一种靶向防龋DNA疫苗及制备方法.pdf

本发明公开了一种靶向防龋DNA疫苗及制备方法，大肠杆菌Escherichia coli JM109/pGJGLU/VAX，CCTCC No：M204027。用限制性酶NheI和NotI酶切处理靶向防龋真核表达质粒pGJGLU切下靶向融合基因(包括CTLA－4－Ig目的基因和GLU片段)，将靶向融合基因克隆到pVAX1载体中，酶切证实构建的正确性，并命名为pGJGLU/VAX，转染真核细胞CHO细胞系，证实可以在真核细胞正确表达重组蛋白。本发明方法简单，安全性高，生产成本低廉，免疫应答持久，可大幅度提高其免疫效能。

1、  一种靶向防龋DNA疫苗，其特征在于大肠杆菌(Escherichia coli)，Escherichia coli JM109/pGJGLU/VAX，CCTCC NO：M204027。

2、  一种实现权利要求1所述的一种靶向防龋DNA疫苗的制备方法，它包括下列步骤：
A.用限制性酶NheI和NotI酶切处理靶向融合防龋真核表达质粒pGJGLU切下CTLA-4-Ig目的基因、GLU片段，用相同限制性酶处理pVAX1载体；
B.电泳胶回收纯化CTLA-4-Ig目的基因、GLU片段和NheI和NotI酶切处理的pVAX1载体片段；
C.将上述两种纯化的目的片段在T₄DNA连接酶作用下连接，转化感受态细胞，接种在卡那霉素阳性LB平板上；
D.筛选重组阳性克隆，接种在卡那霉素阳性的LB培养基中，摇菌，提取质粒，质粒为pGJGLU/VAX。

3、  根据权利要求2所述的一种靶向融合防龋DNA疫苗的制备方法，其特征在于pGJGLU/VAX靶向融合防龋DNA疫苗的基因序列为SEQUENCE LISTING。

一种靶向防龋DNA疫苗及制备方法
                               技术领域
本发明属于口腔预防医学技术领域，更具体涉及一种编码人细胞毒性T淋巴细胞抗原4信号肽、胞外区的序列和Igγ₁铰链区、恒定区融合基因以及变形链球菌葡糖基转移酶基因的DNA防龋疫苗，本发明还涉及一种所述的靶向防龋DNA疫苗的制备方法。
                               背景技术
龋病是一种严重危害人类口腔和全身健康的口腔常见病、多发病。因龋齿造成的功能丧失、炎症、疼痛以及牙源性病灶所致脏器疾病可严重影响生活质量，降低人口健康素质，给社会带来巨大危害。龋病是细菌感染性疾病，而变形链球菌(下称变链菌，Streptococcus mutans)是主要的致龋菌。变链菌能够与牙面紧密粘附并定植于牙面，产生酸性代谢产物，引起牙齿脱矿最终导致龋齿。葡糖基转移酶(glucosyltransferaes GTF_s)是变形链球菌的重要致龋毒力因子。GTF_s合成葡聚糖并介导变形链球菌在牙面的葡聚糖依赖性粘附。GTF_s包含有两个免疫活性区和功能区：催化功能区(catalytic region CAT)和葡聚糖结合区(glucan bindingregion GLU)。能够合成葡聚糖，使变链菌凭借能够与葡聚糖紧密结合的菌体表面结合型葡糖基转移酶和葡聚糖结合蛋白与牙面更加紧密结合。变形链球菌主要合成三种GTFs：GTF-I、GTF-SI、GTF-S，其中GTF-I主要合成以α-1，3糖苷键为主的水不溶性葡聚糖，其编码基因为gtfB。
Taubman等人将根据Streptococcus downei的GTF-I催化功能区的448-457氨基酸序列合成的短肽CAT和葡聚糖结合功能区的1303-1324氨基酸序列合成的短肽GLU与完全弗氏佐剂混合后免疫SD大鼠能够引起明显的血清和唾液抗Streptococcus sobrinus葡糖基转移酶抗体(Taubman，M.A.，D.J.Smith，C.J.Holmberg，and J.W.Eastcott.2000.Coimmunization with complementaryglucosyltransferase peptides results in enhanced immunogenicity and protectionagainst dental caries.Infect Immun 68：2698-703.)。宋长征等根据变形链球菌葡糖基转移酶的葡聚糖结合区和蔗糖结合区(催化区)的保守氨基酸序列设计了27个氨基酸短肽，与弗氏佐剂混合后免疫机体后可有效诱导抗体产生，其免疫血清不仅拮抗GTF酶活性，而且明显抑制了体外变链菌与试管壁的黏附能力(宋长征，赵建等，葡糖基转移酶合成肽疫苗的免疫原性研究，中华口腔医学杂志，2002，37(60)：459-462)。Jespersgaard克隆表达了gtfB基因中的催化活性区(CAT)和葡聚糖结合区(GLU)，将CAT和GLU多肽以鼻内滴注免疫小鼠诱导了明显的粘膜IgA免疫反应；分别免疫兔后，所获得的抗CAT抗体能明显抑制了变形链球菌和茸毛链球菌的GTFS合成水不溶性葡聚糖，而抗GLU抗体显示了较抗CAT抗体更强的抑制变形链球菌的GTFS合成水不溶性葡聚糖的能力。(Jespersgaard，C.，G.Hajishengallis，T.E.Greenway，D.J.Smith，M.W.Russell，andS.M.Michalek.1999.Functional and immunogenic characterization of two clonedregions of Streptococcus mutans glucosyltransferase I.Infect Immun 67：810-6.)。
然而以上的各种防龋多肽疫苗存在许多不足之处，首先是这些多肽制备纯化困难，一般需耗时数周且费用昂贵，保存需要特殊条件；其次，多肽防龋疫苗刺激机体产生有效的免疫反应的能力较差，常需添加各种对人体有害的免疫佐剂；多肽防龋疫苗与其它多肽疫苗一样，诱导特异性免疫反应的持续时间一般较短，需反复多次接种才能达到较满意的效果；另外多肽疫苗一般不能诱导婴幼儿产生免疫反应。(Kowalczyk DW，Ertl HCJ.1999.Immune responses to DNA vaccines.Cell.Mol.Life Sci.，55：751-770)。
随着DNA疫苗的发展，樊明文等学者将编码变形链球菌表面蛋白PAc的A区和P区基因克隆至真核表达载体pCI中，构建了防龋DNA疫苗pCIA-P，免疫大鼠，可以在血清和唾液中检测到特异性抗体，同时证明能有效防龋(樊明文，边专，彭志翔等。编码PAc结构基因的DNA疫苗免疫动物的实验研究。中华口腔医学杂志，2002；37(1)：)。其后，为了提高DNA疫苗的免疫效能，将扩增出的编码变形链球菌GS-5株葡糖基转移酶GTF-I的基因gtfB的葡聚糖结合区的序列GLU克隆到真核表达质粒pCIA-P中获得pGLUA-P融合防龋DNA疫苗。动物实验证实防龋效果优于pCIA-P(贾荣，樊明文，边专等。GTF-PAc融合防龋D NA疫苗研究(III)pGLUA-P免疫定菌鼠防龋研究。口腔医学纵横杂志2002；18(1)：3)。也有学者构建了以pcDNA3为载体的编码葡糖基转移酶GTF-I的基因gtfB序列防龋DNA疫苗，动物实验可以检测到特异性抗体。(杨锦波，周学东，刘天佳，变形链球菌葡糖基转移酶真核表达质粒PcDNA3-gtfB的构建，华西口腔医学杂志，2001；19(4)：249-252)但是，防龋DNA疫苗和其他DNA疫苗一样依旧面临如何提高免疫效能的问题。
CTLA4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA4)，又称CD152，是免疫球蛋白超家族的一员。它主要表达于活化的T细胞表面，亦可表达于CTL细胞。CTLA4结构基因包括四个外显子，分别编码先导序列、胞外区、跨膜区及胞浆区四个独立的功能区，其胞外区包含一个Ig的V样功能区，侧翼与两个疏水区相接，其中一个可以将CTLA4锚定在细胞膜上。研究表明CTLA4与表达于抗原递呈细胞(APC)表面的CD80和CD86分子有很强的结合能力，是另一配体CD28的10～100倍(Ostrov DA，Shi W，Schwartz JCD，et al.Structure ofMurine CTLA-4 and its role in modulating T cell responsiveness.Science，2000，290(27)：816～819)。1998年澳大利亚学者Boyle等研究了结合有CTLA4基因片段的DNA疫苗并免疫小鼠，2周后测得特异性抗体水平比对照组高达10000倍(Boyle JS，Brady JL，Lew AM.，Enhanced responses to a DNA vaccine encoding afusion antigen that is directed to sites of immune induction.Natrue，1998，392(26)：408-411)。其原因可能为CTLA4定向引导抗原与APC表面的B7分子结合，促进了APC摄取抗原，而APC在摄取抗原之后，自身被激活，表达了更多的B7分子，从而使更多的抗原被DC摄取、加工，起到了放大免疫反应的作用。郭继华等把人的细胞毒淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4，CTLA4)基因克隆到变形链球菌PAc和GTFs抗原基因的前端，构建了靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P，使在体内所翻译的蛋白质能够在CTLA4的引导下，与诱导免疫反应的关键细胞APC表面的配体分子B7分子结合从而提高免疫效能(郭继华，樊明文，边专等，靶向融合防龋DNA疫苗的构建与细胞表达，中华口腔医学杂志.2003，38：282-284)。
但是该疫苗的载体pCI质粒含有氨卞青霉素抗性基因，不符合DNA疫苗的载体骨架有关要求。pVAX1是美国Invitrogen公司根据美国药品食品管理局(FDA)的要求，专门为DNA疫苗设计的真核表达载体。pVAX1是高拷贝质粒，在大多数哺乳动物细胞中可以高水平瞬时表达。它携带卡那霉素抗性基因，因此比较安全。本研究将以新型DNA疫苗载体pVAX1为骨架构建新型靶向融合防龋DNA质粒。
                             发明内容
本发明的目的是在于提供了一种靶向防龋DNA疫苗，用真核表达载体pVAX1替代靶向防龋真核表达质粒pGJGLU(专利申请号：02139123.8)中的疫苗载体pCI，构建一种靶向防龋DNA疫苗pGJGLU/VAX。它用于人体安全性高，增强免疫效能。
本发明的另一个目的是在于提供一种制备靶向防龋DNA疫苗的方法，生产成本低廉，方法简单，纯化简单且产物纯度高。
本发明所提供的靶向防龋DNA疫苗为大肠杆菌Escherichia coliJM109/pGJGLU/VAX，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2004年3月23日，保藏编号：CCTCC NO：M204027。其步骤如下：
A.用限制性酶NheI和NotI酶切处理靶向防龋真核表达质粒pGJGLU切下细胞毒性T淋巴细胞抗原4信号肽、胞外区的序列和Igγ₁铰链区、恒定区融合基因(CTLA4-Ig目地基因)，变形链球菌葡糖基转移酶的GLU区序列(GLU片段)，用相同限制性酶处理pVAX1载体；
B.电泳胶回收纯化CTLA-4-Ig目的基因、GLU片段和NheI和NotI酶切处理的pVAX1载体片段；
C.将上述两种纯化的目的片段在T₄DNA连接酶作用下连接，转化感受态细胞，接种在卡那霉素阳性LB平板上；
D.筛选重组阳性克隆，接种在卡那霉素阳性的LB培养基中，摇菌，提取质粒，酶切证实构建的正确性，并命名为pGJGLU/VAX。
pGJGLU/VAX靶向融合防龋DNA疫苗的基因序列为SEQUENCE LISTING。
与其它DNA疫苗相比，pGJGLU/VAX具有巨细胞病毒CMV的早期启动子/增强子(CMV immediate-early ehancer/promoter)，该启动子增强表达的能力显著高于其它如劳斯肉瘤病毒启动子LTR、猴病毒40(SV40)等启动子；pGJGLU/VAX具有牛生长激素(BGH)多聚腺苷酰化信号，允许高效转录终止以及mRNA的多聚腺苷酰化作用；pGJGLU/VAX具有卡那霉素抗性基因，用于人可以避免不必要的过敏反应；pGJGLU/VAX携带人CTLA4信号肽、胞外区的序列和Igγ₁铰链区、恒定区融合基因，因此可以利用CTLA4与其配体牢固结合的特性将宿主表达出的抗原蛋白引导至APC表面，大幅度增强DNA疫苗的免疫效能，同时由于Igγ₁部分功能区的存在使使重组蛋白在体内更加稳定，半衰期延长，利于体内应用。
与多肽防龋疫苗相比，pGJGLU/VAX DNA防龋疫苗具有以下优点：①pGJGLU/VAX质粒物理化学性质稳定，20-25℃下即可保存，便于运输使用，而多肽疫苗一般需要冷藏保存等特殊条件；②pGJGLU/VAX简化了疫苗的生产步骤，仅需完成基因工程的上游部分，省却了下游重组多肽的表达和纯化过程，短时间内可以得到大量的质粒，而且pGJGLU/VAX质粒的纯化方法较为简单且产物纯度很高，而多肽疫苗制备纯化相对困难复杂，一般需耗时数周；③多肽防龋疫苗激发机体产生免疫反应的能力较差，需要添加各种免疫佐剂，但这些佐剂经常引起严重的炎症反应，大大限制了多肽疫苗的应用；pGJGLU/VAX同时携带人CTLA4信号肽、胞外区的序列和Igγ₁铰链区、恒定区融合基因，因此可以利用CTLA4与其配体牢固结合的特性将宿主表达出的抗原蛋白引导至APC表面，大幅度增强DNA疫苗的免疫效能，避免使用各种对人体有害的佐剂；④pGJGLU/VAX如同其它DNA疫苗一样少量接种可能诱导长时间的免疫反应。相反多肽疫苗在体内很不稳定易被蛋白酶降解，因而要接种较大量才能引起明显的免疫反应，且要多次接种以维持效果。另外比不含CTLA4信号肽、胞外区的序列和Igγ₁铰链区、恒定区融合基因的其他防龋DNA疫苗效果要佳。
                           附图说明
图1 pGJGLU/VAX防龋DNA疫苗结构示意图
CMV promoter                  巨细胞病毒早期启动子/增强子
CTLA4-IgGLU片段               CTLA4-Ig、GLU重组DNA片段
BGH polyA signal              牛生长激素多聚腺苷酰化信号
NheI(696)                     限制性内切酶NheI的酶切位点
BclI(1181)                    限制性内切酶BclI的酶切位点
KpnI(1884)                    限制性内切酶KpnI的酶切位点
NotI(2781)                 限制性内切酶SmaI的酶切位点
Kan                        卡那霉素抗性基因
pGJGLU/VAX携带人CTLA4信号肽、胞外区的序列和Igγ₁铰链区、恒定区融合基因，该片段可以直接将抗原蛋白引导于APC表面，并与之结合，含有变形链球菌重要毒力因子的免疫活性区和功能区基因序列即：葡糖基转移酶GTF-I中葡聚糖结合区(GLU)序列，具有巨细胞病毒CMV的早期启动子/增强子(CMV immediate-early ehancer/promoter)，该启动子增强表达的能力显著高于其它如劳斯肉瘤病毒启动子LTR、猴病毒40(SV40)等启动子；pGJGLU/VAX具有卡那霉素抗性基因，用于人可以避免不必要的过敏反应；pGJGLU/VAX具有牛生长激素(BGH)多聚腺苷酰化信号，允许高效转录终止以及mRNA的多聚腺苷酰化作用。
图2 pGJGLU/VAX重组质粒的限制性内切酶酶切分析电泳示意图
1 λHindIII分子量标准
2 pVAX1 KpnJ单酶切
3 pGJGLU/VAX NheI、NotI双酶切
4 pGJGLU/VAX KpnI单酶切
图3 重组质粒pGJGLU/VAX在CHO细胞系中的表达示意图
重组质粒pGJGLU转染后的CHO细胞胞浆内特异性表达产物。(cy3-SABC法，抗GTF抗体，×100)
图4阳性对照质粒pGJGLU在CHO细胞系中的表达示意图
阳性对照质粒pGJGLU转染后的CHO细胞胞浆内特异性表达产物。(cy3-SABC法，抗GTF抗体，×100)
图5空载体pVAX1在CHO细胞系中的表达示意图
空载体pVAX1转染后的CHO细胞胞浆内无特异性表达产物。(cy3-SABC法，抗GTF抗体，×100)
图6小鼠唾液抗GTF IgA抗体滴度示意图
pGJGLU/VAX i.m.：pGJGLU/VAX i.m.组，于股四头肌注射溶于生理盐水中的重组质粒pGJGLU/VAX。
pGJGLU/VAX i.n.：pGJGLU/VAX i.n.组，经鼻粘膜滴注溶于布比卡因中的重组质粒pGJGLU/VAX。
pVAX1 i.m.：pVAX1 i.m.组，于股四头肌注射溶于生理盐水中的载体质粒pVAX1，作为阴性对照。
NS i.m.：NS i.m.组，于股四头肌注射生理盐水，作为空白对照。
图7小鼠血清抗GTF IgG抗体滴度示意图
pGJGLU/VAX i.m.：pGJGLU/VAX i.m.组，于股四头肌注射溶于生理盐水中的重组质粒pGJGLU/VAX。
pGJGLU/VAX i.n.：pGJGLU/VAX i.n.组，经鼻粘膜滴注溶于布比卡因中的重组质粒pGJGLU/VAX。
pVAX1 i.m.：pVAX1 i.m.组，于股四头肌注射溶于生理盐水中的载体质粒pVAX1，作为阴性对照。
NS i.m.：NS i.m.组，于股四头肌注射生理盐水，作为空白对照。
                           具体实施方式
下面根据附图对本发明作进一步详细描述：
根据图1可知，运用分子生物学专业软件：DNASIS综合DNA序列分析软件(日本日立公司)、Gene Construction kit 2.0基因模拟克隆软件(美国Textco公司)分析和设计靶向防龋DNA疫苗并模拟克隆全过程。
根据图2可知，用限制性酶NheI和NotI酶切处理靶向防龋真核表达质粒pGJGLU(专利申请号：02139123.8)以及pVAX1载体；切下靶向融合基因(包括CTLA-4-Ig目的基因、GLU)和NheI和NotI酶切处理的pVAX1载体片段，胶回收纯化目的片段；将上述两种纯化的目的片段在T₄ DNA连接酶作用下20-25℃连接过夜，次日转化感受态细胞，接种在卡那霉素阳性LB平板上；筛选重组阳性克隆，接种在卡那霉素阳性的LB培养基中，摇菌，提取质粒，酶切证实构建的正确性，最终构建出编码细胞毒性T淋巴细胞抗原4信号肽、胞外区的序列和Igγ₁铰链区、恒定区融合基因与变形链球菌葡糖基转移酶的GLU区序列靶向防龋DNA疫苗pGJGLU/VAX。pVAX1经KpnI单酶切得到了3.0kb片段，pGJGLU/VAX经KpnI单酶切得到了5.0kb片段，经NotI和NheI双酶切得到CTLA4-Ig-GLU融合基因2.1kb片段和2.9kb的片段。电泳结果表明pGJGLU/VAX的插入片段大小与预期结果一致(图2)。
根据图3、图4、图5可知，CHO细胞系用细胞培养液D/F(美国Gibco公司)37℃、5％CO₂培养。培养瓶中预先加入盖玻片，使用转染剂梭华-SofastTM基因转染试剂(厦门太阳马生物工程有限公司)进行转染。过程：首先制备梭华-Sofast^TM/DNA复合物的制备，将1-2μg的DNA质粒和3-5μl的梭华-Sofast^Tm分别稀释于100μl的不含血清和抗菌素的D/F中，轻轻混匀。将梭华-Sofast^TM稀释液滴加到DNA稀释液中，一边滴加一边混匀。20-25℃孵育15-20分钟。将梭华-Sofast^TM/DNA复合物加到培养瓶中并轻轻摇动使均匀混合。设置空载体对照以及pGJGLU阳性对照。放置37℃ CO₂孵育箱孵育24-48小时后，取出盖玻片，将转染实验后培养板中的盖玻片取出，PBS液漂洗3×2分钟。中性福尔马林(10％甲醛，以0.01M PBS稀释)固定10分钟。0.01M PBS洗涤3×5分钟。加入山羊血清在20-25℃下封闭30分钟。甩去多余液体，加1∶50兔抗GTF抗体4℃过夜，次日PBS洗涤3×5分钟。加入生物素化羊抗兔IgG，37℃温育30分钟，PBS洗涤3×5分钟，加入Cy3荧光素标记的SABC后置37℃温育30分钟，PBS洗涤3×5分钟。荧光显微镜观察记录。阳性对照和pGJGLU/VAX转染细胞镜下呈现强红色荧光(图3-6)，空载体转染细胞镜下无荧光(图7-8)。证实了重组融合蛋白可以在真核细胞中正确表达。
DNA疫苗应用研究：根据图6、图7可知，为了验证pGJGLU/VAX的有效性，我们将26只雌性Babl/c小鼠随机分为4组，分别经肌肉注射和鼻粘膜途径免疫，分组如下：
pGJGLU/VAX i.m.组：8只，于股四头肌注射溶于生理盐水中的重组质粒pGJGLU/VAX 100μg。
pGJGLU/VAX i.n.组：8只，经鼻粘膜滴注溶于0.25％布比卡因中的重组质粒pGJGLU/VAX 50μg。
pVAX1 i.m.组：5只，于股四头肌注射溶于生理盐水中的载体质粒pVAX1100μg，作为阴性对照。
NS i.m.组：5只，于股四头肌注射生理盐水100μg，作为空白对照。
免疫前和免疫后2、4、8、12周分别收集血清和唾液样本。
ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平，各组唾液抗GTF特异性IgA抗体水平在第8周到第12周时均显著高于对照组(P＜0.01)，但疫苗免疫各组间没有显著性差异(P＞0.05)，第12周时pGJGLU/VAX鼻粘膜滴注组特异性抗体水平最高(图6)。
第4周时疫苗免疫组各组血清抗GTF特异性IgG抗体水平均显著高于对照组，第8周到第12周pGJGLU/VAX肌注免疫组的特异性抗体水平显著高于pGJGLU/VAX鼻粘膜免疫组(P＜0.01)(图7)。
证实了该疫苗在小鼠体内经肌肉注射和鼻粘膜途径免疫可以有效诱导特异性抗体反应。
                        SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120>一种靶向防龋DNA疫苗及制备方法
<130>无
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>5001
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(702)..(2774)
<223>人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)信号肽、胞外区，免疫球蛋白γ1恒
     定和铰链区，变形链球菌血清型C(S.mutans)葡糖基转移酶GLU片段融合肽
<220>
<221>CDS
<222>(3228)..(4022)
<223>卡那霉素抗性基因
<220>
<221>promoter
<222>(137)..(701)
<223>
<220>
<221>BGH polyA_sgnal
<222>(2831)..(3055)
<223>
<400>1
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                                              1               5
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Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala Thr Arg Thr Trp Pro
                10                  15                  20
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Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro Val Phe Cys Lys Ala
            25                  30                  35
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Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys
70                  75                  80                  85
gcg gca acc tac atg atg ggg aat gag ttg acc ttc cta gat gat tcc      1004
Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser
                90                  95                  100
atc tgc acg ggc acc tcc agt gga aat caa gtg aac ctc act atc caa      1052
Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln
            105                 110                 115
gga ctg agg gcc atg gac acg gga ctc tac atc tgc aag gtg gag ctc      1100
Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu
        120                 125                 130
atg tac cca ccg cca tac tac ctg ggc ata ggc aac gga acc cag att      1148
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile
    135                 140                 145
tat gta att gat cca gaa ccg tgc cca gat tct gat cag gag ccc aaa      1196
Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gln Glu Pro Lys
150                 155                 160                 165
tct tct gac aaa act cac aca tcc cca ccg tcc cca gca cct gaa ctc      1244
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu Leu
                170                 175                 180
ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc      1292
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
            185                 190                 195
ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg      1340
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
        200                 205                 210
agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg      1388
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
    215                 220                 225
gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc    1436
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
230                 235                 240                 245
acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg    1484
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
                250                 255                 260
aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc    1532
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
            265                 270                 275
ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca    1580
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
        280                 285                 290
cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag    1628
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
    295                 300                 305
gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc    1676
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
310                 315                 320                 325
gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg    1724
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
                330                 335                 340
cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc    1772
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
            345                 350                 355
acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc    1820
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
        360                 365                 370
gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag agc ctc tcc    1868
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
    375                 380                 385
ctg tct ccg ggt aaa ggt acc gga gaa atg ggc tat caa gcc aaa gga    1916
Leu Ser Pro Gly Lys Gly Thr Gly Glu Met Gly Tyr Gln Ala Lys Gly
390                 395                 400                 405
aaa ttt gta aca act gcc gat ggt aaa ata aga tat ttt gat aag caa    1964
Lys Phe Val Thr Thr Ala Asp Gly Lys Ile Arg Tyr Phe Asp Lys Gln
                410                 415                 420
tct ggg aac atg tac cgt aat cgt ttt att gaa aac gaa gaa ggt aaa    2012
Ser Gly Asn Met Tyr Arg Asn Arg Phe Ile Glu Asn Glu Glu Gly Lys
            425                 430                 435
tgg ctg tat ctc ggt gaa gat ggt gca gca gtg aca gga tct caa acc    2060
Trp Leu Tyr Leu Gly Glu Asp Gly Ala Ala Val Thr Gly Ser Gln Thr
        440                 445                 450
att aac ggt caa cac ctg tac ttt aga gca aac ggt gtt cag gtc aag    2108
Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe Arg Ala Asn Gly Val Gln Val Lys
    455                 460                 465
ggt gaa ttt gtc act gac cac cac ggc cgt atc agc tat tac gac ggc    2156
Gly Glu Phe Val Thr Asp His His Gly Arg Ile Ser Tyr Tyr Asp Gly
470                 475                 480                 485
aat tca ggg gat caa atc cgc aac cgc ttt gtc cgc aat gct cag ggt    2204
Asn Ser Gly Asp Gln Ile Arg Asn Arg Phe Val Arg Asn Ala Gln Gly
                490                 495                 500
caa tgg ttc tac ttt gat aac aat ggc tat gcc gta acc ggt gcc aga    2252
Gln Trp Phe Tyr Phe Asp Asn Asn Gly Tyr Ala Val Thr Gly Ala Arg
            505                 510                 515
acc att aac ggt caa ctc cta tac ttt aga gca aac ggt gtt cag gtc    2300
Thr Ile Asn Gly Gln Leu Leu Tyr Phe Arg Ala Asn Gly Val Gln Val
        520                 525                 530
aag ggt gaa ttt gtc act gac cgc tac ggc cgt atc agc tat tac gac    2348
Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp Arg Tyr Gly Arg Ile Ser Tyr Tyr Asp
    535                 540                 545
ggc aat tca ggg gat caa atc cgc aac cgc ttt gtc cgc aat gct cag    2396
Gly Asn Ser Gly Asp Gln Ile Arg Asn Arg Phe Val Arg Asn Ala Gln
550                 555                 560                 565
ggt caa tgg ttc tac ttt gat aac aat ggc tat gcc gta acc ggt gcc    2444
Gly Gln Trp Phe Tyr Phe Asp Asn Asn Gly Tyr Ala Val Thr Gly Ala
                570                 575                 580
aga acc att aac ggt caa cac cta tac ttt aga gca aac ggt gtt cag    2492
Arg Thr Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe Arg Ala Asn Gly Val Gln
            585                 590                 595
gtc aag ggt gaa ttt gtc act gac cgc cac ggc cgt atc agc tat tac    2540
Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp Arg His Gly Arg Ile Ser Tyr Tyr
        600                 605                 610
gac ggc aat tca ggg gat caa atc cgc aac cgc ttt gtc cgc aat gct    2588
Asp Gly Asn Ser Gly Asp Gln Ile Arg Asn Arg Phe Val Arg Ash Ala
    615                 620                 625
cag ggt caa tgg ttc tac ttt gat aac aat ggc tat gcc gta acc ggt    2636
Gln Gly Gln Trp Phe Tyr Phe Asp Asn Asn Gly Tyr Ala Val Thr Gly
630                 635                 640                 645
gcc aga acc att aac ggt caa cac cta tac ttt aga gca aac ggt gtt    2684
Ala Arg Thr Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe Arg Ala Asn Gly Val
                650                 655                 660
cag gtc aag ggt gaa ttt gtc act gac cgc tac ggc cgt atc agt tat    2732
Gln Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp Arg Tyr Gly Arg Ile Ser Tyr
            665                 670                 675
tac gat gct aac tct gga gaa cga gtt cgg att gtc gac taa            2774
Tyr Asp Ala Asn Ser Gly Glu Arg Val Arg Ile Val Asp
        680                 685                 690
acgcgtgcgg ccgctcgagt ctagagggcc cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt    2834
gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga    2894
aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag    2954
taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga    3014
agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctactg ggcggtttta    3074
tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt tgggaagccc    3134
tgcaaagtaa actggatggc tttctcgccg ccaaggatct gatggcgcag gggatcaagc    3194
tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgc atg att gaa caa gat gga ttg     3248
                                     Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu
                                                     695
cac gca ggt tct ccg gcc gct tgg gtg gag agg cta ttc ggc tat gac      3296
His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp
        700                 705                 710
tgg gca caa cag aca atc ggc tgc tct gat gcc gcc gtg ttc cgg ctg      3344
Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu
    715                 720                 725
tca gcg cag ggg cgc ccg gtt ctt ttt gtc aag acc gac ctg tcc ggt      3392
Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly
730                 735                 740                 745
gcc ctg aat gaa ctg caa gac gag gca gcg cgg cta tcg tgg ctg gcc      3440
Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala
                750                 755                 760
acg acg ggc gtt cct tgc gca gct gtg ctc gac gtt gtc act gaa gcg      3488
Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val Leu Asp Val Val Thr Glu Ala
            765                 770                 775
gga agg gac tgg ctg cta ttg ggc gaa gtg ccg ggg cag gatctc ctg       3536
Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu
        780                 785                 790
tca tct cac ctt gct cct gcc gag aaa gta tcc atc atg gct gat gca      3584
Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys Val Ser Ile Met Ala Asp Ala
    795                 800                 805
atg cgg cgg ctg cat acg ctt gat ccg gct acc tgc cca ttc gac cac      3632
Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro Ala Thr Cys Pro Phe Asp His
810                 815                 820                 825
caa gcg aaa cat cgc atc gag cga gca cgt act cgg atg gaa gcc ggt      3680
Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly
                830                 835                 840
ctt gtc gat cag gat gat ctg gac gaa gag cat cag ggg ctc gcg cca      3728
Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu Glu His Gln Gly Leu Ala Pro
            845                 850                 855
gcc gaa ctg ttc gcc agg ctc aag gcg agc atg ccc gac ggc gag gat    3776
Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp
        860                 865                 870
ctc gtc gtg acc cat ggc gat gcc tgc ttg ccg aat atc atg gtg gaa      3824
Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys Leu Pro Asn Ile Met Val Glu
    875                 880                 885
aat ggc cgc ttt tct gga ttc atc gac tgt ggc cgg ctg ggt gtg gcg      3872
Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala
890                 895                 900                 905
gac cgc tat cag gac ata gcg ttg gct acc cgt gat att gct gaa gag      3920
Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu
                910                 915                 920
ctt ggc ggc gaa tgg gct gac cgc ttc ctc gtg ctt tac ggt atc gcc      3968
Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala
            925                 930                 935
gct ccc gat tcg cag cgc atc gcc ttc tat cgc ctt ctt gac gag ttc      4016
Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe
        940                 945                 950
ttc tga attattaacg cttacaattt cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct       4072
Phe
gtgcggtatt tcacaccgca tacaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct    4132
atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga    4192
taaatgcttc aataatagca cgtgctaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg    4252
aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga    4312
gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta    4372
atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa    4432
gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact    4492
gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca    4552
tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt    4612
accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg    4672
ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag    4732
cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta    4792
agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat    4852
ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg    4912
tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctgggc    4972
ttttgctggc cttttgctca catgttctt                                      5001
<210>2
<211>690
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>人工序列
<400>2
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1               5                   10                  15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
            20                  25                  30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
        35                  40                  45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
    50                  55                  60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65                  70                  75                  80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
                85                  90                  95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
            100                 105                 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
        115                 120                 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
    130                 135                 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145                 150                 155                 160
Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser
                165                 170                 175
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
            180                 185                 190
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
        195                 200                 205
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
    210                 215                 220
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
225                 230                 235                 240
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
                245                 250                 255
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
            260                 265                 270
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
        275                 280                 285
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
    290                 295                 300
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
305                 310                 315                 320
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
                325                 330                 335
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
            340                 345                 350
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
        355                 360                 365
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
    370                 375                 380
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Thr Gly Glu Met Gly
385                 390                 395                 400
Tyr Gln Ala Lys Gly Lys Phe Val Thr Thr Ala Asp Gly Lys Ile Arg
                405                 410                 415
Tyr Phe Asp Lys Gln Ser Gly Asn Met Tyr Arg Asn Arg Phe Ile Glu
            420                 425                 430
Asn Glu Glu Gly Lys Trp Leu Tyr Leu Gly Glu Asp Gly Ala Ala Val
        435                 440                 445
Thr Gly Ser Gln Thr Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe Arg Ala Asn
    450                 455                 460
Gly Val Gln Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp His His Gly Arg Ile
465                 470                 475                 480
Ser Tyr Tyr Asp Gly Asn Ser Gly Asp Gln Ile Arg Asn Arg Phe Val
                485                 490                 495
Arg Asn Ala Gln Gly Gln Trp Phe Tyr Phe Asp Asn Asn Gly Tyr Ala
            500                 505                 510
Val Thr Gly Ala Arg Thr Ile Asn Gly Gln Leu Leu Tyr Phe Arg Ala
        515                 520                 525
Asn Gly Val Gln Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp Arg Tyr Gly Arg
    530                 535                 540
Ile Ser Tyr Tyr Asp Gly Asn Ser Gly Asp Gln Ile Arg Asn Arg Phe
545                 550                 555                 560
Val Arg Asn Ala Gln Gly Gln Trp Phe Tyr Phe Asp Asn Asn Gly Tyr
                565                 570                 575
Ala Val Thr Gly Ala Arg Thr Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe Arg
            580                 585                 590
Ala Asn Gly Val Gln Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp Arg His Gly
        595                 600                 605
Arg Ile Ser Tyr Tyr Asp Gly Asn Ser Gly Asp Gln Ile Arg Asn Arg
    6l0                 615                 620
Phe Val Arg Asn Ala Gln Gly Gln Trp Phe Tyr Phe Asp Asn Asn Gly
625                 630                 635                 640
Tyr Ala Val Thr Gly Ala Arg Thr Ile Asn Gly Gln His Leu Tyr Phe
                645                 650                 655
Arg Ala Asn Gly Val Gln Val Lys Gly Glu Phe Val Thr Asp Arg Tyr
            660                 665                 670
Gly Arg Ile Ser Tyr Tyr Asp Ala Asn Ser Gly Glu Arg Val Arg Ile
        675                 680                 685
Val Asp
    690
<210>3
<211>264
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>人工序列
<400>3
Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val
1               5                   10                  15
Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser
            20                  25                  30
Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe
        35                  40                  45
Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala
    50                  55                  60
Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val
65                  70                  75                  80
Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu
                85                  90                  95
Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys
            100                 105                 110
Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro
        115                 120                 125
Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala
    130                 135                 140
Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala
                165                 170                 175
Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys
            180                 185                 190
Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp
        195                 200                 205
Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala
    210                 215                 220
Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe
225                 230                 235                 240
Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe
                245                 250                 255
Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe
            260