轮状病毒非结构蛋白4可变形式的不同细胞毒性 【发明领域】
本发明涉及轮状病毒非结构蛋白4的可变形式中，导致细胞毒性显著改变的序列差异的鉴别。
【发明背景】
认为轮状病毒是人和动物中严重病毒性肠胃炎的最重要的原因(文献引用1)。轮状病毒是具有由11个双链RNA区段构成的基因组的、无包膜的三层颗粒。A组轮状病毒是人和动物中轮状病毒病的主要原因。
命名为SA11的原型A组轮状病毒，发现于人轮状病毒被鉴定的10年前。Malherbe等(2)描述了从健康东非猿猴的直肠分离出一种病毒：猿猴介质11(SA11)，和其在东非猿猴肾细胞培养物中的细胞病变作用。该病毒分送给了Holmes等，(Dept．Microbiology,University of Melbourne,Australia)(3),Estes等,(Division of Molecular Virology,Baylor College of Medicine,Houston,TX,USA)(4)，和美国典型培养物保藏中心。不幸的是，不知道各病毒样品地准确传代历史。
称为NPS4的非结构蛋白4，是A组轮状病毒的基因10编码的。在多功能轮状病毒非结构蛋白4(NSP4)的几个推测的功能中，是疾病的致病原因(5-11)。该论点根据对原型轮状病毒，SA11株编码的NSP4的过去几个研究(5-8)作出。
1983年Both等根据对澳大利亚Holmes等提供的噬斑纯化的病毒原种的分析，报道了轮状病毒SA11株(A组轮状病毒原型)的基因10的核苷酸序列(12)，其测序通过联合数种方法进行。将基因10的诸部分亚克隆入细菌噬菌体M13中，并用Sanger法测序(13)；将cDNA克隆的其它区域用Maxam和Gilbert法测序(14)。
NSP4的先前研究(5-8,11,12,15-23)是根据Both等提供的NSP4基因版本的cDNA克隆。澳大利亚株的原始NSP4序列在推断的氨基酸序列中氨基酸位置47具有天冬酰胺(NSP4(Asp))(12)。
NSP是一种具有多种功能的跨膜蛋白。它的作用是亚病毒颗粒芽生入感染细胞内质网(ER)的胞内受体(16,21)。NSP4的表达导致Sf9昆虫细胞中胞内钙水平([Ca2+]i)的升高(5)。观察到OSU株(一种不同的A组轮状病毒)的NSP4对细胞内钙水平的改变具有相似的作用(9)。当将NSP4蛋白或合成肽NSP4 114-135外源性加到昆虫(6)或哺乳动物(8)细胞中时，激活了磷脂酶C(PLC)介导途径。
对于病毒诱导的许多病原性过程，已提出了钙在细胞病变作用(CPE)和细胞死亡中的作用(24)。已将[Ca2+]i水平的升高和A组轮状病毒感染的MA104细胞(猴肾细胞；Biowhittaker Inc.,Walkersville,MD)中的细胞毒性联系起来(25)。已提出，NSP4-诱导的细胞毒性是由于在感染细胞中胞内钙水平的升高(5)。已发现NSP4对哺乳动物细胞有细胞毒性(5,11)。也已显示NSP4在幼小鼠中起导致腹泻的肠毒素(7)作用。针对NSP4的抗体在同样的动物模型中提供了对轮状病毒的被动保护(7)。
需要开发具有减弱的细胞毒性，但保留原型轮状病毒株相似的构象，从而仍有抗原性和免疫原性的NSP4可变形式。这种抗原性和免疫原性形式是包括在抗原性组合物中来保护机体抵抗轮状病毒疾病的候选形式。
发明简述
因此，本发明的一个目的是鉴定负责细胞毒性，并提高胞内钙水平的NPS4区域。
本发明的还有一个目的是鉴定并开发具有减弱的细胞毒性，但由于和原型轮状病毒株的构象相近，仍保留抗原性和免疫原性的NSP4可变形式。
如本文所述，与Holmes等得到的并由Both等测序的澳大利亚轮状病毒株(NSP4(Asn))中的天冬酰胺相比较，在SA11 ATCC轮状病毒株(NSP4(His))中NSP4的氨基酸位置47有一个组氨酸。该取代形式NSP4(His)，保留了NSP4(Asn)的主要功能，即，细胞毒性和胞内钙改变功能，但它对细胞的细胞毒性更强。
要产生毒性减弱，同时保留其抗原性和免疫原性的NSP4可变形式，需将NSP4氨基酸位置47的组氨酸和天冬酰胺诱变成另一种氨基酸。例如，将编码氨基酸47的组氨酸密码子CAT或天冬酰胺密码子AAT诱变成编码天冬氨酸的GAA。该氨基酸的其它减毒突变也可用来减弱毒性。
如本文所述的，在SA11 ATCC和澳大利亚轮状病毒株中的氨基酸位置48有一个赖氨酸。将该赖氨酸转变为谷氨酸提高了病毒导致的胞内钙水平和毒性。因此，也将氨基酸48鉴定为和病毒毒性有关的位置。为了产生毒性减弱，同时保留其抗原性和免疫原性的NSP4可变形式，可将氨基酸位置48的赖氨酸诱变成谷氨酸以外的另一种氨基酸。
也可将氨基酸位置47和48旁侧的氨基酸用相似方式诱变。还可将NSP4其它区域的突变和氨基酸位置47和/或48的突变联合起来。
如本文还描述的，本发明也涉及一种分离并纯化的核酸序列，它包含的核酸序列编码：(a)轮状病毒NSP4蛋白，其中氨基酸位置47的组氨酸或天冬酰胺诱变成另一种氨基酸，而产生毒性减弱，同时保留抗原性和免疫原性的NSP4可变形式；(b)轮状病毒NSP4蛋白，其中氨基酸位置48的赖氨酸诱变成谷氨酸以外的另一种氨基酸，而产生毒性减弱，同时保留抗原性和免疫原性的NSP4可变形式；或(c)轮状病毒NSP4蛋白，其中氨基酸位置47的组氨酸或天冬酰胺诱变成另一种氨基酸，并且其中氨基酸位置48的赖氨酸诱变成谷氨酸以外的另一种氨基酸，而产生毒性减弱，同时保留抗原性和免疫原性的NSP4可变形式。
本发明还涉及构建表达上述NSP4可变形式的质粒。
为了获得NSP4可变形式的表达，首先将分离和纯化的核酸序列插入一个合适的质粒载体中。然后用该质粒转化、转染或感染合适的宿主细胞。在本发明的一个实施例中，宿主细胞是Sf9细胞。然后在允许宿主细胞表达所述NSP4可变形式的条件下培养宿主细胞。
在本发明的另一个实施例中，用NSP蛋白的可变形式来制备抗原性组合物，该抗原性组合物在哺乳动物宿主中能诱导抗轮状病毒的保护性免疫应答，或能在已感染了轮状病毒的宿主中改善腹泻症状。该抗原性组合物还可以包含佐剂、稀释剂或载体。这些佐剂的实例包括氢氧化铝、磷酸铝、MPLTM、StimulonTMQS21,IL-12和霍乱毒素。将该抗原性组合物以足以保护宿主抵抗轮状病毒引起的疾病，或足以在已感染了轮状病毒的宿主中改善腹泻症状的免疫原性量施给哺乳动物宿主。
附图简述
图1描述了轮状病毒SA11病毒原种的来源。表明了SA11 ATCC株的传代史。WLVP代表Wyeth-Lederle Vaccines and Pediatrics,VL代表WLVP中用的病毒批号。
图2表示分别用含有轮状病毒基因VP6(方块)、氨基酸47的NSP4(His)(圆形)和氨基酸47的NSP4(Asn)(三角)的重组杆状病毒以0.2MOI分别感染的Sf9细胞的细胞存活率。用台酚蓝排除试验在指定时间测量细胞存活率。各时间点的平均值代表三个独立的感染。
图3表示Sf9细胞(模拟感染)(左)、在氨基酸位置47表达NSP4(Asn)的Sf9细胞(中间)和在氨基酸47表达NSP4(His)的Sf9细胞(右)中的胞内钙水平。图象得自表明[Ca2+]i比率(340/380nm)的代表性实验。
图4描述了Sf9细胞中NSP4表达的蛋白印迹分析：泳道1-氨基酸47的NSP4(His)；泳道2-氨基酸47的NSP4(Asn)；泳道3-作为阳性对照的感染SA11的MA104细胞裂解液；泳道4-分子量标记。
图5描述了用不含轮状病毒(模拟感染)(圆形)，含有氨基酸47的NSP4(His)(方块)、氨基酸47的NSP4(Asn)(十字)、和氨基酸48的NSP4(Glu)(菱形)的重组杆状病毒感染的Sf9细胞的细胞存活率。以10MOI用重组杆状病毒感染Sf9细胞。用台酚蓝排除试验在指定时间测量细胞存活率。各时间点的平均值代表三个独立的感染。
图6描述了Sf9细胞(模拟感染)(黑条)和分别表达氨基酸47处的NSP4(Asn)(暗灰条)、氨基酸47处的NSP4(His)(浅灰条)、和氨基酸48处的NSP4(G1u)(白条)的Sf9细胞的胞内钙水平。以10MOI用重组杆状病毒感染Sf9细胞。在感染48小时后，用荧光钙指示剂fura-2测量胞内钙。各柱显示，与模拟感染的Sf9细胞相比的胞内钙水平。各柱代表三个实验的平均值。
发明详述
Malherbe等在1963年首先分离出轮状病毒SA11(2)。Malherbe博士实验室的SA11传代历史已不可得。用于公布序列的病毒传代史也已不可得。Dr.Estes提供了具有5代传代史的SA11克隆3。
在RNA病毒中，点突变以规律性频率发生。曾估计轮状病毒每次复制在每个核苷酸位点有10-4频率改变的复制错误(26)。因此，可能同一病毒的各分离物都有一些核苷酸序列差异。例如，已报道了从同一病毒分离到的SA11的不同克隆中VP7的两种具有糖基化变体的版本(27)。SA11的基因9中的一个突变导致了VP7的非糖基化形式(克隆28)。因此，该病毒各cDNA克隆的序列或病毒RNA的RT-PCR扩增衍生的一个质粒可能不是该病毒共有序列完全准确的代表。
如下文实施例2所述，对美国典型培养物保藏中心获得的SA11轮状病毒(ATCC登录号VR-899)编码NSP4的基因10(也称为基因NS28)进行了测序。根据核苷酸序列，鉴定了SA11的NSP4版本中氨基酸位置47的组氨酸(NSP4(His))，它和先前出版的澳大利亚株(12)的序列只有这一个氨基酸不同，后者在该位点有一个天冬酰胺残基(NSP4(Asn))。相信本文描述的SA11基因10的序列，即，编码NSP4(His)的基因，是原型序列。
虽然由于不能确定SA11轮状病毒的传代史，明确推断哪个是真正的基因10的原型序列是困难的，但相信编码NSP4(His)的序列是共有序列的代表，因为：ⅰ)在SA11株的不同传代号中，包括非常早期的一代(Lot 1N)中观察到它；ⅱ)通过对两种RT-PCR产物(病毒群的代表)和各克隆的直接测序已证明了它；ⅲ)还在从其它实验室(Estes)获得的不同SA11原种中发现了它；和ⅳ)44种公开的不同轮状病毒株的NSP4序列中有43种在位置47具有His。
由于大多数NSP4研究(5-8,12,15-23)是根据从Both等的cDNA基因10克隆的表达，所以知道在两种NSP4变体，即，NSP4(Asn)和NSP4(His)中NSP功能是否是完全保守的很重要。
为了试验NSP4蛋白的生物功能是否由组氨酸到天冬氨酸的氨基酸取代而改变，将编码位置47处的组氨酸的密码子用编码天冬酰胺的密码子替换。核苷酸139从A到C的改变导致从天冬酰胺到组氨酸的突变。具体的说，将密码子(残基139-141，其中起始密码子是残基1-3)从AAT变为CAT。将NPS4基因的这两种版本克隆入杆状病毒转运载体，然后在昆虫细胞中表达。
用蛋白质印迹和SDS-PAGE检测了重组杆状病毒载体感染的Sf9细胞的NSP4表达。用NSP4抗肽抗体检测到感染的Sf9细胞中有三种形式的NSP4合成：两种为26和28kD的糖基化形式，一种为20kD的非糖基化形式(见图5)。
SA11 NSP4在哺乳动物细胞中的表达看来是细胞毒性的(5)。在用表达NSP4的质粒转染的细胞中已观察到了反常的形态改变。近来，Newton等已显示用重组痘病毒感染的哺乳动物细胞中NSP4的表达导致杀死细胞(11)。本文证明了NSP4表达对昆虫(Sf9)细胞也有细胞毒性。与表达其它轮状病毒蛋白质，包括VP2、VP4、VP6和VP7的细胞比较，用重组杆状病毒感染的Sf9细胞中NSP4的表达导致了显著降低的细胞存活率。
如下文实施例3所述，昆虫细胞中NSP4(His)的表达诱导了和细胞毒性相关的主要细胞病变作用。然而，这个氨基酸改变显著影响了SA11 NSP4的细胞毒性作用程度。在Sf9细胞中表达的NSP4(His)，和NSP4(Asn)比较，导致了细胞死亡率的显著提高。因此，当在Sf9细胞中表达时，NSP4(His)比NSP4(Asn)细胞毒性更强。如下文实施例7中描述的，证实了该结果。
最近的数据(5)显示，在Sf9细胞中NSP4的表达导致了胞内钙水平的显著升高。已指出(5,6)升高的胞内钙可能引起NSP4导致的发病。如下文实施例4所示，NSP4(His)和NSP4(Asn)都导致胞内钙水平的显著升高。然而，NSP4(His)的表达导致比NSP4(Asn)更高的胞内钙水平。如下文实施例8中所述，证实了该结果。在表达NSP4(His)的细胞中观察到的更高的钙水平不是由于该蛋白质的过度表达，因为在感染了重组杆状病毒NSP4(Asn)的Sf9细胞中，比感染了重组杆状病毒NSP4(His)的Sf9细胞中表达更高量的NSP4(见下文实施例5)。因此，位置47的一个氨基酸改变显著影响NSP4对胞内钙活动性的作用。
负责细胞病变性和毒性的功能性NSP4功能域还未被完全确定。然而，已知NSP4跨越氨基酸14到140的功能域对胞内钙活动性是重要的，如下文所示：(ⅰ)对应于NSP4氨基酸114到135的合成肽和完整蛋白质在胞内钙活动性(6)和引起腹泻(7)上功能相似；(ⅱ)Zhang等报道了毒性OSU病毒由于氨基酸135,136,138中的改变和该同一病毒的非毒性形式不同(9)。然而，其它功能域对NSP4的功能可能也是重要的。已显示NSP4的N-连接糖基化(氨基酸8和18)可能是在病毒形态发生中除去临时性包膜所需的(28)。近来，Newton等报道说H3功能域(氨基酸55到85)对NSP4的细胞毒性和膜去稳定活性是关键的(11)。本文描述了一个氨基酸改变(与H2功能域毗邻位置47从组氨酸到天冬氨酸)显著改变了NSP4的功能。这些结果提示除了氨基酸114-140外的功能域对NSP4的细胞毒性和钙活动性是重要的。
NSP4是一种ER跨膜蛋白(图5)。疏水性分析揭示了三个假定的疏水区(H1-H3)。已提出了两种模式的NSP4拓扑结构。Chan等提出第三疏水区(H3，氨基酸67到85)跨越ER膜，而第二疏水区(H2，氨基酸28到47)位于ER内腔(15,27)。Bergmann等提出H2区(氨基酸30到54)横贯ER膜，而H3区(氨基酸63到80)位于ER的细胞质一侧(20)。在Bergmann的模式中，H2区的一部分(氨基酸30到44)跨越ER膜，而氨基酸47(和氨基酸48)延伸入ER的细胞质位置。不受下文所限，氨基酸47(和氨基酸48)可能对NSP4和ER膜的相互作用是重要的。
在位置47将氨基酸从天冬酰胺(它是不带电荷而且是极性的)改变成组氨酸(它是碱性而且带正电的)导致生理pH下H2区中电荷的改变。不受下文所限，作为该电荷改变的结果，由于额外电荷，NSP4(His)可以直接使ER膜去稳定，或通过形成NSP4C-末端膜去稳定区(氨基酸114-140)的结构，可以间接损伤ER膜，从而促进了NSP4的膜去稳定化活性(18)。
因此，NSP4(His)拥有NSP4(Asn)在致病作用(如细胞毒性和胞内钙改变)中的主要功能。然而，位置47的这一个氨基酸改变显著影响了SA11 NSP4的细胞毒性。
通过常规重组DNA技术将NSP4氨基酸位置47的组氨酸诱变成另一种氨基酸，而产生毒性减弱，同时保留其抗原性和免疫原性的NSP4可变形式。例如，在氨基酸47处，将编码组氨酸密码子CAT或编码天冬酰胺的密码子AAT诱变成编码天冬氨酸的GAA。
也可用其它减毒突变来减弱NSP4的毒性。由于在任何给定位置可能的氨基酸数目有限，本领域技术人员可方便的构建一系列质粒，各含有在位置47编码不同氨基酸的不同密码子。然后可轻易的在本文描述的细胞存活率和胞内钙水平系统中测试所得到的表达的NSP4蛋白，以评估毒性是否减弱。然后在乳(幼)小鼠动物模型系统(7)中测试导致毒性减弱的NSP4可变形式，以证实它们的毒性确实减弱了。然后如下测试毒性减弱的NSP4可变形式，来确认它们保留了抗原性和免疫原性。用NSP4可变形式免疫怀孕小鼠。然后用天然NSP4或完整轮状病毒攻击这些免疫母鼠所生的乳小鼠(29)。那些不产生腹泻的乳小鼠受到了NSP4可变形式免疫的母鼠产生的获得性母体抗体被动保护。
NSP4氨基酸位置48的残基也和毒性相关。澳大利亚和SA11轮状病毒株都在氨基酸位置48具有赖氨酸。当如下文实施例6-8所述的，通过常规重组DNA技术将赖氨酸诱变成谷氨酸时，该可变形式具有显著的细胞毒性，并在Sf9细胞中导致胞内钙高水平。
因此，为了减弱NSP4的细胞毒性，本领域熟练技术人员还可轻易的构建一系列质粒，各含有位置48处编码谷氨酸以外的不同氨基酸的密码子。然后方便的在本文所述的细胞存活和胞内钙水平系统中测试得到的表达的NSP4蛋白质，来评估毒性是否减弱。然后在上文所述的动物模式系统中测试导致毒性减弱的那些NSP4可变形式以确认它们的毒性减弱，并保留了抗原性和免疫原性。
NSP4可变形式包含那些在氨基酸位置47处具有突变，或在氨基酸位置48具有突变，或在氨基酸位置47和48都具有突变的形式，只要各可变形式的毒性都减弱，同时保留其抗原性和免疫原性。
在本发明的还有一个实施例中，可以相似方式诱变氨基酸位置47和48旁侧的氨基酸。也可将NSP4其它区的突变和氨基酸位置47和/或48的突变联合起来。
如上文所述，Estes等已集中研究氨基酸114-140之间的功能域。然而，如本文所示，其它区域对NSP4的细胞毒性也是重要的。在H2区内或靠近它的区域--特别是在氨基酸位置47和/或氨基酸48--被作为产生遗传脱毒的NSP4蛋白质的目标。在H2区和/或H3区中引入一个脯氨酸来改变二级/三级结构，并可能因此而减弱细胞毒力。这些进一步的突变可和上文所述氨基酸47的突变联合。
这些NSP4可变形式具有减弱的细胞毒性，但仍保持抗原性和免疫原性。这种脱毒的抗原性和免疫原性形式是包括在抗原性组合物中来保护机体抵抗轮状病毒疾病的候选形式。
本发明也涉及一种分离并纯化的核酸序列，它包含的核酸序列编码：(a)轮状病毒NSP4蛋白，其中氨基酸位置47的组氨酸或天冬氨酸诱变成了另一种氨基酸，而产生毒性减弱，同时保留抗原性和免疫原性的NSP4可变形式；(b)轮状病毒NSP4蛋白，其中氨基酸位置48的赖氨酸诱变成谷氨酸以外的另一种氨基酸，来产生毒性减弱，同时保留抗原性和免疫原性的NSP4可变形式；或(c)轮状病毒NSP4蛋白，其中氨基酸位置47的组氨酸或天冬酰胺诱变成另一种氨基酸，并且其中氨基酸位置48的赖氨酸诱变成谷氨酸以外的另一种氨基酸，而产生毒性减弱，同时保留抗原性和免疫原的NSP4可变形式。
各种宿主细胞-载体系统适用于表达本文描述的NSP4可变形式。载体系统和所用的宿主细胞相容。合适的宿主细胞包括：用质粒DNA、粘粒DNA或细菌噬菌体DNA转化的细菌；牛痘病毒和腺病毒等病毒；毕赤细胞等酵母；Sf9或Sf21细胞等昆虫细胞；或中国仓鼠卵巢细胞等哺乳动物细胞系；以及其它常规生物体。可将各种常规转录和翻译元件用于宿主细胞-载体系统。
通过转化、转导、转染或感染将质粒引入宿主细胞，由所用宿主细胞-载体系统决定。然后在允许宿主细胞表达NSP4可变形式的条件下培养宿主细胞。
NSP4蛋白质的可变形式，可用来制备抗原性组合物，以赋予哺乳动物宿主抗轮状病毒引起的疾病的保护力，或改善已感染了轮状病毒宿主的腹泻症状。
可将含有NSP4蛋白可变形式的抗原性组合物和免疫学上可接受的稀释剂或载体以常规方式混合，来制备可注射溶液或悬液。抗原组合物诱导的抗体水平可以用某些佐剂，如StimulonTM Qs-21(Aquila Biopharmaceuticals,Inc.,Framingham,MA),MPLTM(3-0-去乙酰基一磷酸脂A；RIBI ImmunoChem Research,Inc.,Hamilton,MT)，磷酸铝，氢氧化铝，IL-12(Genetics Institute,Cambridge,MA)和霍乱毒素(野生型或突变型，如其中氨基酸位置29的谷氨酸被另一种氨基酸，优选是组氨酸替换，根据美国临时专利申请号60/102,430)来提高。
用传统方式，如皮下、腹膜内或肌肉内注射入哺乳动物，以及通过口腔、粘膜、鼻内或阴道施药来施用本发明的抗原组合物，来诱导抵抗轮状病毒引起的疾病的保护性免疫应答，或改善已感染了轮状病毒的宿主的腹泻症状。可用本领域技术人员已知方法来确定施药剂量。可用单剂抗原组合物来赋予保护力或改善症状，或可能需要施用几次加强剂量。
还可将这些可变形式用作配体来鉴定轮状病毒肠毒素NSP4的目前还未知的受体。它们可通过形成无功能异二聚物来封闭NSP4受体，因而还具有治疗肠胃炎病的治疗用途。
为了能更好理解本发明，列出了下列实施例。这些实施例仅用于说明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例
实施例1
细胞、病毒株和病毒感染
细胞和SA11轮状病毒
图1中显示了该研究中所用的SA11株的历史。从美国典型培养物保藏中心获得SA11轮状病毒。SA11轮状病毒原种的Lot 1N(它是1980年递交的原始未传代细菌原种(2))，是Dr.Charles Buck的慷慨礼物(美国典型培养物保藏中心，Manassas,VA)。lot 1N的传代历史不明确(在灵长类东非猿猴肾细胞和恒河猴胎肾细胞中不知道传代数)。Lot 1N在ATCC作为Lot2,6,和7的病毒种(Dr.Buck,个人联络)。从ATCC购得了VL589(Lot5)。Lot5在灵长类东非猿猴肾中传代数不明，在CV-1细胞中传了2代。VL589在从ATCC收到后在MA104细胞中传了1代。还从ATCC获得了VL919(Lot7，在灵长类东非猿猴肾和恒河猴胎肾细胞中传代数不明。而在MA104细胞中传了5代)。SA11克隆3是Dr.Mary K.Estes(BaylorCollege of Medicine)好意提供的，在MA104细胞中传了5代。
轮状病毒感染和病毒RNA分离
使MA104细胞生长并维持在改良Dulbecco’s培养基与10％胎牛血清中。用L-1-甲苯磺酰胺-2-苯基乙基氯甲基酮(TPCK)处理的胰蛋白酶(Sigma)以最终浓度10μg/ml活化SA11轮状病毒30分钟，并以感染复数(MOI)10加到MA104细胞中。感染10小时后，用Ultraspec RNA分离系统(Biotecx Laboratories,Inc.,Houston TX)将信使RNA从感染细胞中分离出来。
昆虫细胞感染
使草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆虫细胞系(命名为Sf9,ATCC登录号CAL1711)的细胞在无血清SF 900 II(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)或Insect-Xpress(Biowhittaker Inc.)培养基中生长，以密度2.5×105/ml,28℃接种在120rpm的旋回振荡器上的250mL Erlenmeyer瓶中。以低MOI(0.2)的重组杆状病毒，密度为1.5×106/mL在振荡瓶中感染细胞。每24小时收集1毫升细胞悬液，用于细胞存活率研究(通过台酚蓝排除；见下文实施例3)和用于蛋白质印迹分析。使细胞在二孔培养室(Nunc Inc.,Naperville,IL)中生长，用于显影研究。
实施例2
RT/PCR和测序
用Ready to Go First-Strand Beads(Pharmacia Biotech Inc.,Piscataway,NJ)，然后PCR扩增从纯化的病毒信使RNA(实施例1中获得的)合成了NSP4 cDNA。在PCR反应中所用的SA11 NSP4-特异性引物是根据出版的NSP4序列(12)。SA11NSP4特异性引物的5′末端是ATGGAAAAGCTTACCGACCTC(SEQ ID NO:1)，而SA11特异性引物的3′末端是CTCTTACATTGCTGCAGTC(SEQ ID NO:2)。直接用ABI PRISMTM DNA测序系统(Perkin-Elmer Corporation,Forest City,CA)对PCR产物测序。另外，还对从TATM克隆反应物(Invitrogen,San Diego,CA)获得的各克隆进行了测序。为了对重组杆状病毒中的NSP4基因测序，将病毒DNA用苯然后是乙醇沉淀抽提出来。用NSP4特异性引物PCR扩增NSP4基因序列。用QiaquickTMSpin试剂盒(Qiagen,Santa Clarita,CA)纯化PCR产物，并用ABI PRISMTM DyeTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(Perkin-Elmer Corporation)对反应物进行了测序。
通过对SA11感染细胞的RT-PCR产物，或RT-PCR产物的克隆直接测序获得了基因10的核苷酸序列。核苷酸139从A到C的改变，致使密码子从AAT改变成CAT，导致氨基酸位置47从天冬酰胺到组氨酸的改变。特别是，发现Holmes等得到的，Both等测序的澳大利亚株在NSP4的氨基酸位置47有一个天冬酰胺。相反的，在SA11 ATCC株中，NSP4的氨基酸位置47有一个组氨酸。
为了确定NSP4的哪种版本代表了真正的原型，测定了其它不同SA11病毒原种基因10的核苷酸序列。ATCC SA11主种病毒(从其衍生出所有其它SA11原种)，和完全不同来源的SA11病毒(Dr.Mary K.Estes,Baylor College of Medicine,Houston,TX)在核苷酸位置139有一个C。因此，不同SA11病毒原种的NSP4的大多数版本在氨基酸位置47有一个组氨酸。
通过对重组杆状病毒抽提物的PCR产物测序再确认了重组杆状病毒中的NSP4(His)和NSP4(Asn)的序列。用QuickChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene,LaJolla,CA)构建了NSP4(Asn)基因。将各个NSP4(His)和NSP4(Asn)基因插入到pFastBac转移载体(Life Technologies,Rockville,MD)拷贝中。重组杆状病毒用噬斑纯化3次，以低MOI扩增。用上述方法确认了各病毒的正确序列。通过对感染了重组杆状病毒的Sf9细胞免疫荧光染色和用NSP4抗肽抗体(18；见下文实施例4)蛋白质印迹分析肯定了NSP4的表达。
实施例3
细胞存活率测量
以2.5×105/mL将Sf9细胞接种在无血清Sf-900 ⅡSFMTM培养基或Insect-Xpress培养基的250mL Erlenmeyer瓶中，当细胞密度达到1.5×106/mL时，用重组杆状病毒以MOI0.2感染。使细胞28℃生长在120rpm速度的旋回振荡器中。用台酚蓝排除试验测定细胞存活率(11)。简单说，将一份细胞悬液(50微升)和等量的2％台酚蓝培育5分钟；然后计数染色和未染色的细胞。
6天(D1到D6)内逐日测量表达各种轮状病毒蛋白的Sf9细胞的存活率，在表1中显示了结果。数据以至少三个独立试验的平均值±标准差表示。表达VP2、VP4、VP6和VP7的重组杆状病毒是Dr.Mary K.Estes(Baylor College of Medicine,Houston,TX)友好提供的。
表1：细胞存活率(％) VP2 VP4 VP6 VP7 NSP4(His) NSP4(Asn) D1 99.5+/-0.87 96.9+/-0.56 98.1+/-0.9 98+/-1.2 95.4+/-1.99 97.6+/-1 D2 96.8+/-1.23 97.5+/-1.8 97.5+/-0.7 96.3+/-0.8 65.9+/-2 83+/-1.6 D3 94.3+/-1.87 90.2+/-1.5 88.1+/-7 80.7+/-3.2 47.2+/-0.5 61.6+/-0.3 D4 81+/-2.6 73+/-1.7 61+/-3.5 43+/-7 21+/-1.4 36.4+/-2.9 D5 57+/-4 31+/-4 22.5+/-6.8 12+/-5.2 3.9+/-1 10.8+/-4.7 D6 38+/-9 11+/-6 7.5+/-2.4 3+/-1.4 0 0
NSP4的表达对Sf9细胞有细胞毒性。如表1中所见，NSP4(His)比NSP4(Ash)杀死细胞更迅速，而其它轮状病毒蛋白质，包括VP2、VP4、VP6和VP7的表达，直到感染的很晚期才导致细胞死亡。然而，NSP4的表达导致细胞迅速死亡。感染后48小时(D2)对于表达VP2、VP4、VP6和VP7的细胞，存活率分别是96.8％、97.5％、97.5％和96.3％，而对于表达NSP4(His)和NSP4(Asn)的细胞，存活率分别是65.9％和83％。因此，NSP4(His)比NSP4(Asn)对细胞毒性具有更深的效果。杀死表达NSP4(His)的Sf9细胞比表达NSP4(Asn)的Sf9细胞更快。在感染后72小时(D3)，对于表达VP2、VP4、VP6和VP7的细胞，存活率分别是94.3％、90.2％、88.1％和80.7％。而对于分别表达NSP4(His)和NSP4(Asn)的细胞，存活率分别是47.2％和61.6％(表1和图2)。在任何时间点，表达VP2、VP4、VP6和VP7的细胞中，细胞存活率之间没有统计学上的显著差异。然而，除了表达NSP二版本之一的细胞和表达其它轮状病毒蛋白质的细胞之间在感染后48和72小时存活率有显著差异(p＜0.05)外，在表达不同版本的NSP4的细胞之间存活率上也有显著差异。NSP(His)比NSP(Asn)对Sf9细胞更具细胞毒性。
实施例4
胞内钙水平的测量
使用荧光Ca2+指示剂Fura-2/AM，用装备了QuantexTM QX-7 CCD照相机和数码显影系统的Nikon DiaphotTM荧光显微镜测量，测定了[Ca2+]i。简单说，将Sf9细胞与最终浓度为2μM的Fura-2/AM(Molecular Probes,Eugene,OR)在室温下反应30分钟。如Grynkiewicz等(32)和Nankova等(31)所述，算出各独立细胞中的胞内钙水平，并表达为340nm和380nm处测量的吸光度之比。钙的结合将fura-2的吸光度谱切换到更短的波长(从380到340nm)。340/380的吸光度比代表胞内游离钙的水平。对于各实验，拍摄10张图片。计算各照片中的12个细胞的胞内钙浓度。至少进行三次独立实验。
已显示Sf9细胞中NSP4的表达导致胞内钙水平的显著升高(5)。已提出，胞内钙水平的升高导致哺乳动物细胞SA11-介导的细胞毒性(25)。对表达NSP4的Sf9细胞也已提出了相同的概念(15)。测量了表达NSP4(His)和NSP4(Asn)的Sf9细胞的胞内钙水平。图3描述的结果证明，在表达NSP4(His)的Sf9细胞中(右)比在表达NSP4(Asn)的Sf9细胞中(中)观察到显著更高的胞内钙水平。在感染后48小时，在模拟感染的Sf9细胞、表达NSP4(Asn)的Sf9细胞和表达NSP4(His)的Sf9细胞中胞内钙水平分别是0.12、0.32和0.48(加入Fura-2/AM后读到的340/380nm的比率)。这对应于下列胞内钙水平浓度：模拟感染的Sf9细胞为80nM，表达NSP4(Asn)的细胞为213nM和表达NSP4(His)的细胞为320nM。因此，NSP4(Asn)的表达导致如先前报道(5)的胞内钙水平的显著提高。然而，和表达NSP(Asn)的细胞比较，在表达NSP(His)的细胞中有显著更高的胞内钙水平(P＜0.05)。
实施例5
蛋白质印迹分析
虽然分别将编码NSP4的基因的两种版本克隆入相同的杆状病毒转移载体拷贝中，但对于表达NSP4这两种版本的重组杆状病毒来说，蛋白质表达水平的不同是有可能的。为了排除这种可能性(即与NSP4(His)表达有关的毒性增加和胞内钙堆积是由于在这两种形式之间蛋白质表达水平的不同)，测量了Sf9细胞中NSP4的绝对量。用重组杆状病毒以MOI0.2感染Sf9细胞，并在感染48小时后收集细胞。将等量样品(2×104细胞的裂解液)加到SDS-PAGE上，通过使用NSP4抗肽抗体的蛋白质印迹分析检测(图4)。
Covance Reaseach Products公司(Denver,PA)在两只Elite-New家兔中制备了这种NSP4抗肽抗体。简单的说，合成具有序列Cys Asp Lys Leu ThrThr ArgGlu Ile Glu Gln Val Glu Leu Leu Lys Arg Ile Tyr Lys Asp Leu Thr(SEQ ID NO:3)的合成肽并和KLH交联。用加在N-末端的半胱氨酸来促进特异性交联。此序列的其余部分代表NSP4的残基114-135。将500微克交联肽与500微升FCA混合，并皮内注射。用混合了250微升IFA的250微克交联肽每隔3周加强免疫家兔4次。
用SDS-PAGE分析了感染48小时后收集的杆状病毒重组物感染的Sf9细胞的样品等分。将分离的蛋白质电印迹到硝基纤维素膜上，然后用含有5％BLOTTO(Bio-Rad,Inc.,Hercules,CA)的PBS室温下封闭30分钟，并与PBS1∶100稀释的NSP-4特异性抗肽抗体室温下培育1小时。在PBS中洗涤3次后，在膜上加辣根过氧化物酶(HRP)-偶联山羊抗兔免疫球蛋白(1∶200稀释度)，并培育1小时，然后用HRPTM底物试剂盒(Bio-Rad,Inc.)显色。
如图4所示，如代表糖基化和非糖基化NSP4的条带亮度所测量的那样，在表达NSP4(Asn)的重组杆状病毒感染的Sf9细胞(泳道3)中比表达NSP4(His)的细胞中(泳道2)中表达了更多的NSP4。当等量的重组杆状病毒感染的总细胞蛋白质和蛋白质印迹分析比较，获得基本相同的结果。NSP4的表达在早至24小时时就被检测到，而在48小时和72小时之间达到了峰值。在感染72小时后，观察到NSP4的降解。在各时间点，除了感染后24小时外，NSP4(Asn)的表达比NSP4(His)的表达更高。因此，NSP4(His)的细胞毒性不是因为NSP4(His)的表达水平比NSP4(Asn)更高。
用Bonferroni(乘法比较)t-检验分析了细胞存活率和钙浓度测定至少3个独立实验的结果。简单说，该方法进行了变量参数分析，然后用t-检验配对比较。P值乘以用来解决作许多统计比较的组合风险的比较数字。
实施例6
来自用重组杆状病毒感染的Sf9细胞的NSP4蛋白表达
将编码NSP4蛋白(His)的基因插入pFastBac杆状病毒为基础的转移质粒(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)。通过在核苷酸142用G替换A使该质粒突变。该突变将密码子从AAA(赖氨酸)改变为GAA(谷氨酸)。通过将编码NSP4蛋白(Asn)的基因插入pFastBac转移质粒产生了第三个重组物。将各质粒转染入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞(Gibco BRL)。筛选获得重组杆状病毒DNA的白色菌落。然后纯化重组杆状病毒DNA。分别用这三种重组杆状病毒DNA转染Sf9细胞，如所述(34)噬斑纯化重组杆状病毒。确认了三种NSP4基因的序列。这些构建物被用于下文实施例7和8。
实施例7
细胞存活率的进一步测量
除了用MOI10外，按照实施例3的方案评估了NSP4蛋白的三种重组形式：氨基酸47NSP4(Asn)，氨基酸47NSP4(His)和氨基酸47NSP4(His)、氨基酸48NSP4(Glu)。各时间点的平均数代表三个独立的感染。
NSP4的表达对Sf9细胞有细胞毒性。如图5所见，氨基酸47NSP(His)、氨基酸48(Glu)比氨基酸47NSP4(His)杀死细胞稍快一点，而根据Dunnett乘法比较试验，这两种形式都比氨基酸47NSP4(Asn)以统计学上显著更高的速度杀死细胞。这些结果表明氨基酸47NSP4(His)、氨基酸48NSP4(Glu)是最毒的，而NSP4(Asn)是这三种形式中对细胞毒性最小。
实施例8
胞内钙水平的进一步测量
按照实施例4的方案，除了评估了NSP4蛋白的三种重组形式：氨基酸47NSP4(Asn)，氨基酸47NSP4(His)和氨基酸47NSP4(His)、氨基酸48NSP4(Glu)。图6显示了结果。直方条表示三种NSP4重组体感染的Sf9细胞和模拟感染的Sf9细胞的胞内钙水平。各直方条代表三个实验的平均数。
在表达氨基酸47NSP(His)、氨基酸48(Glu)的细胞中观察到最高的胞内钙水平，然后是NSP4(His)和NSP4(Asn)。这些结果表明氨基酸47NSP(His)、氨基酸48(Glu)对胞内钙水平具有最深的作用，而NSP4(Asn)在三种形式中作用最小。根据Dunnett乘法比较试验，差异由统计学意义。
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