合成改性淀粉的单子叶植物细胞和植物 【发明领域】
本发明涉及遗传修饰的单子叶植物细胞和植物，其中该遗传修饰包括导入编码具有R1蛋白生物活性的蛋白质的外源核酸分子。本发明还涉及其生产手段和方法。这类植物细胞和植物合成一种改性淀粉，其特征在于：与来自未遗传修饰的相应单子叶植物的淀粉相比，其磷酸含量升高，和/或磷酸化模式改变，和/或在RVA图中的终粘度提高，和/或在DSC分析中的峰值温度降低，和/或在结构分析中的凝胶强度提高。因此，本发明也涉及由根据本发明的植物细胞和植物合成的淀粉，和生产这种淀粉的方法。本发明还涉及含有这种改性淀粉的小麦粉，以及含有这种小麦粉和/或淀粉的食品和焙烤食品。
【发明背景】
最近，随着作为原料可再生来源的植物内容物的重要性越来越高，生物技术研究的任务之一是努力使这些植物原料适应加工工业地需要。为了促进可再生原料在尽可能多的领域中应用，也必须提供相当多的物质。
除了油类、脂肪和蛋白质外，多糖也是来自植物的重要可再生原料。除纤维素之外，淀粉(高等植物中最重要的贮存物质之一)可能在多糖中占据中心地位。
多糖淀粉是化学均一的基本成分(即葡萄糖分子)的多聚体。然而，它是不同分子形式的极其复杂的混合物，在聚合程度和在葡萄糖链中出现分支区方面不同。因此淀粉不是一种均一的原料。两种化学上不同的淀粉成分——直链淀粉和支链淀粉之间存在差别。在用于生产淀粉的典型植物中，如玉米、小麦或马铃薯，合成的淀粉含有可达约20％-30％的直链淀粉和可达约70％-80％的支链淀粉。
有很长一段时间认为直链淀粉是由α-1，4-糖苷键合的α-D-葡萄糖单体组成的线性多聚体。然而，在最近的研究中，检测到存在大约0.1％的α-1，6糖苷分支位点(Hizukuri和Takagi，Carbohydr.Res.134，(1984)，1-10；Takeda等人，Carbohydr Res.132，(1984)，83-92)。然而，完全分离直链淀粉与支链淀粉实际上非常困难，因此，直链淀粉的质量强烈依赖于所选择的分离方法的类型。与直链淀粉不同，支链淀粉分支更多，大约含有4％的分支位点，它们是由于存在其它α-1，6糖苷键而形成的。支链淀粉是不同分支的葡萄糖链的复合混合物。
这两种分子的另一个显著差异是它们的分子量。根据淀粉来源，直链淀粉的分子量为5×105-106Da，而支链淀粉为107-108Da。这两种大分子能根据其分子量和不同的物理化学性质区分，最易表现在不同的碘键合性质。
直链淀粉与支链淀粉的另一个显著差异在于可与这些大分子结合存在的痕量物质的相对含量。直链淀粉对疏水性分子有高亲和力。尤其在谷类中，直链淀粉能与含量相对较高的脂类复合(Morrison，Cereal Foods World 40，(1995)，437-446)。另一方面，支链淀粉能以淀粉磷酸单酯的形式含有共价键合的无机磷酸，这对于直链淀粉迄今尚未有描述。特别是在由块茎获得的淀粉中发现有高含量的磷酸单酯。在市售淀粉中，马铃薯淀粉磷酸含量最高，为10-30nmol mg-1淀粉。在姜黄属(Curcuma)的某些种类中，磷酸含量甚至高2-4倍(Bay-Smidt等人，第5届ISPMP会议论文集，(1997)，741)，而在谷类中大约低100倍(Kasemsuwan和Jane，Cereal Chem.73，(1996)，702-707)。与来自块茎、根和荚的淀粉不同，谷类淀粉(单子叶植物)中可检测到的磷酸很少是淀粉单酯衍生物的形式，而主要是磷脂的形式(Jane等人，Cereal Foods World 41，(1996)，827-832)。
除了直链淀粉/支链淀粉比和磷酸含量之外，淀粉的功能性质也受其分子量、侧链分布模式、离子含量、脂类和蛋白质含量等的影响。在此应当提到的重要功能性质有溶解度、退化行为、吸水性、薄膜形成特性、粘度、胶固特性、冻融稳定性、酸稳定性、凝胶强度等。淀粉颗粒大小对于不同的用途也可能是重要的。
原则上能通过遗传工程方法或通过天然淀粉随后的化学磷酸化改变磷酸含量(参见，例如：《淀粉化学和技术》，R.L.Whistler，J.N.BeMiller和E.F.Paschall编著，Academic Press，New York，1988，349-364)。然而，化学修饰通常昂贵且耗时，而且产生的淀粉的理化性质可能与体内修饰的淀粉不同。
由于来源于单子叶野生型植物，特别是来源于谷类植物(小麦、水稻、玉米、燕麦、粟、黑麦)的淀粉，只含有极少量的淀粉磷酸单酯形式的磷酸(Lim等人，Cereal Chem.71，(1994)，488)，因此，本发明的一个目的在于提供单子叶植物，它们与相应的野生型植物细胞和植物相比，能合成磷酸含量(淀粉磷酸单酯含量)提高且理化性质改变的淀粉。
【发明内容】
因此本发明的主要目的在于提供遗传修饰的单子叶植物细胞和植物，与未遗传修饰的相应野生型植物细胞和植物相比，它们能合成结构和/或功能性质发生改变的淀粉，本发明目的还在于提供淀粉，其结构和功能性质不同于来自未遗传修饰的相应野生型植物细胞和植物的淀粉和化学修饰的淀粉，因而更适于普通和/或特殊的工业用途。
此目的通过权利要求书所述的实施方案实现，因为已经惊讶地发现，向单子叶植物细胞和植物的基因组中导入外源核酸分子使得该单子叶植物细胞和植物中合成的淀粉的结构和/或功能性质改变。
外源核酸分子的表达主要在单子叶植物(特别是小麦植物)的淀粉贮藏器官中有利，而且使得自淀粉贮藏器官分离的淀粉与自未遗传修饰的相应野生型植物(特别是小麦植物)的淀粉贮藏器官分离的淀粉相比，磷酸含量提高，粘性改变。而且，根据本发明的淀粉与化学磷酸化的淀粉的区别在于改变的磷酸化模式和改变的粘性，在淀粉胶固和凝胶形成之后，区别还在于改变的凝胶强度。
因此，本发明涉及遗传修饰的单子叶植物细胞，其中该遗传修饰包括至少一种外源核酸分子的导入，该外源核酸分子选自：
a)含有Seq ID No.1所示核苷酸序列的编码区的核酸分子；
b)编码具有Seq ID No.2所示氨基酸序列的马铃薯(Solanumtuberosum)R1蛋白的核酸分子；
c)是Seq ID No.1所示核苷酸序列的衍生物的核酸分子；和
d)是(a)、(b)或(c)所述核酸分子的片段的核酸分子。
在本发明中，术语“遗传修饰的”是指由于导入外源核酸分子，植物细胞的遗传信息改变，以及外源核酸分子的存在或表达导致表型改变。术语“表型改变”优选地是指细胞一种或多种功能的可测量的改变。例如，根据本发明的遗传修饰的植物细胞显示改变的表达模式。在本发明中，术语“遗传修饰”是指根据本发明的单子叶植物细胞至少含有一种以适当方式整合于基因组中的外源核酸分子。
在本发明中，可以认为术语“外源核酸分子”是指这样一种核酸分子，其编码一种具有R1蛋白生物活性的蛋白质，优选地来自马铃薯的R1蛋白，并且不在未遗传修饰的相应野生型植物细胞中天然存在。外源核酸分子优选地是由不同成分组成的重组分子，其组合或特异性空间排列不在植物细胞中天然存在。根据本发明的单子叶植物细胞至少含有一种外源核酸分子，其中后者优选地与确保在植物细胞中转录的调节DNA元件(特别是启动子)连接。
编码马铃薯R1蛋白的外源核酸分子的一个例子如SEQ ID No.1所示。WO 97/11188 A1和Lorberth等人(Nature Biotech.16，(1998)，473-477)也描述了编码马铃薯R1蛋白的核苷酸序列。
马铃薯R1蛋白的重要特征包括：i)其氨基酸序列(例如，见SEQID No.2)；ii)它们在植物细胞质体基质中的位置，它们能以与淀粉粒结合的形式和可溶形式存在；和iii)它们影响植物中淀粉磷酸化程度的能力。例如，在转基因马铃薯植物中编码马铃薯R1蛋白的R1基因的抑制导致可从马铃薯块茎中分离的淀粉磷酸含量减少。此外，Lorberth等人表示，如果在大肠杆菌中表达相应的R1 cDNA，马铃薯R1蛋白能磷酸化细菌糖原(Lorberth等人，Nature Biotech.16，(1998)，473-477)。
Ritte等人(Plant J.21，(2000)，387-391)表示，马铃薯R1蛋白与马铃薯植物中的淀粉粒可逆结合，其中与淀粉粒的结合强度取决于植物的代谢状态。对于淀粉粒结合形式，马铃薯植物中的蛋白质主要存在于置于暗处的叶子中。然而，对叶子进行光照后，该蛋白质主要以不与淀粉粒结合的可溶形式存在。
而且，抑制马铃薯R1基因在转基因马铃薯植物中表达产生“淀粉过量”表型，即相应植物的叶子淀粉含量升高(Lorberth等人，Nature Biotech.16，(1998)，473-477)。除此之外，这类马铃薯植物的块茎的区别还在于，它们在冷藏后显示“冷诱导的甜化”降低(Lorberth等人，Nature Biotech.16，(1998)，473-477)。
原则上，编码R1蛋白的外源核酸分子能来源于任何种类的马铃薯或马铃薯植物，优选地来源于Tomensa、Desiree、Tempora和Thomana品种的马铃薯。
在一个优选实施方案中，外源核酸分子含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
在另一个优选实施方案中，本发明包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列的编码区的外源核酸分子。
在本发明的另一个优选实施方案中，外源核酸分子编码一种来自马铃薯的R1蛋白，该蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
在本发明的另一个实施方案中，外源核酸分子包含成熟(不含质体信号肽)蛋白质的编码区(SEQ ID No.1所示核苷酸序列的bp 447-bp 4607)。在本发明该实施方案中，外源核酸分子包含一种异源质体信号序列，即不天然存在与成熟R1蛋白结合的信号序列，代替马铃薯R1蛋白的质体N-端信号肽(由SEQ ID No.1所示核苷酸序列的核苷酸216-446编码的氨基酸1-77)。质体信号序列本领域技术人员周知。
例如，来自spinate的铁氧还蛋白：NADP+氧化还原酶(FNR)的信号序列能用作质体信号序列。该序列包含spinate质体蛋白铁氧还蛋白：NADP+氧化还原酶的cDNA的5′-非翻译区及侧翼转运肽序列(核苷酸-171到+165；Jansen等人，Current Genetics 13，(1988)，517-522)。
另外，例如，玉米蜡样蛋白的转运肽加成熟蜡样蛋白的前34个氨基酸能用作信号序列(Klsgen等人，Mol.Gen.Genet.217，(1989)，155-161)。此外，也能应用不含成熟蜡样蛋白前34个氨基酸的玉米蜡样蛋白的转运肽。
在本发明的另一个优选实施方案中，外源核酸分子是SEQ IDNo.1所示核苷酸序列的一种衍生物。
在本发明中，表述“衍生物”是指这些分子的序列与SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列在一个或多个位点上不同，并且显示与SEQID No.1所示核苷酸序列的编码区有高度同源性。另外，衍生物的区别还在于它们编码一种具有R1蛋白生物活性的蛋白质，优选地来自马铃薯的R1蛋白。
在本发明中，“同源性”是指至少65％，特别是至少85％，更特别地至少90％，优选地高于95％，最优选地高于98％的核苷酸序列的序列同一性。与上述核酸分子的不同可能是由于缺失、添加、置换、插入或重组。
同源性程度优选地如下确定：将各自的核苷酸序列与SEQ IDNo.1的编码区相比较，特别是与编码SEQ ID No.1所示核苷酸序列的成熟蛋白质的SEQ ID No.1区(bp447-bp4607)相比较。如果将要比较的序列长度不同，同源性程度优选地是指较短核苷酸序列中与较长序列的核苷酸相同的核苷酸的百分数，也就是说，对各自的核苷酸序列重叠的区域测定序列同一性。序列比较能用周知的计算机程序进行，如ClustalW程序(Thompson等人，Nucleic Acids Research 22，(1994)，4673-4680)，该程序由Julie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和Toby Gibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE；欧洲分子生物学实验室，Meyerhofstrasse 1，D 69117 Heidelberg，德国)开发。Clustal W也能从不同的因特网站点下载，例如：IGBMC(Institut de G én étique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire，B.P.163，67404 Illkirch Cedex，法国；ftp：//ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和EBI(欧洲生物信息学研究所)(ftp：//ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)，以及与EBI链接的因特网站点(欧洲生物信息学研究所，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK)。
当采用ClustalW程序(1.8版)时，各种参数使用缺省值。对于DNA序列比较，这些参数的值如下：KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNAMATRIX：IUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，转换：未加权。
对于蛋白质序列的比较，ClustalW程序的参数同样使用缺省值。这些参数的值如下：KTUPLE＝1，TOPDIAG＝5，WINDOW＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，MATRIX＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。
例如，同源性程度能用众所周知的计算机程序确定，如Mview(http：//www.sacseeucsf.edu/documentation/seqsoftware/mview；Brown，N.P.，Leroy C.，Sander C.(1998).Mview：一个Web兼容的数据库搜索或多次比对浏览器。Bioinformatics，14(4)：380-381)。
在本发明中，“同源性”也指在各自的核酸分子或它们编码的蛋白质之间具有功能和/或结构相当。与SEQ ID No.1所示核酸分子同源，并且是这些分子的衍生物的核酸分子，是这些分子的变体，它们具有行使相同生物功能的修饰，在体内也能提高单子叶植物中淀粉的磷酸含量。它们可能是天然存在的变体，例如来自其他种类马铃薯的序列，或突变，其中该突变可自然形成或者可通过定向诱变导入。
在本发明的另一个实施方案中，SEQ ID No.1的衍生物包括SEQID No.1所示核酸分子的等位变体。
这些等位变体是天然存在的变体，能提高淀粉的磷酸含量。
在本发明的另一个实施方案中，外源核酸分子是根据本发明定义的外源核酸分子的片段。
在本发明中，术语“片段”是指外源核酸分子的部分，其编码具有生物活性，优选地酶活性的R1蛋白的部分。
R1蛋白生物活性部分的区别在于：由于外源核酸分子超表达，它在植物中能使磷酸含量提高，和/或在大肠杆菌中表达后促进糖原的磷酸化(见WO 97/11188 A1，实施例9)。
由外源核酸分子的不同变体(片段、衍生物、等位变体)编码的蛋白质显示明确的一般特征。后者的例子包括生物活性、酶活性或能利用上述蛋白质同源性比较方法研究的相似的一级结构。这些蛋白质的氨基酸序列显示至少60％、优选地至少85％、特别地至少95％、最优选地至少97％的相互同源性。
除了上述特征外，外源核酸分子的特征还在于：它们编码具有R1蛋白生物活性的蛋白质，该蛋白质至少含有1种、优选地至少5种、特别地至少10种、最优选地全部下列特有肽基序：
DKAAET(SEQ ID No.3)，IADME(SEQ ID No.4)，VWMRFM(SEQ ID No.5)，MQEWHQ(SEQ ID No.6)，LGHYM(SEQ ID No.7)，ERGYEE(SEQ ID No.No.8)，KAVLDR(SEQ ID No.9)，LSSLL(SEQ ID No.10)，IPDGAV(SEQ IDNo.No.11)，KVCFAT(SEQ ID No.12)，ISADEF(SEQ ID No.13)，PFGVFE(SEQ ID No.14)，SSGDD(SEQ ID No.15)，SFICKK(SEQID No.16)。
在其它差别中，根据本发明的植物细胞与天然存在的植物细胞的区别还在于：它们含有不在这些细胞中天然存在的外源核酸分子，或者如此所述的一种分子整合到细胞基因组中一个不天然存在的位置，即不同的基因组环境中。而且，根据本发明的这类转基因植物细胞与天然存在的植物细胞的区别还在于：除了任选地如在细胞中天然存在的分子拷贝外，它们还含有以稳定方式整合到基因组中的至少一个拷贝的外源核酸分子。如果导入细胞中的核酸分子是细胞中天然存在的分子的其它拷贝，根据本发明的植物细胞与天然存在的植物细胞的区别尤其在于：这些拷贝位于基因组中不天然存在的位点。例如，随后能利用Southern印迹分析检测。
此外，根据本发明的植物细胞与天然存在的植物细胞的区别优选地在于至少下列特征之一：如果导入的核酸分子对于植物是异源的，根据本发明的转基因植物细胞含有导入的核酸分子的转录物，实际上甚至在野生型植物中检测不到转录物的器官中。根据本发明的植物细胞优选地含有外源核酸分子的转录物。例如，它们能通过Northern印迹分析检测。根据本发明的植物细胞优选地含有由导入的外源核酸分子编码的蛋白质。例如，这种添加的蛋白质能用免疫学方法检测，特别是通过Western印迹分析检测。
在一个优选实施方案中，根据本发明的植物细胞和植物显示比未遗传修饰的相应野生型植物细胞和野生型植物提高的R1蛋白生物活性。
对于本发明，例如，能通过测定在根据本发明的植物细胞和植物中合成的淀粉的磷酸含量确定“提高的R1蛋白生物活性”。与来自未遗传修饰的相应野生型植物细胞的淀粉相比，来自根据本发明的植物细胞的淀粉显示提高的R1蛋白生物活性，其区别在于，它们合成一种磷酸含量提高的淀粉，优选地，在葡萄糖单体C6位的磷酸含量提高。
而且，提高的R1蛋白生物活性也能如下测定：测定R1-转录物的量，例如利用Northern印迹分析测定，与未遗传修饰的相应野生型植物中R1-转录物的量相比较。
此外，提高的RI蛋白生物活性也能如下测定：测定R1蛋白的量，例如利用Western印迹分析测定，与未遗传修饰的相应野生型植物中RI蛋白的量相比较。
已经发现，根据本发明的单子叶植物细胞合成一种淀粉，该淀粉与来自未遗传修饰的相应野生型植物细胞的淀粉相比，在葡萄糖单体C6位的磷酸含量提高，和/或磷酸化模式改变，和/或粘性改变。
因此，本发明优选地涉及根据本发明的植物细胞，其合成一种淀粉，该淀粉与来自未遗传修饰的相应野生型植物细胞的淀粉相比，在葡萄糖单体C6位的磷酸含量提高，和/或磷酸化模式改变，和/或粘性改变。
在本发明中，术语“磷酸含量”是指以淀粉磷酸单酯形式共价键合的磷酸的含量。
在本发明中，术语“C6位”是指磷酸基团，它在碳原子位点“6”处与淀粉的葡萄糖单体键合。
对于本发明，表述“提高的C6位的磷酸含量”是指利用光学-酶试验能在C6位检测到的葡萄糖单体磷酸基团(Nielsen等人，PlantPhysiol.105，(1994)，111-117，见方法)。表述“提高的C6位的磷酸含量”优选地是指，与来自未遗传修饰的相应野生型植物的淀粉的磷酸含量相比，淀粉在葡萄糖单体C6位的磷酸含量至少提高20％，优选地至少50％，最优选地至少100％。原则上，淀粉中葡萄糖单位的C2、C3和C6位能在体内磷酸化。对于本发明，C6位的磷酸含量(＝C6P含量)能利用光学-酶试验通过葡萄糖-6-磷酸测定法测定(Nielsen等人，Plant Physiol.105，(1994)，111-117)(见方法)。
在本发明中，术语“改变的磷酸化模式”是指相对于由来自未遗传修饰的相应植物的淀粉产生的化学磷酸化淀粉，与淀粉粒不同层内的淀粉共价键合的磷酸基团的总磷酸含量改变。化学磷酸化淀粉的区别在于淀粉粒内的磷酸梯度，其中外层一般比内层更强烈地磷酸化。相反，根据本发明的淀粉的区别在于，磷酸基团在淀粉粒不同层上分布不同，即，根据本发明的淀粉的特征可能在于，它们不含化学磷酸化淀粉特有的从外到内的梯度。
研究淀粉磷酸化模式的方法本领域技术人员周知(例如，见Jane和Shen，Carbohydrate Research 247，(1993)，279-290；Gough和Pybus，Staerke 25，(1973)，123-130)。这些方法基于淀粉粒不同层的逐步化学胶固，在这些步骤中机械去除淀粉粒的胶固层。在此去壳步骤之后，利用标准方法测定不同淀粉粒层的总磷酸含量。
在本发明中，术语“化学磷酸化淀粉”是指通过来自未遗传修饰的相应植物细胞和/或植物的天然淀粉的化学磷酸产生的淀粉。对于本发明，化学磷酸化淀粉的区别优选地在于，与根据本发明的淀粉的直链淀粉含量相当的直链淀粉含量。在天然淀粉的化学磷酸化过程中，通过选择适当的试验条件调节C6位的磷酸含量，使得化学磷酸化淀粉C6位的磷酸含量与根据本发明的淀粉的葡萄糖单体C6位的磷酸含量相同和/或相当。
对于本发明，术语“改变的粘性”特别是指RVA图中终粘度的提高和/或DSC分析中峰值温度的降低。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的植物细胞合成一种淀粉，与来自未遗传修饰的相应野生型植物的淀粉相比，其终粘度提高。
对于本发明，术语“终粘度”是指能根据粘度分布图(见图1)确定的粘度，表示为“终粘度＝Fin”。粘度分布图能用快速粘度分析仪(RVA)(Newport Scientific Pty Ltd，Investment Support Group，Warriewood，NSW 2102，澳大利亚)获得。在小麦淀粉的分析中，粘度分布图通过下列步骤获得：2.5g淀粉(干物质)吸收于25ml H2O中，用快速粘度分析仪(Newport Scientific Pty Ltd，InvestmentSupport Group，Warriewood，NSW 2102，澳大利亚)分析。仪器按照使用说明书操作。完整的温度程序在图1中示意说明。下文详述了如何进行RVA分析(见方法)。
在本发明中，术语“提高的终粘度”是指与来自未遗传修饰的相应野生型植物细胞的淀粉相比，终粘度至少提高10％，优选地至少30％，特别地至少50％，最优选地至少80％，其中与来自未遗传修饰的相应野生型植物细胞的淀粉相比，终粘度最多能提高1000％，优选地最多500％，特别地最多250％。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的植物细胞合成一种淀粉，与来自未遗传修饰的相应野生型植物的淀粉相比，和/或与化学磷酸化淀粉相比，该淀粉在葡萄糖单体C6位有相同或相当的磷酸含量，和/或峰值温度降低。
在本发明的上下文中，术语“峰值温度”应当是指温度Tp，它能通过本领域技术人员周知的差示扫描量热法(DSC)测量。峰值温度是通常赋予DSC曲线第一峰最大值的温度。例如，能用大体积容器，用Perkin Elmer的仪器(仪器名称：DSC-7)测量，其中所研究的样品的淀粉与总含水量之比约为1∶4，以10℃/min的加热速度在10℃-160℃温度范围内进行测量(见实施例4)。
术语“降低的峰值温度”Tp是指与来自未遗传修饰的相应野生型植物细胞的淀粉相比，峰值温度Tp至少降低1.5℃，优选地至少2.5℃，特别地至少4℃，最优选地至少6℃，最多降低5℃、12℃或9℃。
在另一个优选实施方案中，本发明涉及根据本发明的植物细胞，其合成一种淀粉，在胶固后形成凝胶，与来自未遗传修饰的相应野生型植物细胞的淀粉形成的凝胶相比，凝胶强度提高。
在本发明中，术语“提高的凝胶强度”是指与来自未遗传修饰的相应野生型植物细胞的淀粉的凝胶强度相比，凝胶强度至少提高20％，特别地至少50％，优选地至少80％，最优选地至少100％，最大值最多降低500％，或最多250％。
对于本发明，能在下述条件下利用结构分析仪测定凝胶强度(见方法)。
在本发明的另一个实施方案中，淀粉磷酸含量的提高可能与淀粉的支链淀粉成分有关。
因此，本发明也涉及根据本发明的植物细胞，它们合成一种淀粉，其支链淀粉成分磷酸化，与在葡萄糖单体C6位具有相同淀粉磷酸含量的相应化学磷酸化淀粉的直链淀粉成分相比，其直链淀粉成分的总磷酸含量降低。
因此，与在葡萄糖单体C6位具有相同淀粉磷酸含量的化学磷酸化淀粉不同，根据本发明的植物细胞的淀粉的区别在于：与化学磷酸化淀粉(在葡萄糖单体C6位具有相同磷酸含量，由来自未遗传修饰的相应植物的淀粉产生，优选地具有相当的直链淀粉含量)的直链淀粉成分相比，来自根据本发明的植物细胞的淀粉的直链淀粉成分总磷酸含量降低，和/或葡萄糖单体C6位的磷酸含量降低。
对于本发明，术语“总磷酸含量”是指在葡萄糖单位C2、C3和C6位以淀粉磷酸单酯形式共价结合的磷酸的含量。根据本发明，术语“总磷酸含量”不包括磷酸化的非葡聚糖(如磷脂)的含量。因此，在测定总磷酸含量之前必须定量分离磷酸化的非葡聚糖。
从淀粉中分离磷酸化的非葡聚糖(例如磷脂)的方法本领域技术人员周知。
在本发明中，术语“降低的总磷酸含量”是指，与化学磷酸化淀粉(由来自未遗传修饰的相应植物的淀粉产生，具有相同的C6磷酸含量)直链淀粉成分的总磷酸含量相比，总磷酸含量至少降低5％，特别地至少20％，优选地至少50％，最优选地至少80％。
测定总磷酸含量的方法本领域技术人员周知，如下所述(见方法)。
在本发明中，可以认为术语“降低的葡萄糖单体C6位磷酸含量”是指，与化学磷酸化淀粉(由来自未遗传修饰的相应植物的淀粉产生，具有相同的C6磷酸含量)直链淀粉成分的总磷酸含量相比，直链淀粉成分的葡萄糖单体C6位的磷酸含量至少降低10％，特别地至少20％，优选地至少50％，最优选地至少80％。
测定葡萄糖单体C6位磷酸含量的方法本领域技术人员周知，如下所述(见方法)。
在本发明中，术语“支链淀粉成分”是指淀粉的支链淀粉。
在本发明中，术语“直链淀粉成分”是指淀粉的直链淀粉。
分离直链淀粉与支链淀粉的方法本领域技术人员周知。例如，直链淀粉成分能通过淀粉的水浸析获得，如Roger和Colonna所述(International Journal of Biological Macromolecules 19，(1996)，51-61)。
在本发明的另一个优选实施方案中，根据本发明的淀粉的特征还在于：直链淀粉成分C6位上葡萄糖单体的C6磷酸含量与淀粉C6位上葡萄糖单体的C6磷酸含量之比小于0.75，特别是小于0.5，优选地小于0.25，最优选地小于0.20。与化学磷酸化的淀粉不同，根据本发明的淀粉的区别在于，在淀粉的支链淀粉成分中检测到大部分葡萄糖单体C6位的磷酸，而在直链淀粉成分中未检测到。
根据本发明的植物细胞来源于单子叶植物。它们优选地是来自农业植物的植物细胞，即来自为了营养目的或技术目的，特别是工业目的人工培育的植物。因此，本发明优选地涉及来自淀粉合成或淀粉贮藏植物的植物细胞，例如黑麦、大麦、燕麦、小麦、粟、水稻或玉米。
在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的植物细胞来源于选自下列的植物：小麦、水稻、大麦、燕麦、黑麦和玉米。优选来自小麦、水稻和玉米植物的植物细胞；特别优选来自小麦植物的植物细胞。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的植物细胞合成一种淀粉，该淀粉在葡萄糖单体C6位的磷酸含量至少为0.1nmol C6Pmg-1淀粉，特别地至少0.5nmol C6Pmg-1，优选地至少1nmol C6Pmg-1淀粉，更优选地至少2nmol C6Pmg-1淀粉，最优选地至少5nmol C6Pmg-1淀粉，最特别优选地至少10nmol C6Pmg-1淀粉，其中根据本发明的植物细胞合成一种淀粉，该淀粉在葡萄糖单体C6位的磷酸含量最多为100nmol C6Pmg-1淀粉，特别地最多50nmol C6Pmg-1淀粉，最特别地最多25nmol C6Pmg-1淀粉。
在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的植物细胞能合成一种在葡萄糖单体C6位的磷酸含量至少为15nmol C6Pmg-1淀粉的淀粉，其中根据本发明的植物细胞合成一种淀粉，该淀粉在葡萄糖单体C6位的磷酸含量最多为100nmol C6Pmg-1淀粉，特别地最多50nmol C6Pmg-1淀粉，最特别地最多25nmol C6Pmg-1淀粉。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种生产根据本发明的植物细胞的方法，其中遗传修饰单子叶植物细胞，此遗传修饰包括至少一种外源核酸分子的导入。
有多种技术可用于向植物宿主细胞中转移DNA。这些技术包括：用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化剂，用T-DNA转化植物细胞，原生质体融合，注射，DNA的电穿孔，利用biolistic技术和其它可能的技术导入DNA。
已经广泛研究了农杆菌介导的植物细胞转化的应用，在下列文献中描述，例如：EP 120516；Hoekema，《二元植物载体系统》，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam(1985)，第V章；Fraley等人，Crit.Rev.Plant Sci.4，146，An等人，EMBO J.4，(1985)，277-287。关于马铃薯的转化，例如见Rocha-Sosa等人，EMBO J.8，(1989)，29-33)。
单子叶植物的转化同时用biolistic技术并利用农杆菌常规进行(Komari等人，(1998)，谷类基因转移进展；《现代植物生物技术观点》，第161页；Bilang等人，(1999)，谷类的转化，《基因工程》，12，第113-148页，编者：JK Setlow，Kluwer Academic/Plenum Publisher，纽约)。基于农杆菌的载体已经描述(Chan等人，Plant Mol.Biol.22，(1993)，491-506；Hiei等人，Plant J.6，(1994)271-282；Deng等人，Science in China 33，(1990)，28-34；Wilmink等人，Plant Cell Reports 11，(1992)，76-80；May等人，Bio/Technology13，(1995)，486-492；Conner和Domisse，Int.J.Plant Sci.153(1992)，550-555；Ritchie等人，Transgenic Res.2，(1993)，252-265)。用于单子叶植物转化的备选系统包括：利用biolistic技术转化(Wan和Lemaux，Plant Physiol.104，(1994)，37-48；Vasil等人，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558；Ritala等人，Plant Mol.Biol.24，(1994)，317-325；Spencer等人，Theor.Appl.Genet.79，(1990)，625-631)，原生质体转化，部分透化细胞的电穿孔，利用玻璃纤维导入DNA。特别是，玉米的转化已在文献中多次描述(例如：WO95/06128，EP 0513849，EO 0465875，EP 292435；Fromm等人，Biotechnology 8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2，(1990)，603-618；Koziel等人，Biotechnology 11(1993)，194-200；Moroc等人，Theor.Appl.Genet.80，(1990)，721-726)。
其它种类谷类的成功转化也有描述，例如，对于大麦(Wan和Lemaux，见上文；Ritala等人，见上文；Krens等人，Nature 296，(1982)，72-74)，对于小麦(Becker等人，Plant J.5(2)，(1994)，229-307；Nehra等人，Plant J.5，(1994)，285-297)。
已经描述了用于水稻的多种转化方法，例如，农杆菌介导的转化(Hiei等人，Plant J.6(1994)，271-282；Hiei等人，Plant Mol.Biol.35(1997)，205-218；Park等人，J.Plant Biol.38(1995)，365-371)，原生质体转化(Datta，《向植物中的基因转移》，Potrykus，Spangenberg(编写)，Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg，1995，66-75；Datta等人，Plant Mol.Biol.20(1992)，619-629；Sadasivam等人，Plant Cell Rep.13(1994)，394-396)，用于植物转化的biolistic技术(Li等人，Plant Cell Rep.12(1993)，250-255；Cao等人，Plant Cell Rep.11(1992)，586-591；Christou，Plant Mol.Biol.(1997)，197-203)，电穿孔(Xu等人，《向植物中的基因转移》，Potrykus，Spangenberg(编写)，Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg，1995，201-208)。
本发明还涉及包含根据本发明的植物细胞的植物和/或能通过根据本发明的植物细胞再生产生的植物。这些植物优选地是有用的单子叶植物，例如：黑麦、大麦、燕麦、小麦，粟、水稻和玉米。优选小麦、水稻和玉米，特别优选小麦。
根据本发明的植物合成一种改性淀粉，其磷酸含量和/或磷酸化模式和/或粘性不同于来自未遗传修饰的相应野生型植物的淀粉，如对于根据本发明的植物细胞所述。
因此，本发明也涉及根据本发明的植物，其合成一种淀粉，与来自未遗传修饰的相应植物的淀粉相比，该淀粉在葡萄糖单体C6位的磷酸含量提高，和/或显示改变的磷酸化模式和/或改变的粘性。
对根据本发明的植物细胞所作的描述，在淀粉葡萄糖单体C6位磷酸含量的提高、磷酸化模式的改变和淀粉粘性的改变等方面是适用的。
本发明优选地涉及根据本发明的植物，其合成一种淀粉，在胶固后形成凝胶，与来自未遗传修饰的相应野生型植物的淀粉形成的凝胶相比，凝胶强度提高。
术语“提高的凝胶强度”对根据本发明的植物细胞定义。
在本发明的另一个优选实施方案中，根据本发明的植物优选地是小麦植物，其合成一种淀粉，优选地小麦淀粉，在葡萄糖单体C6位的磷酸含量至少为0.1nmol C6Pmg-1淀粉，特别地至少0.5nmol C6Pmg-1，优选地至少1nmol C6Pmg-1淀粉，最优选地至少2nmolC6Pmg-1淀粉，特别地至少5nmol C6Pmg-1淀粉，最优选地至少10nmol C6Pmg-1淀粉，其中根据本发明的植物合成一种淀粉，该淀粉在葡萄糖单体C6位的磷酸含量最多为100nmol C6Pmg-1淀粉，特别地最多50nmol C6Pmg-1淀粉，或最多25nmol C6Pmg-1淀粉。
在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的植物能合成一种在葡萄糖单体C6位的磷酸含量至少为15nmol C6Pmg-1淀粉的淀粉，其中根据本发明的植物合成一种淀粉，该淀粉在葡萄糖单体的C6位的磷酸含量最多为100nmol C6Pmg-1淀粉，特别地最多50nmol C6Pmg-1淀粉，或最多25nmol C6Pmg-1淀粉。
在本发明的另一个优选实施方案中，根据本发明的植物在根据本发明的植物的淀粉贮藏器官中合成根据本发明的淀粉。
在一个最优选的实施方案中，根据本发明的植物在其淀粉贮藏器官中合成一种淀粉，与来自未遗传修饰的相应野生型植物的淀粉贮藏器官的淀粉相比，该淀粉在葡萄糖单体C6位的磷酸含量提高，和/或磷酸化模式改变，和/或粘性改变。
就此而言，表述“淀粉贮藏器官”是指与只暂时合成淀粉的器官(如叶子)不同，含有贮藏淀粉的那些器官，例如玉米、水稻、和小麦植物的谷粒。
外源核酸分子的表达在单子叶植物(尤其小麦植物)的淀粉贮藏器官中特别有利，而且使得能从淀粉贮藏器官分离的淀粉与能从未遗传修饰的相应野生型植物(特别是小麦植物)的淀粉贮藏器官分离的淀粉相比，磷酸含量提高。
外源核酸分子在单子叶植物的淀粉贮藏器官中的表达首先能利用组成型启动子实现，例如花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(参见例如US-A-5,352,605)和玉米遍在蛋白启动子(参见例如US-A-5,614,399)。
优选地使用淀粉贮藏器官特异的启动子，例如：胚乳特异的启动子，如谷蛋白启动子(Leisy等人，Plant Mol.Biol.14，(1990)，41-50；Zheng等人，Plant J.4，(1993)，357-366；Yoshihara等人，FEBS Lett.383，(1996)，213-218)，shrunken-1启动子(Werr等人，EMBO J.4，(1985)，1373-1380)，小麦HMW启动子(Anderson Anderson，Theoretical and Applied Genetics 96，(1998)，568-576，Thomas，PlantCell 2(12)，(1990)，1171-1180)，USP启动子，菜豆蛋白启动子(Sengupta-Gopalan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)，3320-3324，Bustos，Plant Cell 1(9)(1989)，839-853)，或来自玉米的玉米醇溶蛋白基因启动子(Pedersen等人，Cell 29，(1982)，1015-1026；Quatroccio等人，Plant Mol.Biol.15(1990)，81-93)，或小麦GBSSI(颗粒结合的淀粉合酶I)(DE10041861.9)和SSII(可溶性淀粉合酶II)的颖果特异性启动子(DE10032379.0)。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的植物在该植物的淀粉贮藏器官中显示R1基因表达。
R1基因的表达能如下测定，例如：测定R1转录物的量，例如通过Northern印迹分析测定，与野生型植物的R1转录物的量相比较。
而且，对于本发明，R1基因的表达能如下测定：测定R1蛋白的量，例如通过Western印迹分析测定。优选地利用从胚乳植物细胞分离的蛋白质提取物测定R1蛋白的量。
在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的植物在该植物的淀粉贮藏器官中显示R1基因表达，与未遗传修饰的相应野生型植物的淀粉贮藏器官中的R1基因表达相比，优选地至少提高50％，最优选地至少100％，特别地至少250％，最特别地至少500％。
在一个最优选的实施方案中，根据本发明的植物显示外源核酸分子在根据本发明的植物的淀粉贮藏器官中器官特异的表达。
在本发明中，术语“器官特异的”是指与成熟的叶子相比，选择的启动子更偏好在淀粉贮藏器官中表达外源核酸分子，并且导致表达程度显著提高，如表达水平至少提高2-5倍，优选地5-10倍，最优选地10-100倍。
在本发明该实施方案中，根据本发明的植物的区别在于，由于外源核酸分子器官特异地表达，它们显示R1基因在淀粉贮藏器官中的表达高于内源R1基因在未遗传修饰的相应野生型植物的淀粉贮藏器官中的基因表达。在本发明该实施方案中，R1基因在根据本发明的植物叶子中表达的提高不能与在淀粉贮藏器官中的表达同等检测。R1基因表达的提高优选地只与淀粉贮藏器官有关。
在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的植物是选自小麦、水稻、大麦，粟、燕麦、黑麦和玉米的植物。优选小麦、水稻和玉米植物；特别优选小麦植物。
本发明也涉及一种生产根据本发明定义的植物的方法，其中：
(a)遗传修饰一种单子叶植物细胞，其中该遗传修饰包括导入至少一种外源核酸分子；
(b)由根据步骤(a)的细胞再生的一种植物；和任选地
(c)由根据步骤(b)生产的植物生产的其它植物。
本发明还涉及一种生产根据本发明定义的植物的方法，在该植物的淀粉贮藏器官中合成一种淀粉，与来自野生型植物淀粉贮藏器官的淀粉相比，该淀粉的磷酸含量提高，和/或磷酸化模式改变，和/或终粘度提高，和/或峰值温度降低，其中：
(a)遗传修饰一种单子叶植物细胞，其中该遗传修饰包括导入至少一种根据本发明定义的外源核酸分子；
(b)由根据步骤(a)的细胞再生的一种植物；和任选地
(c)由根据步骤(b)生产的植物生产的其它植物。
同样适用于根据步骤(a)导入的遗传修饰，如上对于根据本发明的植物细胞和植物所述。
根据步骤(b)的植物再生能用本领域技术人员周知的方法完成。
按照根据本发明的方法的步骤(c)生产其它植物能如下完成，例如：通过无性繁殖，例如通过插枝、块茎或通过愈伤组织培育和完整植物的再生，或通过有性繁殖。有性繁殖优选地以受控方式发生，即，具有确定特性的所选植物彼此杂交、繁殖。
在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的方法的区别在于：导入根据步骤(a)的植物细胞的外源核酸分子选自：
(i)含有Seq ID No.1所示核苷酸序列的编码区的核酸分子；
(ii)编码具有Seq ID No.2所示氨基酸序列的马铃薯R1蛋白的核酸分子；
(iii)作为Seq ID No.1所示核苷酸序列的衍生物的核酸分子；和
(iv)作为(i)、(ii)或(iii)所示核酸分子的片段的核酸分子。
在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的方法的区别在于：外源核酸分子受控于一种启动子，优选地胚乳-特异和/或颖果-特异的启动子，它器官特异性地促进R1基因在淀粉贮藏组织中的表达。
这种类型的启动子，如胚乳-特异和颖果-特异的启动子，已在上文对于根据本发明的植物描述。
在另一个实施方案中，根据本发明的方法涉及有用的单子叶植物，例如：黑麦、大麦、燕麦、小麦、粟、水稻和玉米。优选小麦、水稻和玉米；特别优选小麦。
本发明也涉及能利用根据本发明的方法获得的植物。
本发明也涉及含有根据本发明的植物细胞的植物的繁殖材料，和利用根据本发明的方法生产的植物。在本发明中，术语“繁殖材料”包括适于通过无性或生殖途径生产或繁殖的植物的任何成分。例如，插条、愈伤组织培养物、根茎或块茎适于无性繁殖。其它繁殖材料包括，例如：果实、种子、幼苗、原生质体、细胞培养物等。种子是优选的繁殖材料。
在一个优选实施方案中，本发明涉及玉米粒。
在一个最优选的实施方案中，本发明涉及小麦粒。
根据本发明的玉米和小麦粒特别适于饲料和食品的生产。
本发明还涉及根据本发明定义的外源核酸分子在生产根据本发明的植物，优选地小麦、玉米和水稻植物，最优选地小麦植物，或在生产根据本发明的单子叶植物细胞中的用途。
根据本发明的植物细胞和植物合成，特别是在淀粉贮藏器官中合成一种淀粉，与在野生型植物中合成的淀粉相比，以及与化学磷酸化的淀粉相比，其理化性质，特别是磷酸含量和/或粘性行为和/或磷酸化模式改变。
因此，本发明也涉及能从根据本发明的植物细胞、植物和/或繁殖材料获得的淀粉。
在本发明的一个优选实施方案，根据本发明的淀粉的特征在于：与来自未遗传修饰的相应野生型植物的淀粉相比，其在葡萄糖单体C6位的磷酸含量提高，和/或磷酸化模式改变，和/或终粘度提高，和/或峰值温度降低。
本发明也涉及如下淀粉，其特征在于：与来自未遗传修饰的相应野生型植物的淀粉相比，其在葡萄糖单体C6位的磷酸含量提高，和/或磷酸化模式改变，和/或终粘度提高，和/或峰值温度降低。
对于根据本发明的植物细胞所做的描述适用于C6位磷酸含量的提高、磷酸化模式的改变和粘性(终粘度、峰值温度)的改变。
在另一个实施方案中，本发明涉及淀粉，优选地小麦淀粉，其特征在于：在葡萄糖单体C6位的磷酸含量至少为0.1nmol C6Pmg-1淀粉，特别地至少0.5nmol C6Pmg-1淀粉，优选地至少1nmol C6Pmg-1淀粉，最优选地至少2nmol C6Pmg-1淀粉，最特别地至少5nmol C6Pmg-1淀粉，最优选地至少10nmol C6Pmg-1淀粉，和/或终粘度提高，和/或峰值温度降低，其中根据本发明的淀粉在葡萄糖单体C6位的磷酸含量最多为100nmol C6Pmg-1淀粉，特别地最多50nmol C6Pmg-1淀粉，或最多25nmol C6Pmg-1淀粉。
在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的淀粉的特征在于：在葡萄糖单体C6位的磷酸含量至少为15nmol C6Pmg-1淀粉，其中根据本发明的淀粉在葡萄糖单体C6位的磷酸含量最多为100nmolC6Pmg-1淀粉，特别地最多50nmol C6Pmg-1淀粉，或最多25nmol C6Pmg-1淀粉。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的淀粉，优选地小麦淀粉，其特征在于：根据本发明的淀粉在胶固后形成凝胶，与具有相同磷酸含量的相应化学磷酸化淀粉的凝胶相比，和/或与来自未遗传修饰的相应植物的淀粉的凝胶相比，凝胶强度提高。
在本发明的另一个优选实施方案中，根据本发明的淀粉的特征在于：大部分磷酸基团与淀粉的支链淀粉成分键合，而直链淀粉只含有极少量的共价键合的淀粉单磷酸酯。与具有相似C-6磷酸含量的化学磷酸化淀粉相比，根据本发明的植物细胞产生的根据本发明的淀粉的区别在于，根据本发明的淀粉的直链淀粉比支链淀粉成分磷酸化强度低。
在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的淀粉的特征在于，与优选地在葡萄糖单体C6位具有相同磷酸含量的化学磷酸化淀粉的直链淀粉成分相比，该淀粉的直链淀粉成分的总磷酸含量降低。
总磷酸含量的测定方法本领域技术人员周知，如下所述(见方法)。
在本发明的另一个实施方案中，根据本发明的淀粉的特征在于：与化学磷酸化淀粉(由未遗传修饰的相应植物的淀粉产生，在葡萄糖单体C6位磷酸含量相同)的直链淀粉成分相比，能用31P NMR(Kasemsuwan和Jane(Cereal Chemistry 73(6)，(1996)，702-707)检测的淀粉直链淀粉成分的总磷酸含量至少减少5％，优选地至少20％，特别地至少50％，最优选地至少80％。
在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的淀粉的特征在于，与化学磷酸化淀粉相比，它们显示改变的磷酸化模式。
术语“改变的磷酸化模式”已经对根据本发明的植物细胞定义。
在本发明的一个优选实施方案中，淀粉是来自有用单子叶植物的淀粉，如黑麦、大麦、燕麦、小麦、粟、水稻和玉米淀粉。优选小麦、水稻和玉米淀粉；特别优选小麦淀粉。
本发明进一步涉及一种生产根据本发明的淀粉的方法，包括从如上所述的植物或植物细胞中，和/或从所述植物的淀粉贮藏部分中，和/或从根据本发明的繁殖材料中提取淀粉的步骤。如此所述的一种方法优选地也包括在提取淀粉之前收获培育的植物和/或该植物的淀粉贮藏部分的步骤，最优选地还包括在收获之前培育根据本发明的植物和/或根据本发明的繁殖材料的步骤。从植物或植物的淀粉贮藏部分提取淀粉的方法本领域技术人员周知。从不同淀粉贮藏植物提取淀粉的方法也在下列文献中描述，例如：《淀粉：化学与技术》(编者：Whistler，BeMiller和Paschall(1994)，第二版，Academic PressInc.London Ltd；ISBN 0-12-746270-8；见第XII章，第412-468页，例如：“玉米和高粱淀粉：生产”；Watson；第XIII章，第469-479页：“木薯、竹芋和西米淀粉：生产”；Corbishley和Miller；第XIV章，第479-490页：“马铃薯淀粉：生产和用途”；Mitch；第XV章，第491-506页：“小麦淀粉：生产、修饰和用途”；Knight和Oson；第XVI章，第507-528页：“水稻淀粉：生产和用途”；Rohmer和Klem；参见“玉米淀粉”：Eckhoff等人，Cereal Chem.73(1996)54-57。工业规模的玉米淀粉提取通常用被称为“湿磨”的方法实现。常用于从植物材料中提取淀粉的装置包括：磨粉机、分离器、倾析器、水力旋流器、喷雾干燥机和液化床干燥机。
本发明也涉及能用上述根据本发明的方法获得的根据本发明的淀粉。
随后能用本领域技术人员周知的方法修饰根据本发明的淀粉，其未修饰或修饰的形式适于食品或非食品部门的不同用途。
因此，本发明也涉及随后经化学和/或物理修饰的根据本发明定义的淀粉。
能用于化学和/或物理修饰的不同选项在下文详述。
通过对植物进行基因工程操作生产改性淀粉首先能改变从植物获得的淀粉的性质，从而似乎不再需要用化学或物理方法进一步修饰。其次，利用基因工程方法修饰的淀粉能进一步进行化学和/或物理修饰，进一步提高质量，用于上述某些应用领域。这些化学和物理修饰基本已知。具体而言，包括用下列方法修饰：
-热处理，
-酸处理，
-淀粉醚的生产，
淀粉烷基醚，O-烯丙醚，羟烷基醚，O-羧甲基醚，含氮淀粉醚，含磷淀粉醚，含硫淀粉醚，
-交联淀粉的生产，
-淀粉接枝聚合物的生产，
-氧化，和
-用于生产磷酸、硝酸、硫酸、黄原酸、醋酸和柠檬酸淀粉的酯化操作。其它有机酸也能用于酯化。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的淀粉在工业，优选地在食品生产中的用途。
在另一个实施方案中，本发明涉及含有根据本发明的淀粉的小麦粉。在其他特性中，根据本发明的小麦粉与普通小麦粉的区别在于焙烤特性改变。由小麦粒生产小麦粉的方法本领域技术人员周知。通过这些方法，能从根据本发明的植物细胞和植物以及从根据本发明的繁殖材料中分离根据本发明的小麦粉。
因此，本发明也涉及能从根据本发明的植物细胞和植物以及从根据本发明的繁殖材料中获得的小麦粉。
与来自未遗传修饰的相应野生型植物的淀粉相比，根据本发明的面粉的区别尤其在于它们的吸水性提高。测定吸水性的方法本领域技术人员周知，在下文详述(见方法)。
在本发明的一个优选实施方案中，与来自未遗传修饰的相应小麦植物的小麦粉相比，该小麦粉显示吸水性至少提高5％，特别地至少15％，优选地至少20％，最优选地至少25％。
由于具有强吸水性，根据本发明的面粉在生面团的工业生产中具有在生面团生产期间只需向面粉中添加少量水的优点。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的小麦粉和/或根据本发明的淀粉在生产焙烤混合物和/或生产食品中的用途。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的小麦粉和/或根据本发明的淀粉在包装的包衣中的用途。
在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及一种含有根据本发明的小麦粉和/或根据本发明的淀粉的焙烤混合物。就此而言，术语“焙烤混合物”是指能用于生产生面团(例如酵母生面团、干面食生面团、酥皮糕点、酸生面团等)和/或焙烤食品的任何混合物(例如面包、蛋糕、面卷、新月形面包等)。
在另一个特别优选的实施方案中，本发明涉及一种食品，优选地焙烤食品和发面食品(例如干面食)，它是用根据本发明的小麦粉和/或根据本发明的焙烤混合物和/或根据本发明的淀粉生产的。
与使用未遗传修饰的相应野生型小麦植物的小麦粉生产的焙烤食品相比，根据本发明的焙烤食品和/或食品在贮藏上的区别在于焙烤食品经历的陈化(ageing)过程减缓。
焙烤食品的陈化过程与淀粉的支链淀粉成分的退化(再结晶)紧密相关。假定随着焙烤食品和/或食品的陈化过程进行，支链淀粉成分的退化程度越高。能用DSC测定的支链淀粉的熔解焓提供了关于支链淀粉退化程度的信息。因此，通过用DSC(＝差示扫描量热法)分析测定特定时间点上支链淀粉的熔解焓，能测定焙烤食品的陈化程度(见方法)。
如果在贮藏3天和/或7天和/或13天后测定根据本发明的焙烤食品和/或食品的支链淀粉的熔解焓，例如，一般发现，与储存相同时间、基于未遗传修饰的相应野生型植物的小麦粉的焙烤食品和/或食品的支链淀粉相比，该支链淀粉的熔解焓减少。
【附图说明】
图1：RVA图的示意图；
图2：载体pUbi2afp的质粒图谱
图3：载体pUbiR1的质粒图谱
图4：载体p35SAcS的质粒图谱(pUC18的一种衍生物(PietrzakM.等人，Nucleic Acids Res.14，(1986)，5857-5868)：含有在CaMV35S启动子控制下的绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)pat基因(Wohlleben等人，Gene 70，(1988)，25-37)。
图5：载体pAct1-Fneo/CaIgus的质粒图谱(pUC19-衍生物(Yannish-Perron等人，1985，Gene 33：103-119)：由pAct1-Fneo(M üller等人，Plant Science 114，(1996)，71-82)和pCaIgus形成，含有CaMV35S启动子(参见例如US-A-5,352,605)、玉米AdhI内含子(Genes Dev 1987 Dec；1(10)：1183-200)和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因(GUS报道系统，作为研究植物基因表达的工具，《GUS方案：使用GUS基因作为基因表达报道基因》，Academic Press(1992)，23-43)。
图6：显示贮藏1、3、7、13天后面包屑的焓。
方法：
淀粉葡萄糖单体C6位磷酸含量(＝C6P含量)的测定(Nielsen等人，Plant Physiol.105，(1994)，111-117)：
为了测定淀粉的C6P含量，50mg淀粉在500μl 0.7M HCl中95℃水解4小时。随后以15500g离心该批10分钟，吸出上清液。7μl上清液与193μl咪唑缓冲液(100mM咪唑，pH 7.4；5mMMgCl2，1mM EDTA和0.4mM NAD)混合。在340nm下用光度计进行测量。在建立基线吸光度后，通过加入2U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(来自肠膜样明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，BoehringerMannheim)启动酶促反应。吸光度的改变与淀粉的C-6P含量的浓度成正比。
淀粉总磷酸含量的测定：
在测定淀粉的总磷酸含量之前，必须从磷酸化的非葡聚糖(如磷脂)中完全分离淀粉。
总磷酸含量的测定通过Ames的方法进行(Methods inEnzymology VIII，(1966)，115-118)，如下：
约50mg淀粉用30μl 10％乙醇硝酸镁溶液处理，在马弗炉中燃烧3小时。残余物用500μl 0.5M盐酸处理，在60℃下温育30分钟。然后加入0.5M盐酸使20μl等份至300μl，加至100μl 10％抗环血酸和600μl 0.42％钼酸铵的混合物中，在45℃下温育20分钟。之后用磷酸校准系列作为标准，在820nm下进行光度测量。
凝胶强度的测定(结构分析仪)：
2.5g淀粉(TS)在RVA仪器(参见利用Rapid Visco分析仪(RVA)测定粘性)中在25ml H2O中胶固，之后在室温下贮存24小时。样品在Stable Micro Systems(Surrey，UK)的TA-XT2结构分析仪的传感器(具有一个平面的圆柱形活塞)下固定，用下列仪器设置测量凝胶强度：
-测试速度 0.5mm/s
-刺入深度 7mm
-接触面积 113mm2
-压力 2g
利用Rapid Visco分析仪(RVA)测定粘性(例如终粘度)：
2.5g淀粉(干重)吸收25ml H2O，用于在Rapid Visco分析仪(Newport Scientific Pty Ltd.，Investment Support Group，WarriewodNSW 2102，澳大利亚)中分析。仪器按照使用说明书操作。为了测定淀粉水溶液的粘度，首先加热淀粉悬液1分钟至50℃，然后以每分钟12℃的速度从50℃加热到95℃。在95℃下保温2.5分钟。之后，溶液以每分钟12℃的速度从95℃冷却到50℃。最后，在50℃下再保温6分钟。在整个试验期间测定粘度。
通过水浸析分离淀粉的直链淀粉成分：
众所周知，通过水浸析(Roger和Colonna(InternationalJournal of Biological Macromolecules 19，(1996)，51-61)能从淀粉中获得直链淀粉。
为了分离淀粉的直链淀粉成分，制备25ml淀粉水悬液(10％w/v)，随着搅拌在RVA(Newport Scientific)中加热，使用下列参数：
时间[min] 类型 值[℃]或[rpm]
0 温度 30℃
0 速度 960rpm
0.5 速度 300rpm
10 温度 95℃
在悬液或溶液的粘度超过200cP之后，立即终止程序，并将淀粉悬液或溶液转移到一个预冷的50ml反应管中，与25ml冷水混合，并在冰浴中冷却10分钟至大约室温(RT)。之后，未溶解的葡聚糖经离心(20min，2300g，RT)形成沉淀，澄清的上清液用10mg NaCl/ml处理。然后在冰上用80％乙醇沉淀溶解的葡聚糖，再次用乙醇洗涤，在37℃下干燥3天。随后研磨沉淀(15s 30Hz，在德国Retsch的振动磨中使用碳化钨球)，将25mg沉淀悬浮于500μl 0.7M HCl中，在95℃下水解4小时。然后离心去除未溶解的颗粒，酶学测定葡萄糖-6P的含量(见上文：“葡萄糖单体C6位磷酸含量的测定”)。
对小麦粉进行的小规模吸水试验程序：
材料
来自Sarsted的带有螺帽的Eppendorf管(2ml)。
Eppendorf离心机(Sigma 202)
振荡器(Wilten)
分析天平(Mettler)
方法
用分析天平称量Eppendorf管重量，保留小数点后四位。
向Eppendorf管中填充100-110mg面粉，注意精确的重量。
将带有面粉的管置于振荡涡旋器上，边振荡边加入1.0ml水。
持续振荡10秒钟。
加入0.9ml水，用螺帽拧紧Eppendorf管，
等待10分钟。
将Eppendorf管放入离心机的6*10转子中(转位式)。
以10000转/分离心30分钟(约8600*g)。
从管中倒出水。
用滤纸吸干管的内部，不干扰湿残余物。
用分析天平称量带有湿面粉的Eppendorf管的重量，保留小数点后四位。
计算吸收的水的重量。
测量每种面粉的吸水量10次，计算平均值。
差示扫描量热法：
差示扫描量热法(DSC)是一种研究热转化的技术，此处研究面包屑。
利用该技术以连续(相对较低)的加热速度测量流入样品中的热量。基线的峰值(距基线的偏移(内热))或梯级(玻璃转换)决定转换。
相对于基线的峰面积取积分产生转换的焓。对于面包屑，通常观察到40-70℃(60℃峰值)的支链淀粉熔解热和大约120℃的直链淀粉-脂质解络合。
不同面粉样品之间支链淀粉熔解热的不同表明退化行为的不同，因而表明面包已变得不新鲜。支链淀粉晶体的熔解焓随着焙烤后贮藏时间的延长而升高。贮藏期间熔解焓的升高是再结晶的支链淀粉的量随时间增加的量度。为了根据含湿量不同进行修正，以干物质为基础计算焓(j/g)。
DSC测量用配有LNCA冷却单元的TA Instruments Type 2920热量计进行。这个冷却单元使用液氮在实验后快速冷却。
样品(40-50mg面包屑)置于DSC锅中，用指甲手工压缩。用压缩单位密封DSC锅后，将样品置于DSC-装置中。
样品(40-50mg面包屑)在密封的不锈钢锅(Perkin Elmer)中以7.5℃/min的速度从20℃加热到160℃。以填充100mg铝的中压锅(120μl体积)作为参照。
在贮藏1、3、7、14天后单次测量小面包碎屑的焓。
下列实施例用来解释本发明，而不在任何方面进行限制：
实施例1
用于小麦植物转化的载体pUbiR1的制备
为了制备载体pUbiR1，首先如下制备载体pUbi.cas：
载体pUbi2afp(见图2)用限制酶PstI/EcoRI部分酶切。产生的4.19Kb片段包含pUC19载体(Yannish-Perron等人，1985，Gene 33：103-119)、1.5Kb遍在蛋白启动子和ubi基因的第一个外显子和缩短的遍在蛋白1内含子(ClaI缺失)(Christensen等人，Plant Mol.Biol.18，(1992)，675-689)，在凝胶洗脱后使用。
nos终止子作为PstI/EcoRI片段从载体pAct.cas(产品号CambiaTG0063，Cambia，GPO Box 3200，Canberra ACT 2601，澳大利亚)上分离，连接两个片段产生载体pUbi.cas。
随后，马铃薯R1基因的cDNA(SEQ ID No.1)作为部分消化物(SmaI/Asp718片段)从载体pRL2(WO97/11188，实施例4，在德国微生物保藏中心保藏号为DSM 10225)上分离，整合到载体pUbi.cas(用SmaI/Asp718限制酶切)上。产生的构建体命名为pUbiR1(见图3)。该构建体包含马铃薯R1 cDNA的编码区，它受遍在蛋白启动子控制(Christensen等人，1992，Plant Mol.Biol.18：675-689)，也包含ubi基因的第一个外显子(Ch ristensen等人，1992，Plant Mol.Biol.18：675-689)和缩短的第一个内含子(Christensen等人，1992，Plant Mol.Biol.18：675-689)，内部ClaI片段缺失)作为另外的调节单位。
实施例2
表达马铃薯R1基因的小麦植物的生产，和这些植物的淀粉的磷酸含量分析
用biolistic转化法进行小麦的转化(Becker等人，Plant J.5(2)，(1994)，229-307)。用于biolistic共转化的载体pUbiR1和载体p35SacS(见图4)或pAct1-Fneo/CaIgus(Müller等人，Plant Science114，(1996)，71-82，见图5)在DNA颗粒沉淀批次中以相同摩尔比使用。
载体p35SAcS如下制备：绿色产色链霉菌的pat基因(Wohlleben等人，Gene 70，(1988)，25-37)通过聚合酶链反应扩增。设计使用的引物，使得在扩增物两侧产生BamHI酶切位点。随后将BamHI片段克隆到置于载体pDH51(Pietzrak等人，Nucleic Acids Res.14，(1986)，5857-5868)的35S启动子与35S终止子之间的BamHI酶切位点。将含有35S启动子、pat基因和35S终止子的盒切割为EcoRI片段，克隆到载体pUC18的EcoRI酶切位点(Pietzrak等人，Nucleic AcidsRes.14，(1986)，5857-5868)。
用来自小麦植物的14天的不成熟胚芽的盾片作为转化的靶细胞。转化后在含有2mg/l 2，4-D(＝2，4二氯苯氧乙酸)的MS-培养基(PCT/EP97/02793)上进行体外培养。转化两周后，在已添加2mg/l膦丝菌素或150mg/l硫酸卡那霉素的相同培养基上进行传代培养。再两周后，将发育的愈伤组织移植到再生培养基上(含有0.1mg/l 2，4-D和2mg/l PPT或150mg/l卡那霉素的MS-培养基)。将发育的幼芽转移到不含2，4-D和膦丝菌素或卡那霉素的半浓缩MS-培养基中，然后转移到土壤中。在土壤中生长约14天后，喷洒分别含有150和200mg/l膦丝菌素、0.1％Tween 20(ICI America，相当于聚山梨醇酯20)的水溶液两次，或喷洒2.5％硫酸卡那霉素、0.1％Tween 20两次，鉴定转基因植物。
马铃薯R1基因在T0植物中的表达
马铃薯R1基因在转基因小麦T0植物中的表达通过Nortern和Western印迹分析检测，并酶学测定颖果淀粉葡萄糖单体C6位的磷酸含量(Nielsen等人，Plant Physiol.105，(1994)，111-117)。
利用抗马铃薯R1蛋白抗体检测转基因小麦植物中的R1蛋白(Ritte等人，Plant J.21(4)，(2000)，387-391)。
用来自约20天的不成熟颖果的胚芽的蛋白质提取物筛选转基因植物。
为了测定C6磷酸，从不成熟和成熟的小麦颖果中分离来自转基因T0植物的淀粉。颖果在研钵中磨碎，形成粉末。在加入15ml 100mM Tris缓冲液(pH 8.0)后，悬液通过100μm筛过滤，离心沉淀淀粉(2600g，5min，4℃)。弃去上清液。然后将淀粉沉淀重悬浮于2ml 100mM Tris缓冲液(pH 8.0)中，转移到8ml Percoll梯度中。在4℃下以170g离心15分钟沉淀淀粉。用10ml 100 Tris缓冲液(pH 8.0)洗涤淀粉沉淀三次。最后，通过丙酮温育使淀粉脱脂并干燥。
以上述方法利用光学-酶试验(Nielsen等人，Plant Physiol.105，(1994)，111-117)通过葡萄糖-6-磷酸测定法测定C6P含量。
试验表明，在Southern印迹分析中产生阳性结果的小麦T0植物中，有大约50％的系在颖果中合成一种淀粉，它与来自未遗传修饰的相应Florida品种野生型植物的淀粉相比，在葡萄糖单体C6位的磷酸含量提高。表1给出了选择的某些系的数据。
自然子代的分析
播种从表达R1的亲代系自然获得的种子，确定分离比。通过Southern和Northern印迹分析能检测R1基因在不同系的T1子代中的整合和表达。测定这些系在淀粉C6位的磷酸含量。表1显示选择的某些系的数据。
表1：
系编号 C6P 基因-分配 标准差
nmol/mg
野生型Florida品种 不可检测 - 0.0
19 2.8 T0 0.2
20-25 6.7 T1 0.2
37 1.4 T0 0.3
40A-11-8 10.7 T2 0.7
实施例3
来自表达马铃薯R1基因的转基因小麦植物的植物淀粉的RVA分析，和凝胶强度的研究
来自实施例1和2所述小麦植物的淀粉进行RVA分析。
RVA分析结果(实验：见方法)表明，与来自未遗传修饰的相应野生型小麦植物(Florida品种)的淀粉相比，来自表达马铃薯R1基因的转基因小麦植物的淀粉的粘性行为显著改变(见表2)。
表2：
系编号 RVA RVA RVA RVA RVA
Max Min Fin Set T
(％) (％) (％) (％) (％)
野生型(Florida) 100 100 100 100 100
19(T0) 98.7 113.8 116.8 120.7 102
20-25(T1) 155.3 190 193.8 198.8 99
37(T0) 143.8 156.2 148.8 139 101
40-11-8(T2) 156.2 185.5 187.7 190.6 97
图例：
RVA＝Rapid Visco分析仪
Max＝见图1
Min＝见图1
Fin＝终粘度，见图1
Set＝Setback＝Min与Fin之差，见图1
T＝胶固温度，见图1
百分比相对于野生型(＝100％)。
来自表达马铃薯R1基因的转基因小麦植物的淀粉的凝胶强度(凝胶强度的测定：见方法)不同于随后化学磷酸化的来自未遗传修饰的相应野生型小麦植物(Florida品种)的淀粉和野生型淀粉(Florida品种)(见表3)。
与在葡萄糖单体C6位有相似磷酸含量的化学磷酸化淀粉不同，在胶固后，根据本发明的淀粉的凝胶显示凝胶强度高于野生型植物的淀粉的凝胶。与此不同，将利用Lim所述方法生产的化学磷酸化淀粉与野生型植物的淀粉的凝胶相比较。
表3：
系编号 凝胶强度(TA)(％) C6位的磷酸含量
μmol磷酸/g淀粉
野生型(Florida) 100 不可检测
19(T0) 167 2.8
20-25(T1) 192 6.7
37(T0) 168 1.4
40-11-8(T2) 224 10.7
化学磷酸化的野生型(Florida)淀粉
STMP1 84 2.1
STMP6 75 6.5
STMP8 67 11.5
TA＝结构分析仪
百分比相对于野生型(＝100％)。
实施例4
来自表达马铃薯R1基因的转基因小麦植物的植物淀粉的DSC分析
来自实施例1和2所述小麦植物的淀粉进行DSC分析。
用Perkin Elmer的仪器(仪器名称：DSC-7)用大体积容器测量峰值温度，其中所研究的样品的淀粉与总含水量之比约为1∶4，并且以10℃/min的加热速度在10℃-160℃温度范围内进行测量。
DSC分析结果(表4)显示，与来自未遗传修饰的相应野生型小麦植物(Florida品种)的淀粉相比，与随后化学磷酸化的、在葡萄糖单体C6位有相似磷酸含量的淀粉相比，来自表达马铃薯R1基因的转基因小麦植物的淀粉的峰值温度Tp降低。
表4：
样品 样品的含水 淀粉(干重)：峰值温度 其它峰最大值
量(％) 水(总含水量)℃(第一峰最大值) ℃
野生型 16.6 1∶4.01 61 101
(Florida)
19(T0) 10.5 1∶3.99 58 100
20-25(T1) 16.9 1∶4.05 55 100
40-11-8(T2) 16.9 1∶3.98 56 100
STMP2* 10.9 1∶4.00 60 101
STMP6 10.7 1∶4.00 61 101
*化学磷酸化淀粉STMP2在C6位的磷酸含量为3.0μmol磷酸/g淀粉。表3列出了其它所有磷酸数据。
实施例5
不同淀粉的直链淀粉成分的C6P含量测定
除了来自表达马铃薯R1基因的转基因小麦植物的淀粉之外，还研究了两种化学磷酸化淀粉(STMP3和STPP4)。化学磷酸化用Lim和Seib(Cereal Chem.70(2)，(1993)，137-144)所述的方法实现，其中淀粉在pH 6下反应2小时产生STMP3，而在pH 8下反应30分钟产生STPP4。缩写STMP代表选择的磷酸化试剂，即三间磷酸钠；STPP代表三聚磷酸钠。
不同淀粉的直链淀粉成分如上所述分离(淀粉的直链淀粉成分通过水浸析分离)。
C6位的磷酸含量如上所述测定(葡萄糖单体C6位磷酸含量的测定)。
表5：
样品 C6P含量 C6P含量 直链淀粉的C6P含
μmol磷酸/g淀粉 μmol磷酸/g直链淀粉 量/淀粉的C6P含量
40-11-8(T2) 10.7 1.9 0.18
STPP4 20.5 20.4 0.99
STMP3 6.0 5.1 0.85
可以看出，在化学磷酸化淀粉中，直链淀粉的C6P含量与淀粉的C6P含量之比大大高于来自超表达马铃薯R1基因的转基因小麦植物的淀粉。化学磷酸化淀粉中磷酸化直链淀粉的含量高于来自转基因小麦植物的淀粉。
实施例6
由不同来源的面粉生产的小面包面包屑的DSC分析
用来自野生型小麦植物(Florida品种)和超表达马铃薯R1基因的遗传修饰小麦植物的小麦粉生产小面包，采用下列食谱：
小麦粉 10.00g
酵母 0.25g
盐 0.20g
葡萄糖 0.10g
抗坏血酸20ppm
水 在吸水试验中确定并且根据稠度修正的水量(见方法“对小麦粉进行的小规模吸水试验程序”)
遗传修饰的小麦植物的生面团在混合过程中变得非常粘。为了获得具有正确操作特性的生面团，使用少量的水。根据生面团硬度的技术感官知觉修正生面团的稠度。
生面团在验证箱中验证45分钟(28℃)，手工操作，第二次验证15分钟(28℃)，形成并置于烤罐中。随后对生面团进行60分钟的最后验证(28℃)。面包在烤箱中焙烤15分钟(200℃)，罐嵌入潮湿的木框中。这样嵌入的目的是为烤罐遮挡辐射出的大量热量。最后，在没有木框的情况下烘焙面包5分钟，使面包皮变为棕色。
利用差示扫描量热法(DSC)(见方法)测定面包屑的热转化。在贮藏1、3、7、14天后测量面包屑的焓(图6)。
图6显示贮藏的面包屑在贮藏1、3、7、13天后支链淀粉熔解峰的焓(40℃-70℃)，表示陈化作用。用野生型(Florida)面粉制成的面包屑的焓高于由超表达马铃薯R1基因的两种不同遗传修饰小麦植物系(GMO1和GMO2)的面粉制成的相同时间长度的面包屑。这表明，面包含有较低水平的再结晶淀粉，较少的淀粉退化和较少的陈化。
序列表：
SEQ ID No.1(R1 cDNA马铃薯，核苷酸序列5061bp，编码区：bp216-bp 4607)：
gaattgtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatcgataagctt
gatatcgaattcgcggccgcttttgcttcgtgaattcatcttcatcgaatttctcgacgcttcttcgctaatttcctcgttact
tcactagaaatcgacgtttctagctgaacttgagtgaattaagccagtgggaggatatgagtaattccttagggaat
aacttgctgtaccagggattcctaacctcaacagtgttggaacataaaagtagaatcagtcctccttgtgttggagg
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gctcaattggtcaaagagctgaaggaaaagatgcagggttctggcatgccttggcctggtgatgaaggtccaaa
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gggaaacacttgttggagcttacccaggacgtgctttgagttttatctgcaagaaaaaggatctcaactctcctcaa
gtgttaggttacccaagcaaaccgatcggccttttcataaaaagatctatcatcttccgatctgattccaatggggaa
gatttggaaggttatgccggtgctggcctctacgacagtgtaccaatggatgaggaggaaaaagttgtaattgatt
actcttccgacccattgataactgatggtaacttccgccagacaatcctgtccaacattgctcgtgctggacatgcta
tcgaggagctatatggctctcctcaagacatcgagggtgtagtgagggatggaaagatttatgtcgttcagacaag
acctcagatgtgatcatattctcgttgtatgttgttcagagaagaccatagatgtgatcatattctcatggtatcagatct
gtgaccacttacctcccatgaagttgcctgtatgattatacgtgatccaaagccatcacatcatgttcaccttcagcta
ttggaggagaagtgagaagtaggaattgcaatatgaggaataataagaaaaactttgtagaagttaaattagctg
ggtatgatatagggagaaatgtgtaaacattgtactatatatagtatacacacgcattatgtatttgcattatgcactg
aataatatcgcagcatcaaagaagaaatcctttgagtggtttcaattgccgcggccgcgaattcctgcagcccgg
gggatccactagttctagagcggccgccaccgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattt
SEQ ID No.2(马铃薯R1蛋白，氨基酸序列：1464个氨基酸)
MsnslgnnllyqgfltstvlehksrisppcvggnslfqqqvisksplstefrgnrlkvqkkkipMgknrafsssphavl
ttdtsselaekfslegnielqvdvrpptsgdvsfvdfqatngsdklflhwgavkfgketwslpndrpdgtkvyknkal
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eiskaqdrltdllqnaftshpqyreilrMiMstvgrggegdvgqrirdeilviqrkndckggMMeewhqklhnnts
pddvvicqalidyiksdfdlgvywktlnengitkerllsydraihsepnfrgdqkngllrdlghyMrtlkavhsgadle
saiancMgyktegegfMvgvqinpvsglpsgfqgllhfvldhvedknveflleglleareeirplllkpnnrlkdllfld
drirlalaskaewyhhllqpsaeylgsilgvdqwalnifteeiiragsaaslssllnrldpvlrktanlgswqiispveav
gyvvvvdellsvqneiykkptilvansvkgeeeipdgavalitpdMpdvlshvsvrarngkvcfatcfdpniladlq
akegrilllkptpsdiiysevneielqsssnlveaetsatlrlvkkqfggcyaisadeftseMvgaksrniaylkgkvp
ssvgiptsvalpfgvfekvlsddinqgvakelqiltkklsegdfsalgeidtildlsapaqlvkelkekMqgsgMpw
pgdegpkrweqawMaikkvwaskwnerayfstrkvkldhdylcMavlvqeiinadyafvihttnpssgddsei
yaevvrglgetlvgaypgralsfickkkdlnspqvlgypskpiglfikrsiifrsdsngedlegyagaglydsvpMde
eekvvidyssdplitdgnfrqtilsniaraghaieelygspqdiegvvrdgkiyvvqtrpqM
序列表
【序列表】
<110>Aventis CropScience GmbH
<120>合成改性淀粉的单子叶植物细胞和植物
<130>2000/M 233
<140>
<141>
<150>DE 10052492.3
<151>2000-10-23
<150>DE 10064805.3
<151>2000-12-22
<160>16
<170>Patent in Ver.2.1
<210>1
<211>5061
<212>DNA
<213>马铃薯(Solanum tuberosum)
<220>
<221>CDS
<222>(216)..(4607)
<400>1
gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttgggtaccg ggccccccct cgaggtcgac 60
ggtatcgata agcttgatat cgaattcgcg gccgcttttg cttcgtgaat tcatcttcat 120
cgaatttctc gacgcttctt cgctaatttc ctcgttactt cactagaaat cgacgtttct 180
agctgaactt gagtgaatta agccagtggg aggat atg agt aat tcc tta ggg 233
Met Ser Asn Ser Leu Gly
1 5
aat aac ttg ctg tac cag gga ttc cta acc tca aca gtg ttg gaa cat 281
Asn Asn Leu Leu Tyr Gln Gly Phe Leu Thr Ser Thr Val Leu Glu His
10 15 20
aaa agt aga atc agt cct cct tgt gtt gga ggc aat tct ttg ttt caa 329
Lys Ser Arg Ile Ser Pro Pro Cys Val Gly Gly Asn Ser Leu Phe Gln
25 30 35
caa caa gtg atc tcg aaa tca cct tta tca act gag ttt cga ggt aac 377
Gln Gln Val Ile Ser Lys Ser Pro Leu Ser Thr Glu Phe Arg Gly Asn
40 45 50
agg tta aag gtg cag aaa aag aaa ata cct atg gga aag aac cgt gct 425
Arg Leu Lys Val Gln Lys Lys Lys Ile Pro Met Gly Lys Asn Arg Ala
55 60 65 70
ttt tct agt tct cct cat gct gta ctt acc act gat acc tct tct gag 473
Phe Ser Ser Ser Pro His Ala Val Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ser Glu
75 80 85
cta gca gaa aag ttc agt cta gaa ggg aat att gag cta cag gtt gat 521
Leu Ala Glu Lys Phe Ser Leu Glu Gly Asn Ile Glu Leu Gln Val Asp
90 95 100
gtt agg cct ccc act tca ggt gat gtg tcc ttt gtg gat ttt caa gct 569
Val Arg Pro Pro Thr Ser Gly Asp Val Ser Phe Val Asp Phe Gln Ala
105 110 115
aca aat ggt agt gat aaa ctg ttt ttg cac tgg ggg gca gta aag ttc 617
Thr Asn Gly Ser Asp Lys Leu Phe Leu His Trp Gly Ala Val Lys Phe
120 125 130
gga aaa gaa aca tgg tct ctt cct aat gat cgt cca gat ggg acc aaa 665
Gly Lys Glu Thr Trp Ser Leu Pro Asn Asp Arg Pro Asp Gly Thr Lys
135 140 145 150
gtg tac aag aac aaa gca ctt aga act cca ttt gtt aaa tct ggc tct 713
Val Tyr Lys Asn Lys Ala Leu Arg Thr Pro Phe Val Lys Ser Gly Ser
155 160 165
aac tcc atc ctg aga ctg gag ata cgg gac act gct atc gaa gct att 761
Asn Ser Ile Leu Arg Leu Glu Ile Arg Asp Thr Ala Ile Glu Ala Ile
170 175 180
gag ttt ctc ata tac gat gaa gcc tac gat aaa tgg ata aag aat aat 809
Glu Phe Leu Ile Tyr Asp Glu Ala Tyr Asp Lys Trp Ile Lys Asn Asn
185 190 195
ggt ggc aat ttt cgt gtc aaa ttg tca aga aaa gag ata cga ggc cca 857
Gly Gly Asn Phe Arg Val Lys Leu Ser Arg Lys Glu Ile Arg Gly Pro
200 205 210
gat gtt tca gtt cct gag gag ctt gta cag atc caa tca tat ttg agg 905
Asp Val Ser Val Pro Glu Glu Leu Val Gln Ile Gln Ser Tyr Leu Arg
215 220 225 230
tgg gag agg aag gga aaa cag aat tac acc cct gag aaa gag aag gag 953
Trp Glu Arg Lys Gly Lys Gln Asn Tyr Thr Pro Glu Lys Glu Lys Glu
235 240 245
gaa tat gag gct gct cga act gag cta cag gag gaa ata gct cgt ggt 1001
Glu Tyr Glu Ala Ala Arg Thr Glu Leu Gln Glu Glu Ile Ala Arg Gly
250 255 260
gct tcc ata cag gac att cga gca agg cta aca aaa act aat gat aaa 1049
Ala Ser Ile Gln Asp Ile Arg Ala Arg Leu Thr Lys Thr Asn Asp Lys
265 270 275
agt caa agc aaa gaa gag cct ctt cat gta aca aag agt gaa ata cct 1097
Ser Gln Ser Lys Glu Glu Pro Leu His Val Thr Lys Ser Glu Ile Pro
280 285 290
gat gac ctt gcc caa gca caa gct tac att agg tgg gag aaa gca gga 1145
Asp Asp Leu Ala Gln Ala Gln Ala Tyr Ile Arg Trp Glu Lys Ala Gly
295 300 305 310
aag ccg aac tat cct cca gaa aag caa att gaa gaa ctc gaa gaa gca 1193
Lys Pro Asn Tyr Pro Pro Glu Lys Gln Ile Glu Glu Leu Glu Glu Ala
315 320 325
aga aga gaa ttg caa ctt gag ctt gag aaa ggc att acc ctt gat gag 1241
Arg Arg Glu Leu Gln Leu Glu Leu Glu Lys Gly Ile Thr Leu Asp Glu
330 335 340
ttg cgg aaa aag att aca aaa ggg gag ata aaa act aag gcg gaa aag 1289
Leu Arg Lys Lys Ile Thr Lys Gly Glu Ile Lys Thr Lys Ala Glu Lys
345 350 355
cac gtg aaa aga agc tct ttt gcc gtt gaa aga atc caa aga aag aag 1337
His Val Lys Arg Ser Ser Phe Ala Val Glu Arg Ile Gln Arg Lys Lys
360 365 370
aga gac ttt ggg cag ctt att aat aag tat cct tcc agt cct gca gta 1385
Arg Asp Phe Gly Gln Leu Ile Asn Lys Tyr Pro Ser Ser Pro Ala Val
375 380 385 390
caa gta caa aag gtc ttg gaa gaa cca cca gcc tta tct aaa att aag 1433
Gln Val Gln Lys Val Leu Glu Glu Pro Pro Ala Leu Ser Lys Ile Lys
395 400 405
ctg tat gcc aag gag aag gag gag cag att gat gat ccg atc ctt aat 1481
Leu Tyr Ala Lys Glu Lys Glu Glu Gln Ile Asp Asp Pro Ile Leu Asn
410 415 420
aaa aag atc ttt aag gtc gat gat ggg gag cta ctg gta ctg gta gca 1529
Lys Lys Ile Phe Lys Val Asp Asp Gly Glu Leu Leu Val Leu Val Ala
425 430 435
aag tcc tct ggg aag aca aaa gta cat ata gct aca gat ctg aat cag 1577
Lys Ser Ser Gly Lys Thr Lys Val His Ile Ala Thr Asp Leu Asn Gln
440 445 450
cca att act ctt cac tgg gca tta tcc aaa agt cgt gga gag tgg atg 1625
Pro Ile Thr Leu His Trp Ala Leu Ser Lys Ser Arg Gly Glu Trp Met
455 460 465 470
gta cca cct tca agc ata ttg cct cct gga tca att att tta gac aag 1673
Val Pro Pro Ser Ser Ile Leu Pro Pro Gly Ser Ile Ile Leu Asp Lys
475 480 485
gct gcc gaa aca cct ttt tcc gcc agt tct tct gat ggt cta act tct 1721
Ala Ala Glu Thr Pro Phe Ser Ala Ser Ser Ser Asp Gly Leu Thr Ser
490 495 500
aag gta caa tct ttg gat ata gta att gaa gat ggc aat ttt gtg ggg 1769
Lys Val Gln Ser Leu Asp Ile Val Ile Glu Asp Gly Asn Phe Val Gly
505 510 515
atg cca ttt gtt ctt ttg tct ggt gaa aaa tgg att aag aac caa ggg 1817
Met Pro Phe Val Leu Leu Ser Gly Glu Lys Trp Ile Lys Asn Gln Gly
520 525 530
tcg gat ttc tat gtt gac ttc agt gct gca tcc aaa tta gca ctc aag 1865
Ser Asp Phe Tyr Val Asp Phe Ser Ala Ala Ser Lys Leu Ala Leu Lys
535 540 545 550
gct gct ggg gat ggc agt gga act gca aag tct tta ctg gat aaa ata 1913
Ala Ala Gly Asp Gly Ser Gly Thr Ala Lys Ser Leu Leu Asp Lys Ile
555 560 565
gca gat atg gaa agt gag gct cag aag tca ttt atg cac cgg ttt aat 1961
Ala Asp Met Glu Ser Glu Ala Gln Lys Ser Phe Met His Arg Phe Asn
570 575 580
att gct gct gac ttg ata gaa gat gcc act agt gct ggt gaa ctt ggt 2009
Ile Ala Ala Asp Leu Ile Glu Asp Ala Thr Ser Ala Gly Glu Leu Gly
585 590 595
ttt act gga att ctt gta tgg atg agg ttc atg gct aca agg caa ctg 2057
Phe Thr Gly Ile Leu Val Trp Met Arg Phe Met Ala Thr Arg Gln Leu
600 605 610
ata tgg aac aaa aac tat aac gta aaa cca cgt gaa ata agc aag gct 2105
Ile Trp Asn Lys Asn Tyr Asn Val Lys Pro Arg Glu Ile Ser Lys Ala
615 620 625 630
cag gac aga ctt aca gac ttg ttg cag aat gct ttc acc agt cac cct 2153
Gln Asp Arg Leu Thr Asp Leu Leu Gln Asn Ala Phe Thr Ser His Pro
635 640 645
caa tac cgt gaa att ttg cgg atg att atg tca act gtt gga cgt gga 2201
Gln Tyr Arg Glu Ile Leu Arg Met Ile Met Ser Thr Val Gly Arg Gly
650 655 660
ggt gaa ggg gat gta gga cag cga att agg gat gaa att ttg gtc atc 2249
Gly Glu Gly Asp Val Gly Gln Arg Ile Arg Asp Glu Ile Leu Val Ile
665 670 675
cag agg aaa aat gac tgc aag ggt ggt atg atg gaa gaa tgg cat cag 2297
Gln Arg Lys Asn Asp Cys Lys Gly Gly Met Met Glu Glu Trp His Gln
680 685 690
aaa ttg cat aat aat act agt cct gat gat gtt gtg atc tgt cag gca 2345
Lys Leu His Asn Asn Thr Ser Pro Asp Asp Val Val Ile Cys Gln Ala
695 700 705 710
ttg att gac tac atc aag agt gat ttt gat ctt ggt gtt tat tgg aaa 2393
Leu Ile Asp Tyr Ile Lys Ser Asp Phe Asp Leu Gly Val Tyr Trp Lys
715 720 725
acc ctg aat gag aac gga ata aca aaa gag cgt ctt ttg agt tat gac 2441
Thr Leu Asn Glu Asn Gly Ile Thr Lys Glu Arg Leu Leu Ser Tyr Asp
730 735 740
cgt gct atc cat tct gaa ccg aat ttt aga gga gat caa aag aat ggt 2489
Arg Ala Ile His Ser Glu Pro Asn Phe Arg Gly Asp Gln Lys Asn Gly
745 750 755
ctt ttg cgt gat tta ggt cac tat atg aga aca ttg aag gct gtt cat 2537
Leu Leu Arg Asp Leu Gly His Tyr Met Arg Thr Leu Lys Ala Val His
760 765 770
tca ggt gca gat ctt gag tct gct att gca aac tgc atg ggc tac aaa 2585
Ser Gly Ala Asp Leu Glu Ser Ala Ile Ala Asn Cys Met Gly Tyr Lys
775 780 785 790
act gag gga gaa ggc ttt atg gtt gga gtc cag ata aat cct gta tca 2633
Thr Glu Gly Glu Gly Phe Met Val Gly Val Gln Ile Asn Pro Val Ser
795 800 805
ggc ttg cca tct ggc ttt cag ggc ctc ctc cat ttt gtc tta gac cat 2681
Gly Leu Pro Ser Gly Phe Gln Gly Leu Leu His Phe Val Leu Asp His
810 815 820
gtg gaa gat aaa aat gtg gaa act ctt ctt gag gga ttg cta gag gct 2729
Val Glu Asp Lys Asn Val Glu Thr Leu Leu Glu Gly Leu Leu Glu Ala
825 830 835
cgt gag gag ctt agg ccc ttg ctt ctc aaa cca aac aac cgt cta aag 2777
Arg Glu Glu Leu Arg Pro Leu Leu Leu Lys Pro Asn Asn Arg Leu Lys
840 845 850
gat ctg ctg ttt ttg gac ata gca ctt gat tct aca gtt aga aca gca 2825
Asp Leu Leu Phe Leu Asp Ile Ala Leu Asp Ser Thr Val Arg Thr Ala
855 860 865 870
gta gaa agg gga tat gaa gaa ttg aac aac gct aat cct gag aaa atc 2873
Val Glu Arg Gly Tyr Glu Glu Leu Asn Asn Ala Asn Pro Glu Lys Ile
875 880 885
atg tac ttc atc tcc ctc gtt ctt gaa aat ctc gca ctc tct gtg gac 2921
Met Tyr Phe Ile Ser Leu Val Leu Glu Asn Leu Ala Leu Ser Val Asp
890 895 900
gat aat gaa gat ctt gtt tat tgc ttg aag gga tgg aat caa gct ctt 2969
Asp Asn Glu Asp Leu Val Tyr Cys Leu Lys Gly Trp Asn Gln Ala Leu
905 910 915
tca atg tcc aat ggt gga gac aac cat tgg gct tta ttt gca aaa gct 3017
Ser Met Ser Asn Gly Gly Asp Asn His Trp Ala Leu Phe Ala Lys Ala
920 925 930
gta ctt gac aga atc cgt ctt gca ctt gca agc aag gca gag tgg tac 3065
Val Leu Asp Arg Ile Arg Leu Ala Leu Ala Ser Lys Ala Glu Trp Tyr
935 940 945 950
cat cac tta ttg cag cca tct gcc gaa tat cta gga tca atc ctt ggg 3113
His His Leu Leu Gln Pro Ser Ala Glu Tyr Leu Gly Ser Ile Leu Gly
955 960 965
gtg gac caa tgg gct ttg aac ata ttt act gaa gaa att ata cgt gct 3161
Val Asp Gln Trp Ala Leu Asn Ile Phe Thr Glu Glu Ile Ile Arg Ala
970 975 980
gga tca gca gct tca tta tcc tct ctt ctt aat aga ctc gat ccc gtg 3209
Gly Ser Ala Ala Ser Leu Ser Ser Leu Leu Asn Arg Leu Asp Pro Val
985 990 995
ctt cgg aaa act gca aat cta gga agt tgg cag att atc agt cca gtt 3257
Leu Arg Lys Thr Ala Asn Leu Gly Ser Trp Gln Ile Ile Ser Pro Val
1000 1005 1010
gaa gcc gtt gga tat gtt gtc gtt gtg gat gag ttg ctt tca gtt cag 3305
Glu Ala Val Gly Tyr Val Val Val Val Asp Glu Leu Leu Ser Val Gln
1015 1020 1025 1030
aat gaa atc tac aag aag ccc acg atc tta gta gca aac tct gtt aaa 3353
Asn Glu Ile Tyr Lys Lys Pro Thr Ile Leu Val Ala Asn Ser Val Lys
1035 1040 1045
gga gag gag gaa att cct gat ggt gct gtt gcc ctg ata aca cca gac 3401
Gly Glu Glu Glu Ile Pro Asp Gly Ala Val Ala Leu Ile Thr Pro Asp
1050 1055 1060
atg cca gat gtt ctt tca cat gtt tct gtt cga gct aga aat ggg aag 3449
Met Pro Asp Val Leu Ser His Val Ser Val Arg Ala Arg Asn Gly Lys
1065 1070 1075
gtt tgc ttt gct aca tgc ttt gat ccc aat ata ttg gct gac ctc caa 3497
Val Cys Phe Ala Thr Cys Phe Asp Pro Asn Ile Leu Ala Asp Leu Gln
1080 1085 1090
gca aag gaa gga agg att ttg ctc tta aag cct aca cct tca gac ata 3545
Ala Lys Glu Gly Arg Ile Leu Leu Leu Lys Pro Thr Pro Ser Asp Ile
1095 1100 1105 1110
atc tat agt gag gtg aat gag att gag ctc caa agt tca agt aac ttg 3593
Ile Tyr Ser Glu Val Asn Glu Ile Glu Leu Gln Ser Ser Ser Asn Leu
1115 1120 1125
gta gaa gct gaa act tca gca aca ctt aga ttg gtg aaa aag caa ttt 3641
Val Glu Ala Glu Thr Ser Ala Thr Leu Arg Leu Val Lys Lys Gln Phe
1130 1135 1140
ggt ggt tgt tac gca ata tca gca gat gaa ttc aca agt gaa atg gtt 3689
Gly Gly Cys Tyr Ala Ile Ser Ala Asp Glu Phe Thr Ser Glu Met Val
1145 1150 1155
gga gct aaa tca cgt aat att gca tat ctg aaa gga aaa gtg cct tcc 3737
Gly Ala Lys Ser Arg Asn Ile Ala Tyr Leu Lys Gly Lys Val Pro Ser
1160 1165 1170
tcg gtg gga att cct acg tca gta gct ctt cca ttt gga gtc ttt gag 3785
Ser Val Gly Ile Pro Thr Ser Val Ala Leu Pro Phe Gly Val Phe Glu
1175 1180 1185 1190
aaa gta ctt tca gac gac ata aat cag gga gtg gca aaa gag ttg caa 3833
Lys Val Leu Ser Asp Asp Ile Asn Gln Gly Val Ala Lys Glu Leu Gln
1195 1200 1205
att ctg acg aaa aaa cta tct gaa gga gac ttc agc gct ctt ggt gaa 3881
Ile Leu Thr Lys Lys Leu Ser Glu Gly Asp Phe Ser Ala Leu Gly Glu
1210 1215 1220
att cgc aca acg att tta gat ctt tca gca cca gct caa ttg gtc aaa 3929
Ile Arg Thr Thr Ile Leu Asp Leu Ser Ala Pro Ala Gln Leu Val Lys
1225 1230 1235
gag ctg aag gaa aag atg cag ggt tct ggc atg cct tgg cct ggt gat 3977
Glu Leu Lys Glu Lys Met Gln Gly Ser Gly Met Pro Trp Pro Gly Asp
1240 1245 1250
gaa ggt cca aag cgg tgg gaa caa gca tgg atg gcc ata aaa aag gtg 4025
Glu Gly Pro Lys Arg Trp Glu Gln Ala Trp Met Ala Ile Lys Lys Val
1255 1260 1265 1270
tgg gct tca aaa tgg aat gag aga gca tac ttc agc aca agg aag gtg 4073
Trp Ala Ser Lys Trp Asn Glu Arg Ala Tyr Phe Ser Thr Arg Lys Val
1275 1280 1285
aaa ctg gat cat gac tat ctg tgc atg gct gtc ctt gtt caa gaa ata 4121
Lys Leu Asp His Asp Tyr Leu Cys Met Ala Val Leu Val Gln Glu Ile
1290 1295 1300
ata aat gct gat tat gca ttt gtc att cac aca acc aac cca tct tcc 4169
Ile Asn Ala Asp Tyr Ala Phe Val Ile His Thr Thr Asn Pro Ser Ser
1305 1310 1315
gga gac gac tca gaa ata tat gcc gag gtg gtc agg ggc ctt ggg gaa 4217
Gly Asp Asp Ser Glu Ile Tyr Ala Glu Val Val Arg Gly Leu Gly Glu
1320 1325 1330
aca ctt gtt gga gct tac cca gga cgt gct ttg agt ttt atc tgc aag 4265
Thr Leu Val Gly Ala Tyr Pro Gly Arg Ala Leu Ser Phe Ile Cys Lys
1335 1340 1345 1350
aaa aag gat ctc aac tct cct caa gtg tta ggt tac cca agc aaa ccg 4313
Lys Lys Asp Leu Asn Ser Pro Gln Val Leu Gly Tyr Pro Ser Lys Pro
1355 1360 1365
atc ggc ctt ttc ata aaa aga tct atc atc ttc cga tct gat tcc aat 4361
Ile Gly Leu Phe Ile Lys Arg Ser Ile Ile Phe Arg Ser Asp Ser Asn
1370 1375 1380
ggg gaa gat ttg gaa ggt tat gcc ggt gct ggc ctc tac gac agt gta 4409
Gly Glu Asp Leu Glu Gly Tyr Ala Gly Ala Gly Leu Tyr Asp Ser Val
1385 1390 1395
cca atg gat gag gag gaa aaa gtt gta att gat tac tct tcc gac cca 4457
Pro Met Asp Glu Glu Glu Lys Val Val Ile Asp Tyr Ser Ser Asp Pro
1400 1405 1410
ttg ata act gat ggt aac ttc cgc cag aca atc ctg tcc aac att gct 4505
Leu Ile Thr Asp Gly Asn Phe Arg Gln Thr Ile Leu Ser Asn Ile Ala
1415 1420 1425 1430
cgt gct gga cat gct atc gag gag cta tat ggc tct cct caa gac atc 4553
Arg Ala Gly His Ala Ile Glu Glu Leu Tyr Gly Ser Pro Gln Asp IIe
1435 1440 1445
gag ggt gta gtg agg gat gga aag att tat gtc gtt cag aca aga cct 4601
Glu Gly Val Val Arg Asp Gly Lys Ile Tyr Val Val Gln Thr Arg Pro
1450 1455 1460
cag atg tgatcatatt ctcgttgtat gttgttcaga gaagaccata gatgtgatca 4657
Gln Met
tattctcatg gtatcagatc tgtgaccact tacctcccat gaagttgcct gtatgattat 4717
acgtgatcca aagccatcac atcatgttca ccttcagcta ttggaggaga agtgagaagt 4777
aggaattgca atatgaggaa taataagaaa aactttgtag aagttaaatt agctgggtat 4837
gatataggga gaaatgtgta aacattgtac tatatatagt atacacacgc attatgtatt 4897
tgcattatgc actgaataat atcgcagcat caaagaagaa atcctttgag tggtttcaat 4957
tgccgcggcc gcgaattcct gcagcccggg ggatccacta gttctagagc ggccgccacc 5017
gcggtggagc tccagctttt gttcccttta gtgagggtta attt 5061
<210>2
<211>1464
<212>PRT
<213>马铃薯
<400>2
Met Ser Asn Ser Leu Gly Asn Asn Leu Leu Tyr Gln Gly Phe Leu Thr
1 5 10 15
Ser Thr Val Leu Glu His Lys Ser Arg Ile Ser Pro Pro Cys Val Gly
20 25 30
Gly Asn Ser Leu Phe Gln Gln Gln Val Ile Ser Lys Ser Pro Leu Ser
35 40 45
Thr Glu Phe Arg Gly Asn Arg Leu Lys Val Gln Lys Lys Lys Ile Pro
50 55 60
Met Gly Lys Asn Arg Ala Phe Ser Ser Ser Pro His Ala Val Leu Thr
65 70 75 80
Thr Asp Thr Ser Ser Glu Leu Ala Glu Lys Phe Ser Leu Glu Gly Asn
85 90 95
Ile Glu Leu Gln Val Asp Val Arg Pro Pro Thr Ser Gly Asp Val Ser
100 105 110
Phe Val Asp Phe Gln Ala Thr Asn Gly Ser Asp Lys Leu Phe Leu His
115 120 125
Trp Gly Ala Val Lys Phe Gly Lys Glu Thr Trp Ser Leu Pro Asn Asp
130 135 140
Arg Pro Asp Gly Thr Lys Val Tyr Lys Asn Lys Ala Leu Arg Thr Pro
145 150 155 160
Phe Val Lys Ser Gly Ser Ash Ser Ile Leu Arg Leu Glu Ile Arg Asp
165 170 175
Thr Ala Ile Glu Ala Ile Glu Phe Leu Ile Tyr Asp Glu Ala Tyr Asp
180 185 190
Lys Trp Ile Lys Asn Asn Gly Gly Asn Phe Arg Val Lys Leu Ser Arg
195 200 205
Lys Glu Ile Arg Gly Pro Asp Val Ser Val Pro Glu Glu Leu Val Gln
210 215 220
Ile Gln Ser Tyr Leu Arg Trp Glu Arg Lys Gly Lys Gln Asn Tyr Thr
225 230 235 240
Pro Glu Lys Glu Lys Glu Glu Tyr Glu Ala Ala Arg Thr Glu Leu Gln
245 250 255
Glu Glu Ile Ala Arg Gly Ala Ser Ile Gln Asp Ile Arg Ala Arg Leu
260 265 270
Thr Lys Thr Asn Asp Lys Ser Gln Ser Lys Glu Glu Pro Leu His Val
275 280 285
Thr Lys Ser Glu Ile Pro Asp Asp Leu Ala Gln Ala Gln Ala Tyr Ile
290 295 300
Arg Trp Glu Lys Ala Gly Lys Pro Asn Tyr Pro Pro Glu Lys Gln Ile
305 310 315 320
Glu Glu Leu Glu Glu Ala Arg Arg Glu Leu Gln Leu Glu Leu Glu Lys
325 330 335
Gly Ile Thr Leu Asp Glu Leu Arg Lys Lys Ile Thr Lys Gly Glu Ile
340 345 350
Lys Thr Lys Ala Glu Lys His Val Lys Arg Ser Ser Phe Ala Val Glu
355 360 365
Arg Ile Gln Arg Lys Lys Arg Asp Phe Gly Gln Leu Ile Asn Lys Tyr
370 375 380
Pro Ser Ser Pro Ala Val Gln Val Gln Lys Val Leu Glu Glu Pro Pro
385 390 395 400
Ala Leu Ser Lys Ile Lys Leu Tyr Ala Lys Glu Lys Glu Glu Gln Ile
405 410 415
Asp Asp Pro Ile Leu Asn Lys Lys Ile Phe Lys Val Asp Asp Gly Glu
420 425 430
Leu Leu Val Leu Val Ala Lys Ser Ser Gly Lys Thr Lys Val His Ile
435 440 445
Ala Thr Asp Leu Asn Gln Pro Ile Thr Leu His Trp Ala Leu Ser Lys
450 455 460
Ser Arg Gly Glu Trp Met Val Pro Pro Ser Ser Ile Leu Pro Pro Gly
465 470 475 480
Ser Ile Ile Leu Asp Lys Ala Ala Glu Thr Pro Phe Ser Ala Ser Ser
485 490 495
Ser Asp Gly Leu Thr Ser Lys Val Gln Ser Leu Asp Ile Val Ile Glu
500 505 510
Asp Gly Asn Phe Val Gly Met Pro Phe Val Leu Leu Ser Gly Glu Lys
515 520 525
Trp Ile Lys Asn Gln Gly Ser Asp Phe Tyr Val Asp Phe Ser Ala Ala
530 535 540
Ser Lys Leu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Asp Gly Ser Gly Thr Ala Lys
545 550 555 560
Ser Leu Leu Asp Lys Ile Ala Asp Met Glu Ser Glu Ala Gln Lys Ser
565 570 575
Phe Met His Arg Phe Asn Ile Ala Ala Asp Leu Ile Glu Asp Ala Thr
580 585 590
Ser Ala Gly Glu Leu Gly Phe Thr Gly Ile Leu Val Trp Met Arg Phe
595 600 605
Met Ala Thr Arg Gln Leu Ile Trp Asn Lys Asn Tyr Asn Val Lys Pro
610 615 620
Arg Glu Ile Ser Lys Ala Gln Asp Arg Leu Thr Asp Leu Leu Gln Asn
625 630 635 640
Ala Phe Thr Ser His Pro Gln Tyr Arg Glu Ile Leu Arg Met Ile Met
645 650 655
Ser Thr Val Gly Arg Gly Gly Glu Gly Asp Val Gly Gln Arg Ile Arg
660 665 670
Asp Glu Ile Leu Val Ile Gln Arg Lys Asn Asp Cys Lys Gly Gly Met
675 680 685
Met Glu Glu Trp His Gln Lys Leu His Asn Asn Thr Ser Pro Asp Asp
690 695 700
Val Val Ile Cys Gln Ala Leu Ile Asp Tyr Ile Lys Ser Asp Phe Asp
705 710 715 720
Leu Gly Val Tyr Trp Lys Thr Leu Asn Glu Asn Gly Ile Thr Lys Glu
725 730 735
Arg Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Ala Ile His Ser Glu Pro Asn Phe Arg
740 745 750
Gly Asp Gln Lys Asn Gly Leu Leu Arg Asp Leu Gly His Tyr Met Arg
755 760 765
Thr Leu Lys Ala Val His Ser Gly Ala Asp Leu Glu Ser Ala Ile Ala
770 775 780
Asn Cys Met Gly Tyr Lys Thr Glu Gly Glu Gly Phe Met Val Gly Val
785 790 795 800
Gln Ile Asn Pro Val Ser Gly Leu Pro Ser Gly Phe Gln Gly Leu Leu
805 810 815
His Phe Val Leu Asp His Val Glu Asp Lys Asn Val Glu Thr Leu Leu
820 825 830
Glu Gly Leu Leu Glu Ala Arg Glu Glu Leu Arg Pro Leu Leu Leu Lys
835 840 845
Pro Asn Asn Arg Leu Lys Asp Leu Leu Phe Leu Asp Ile Ala Leu Asp
850 855 860
Ser Thr Val Arg Thr Ala Val Glu Arg Gly Tyr Glu Glu Leu Asn Asn
865 870 875 880
Ala Asn Pro Glu Lys Ile Met Tyr Phe Ile Ser Leu Val Leu Glu Asn
885 890 895
Leu Ala Leu Ser Val Asp Asp Asn Glu Asp Leu Val Tyr Cys Leu Lys
900 905 910
Gly Trp Asn Gln Ala Leu Ser Met Ser Asn Gly Gly Asp Asn His Trp
915 920 925
Ala Leu Phe Ala Lys Ala Val Leu Asp Arg Ile Arg Leu Ala Leu Ala
930 935 940
Ser Lys Ala Glu Trp Tyr His His Leu Leu Gln Pro Ser Ala Glu Tyr
945 950 955 960
Leu Gly Ser Ile Leu Gly Val Asp Gln Trp Ala Leu Asn Ile Phe Thr
965 970 975
Glu Glu Ile Ile Arg Ala Gly Ser Ala Ala Ser Leu Ser Ser Leu Leu
980 985 990
Asn Arg Leu Asp Pro Val Leu Arg Lys Thr Ala Asn Leu Gly Ser Trp
995 1000 1005
Gln Ile Ile Ser Pro Val Glu Ala Val Gly Tyr Val Val Val Val Asp
1010 1015 1020
Glu Leu Leu Ser Val Gln Asn Glu Ile Tyr Lys Lys Pro Thr Ile Leu
1025 1030 1035 1040
Val Ala Asn Ser Val Lys Gly Glu Glu Glu Ile Pro Asp Gly Ala Val
1045 1050 1055
Ala Leu Ile Thr Pro Asp Met Pro Asp Val Leu Ser His Val Ser Val
1060 1065 1070
Arg Ala Arg Asn Gly Lys Val Cys Phe Ala Thr Cys Phe Asp Pro Asn
1075 1080 1085
Ile Leu Ala Asp Leu Gln Ala Lys Glu Gly Arg Ile Leu Leu Leu Lys
1090 1095 1100
Pro Thr Pro Ser Asp Ile Ile Tyr Ser Glu Val Asn Glu Ile Glu Leu
1105 1110 1115 1120
Gln Ser Ser Ser Asn Leu Val Glu Ala Glu Thr Ser Ala Thr Leu Arg
1125 1130 1135
Leu ValLys Lys Gln Phe Gly Gly Cys Tyr Ala lle Ser Ala Asp Glu
1140 1145 1150
Phe Thr Ser Glu Met Val Gly Ala Lys Ser Arg Asn Ile Ala Tyr Leu
1155 1160 1165
Lys Gly Lys Val Pro Ser Ser Val Gly Ile Pro Thr Ser Val Ala Leu
1170 1175 1180
Pro Phe Gly Val Phe Glu Lys Val Leu Ser Asp Asp Ile Asn Gln Gly
1185 1190 1195 1200
Val Ala Lys Glu Leu Gln Ile Leu Thr Lys Lys Leu Ser Glu Gly Asp
1205 1210 1215
Phe Ser Ala Leu Gly Glu Ile Arg Thr Thr Ile Leu Asp Leu Ser Ala
1220 1225 1230
Pro Ala Gln Leu Val Lys Glu Leu Lys Glu Lys Met Gln Gly Ser Gly
1235 1240 1245
Met Pro Trp Pro Gly Asp Glu Gly Pro Lys Arg Trp Glu Gln Ala Trp
1250 1255 1260
Met Ala Ile Lys Lys Val Trp Ala Ser Lys Trp Asn Glu Arg Ala Tyr
1265 1270 1275 1280
Phe Ser Thr Arg Lys Val Lys Leu Asp His Asp Tyr Leu Cys Met Ala
1285 1290 1295
Val Leu Val Gln Glu Ile Ile Asn Ala Asp Tyr Ala Phe Val Ile His
1300 1305 1310
Thr Thr Asn Pro Ser Ser Gly Asp Asp Ser Glu Ile Tyr Ala Glu Val
1315 1320 1325
Val Arg Gly Leu Gly Glu Thr Leu Val Gly Ala Tyr Pro Gly Arg Ala
1330 1335 1340
Leu Ser Phe Ile Cys Lys Lys Lys Asp Leu Asn Ser Pro Gln Val Leu
1345 1350 1355 1360
Gly Tyr Pro Ser Lys Pro Ile Gly Leu Phe Ile Lys Arg Ser Ile Ile
1365 1370 1375
Phe Arg Ser Asp Ser Asn Gly Glu Asp Leu Glu Gly Tyr Ala Gly Ala
1380 1385 1390
Gly Leu Tyr Asp Ser Val Pro Met Asp Glu Glu Glu Lys Val Val Ile
1395 1400 1405
Asp Tyr Ser Ser Asp Pro Leu Ile Thr Asp Gly Asn Phe Arg Gln Thr
1410 1415 1420
Ile Leu Ser Asn Ile Ala Arg Ala Gly His Ala Ile Glu Glu Leu Tyr
1425 1430 1435 1440
Gly Ser Pro Gln Asp Ile Glu Gly Val Val Arg Asp Gly Lys Ile Tyr
1445 1450 1455
Val Val Gln Thr Arg Pro Gln Met
1460
<210>3
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：部分序列
<400>3
Asp Lys Ala Ala Glu Thr
1 5
<210>4
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：部分序列
<400>4
Ile Ala Asp Met Glu
1 5
<210>5
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：部分序列
<400>5
Val Trp Met Arg Phe Met
1 5
<210>6
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：部分序列
<400>6
Met Gln Glu Trp His Gln
1 5
<210>7
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：部分序列
<400>7
Leu Gly His Tyr Met
1 5
<210>8
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：部分序列
<400>8
Glu Arg Gly Tyr Glu Glu
1 5
<210>9
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：部分序列
<400>9
Lys Ala Val Leu Asp Arg
1 5
<210>10
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：部分序列
<400>10
Leu Ser Ser Leu Leu
1 5
<210>11
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：部分序列
<400>11
Ile Pro Asp Gly Ala Val
1 5
<210>12
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：部分序列
<400>12
Lys Val Cys Phe Ala Thr
1 5
<210>13
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：部分序列
<400>13
Ile Ser Ala Asp Glu Phe
1 5
<210>14
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：部分序列
<400>14
Pro Phe Gly Val Phe Glu
1 5
<210>15
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：部分序列
<400>15
Ser Ser Gly Asp Asp
1 5
<210>16
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：部分序列
<400>16
Ser Phe Ile Cys Lys Lys
1 5