与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记及其应用 【技术领域】
本发明属于农业生物技术领域，具体地涉及与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记及其应用。
背景技术
氮素是水稻生长中最重要的营养。半个世纪以来，随着矮秆耐肥高效品种的培育与推广，世界各国都把增施氮肥作为增加水稻产量的重要农业措施。然而，尽管近年来化肥用量年年增长、在生产成本中的比重逐年增加，粮食产量却一直徘徊不前。从1984年到1993年，我国化肥用量增加了81％，而粮食总产只增加了14.6％。而且，高氮引起的环境污染问题日趋严重。据统计，我国氮肥的平均利用率只有35％，养分损失不仅严重浪费了有限的养分资源，由于其向水体和大气的排放，也带来了令人担忧的环境问题。有的地下饮用水中NO3-含量超过上限50mg/L，NO3-污染会引起许多疾病，如高铁血蛋白缺氧症、胃癌和幼儿畸形等。
水稻是全球半数人口的主食，我国是水稻生产大国，全国水稻年播种面积达4.8亿亩，约占粮食作物总面积的26.6％左右。由于水稻与其他作物不同，需水量大，施肥次数多，搁田或雨量大引起的NO3-流失多，水稻生产成为目前最大的污染源之一。这一现象在欧洲早已引起极大关注，德国巴登符腾堡州1989年就把旱作施肥列为地下水硝酸盐污染的重要来源，通过专门法律条款限制水资源保护区的旱作种植及氮肥施用量。因此，探讨有限氮素供应条件下作物高产高效的新途径不仅是实现我国两高一优农业生产目标所必需的，而且也是保护环境、造福子孙后代的重要问题。
水稻育种实践证明，利用氮素营养调控基因培育新品种将是提高氮素利用效率和作物产量以及减少环境污染最为经济有效的方法。随着分子生物学的发展，使难以鉴定、易受环境影响的农艺性状采用分子辅助育种已成为可能，该技术可在早代进行准确、稳定的选择，从而加速育种进程，提高育种效率，但该技术的基础是必须拥有优良的目标基因及与之紧密连锁的分子标记。
【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中的上述缺陷，用分子生物学方法以氮高效水稻品种为材料，筛选和寻找新的、而且稳定存在的与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记，用于水稻辅助选择育种及新品种鉴定，同时，根据所得分子标记也有助于水稻氮营养调控基因的克隆。
本发明所述的氮营养调控基因即氮高效基因。
实现上述目的的技术方案如下：
与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记，所述的分子标记为位于水稻第2染色体上的SSR分子标记RM5897，其核苷酸序列如下：
上游引物5’-GGCATCTTCCCCTCTCTCTC-3’
下游引物5’-CCAACCCAAACCAGTCTACC-3’。
与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记，所述的分子标记为位于水稻第2染色体上的STS分子标记AP5756，其核苷酸序列如下：
上游引物5’-CTATTGGTGGTTAGGGCTGAT-3’
下游引物5’-AGTTGATTTAGATGTGTTTTA-3’。
上述与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记RM5897和AP5756，是使用下述方法得到的：
(1)氮高效基因供体亲本来自中国水稻研究所的籼稻品种窄叶青8号(ZYQ8)，与普通粳稻品种京系17(JX17)进行杂交，利用F 1代花药培养获得加倍单倍体(DH)群体，从中获得氮高效株系DH78，通过DH78与JX17回交和自交，进行配组和基因定位，统计分离群体单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用Mapmaker EXP3.0b计算标记与氮营养调控基因之间的遗传距离。
(2)用CTAB法提取水稻亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组DNA。
(3)采用SSR和STS分子标记方法进行水稻氮营养调控基因分子标记的筛选。
(4)筛选出一个SSR分子标记RM5897和一个STS分子标记AP5756，经连锁分析，发现这两个标记与水稻氮营养调控基因相连锁，分别位于水稻氮营养调控基因的两侧。
采用SSR和STS分子标记进行筛选与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记的方法是：
(1)SSR、STS引物在亲本以及他们的杂交后代间DNA多态性分析：
用SSR标记技术筛选，采用根据Temnykh在2000年发表的分布于水稻12条染色体上的SSR引物，引物由上海申能博彩公司合成，在PTC-225PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为：20ng/ul水稻基因组DNA 1ul，10×PCR Buffer 2.0ul，25mM MgCl2 2.0ul，2mM dNTP 2.0ul，10uM引物2.0ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.3ul，ddH2O 10.7ul，总体系20ul。反应程序：94℃预变性4分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，40个循环；72℃补齐10分钟；产物检测：在含有0.5ug/ul EB的5.0％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并拍照记录结果。
用STS标记技术筛选，首先对基因组已完成测序的粳稻日本晴(http://rgp.dna.affrc.go.jp)和籼稻93-11(http://www.rise.genomics.org.cn)的序列进行序列比对，根据日本晴和93-11序列比对的结果设计合适的引物用于ZYQ8和JX17地多态性筛选，引物由上海申能博彩公司合成，在PTC-225 PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为：20ng/ul水稻基因组DNA 1ul，10×PCR Buffer 2.0ul，25mM MgCl2 2.0ul，2mM dNTP 2.0ul，10uM引物2.0ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.3ul，ddH2O 10.7ul，总体系20ul。反应程序：94℃预变性4分钟；94℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，40个循环；72℃补齐10分钟；产物检测：在含有0.5ug/ul EB的5.0％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并拍照记录结果。
(2)分子标记的连锁分析
分别提取分离群体单株的总DNA，用与前面同样的反应体系、筛选获得的多态性引物及程序进行单株的PCR扩增，统计单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用MapnakerEXP3.0b计算标记与水稻氮营养调控基因之间的遗传距离。
探讨有限氮素供应条件下作物高产高效的新途径不仅是实现我国两高一优农业生产目标所必需的，也是保护环境、造福子孙后代的重要问题。本发明是利用分子标记方法得到两个新的与氮营养调控基因紧密连锁的分子标记。利用这种方法，不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点，还可以有目的地将调控基因在实验室内选择获得并有目的地进行多个基因的聚合，从而培育出具有稳定性状的水稻新品种。同时，也可利用这两个氮营养调控基因分子标记，深入进行氮营养调控基因的克隆并对其进行结构和功能分析，这对于进一步了解水稻氮营养调控的分子遗传学机制有积极的意义。因此，本研究结果在水稻育种实践及氮素营养调控的理论研究上都有重要意义。其优点具体归纳如下：
(1)本发明与氮营养调控基因紧密连锁的分子标记，是在对水稻氮高效株系及其杂交后代单株中获得的新标记，可用于水稻氮营养调控新品种的鉴定和辅助选择育种。
(2)本研究所用的材料具有很高的氮素利用和调控能力，因此，根据所得的分子标记有望克隆到新的氮营养调控基因。
(3)为克隆水稻氮营养调控基因、基因序列分析以及转氮营养调控基因水稻研究奠定了良好基础。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
【附图说明】
图1为两个水稻品种及其后代基因组DNA的SSR分子标记RM5897筛选电泳谱带图；
图2为两个水稻品种及其后代基因组DNA的STS分子标记AP5756筛选电泳谱带图；
图3为检测分子标记RM5897与氮营养调控基因连锁的电泳谱带图(部分图)；
图4为检测分子标记AP5756与氮营养调控基因连锁的电泳谱带图(部分图)；
图5为SSR分子标记RM5897和STS分子标记AP5756与氮营养调控基因NI间的遗传距离图。
图1-5中符号分别表示：
1-DH78；2-JX17；3-DH78/JX17的F1植株；F2-DH78和JX17杂交后代的单株(通过杂交、回交的自交得到)。
【具体实施方式】
实施例1：
用SSR分子标记获得与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记RM5897
植物材料：氮高效基因供体亲本来自中国水稻研究所的籼稻品种窄叶青8号(ZYQ8)，与普通粳稻品种京系17(JX17)进行杂交，利用F1代花药培养获得加倍单倍体(DH)群体，从中获得氮高效株系DH78，通过DH78与JX17杂交、回交和自交，进行配组和基因定位，从该群体后代中鉴定得到87株与DH78表型相似的个体用于连锁关系分析。
(一)、提取DNA
首先配制DNA提取缓冲液，按顺序依次加1体积的DNA提取溶液(0.35M sorbitol；0.1M Tris，pH8.2；0.005M EDTA)，1体积的核裂解液(0.2M Tris，pH7.5；0.05M EDTA；2M NaCl；0.055M CTAB)和0.4体积的5％sarkosyl，加入亚硫酸氢钠，终浓度为0.02M。称取0.1g的水稻叶片用液氮研磨成粉状，然后加入700μl的DNA提取缓冲液，65℃水浴40分钟。加700μl的氯仿∶异戊醇(24∶1)，并混匀。10000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的离心管中。加2/3至1倍体积预冷的异丙醇，轻轻混匀至DNA沉淀。13000rpm离心8分钟，倒出上清液，用70％的己醇洗涤DNA沉淀。将DNA凉干并溶于100μl TE或双纯水中。紫外分光光度法检测DNA样品的浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
(二)、SSR分析：
根据Temnykh在2000年发表的分布于水稻12条染色体上的SSR引物序列，由上海申能博彩公司合成引物100对。
1.PCR扩增
(1)反应体系为：
水稻基因组DNA 20ng/ul 1ul，10×PCR Buffer 2.0ul，25mM MgCl2 2.0ul，2mM dNTP 2.0ul，10uM引物2.0ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.3ul，ddH2O10.7ul，总体系20ul。
(2)反应程序
94℃预变性4分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，40个循环；72℃补齐10分钟。
2.电泳检测
取扩增产物20ul，用5.0％的琼脂糖凝胶(含有0.5ug/ul EB)电泳，紫外灯下观察并拍照记录结果。
我们利用100对SSR引物对DH78和JX17进行多态性分析，其中有61对引物在双亲间表现出多态性。进一步用这61对引物对DH78、JX17和其杂交、回交后代单株进行SSR分析，发现SSR引物RM5897在所有的杂交后代单株中均出现氮高效亲本DH78一样的带型(如图1所示)。说明SSR引物RM5897与水稻氮营养调控基因存在联系。
RM5897引物序列为：上游引物5’-GGC ATC TTC CCC TCT CTC TC-3’，下游引物5’-CCA ACC CAA ACC AGT CTA CC-3’，定位于水稻第2染色体上。
(三)、SSR分子标记RM5897的连锁性鉴定
分别提取分离群体单株的总DNA，用与前面同样的反应体系、筛选获得的多态性引物及程序进行单株的PCR扩增，统计单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用MapnakerEXP3.0b计算标记与水稻氮营养调控基因之间的遗传距离。以RM5897对杂交后代群体87个与DH78表型相似的单株进行PCR扩增。结果显示，87个单株中有84单株的带型与氮高效亲本DH78一样，有3株的带型同时带有双亲的带型，没发现与亲本JX17带型一样的单株。这一实验结果表明：SSR分子标记RM5897与水稻氮营养调控基因是紧密连锁的，但在分离群体单株中仍有一定的交换，如图3所示，出现双亲带型的单株表明发生了交换。经计算，其重组率为1.7％，SSR分子标记与氮营养调控基因间的遗传距离为1.7cM(如图5所示)。
实施例2：
用STS分子标记获得与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记
AP5756
植物材料同实施例1，具体做法如下：
(一)、提取DNA
首先配制DNA提取缓冲液，按顺序依次加1体积的DNA提取溶液(0.35M sorbitol；0.1M Tris，pH8.2；0.005M EDTA)，1体积的核裂解液(0.2M Tris，pH7.5；0.05M EDTA；2M NaCl；0.055M CTAB)和0.4体积的5％sarkosyl，加入亚硫酸氢钠，终浓度为0.02M。称取0.1g的水稻叶片用液氮研磨成粉状，然后加入700μl的DNA提取缓冲液，65℃水浴40分钟。加700μl的氯仿∶异戊醇(24∶1)，并混匀。10000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的离心管中。加2/3至1倍体积预冷的异丙醇，轻轻混匀至DNA沉淀。13000rpm离心8分钟，倒出上清液，用70％的己醇洗涤DNA沉淀。将DNA凉干并溶于100μlTE或纯水中。紫外分光光度法检测DNA样品的浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
(二)、STS分析：
STS引物设计根据日本晴和93-11序列比对的结果设计合适的引物用于双亲的多态性筛选，由上海申能博彩公司合成设计的STS引物5对。
1.PCR扩增
(1)反应体系为
水稻基因组DNA 20ng/ul 1ul，10×PCR Buffer 2.0ul，25mM MgCl2 2.0ul，2mM dNTP 2.0ul，10uM引物2.0ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.3ul，ddH2O10.7ul，总体系20ul。
(2)反应程序
94℃预变性4分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，40个循环；72℃补齐10分钟。
2.电泳检测
取扩增产物20ul，用5.0％的琼脂糖凝胶(含有0.5ug/ul EB)电泳，紫外灯下观察并拍照记录结果。
我们利用5对STS引物对DH78和JX17进行多态性分析，其中有1对引物在双亲间表现出多态性。进一步用这对引物对DH78、JX17和其杂交后代单株进行STS分析，发现STS引物AP5756在所有的杂交后代单株中均带有亲本DH78一样的带型(如图2所示)。说明STS引物AP5756与水稻氮营养调控基因存在联系。
AP5756引物序列为：上游引物5’-CTA TTG GTG GTT AGG GCT GAT-3’，下游引物5’-AGT TGA TTT AGA TGT GTT TTA-3’，定位于水稻第2染色体上。
(三)、STS分子标记AP5756的连锁性鉴定
分别提取分离群体单株的总DNA，用与前面同样的反应体系、筛选获得的多态性引物及程序进行单株的PCR扩增，统计单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用MapnakerEXP3.0b计算标记与水稻氮营养调控基因之间的遗传距离。以AP5756对杂交后代群体87个与DH78表型相似的单株进行PCR扩增。结果显示，87个单株中有81单株的带型与氮高效亲本DH78一样，有6株的带型同时带有双亲的带型，没发现与亲本JX17带型一样的单株。这一实验结果表明：SSR分子标记AP5756与水稻氮营养调控基因是紧密连锁的，但在分离群体单株中仍有一定的交换，如图4所示，出现双亲带型的单株表明发生了交换。经计算，其重组率为3.4％，SSR分子标记与氮营养调控基因间的遗传距离为3.4cM(如图5所示)。
经上述实施例1、2所获的分子标记可以用于水稻氮营养调控新品种的鉴定及氮高效水稻的辅助选择育种，同时为克隆氮营养调控基因奠定基础，另外，本发明对选育环保类型水稻新品种、提高肥料利用率和保护环境都具有一定的实践意义。
【序列表】
<110>中国水稻研究所
<120>与水稻氮营养调控基因相连锁的分子标记及其应用
<160>4
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ggcatcttcc cctctctctc
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ccaacccaaa ccagtctacc
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ctattggtgg ttagggctga t
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
agttgattta gatgtgtttt a