后与5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐和4-硝基蓝四唑氯化物(Boehringer Mannheim)反应，使洋地黄毒苷-dUTP复合物可见。
实施例9
通过微粒轰击转化T.reesei RutC30、M2C38和BTR48
使用Biolistic PDS-1000/He系统(BioRad；E.I.DuPont deNemours and Company)转化T.reesei菌株RutC30、M2C38和BTR48的孢子，按照厂家推荐进行所有方法。使用M-10钨粒(平均直径0.7μm)作为微载体。使用下面的参数来优化转化：破坏压力1100psi，氦气压力29mm汞柱，狭缝宽度0.95cm，巨载体飞行距离16mm，靶宽度9cm。用在Potato Dextrose Agar培养基(PDA)上的1×106孢子制备平板。轰击后的平板在28℃培育。轰击后四小时，在平板上覆盖添加了80单位/ml HygB的选择性PDA培养基，初步筛选孢子。轰击平板在28℃培育。生长3-6天后，可以观察到转化子；然而，有必要进一步培育以达到孢子形成。
孢子形成后，进行再次筛选过程以分离单独的转化子。用接种环从平板上收集孢子并重悬浮于无菌水中。然后用填塞玻璃微纤维的无菌注射器过滤该悬浮物。这使得孢子滤过但截留了不想要的菌丝。需要测定该悬浮物中孢子的浓度，并将随后的稀释物涂布在添加了0.75％ Oxgall(Difco)和HygB(40单位/mL)的PDA平板上，使得每平板20-50个孢子。Oxgall作为菌落限制物起作用，由此使得能够分离这些再次筛选平板上单独的菌落。2-3天后可以观察到分离的菌落。
实施例10
从T.reesei菌株RutC30、RC300、RC-302、M2C38、RM4-300、
R4-301、RM4-302、BTR48和RB4-301分离的
基因组DNA的DNA印迹分析
如实施例1从每个菌株分离基因组DNA。为进行DNA印迹分析，用3-10单位KpnⅠ或XbaⅠ在37℃消化1μg DNA至少2小时，在0.04M Tris-乙酸盐，1mM EDTA中的0.8％琼脂糖凝胶上分离消化产物。通过毛细管转移(Sambrook等人，第9.38-9.44页)用尼龙膜(Boehringer Mannheim)转移DNA。用DIG标记和检测试剂盒(Boehringer Mannheim)制备的洋地黄毒苷-11-dUTP标记的随机引发探针杂交，进行DNA印迹分析。模板是包含已公开的bgl1序列(Barnett等人)第1215-2464碱基对的1.3kb EcoRⅠ-BglⅡ片段。杂交后洗涤后，通过与抗洋地黄毒苷碱性磷酸酶缀合物(BoehringerMannheim)温育，然后与化学发光试剂CSPD(Boehringer Mannheim)反应并在X-射线底片(Kodak)上曝光，使洋地黄毒苷-dUTP复合物可见。结果在表1中概述。
表1 在亲本和重组T.reesei菌株中bgl1的拷贝数 菌株 宿主 启动子 分泌 信号 载体天然bgl1基因bgl1载体数总bgl1基因数 RutC30 RC-300 RC-302 M2C38 RM4-300 RM4-301 RM4-302 BTR48 RB4-301 同一菌株 RutC30 RutC30 同一菌株 M2C38 M2C38 M2C38 同一菌株 BTR48 bgl1 cbh1 cbh1 bgl1 cbh1 xln2 cbh1 bgl1 xln2 bgl1 cbh1 xln2 bgl1 cbh1 xln2 xln2 bgl1 xln2无pCBG1-TVpC/XBG1-TV无pCBG1-TVpXBG1-TVpC/XBG1-TV无pXBG1-TV存在存在不存在存在不存在存在存在存在不存在 0 1 1 0 2 2 2 0 2 1 2 1 1 2 3 3 1 2
实施例11
β-葡糖苷酶在液体培养物中的生产
本实施例描述了用于测定由木霉菌属菌株产生的β-葡糖苷酶酶的量的方法。
将木霉菌属的各个菌落转移到PDA平板上以繁殖每个培养物。为获得统一的摇瓶接种(用于测试培养物产生β-葡糖苷酶和纤维素酶的能力)，必需形成孢子。培养基包含以下成分：
成分 g/L
(NH4)2SO4 6.35
KH2PO4 4.00
MgSO4-7H2O 2.02
CaCl2-2H2O 0.53
CSL 6.25
CaCO3 10.00
碳源** 5-10
微量元素* 1mL/L
*微量元素溶液含有5g/l FeSO4-7H2O；1.6g/l MnSO4-H2O；1.4g/lZnSO4-7H2O。
**5g/l葡萄糖加10g/l Solka絮凝物(当使用cbh1或其它纤维素酶启动子时)、10g/l木聚糖(当使用xln2启动子时)或其它与指导β-葡糖苷酶表达的启动子相容的碳源。所述碳源可以作为pH 2到7的水溶液单独灭菌，并单独加入其余培养基中。
每个1升培养瓶中的液体体积是150mL，起始pH为5.5，每个培养瓶接种前在121℃通过蒸汽高压灭菌30分钟。
对于未转化细胞(即天然细胞)和转化细胞，如实施例9中所述从PDA平板分离孢子，并且每个培养瓶接种1-2×106孢子。培养瓶在28℃的温度下以200rpm振荡培养6天时间。通过用GF/A玻璃微纤维滤纸(Whatman)过滤，收集含有分泌蛋白的滤液。使用Bio-Rad蛋白分析仪(目录号500-0001)，用木霉菌属纤维素酶作为标准品，测定蛋白浓度。如实施例16中所述测定β-葡糖苷酶活性。
按用培养物滤液的β-葡糖苷酶活性IU/ml除以培养物滤液的蛋白浓度mg/ml的测定，由此筛选出具有使β-葡糖苷酶(以IU/mg为单位)增加到未转化宿主菌株的至少10倍的能力的转化子。
实施例12
使用Solka絮凝物碳源从T.reesei菌株RutC30、
RC-300和RC-302产生β-葡糖苷酶
基于以前使用cbh1启动子和分泌信号在木霉菌属中过量表达蛋白所获得的成功，将成熟β-葡糖苷酶编码区置于图1所示并在实施例5中描述的遗传构建物(pCBG1-TV)中cbh1启动子和分泌信号的下游。通过粒子轰击(实施例9)将所述载体引入T.reesei RutC30，得到的转化子RC-300产生的β-葡糖苷酶活性是亲本菌株的7倍(表2)。这个7倍的增加源于将转化载体的一个拷贝引入宿主染色体(实施例10，表1)。由一个拷贝的用cbh1启动子和分泌信号表达β-葡糖苷酶的构建物获得的β-葡糖苷酶活性更大的增加表明，这种策略比Barnett等人和Fowler等人所用的策略更好，其中Barnett等人和Fowler等人所用的策略由10-15拷贝的构建物获得β-葡糖苷酶活性仅仅增加5倍，该构建物中β-葡糖苷酶由本身的启动子和分泌信号表达。然而，得到的β-葡糖苷酶活性增加7倍仍不足以缓解纤维素水解中β-葡糖苷酶的缺乏。
通过粒子轰击用来自载体pC/XBG(Xba1)-TV的遗传构建物转化未转化的T.reesei菌株RutC30，其中所述遗传构建物编码连接到T.reesei木聚糖酶Ⅱ分泌信号的成熟T.reesei β-葡糖苷酶。
使用实施例11的方法，用10g/L Solka絮凝物和5g/L葡萄糖作碳源，培养未转化的菌株RutC30和由该宿主得到的转化菌株RC-302。结果显示于表2。
未转化的菌株产生每mg蛋白0.14IUβ-葡糖苷酶。
带有CBH1启动子和木聚糖酶Ⅱ分泌信号的转化子RC-302产生19IU/mgβ-葡糖苷酶。这代表相对于未转化菌株增加约136倍，这对于纤维素到乙醇的工艺来说是非常显著的。
带有CBH1启动子和木聚糖酶分泌信号的转化子RC-302产生的β-葡糖苷酶活性较最好的带有CBH1启动子和CBH1分泌信号的RutC30转化子产生的β-葡糖苷酶活性增加约19倍。
表2 150ml瓶培养中T.reesei菌株RutC30、RC-300和RC-302中 β-葡糖苷酶的产量菌株启动子分泌信号β-葡糖苷酶(IU/mg) RutC30 bgl1 bgl1 0.14 RC-300 cbh1 cbh1 1.0 RC-302 cbh1 xln2 19
实施例13
使用Solka絮凝物碳源由菌株M2C38和RM4-302产生
β-葡糖苷酶
通过粒子轰击(实施例9)将载体pCBG1-TV引入T.reeseiM2C38，其中在载体pCBG1-TV中β-葡糖苷酶从CBH1启动子和分泌信号(图1和实施例5)表达。得到的转化子RM4-300产生的β-葡糖苷酶活性是亲本菌株的β-葡糖苷酶活性的约7-12倍。
通过粒子轰击(实施例9)用来自载体pC/XBG(Xba1)-TV的遗传构建物转化未转化的T.reesei菌株M2C38，其中所述遗传构建物编码连接到T.reesei木聚糖酶Ⅱ分泌信号的成熟T.reeseiβ-葡糖苷酶。
使用实施例11的方法，用10g/L Solka絮凝物和5g/L葡萄糖作碳源，培养未转化的菌株M2C38和由该宿主得到的转化菌株RM4-302。结果显示于表3。
未转化的菌株产生每mg蛋白0.35IU β-葡糖苷酶。
带有CBH1启动子和木聚糖酶Ⅱ分泌信号的转化子RM4-302产生14.1 IU/mg β-葡糖苷酶。这代表增加到未转化菌株的约40倍，这对于纤维素到乙醇的工艺来说是非常显著的。
带有CBH1启动子和木聚糖酶Ⅱ分泌信号的转化子RM4-302产生的β-葡糖苷酶活性是带有CBH1启动子和CBH1分泌信号的转化子产生的β-葡糖苷酶活性的约3倍。这是一个显著的差别，因为CBH1启动子和分泌信号并不导致产生足够的β-葡糖苷酶以完全抑制水解中纤维二糖的产生。
表3 150ml瓶培养中T.reesei菌株M2C38、RM4-300和RM4-302中 β-葡糖苷酶的产量菌株启动子分泌信号β-葡糖苷酶(IU/mg) M2C38 bgl1 bgl1 0.35 RM4-300 cbh1 cbh1 4.5 RM4-302 cbh1 xln2 14.1
实施例14
使用木聚糖碳源由T.reesei菌株M2C38和RM4-301
产生β-葡糖苷酶
通过粒子轰击(实施例9)用来自载体pXBG1-TV的遗传构建物转化未转化的T.reesei菌株M2C38，其中所述遗传构建物编码连接到木聚糖酶启动子和分泌信号的成熟T.reesei β-葡糖苷酶。
使用实施例11的方法，用5g/L葡萄糖和10g/L木聚糖作碳源，培养未转化的菌株M2C38和由该宿主得到的转化菌株RM4-301。结果显示于表4。
未转化的菌株产生每mg蛋白0.16IUβ-葡糖苷酶。
带有木聚糖酶Ⅱ启动子和木聚糖酶Ⅱ分泌信号的转化子RM4-301产生20.4IU/mg β-葡糖苷酶。这代表增加到未转化菌株的约127倍，这对于纤维素到乙醇的工艺来说是非常显著的。
表4 使用木聚糖在150ml瓶培养中T.reesei菌株M2C38
和RM4-301中β-葡糖苷酶的产量菌株启动子分泌信号β-葡糖苷酶(IU/mg) M2C38 bgl1 bgl1 0.16 RM4-301 xln2 xln2 20.4
实施例15
使用Solka絮凝物碳源由菌株BTR-48和RB48-301
产生β-葡糖苷酶
通过粒子轰击用来自载体pXBG1-TV的遗传构建物转化未转化的T.reesei菌株BTR48，其中所述遗传构建物编码连接到木聚糖酶启动子和分泌信号的成熟T.reesei β-葡糖苷酶。
使用实施例11的方法，用5g/L葡萄糖和10g/L Solka絮凝物作碳源，培养未转化的菌株BTR-48和由该宿主得到的转化菌株RB48-301。结果显示于表5。
未转化的菌株产生每mg蛋白0.16IU β-葡糖苷酶。
带有木聚糖酶Ⅱ启动子和木聚糖酶Ⅱ分泌信号的转化子RB48-301产生约21.9IU/mg β-葡糖苷酶。这代表增加到未转化菌株的约136倍，这对于纤维素到乙醇的工艺来说是非常显著的。
表5
使用Solka絮凝物在150ml瓶培养中
T.reesei菌株BTR48和RB48-301中β-葡糖苷酶的产量菌株启动子分泌信号β-葡糖苷酶(IU/mg) BTR48 bgl1 bgl1 0.16 RB48-301 xln2 xln2 21.9
实施例16
测定酶混合物中的β-葡糖苷酶活性
使用Ghose，“纤维素酶活性测定，”Pure and Appl.Chem.,59:257-268(1987)的方法如下测定酶中β-葡糖苷酶的活性方法。将酶样品在50mM醋酸钠缓冲液，pH4.8中稀释到几个浓度，稀释至0.5ml体积。稀释的合适范围是样品估计活性的3到24倍。例如，10单位/ml的样品应当以1∶30到1∶240稀释。不考虑所用的稀释度，在每个酶管中加入0.5ml在构缘酸盐缓冲液中的样品。底物是15mM(5.13g/L)纤维二糖。稀释的酶贮液和底物分别预加热到50℃5分钟，然后向每个装有酶的管中加入0.5ml等份底物。试管在50℃温育30分钟。将每支试管浸入沸水浴中5分钟，终止反应。旋转混合试管，考虑来自酶的微弱本底，在YSI葡萄糖分析仪上测量每个酶样品产生的糖的量。
一单位β-葡糖苷酶活性定义为每分钟产生的葡萄糖的微摩尔数。使用产生0.15到1.5mg/ml葡萄糖的每个稀释度的平均值，根据等式1计算活性。
A=C*G*D (1)
其中A=活性，β-葡糖苷酶单位/ml
(或微摩尔葡萄糖/ml/分钟)
C=16.7微摩尔/mg/分钟
G=产生的葡萄糖，mg/ml
D=酶稀释度，无单位
实施例17
纤维素水解
本实验的目的是证实由转化木霉菌属产生的β-葡糖苷酶在增强纤维素水解中的有效性。
用于该研究的酶是Iogen纤维素酶，即Iogen公司的一种纤维素酶商品酶，以及使用实施例11中所述的方法在30L发酵罐中生长RM4-302的产品，其中使用所述实施例中所列培养基浓度的两倍。超滤通过Amicon 10,000 MWCO膜，增加酶的浓度，并将酶浓度归一化为Iogen纤维素酶的相同纤维素酶活性。两种酶的活性显示于表6。
表6 在纤维素水解研究中使用的酶活性 酶β-葡糖苷酶IU/ml纤维素酶FPU/mlBG IU/mg@10FPU/g Iogen纤维素酶 112 140 8.0 RM4-301 1170 140 83.6
用于本研究的纤维素是经过预处理的燕麦壳，如Foody等人，Improved Pretreatment Process for Conversion of Cellulose to FuelEthanol,1997年6月9日申请的美国专利申请，实施例6所述的方法制备。
将0.5克经过预处理的燕麦壳纤维素的样品加入装有49.5克0.05摩尔醋酸钠缓冲液，pH4.8的25ml瓶中。
所述酶以相当于每克纤维素10FPU的量加入所述瓶中。得到的β-葡糖苷酶量列于表6。
在两种情况下，培养瓶在250RPM振荡培养并在50℃维持24小时。在这个时候，取样，过滤除去不溶性纤维素，使用标准Dionex脉冲电流测定HPLC糖类分析方法分析葡萄糖和纤维二糖的浓度。结果列于表7。
常规木霉菌属纤维素酶Iogen纤维素酶将仅45％的纤维素转化成为葡萄糖。这对于乙醇工艺来说是难以接受的低。纤维二糖的积累非常显著，占纤维素的13％。
具有增强β-葡糖苷酶的纤维素酶表现好得多。纤维素到葡萄糖的转化达到84％。这种优异表现的原因是由于有大量β-葡糖苷酶，纤维二糖的积累是微不足道的。
表7 高含量β-葡糖苷酶增强的纤维素水解酶葡萄糖(纤维素的％)纤维二糖(纤维素的％) Iogen纤维素酶 45 13 RM4-301 84 ＜1
实施例18
菌株RutC30和M2C38中Trichoderma reesei xln2
和bgl1基因的比较
对用六种不同限制酶消化的M2C38和RutC30 DNA进行DNA印迹分析，确定在两个菌株之间是否存在任何多态性，其中所述六种限制酶同时在编码成熟β-葡糖苷酶和木聚糖酶分泌信号的区(实施例8)的内部和外部进行切割。如图4和图5所示，发现有相同的带与标记探针杂交，表明在两个菌株的这些区之间没有多态性并存在高度DNA序列同源性，其中所述标记探针由编码成熟β-葡糖苷酶和木聚糖酶Ⅱ启动子以及分泌信号的M2C38片段制备。
制备实施例5-7所述的遗传构建物必需的用于鉴定和克隆M2C38DNA序列的探针和引物是基于来自几种不同Trichoderma reesei菌株的不同基因的已公开的DNA序列，其中所述Trichoderma reesei菌株包括QM9414(pgk,Vanhanen等人，1989和cbh2,Chen等人)、QM9414衍生物VTT-D79125 (xln2,Saarelainen等人)和L27(cbh1,Shoemaker等人)以及菌株RL-P37衍生菌株P40(bgl1,Barnett等人)。所有这些菌株，与M2C38一样，均由菌株QM6a(Carter,Allison,Rey和Dunn-Coleman,“Trichoderma reesei电泳核型的染色体和遗传分析：纤维素酶基因和木聚糖酶基因的作图，”Molecular Microbiology 6:2167-2174,1992)衍生获得。
因为RutC30是M2C38的QM6a衍生祖先，所以本发明人确信如实施例2-4所述的为分离用于制备实施例5-7所述的β-葡糖苷酶表达载体的基因序列的方法应用于分离M2C38和RutC38的相同基因序列的效果将同样好。根据上文所述的菌株谱系和DNA印迹分析数据，本发明人还非常自信从RutC30 DNA制备的遗传构建物将含有与从M2C38 DNA制备的遗传构建物同样的编码成熟β-葡糖苷酶和木聚糖酶Ⅱ分泌信号的DNA区段。由于从M2C38 DNA制备的构建物(实施例5-7)在M2C38和RutC30中都导致β-葡糖苷酶表达增强(实施例12-14)，本发明人也坚信从RutC30 DNA制备的遗传构建物将在RutC30和M2C38中导致相似水平的β-葡糖苷酶活性增强。
虽然已经根据目前认为的最佳实施方案描述了本发明，但应当理解本发明并不限制于已公开的实施方案。相反，本发明覆盖在后面所附的权利要求的精神和范围内的不同改进和同等安排。以下权利要求书的范围应当符合最广泛的解释以便包含所有这样的改变和等同组成(formulation)及功能。