含交联颗粒的多孔基体 本发明涉及颗粒材料的基体。更具体而言，本发明涉及可用于医学，包括兽医学的颗粒材料的基体。
已知颗粒材料基体在医学中被用作组织骨架，但是本发明的基体既可以用作组织骨架，又可以用作药物或其他治疗试剂的递送系统。
许多专利申请描述了使用凝胶或溶胶，特别是水凝胶作为组织骨架。例如，WO 00/23054描述了聚乙烯醇微球体在血管闭塞或栓塞中的应用。WO 99/15211和WO 00/64977描述了水凝胶作为组织骨架的应用。将水凝胶植入患者以为了支持组织生长和/或修复。
水凝胶作为组织骨架的应用是有问题的，因为尽管凝胶本身可以充分填充它们所插入的空腔，但是它们的扩散性差，同样，提供给凝胶的药物、营养物或其他因子不能充分扩散通过凝胶。该问题当活细胞接种于凝胶时更加恶化，因为营养物的差的扩散性可能导致未成熟细胞死亡，导致治疗失败。与凝胶骨架有关的另一个问题是用于稳定或固化凝胶的交联方法，特别是在原位进行时，可能损伤截留细胞。
基于不溶于水的聚合物的骨架也是本领域已知的，例如，WO99/25391描述了聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)作为组织再生，特别是骨组织再生地聚合物骨架的应用。聚合物被加工成多孔结构。像水凝胶一样，不溶于水的聚合物是为了支持组织生长和/或修复而被植入患者体内的。
但是，这种不溶于水聚合物的缺点在于它们仅能填充开口形状的空腔，而且使材料定型的方法还不完善。此外，在用细胞接种的骨架中，接种是效率差的(很少的孔被细胞填满)或者细胞在接种过程中被结构所损伤，并且周围的组织细胞也可能被植入程序所损害。
WO 99/11196描述了颗粒基体作为组织骨架的应用，这种颗粒具有内部交联以稳定颗粒结构。在WO 99/11196中所述的交联是在颗粒内部，因此它能稳定颗粒。但是，在颗粒之间没有交联，即颗粒-颗粒交联，来稳定基体本身没有描述。因此，WO 99/11196描述的交联是颗粒内交联，而非颗粒间交联。
所以，本发明的一个目的是提供一种能够克服与已知基体相关的问题的基体，即，这种基体能够使物质扩散通过基体，可以符合所需的形状而不损伤可能接种其中的任何细胞，而且也不损伤任何已经接种于其中的细胞。
因此，本发明提供了一种开放式的颗粒材料多孔基体，在医学上，包括兽医学中用于或用在靶组织上，该基体包含相互交联的颗粒从而在颗粒间形成多孔。
本发明基体的优势在于由于颗粒间的交联使基体稳定，使得孔结构被很好地划定界限(define)。即，基体中每个颗粒都是和一个或多个其他颗粒相交联的。
多孔的存在使得基体可以被接种细胞以用于组织再生，或者使药物、营养物或其他治疗剂能够扩散穿过基体。作为选择，基体或其中的每个颗粒可以是经过表面设计的，以吸引和/或保留细胞或肽片段，从而形成用于组织再生的细胞外基体。例如，基体可以具有保留于其上的相关肽片段以将细胞吸引和保留到基体上或基体内。
本发明还提供一种流体组合物，该流体组合物含颗粒材料和交联剂，在靶组织中或靶组织上引入到交联剂时所述颗粒交联形成基体。
有利地，颗粒，和任何其它将递送给患者的试剂，和交联剂在向患者给药之前或给药过程中混合，且基体是在原位形成的，从而符合目标物或递送位点的形状。优选地，颗粒和交联剂是同时对者给药，理想地它们被共同递送到目标物或递送位点。
颗粒和交联剂可以通过不经肠给药、局部给药或口服递送给药。优选颗粒是通过共注射到内部靶位点和局部地到外部位点来递送。
共注射递送到内部靶位点的一个优点是向靶位点引入基体对被治疗的患者侵略性是最小的。
基体可以被用作新组织生长用的骨架，或者它可以用作药物、疫苗、激素(包括避孕激素)、酶、营养物或其他治疗试剂或因子的递送系统或植入物。根据应用，所用颗粒一般为1nm～1mm，优选为100nm～500μm。优选使用纳米级的颗粒作为递送系统或植入物，而使用微米级的颗粒作为组织骨架。但是，这并不意味着本发明限于这些大小/用途选择，因为植入物的一些应用可能需要微米级大小的颗粒，例如，避孕用的或用于肿瘤治疗的子宫内植入物，而且一些作为组织骨架的应用可能需要纳米级颗粒，例如在脊柱或脑内。
优选颗粒是硬的或固体颗粒，尽管本发明的范围不排除固体和半固体混合物或者软颗粒。软颗粒，例如脂质体，可以用于本发明，但是现有的脂质体技术还不能制造出足够坚固的颗粒，以产生用于本发明设想用途所需的强度。但是，可以使用硬颗粒和脂质体的混合物，优选脂质体分散穿过基体，在那儿向周围的组织并经由基体释放物质，例如抗生素。
例如，颗粒可以是由天然或合成的聚合物制成的，聚合物例如丝、弹性蛋白、壳多糖、脱乙酰壳多糖、多(α-羟基酸)，特别是聚乳酸或多羟基乙酸、聚酸酐或聚原酸酯。可以使用多羟基酸的聚合物，所述多羟基酸包括多羟基丁酸，乳酸，羟基乙酸和s-己酸，聚酸酐，聚原酸酯，聚磷腈，多磷酸酯，聚己酸内酯或者用这些聚合物的单体制备的共聚物(参见，例如WO 95/03357中所述的方法)。
颗粒可以是至少部分中空的或者是吸附剂(adsorbent)以使颗粒能够摄取需要在靶位点释放的物质。例如，如果希望向靶位点持续缓慢地递送物质，颗粒可以形成胶囊，其中填充或充满物质，该物质或者通过扩散缓慢地释放，或者通过机体自然代谢过程随着颗粒的破裂而释放出来。能够保护物质免于机体作用从而延迟或持久释放物质是有利的，例如生长促进剂或肿瘤抑制剂是需要缓慢释放的，或者，例如在延迟释放情况下，表示“停止”信号的物质核，例如形态发生蛋白，被包埋在颗粒里，只有在预定的降解期之后才被释放出来。
优选颗粒是和将要在靶位点释放的物质共同形成的。在最优选的实施方案中，使用的是多-层技术，使物质团块(bolus or boli)包埋于颗粒中。
作为选择，可以将颗粒涂上打算立即或在非常短时间内释放的物质，例如用于防止靶位点感染的抗生素，或者细胞受体的整联蛋白目标或其他目标配体以促进周围的细胞附着在基体上。特别优选至少基体的外部是这样涂布的。
可以位于颗粒内部或表面上的物质实例包括表皮生长因子(EGF)，神经生长因子，胰岛素样生长因子(IGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，转化生长因子-P，以及相关的生长因子，例如骨形成蛋白(BMPs)，细胞因子包括干扰素，白细胞介素，单核细胞趋化性蛋白-1(MCP-1)，雌激素，睾酮，激酶，化学激酶(chemokinase)，葡萄糖或其他糖类，氨基酸，多巴胺，富含胺的寡肽，例如在诸如纤连蛋白和层粘连蛋白的粘着蛋白中发现的肝素结合域，其他胺类三苯氧胺，顺铂(cis-platin)，肽和某些类毒素。上面所列的名单是为了进行说明，而没有任何限制意义。如上所述，任何物质，例如药物，激素，酶，营养物或其他治疗试剂或因子或它们的混合物都可以在颗粒内部或颗粒上。
颗粒可以是由生物可降解材料制成的。此处所用的术语“生物可降解材料”意图指在所需应用的可接受时间内溶解或分解或打断的材料，该可接受的时间小于或约5年，优选为1小时～5年，更优选1天～1年，理想地是一星期～一年。
尽管也可以使用其他方法，但用如下方法可以很便利地测量溶解或降解速率：暴露于pH6.0～8.0、温度为25℃～37℃，例如pH7.0、30℃的生理盐水中。应当理解样品的大小和形状可能对降解速率有一些影响，优选测试样品具有和将要实际使用的那些相似的形状和大小。对于经历表面侵蚀的生物可降解材料而言，大小和形状的影响是显著的。这些材料仅从表面开始侵蚀(降解)，因此任何颗粒表面积都将决定生物材料的清除速率。表面侵蚀聚合物包括聚酐和聚(原酸酯)类聚合物。大多数其他生物可降解的聚合物都是整体侵蚀(bulk eroding)(即，降解发生于整个聚合物物品，而不仅在表面发生)，包括乳酸和羟基乙酸基聚酯类。
优选颗粒是由生物相容的材料制成的。此处所用的术语“生物相容的”是用于定义不是不可接受的免疫原性的、变应原的或毒素的材料和其降解产物。理想的颗粒既是生物可降解的，又是生物相容的。
合适的合成生物可降解聚合物在下列表中陈述：
1、聚酯类，包括：
聚(乳酸)
聚(羟基乙酸)
乳酸和羟基乙酸的共聚物
乳酸、羟基乙酸和聚乙二醇的共聚物
聚(E-己内酯)
聚(3-羟基丁酸酯)
聚(对-二噁烷酮)
聚(富马酸亚丙酯)
2、聚(原酸酯)，包括：
多元醇/双烯酮乙缩醛加成聚合物(如Heller ACS SymposiumSeries 567，292-305，1994所述的)
3、聚酐类，包括：
聚(癸二酸酐)(PSA)
聚(羧基双羧基苯氧基苯氧基己烷)(PCPP)
聚[双(对-羧基苯氧基)甲烷](PCPM)
SA、CPP和CPM9的共聚物，如Tamada和Langer在Journal ofBiomaterials Science Polymer Edition，3，315-353，1992和Domb在Handbook of Biodegradable Polymers(Domb A.J.和Wiseman R.M.编辑，Harwood Academic Publishers)第8章中所述的。
4、聚(氨基酸)
5、聚(假氨基酸)(包括James和Kohn在Controlled Drug DeliveryChallenges and Strategies，American Chemical Society，WashingtonDC389-403页中所述的那些)
6、聚磷腈类，包括
聚[(二氯)磷腈]的衍生物
聚[(有机)磷腈]
Schacht在Biotechnology and Bioengineering，52，102-108，1996中所述的聚合物。
在优选实施方案中使用的是聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)聚酯类。这些聚合物已经被FDA批准为非肠道给药。因为PLGA在初始阶段是通过非酶水解而降解的，因此体内降解速率可以根据体外数据预测。PLGA降解成乳酸和羟基乙酸，这些机体内天然存在的物质。
带氨基酸的共聚物可以这样合成，例如(用)羟基乙酸和甘氨酸，或者乳酸和赖氨酸(Barrera等(1993)J Am Chem Soc115，11010-11011和Cook等(1997)J Biomed Mat Res 35，513-523)。这些可用于固定其他分子，例如通过赖氨酰s-氨基部分。这些聚合物可用来用共价键将肽结合到表面上。例如，如上面参考文件中所述的，可以用1，1’-羰基-二咪唑(CDI，Aldrich)作为连接剂将肽结合到聚(乳酸-共-赖氨酸)上。
通过控制乳酸和羟基乙酸的摩尔比及共聚物的分子量，可以获得不同的降解模式。聚L-丙交酯的体外降解时间为几个月至几年。降解时间长是因为它的结晶度高，从而保护聚合物不被水渗透。聚乙交酯的降解时间为一到几个月，而聚-D，L-丙交酯是无定形的，降解时间为一至几个月。D，L PLGA的体外降解时间为几个星期至几个月。随着羟基乙酸比例的升高，降解速率也加快。s-己酸的均聚物可以在植入后2-3年内保持完整状态。
应当理解当聚合物中掺入其他分子时，聚合物的降解时间可能改变。
PLA-PEG-生物素是一种具有产生亲水表面区域的两亲性质的、生物相容的、生物可降解的固体聚合物，是本发明实施方案中特别优选的。
带聚亚烷基二醇的共聚物，例如PEG，降低了所见炎症的程度。含聚亚烷基二醇的共聚物比不含聚亚烷基二醇的共聚物优选。聚亚烷基二醇还有助于减少非特异蛋白的吸收。为了保证从机体中排出，PEG的分子量应当为约300～20,000道尔顿。对于含具有聚亚烷基二醇的生物可降解组分的共聚物，其水解速率也增加了。
本发明可以使用其他表面活性剂，但是某些表面活性剂涂在颗粒上会使交联剂不能充分结合到颗粒上。例如，当使用生物素作为交联剂时，使用PVA在PLA上作为表面活性剂将会妨碍生物素结合到颗粒表面上，因而将不会发生交联。
如此，应当选择相匹配的交联剂和表面活性剂。
在目前优选的一个实施方案中，使用的是PEG，据发现PEG一般在颗粒内部，而不是作为涂层，这样使涂在颗粒上阻碍交联剂结合副作用的可能性最小化。
有利之处还在于PEG在制造过程中使颗粒表面稳定。
交联剂可以是任何已知的非细胞毒性或非抑制细胞的交联剂。一个优选的交联剂是生物活性配体。理想的交联剂是“锚-连接物-标记物”体系类型的(如专利申请PCT/GB99/001921中所述的，其内容结合在此作为参考)，其中连接物可以特异性地且高选择性地和存在于一个颗粒上的锚分子和存在于另一个颗粒上的标记物分子相互作用。
应当理解本发明这一方面所要求的所述特异性分子相互作用可以发生于颗粒表面组分和生物活性配体分子(例如，可以是融合分子，例如具有生物活性结构域和与颗粒表面的所述组分相互作用的结构域的分子)之间。作为选择，例如，如上所述的，它可以发生于颗粒表面组分和连接物分子之间，和/或所述连接物分子和生物活性配体分子或所结合的标记物之间。
还应当理解只有生物活性配体分子通过一种特异性分子相互作用结合到所述颗粒表面上是必需的；其他任何一种所涉及的分子相互作用不需要为特异性分子相互作用。但是，应当明白如果每个配体分子参与了多于一个的所述分子相互作用是优选的，然后多于一个的所述分子相互作用可以是特异性分子相互作用。因此，颗粒表面和连接物之间以及所述连接物和标记物之间的相互作用可以是，但不必都是特异性分子相互作用。连接物可以包含多于一个组分，使得组分的一条链将配体连接到颗粒表面；每个相互作用可以是，但不必都是特异性分子相互作用。
应当理解连接物分子可以是，例如能够和多于一个分子或者多于一种类型的分子形成特异性分子相互作用。例如，连接物可以和锚分子有特异性分子相互作用，还可以和标记物分子有特异性分子相互作用；锚和标记物分子可以是相同的化学本体，例如生物素，也可以不同。
优选交联是此前所述的锚-连接物-标记物类型的。颗粒和交联剂之间的连接可以是任何类型的，但是优选强键合类型。这种键合可以在特异性分子相互作用发生以后自发形成，或者它需要催化剂。应当理解这种键合可以是在参与特异性分子相互作用的分子间形成的，例如在锚分子和连接物分子之间，或者形成于其他分子之间，例如在生物活性配体和存在于所述颗粒表面的分子之间，所述分子表面没有和配体形成特异性分子相互作用。优选该键是共价键，或者至少键强度或键能处于共价键级别。但是，根据所结合的分子的特性或者应用种类或靶组织，使用离子键、静电相互作用或氢键也是同等有效的。
在特别优选的实施方案中，锚和标记物是生物素，而连接物是抗生物素蛋白或链霉抗生物素。生物素的化合价是1，而链霉抗生物素或抗生物素蛋白为4。生物素和链霉抗生物素/抗生物素蛋白结合的Kd为约10-15M。这种结合远强于许多共价相互作用，例如抗体/抗原相互作用。因此该体系提供了极高的亲合力和长期持久的结合。
在最优选的实施方案中，锚和标记物都是生物素，而连接物是抗生物素蛋白。优选该体系是因为生物素和抗生物素蛋白都是细胞相容的连接物，并且因为抗生物素蛋白和生物素之间的结合是非共价的，但其强度超过分子识别类型的其他相互作用。
有利地，抗生物素蛋白的四个结合位点使得生物素可以在基体内将另一物质递送至靶位点。例如生物素化的蛋白或糖等。
方便地，基体还可以和周围组织交联起来。可随意采用相同的交联反应和交联剂。
其他的交联策略包括使用带电颗粒或聚合物，丙烯酸酯交联，以及在颗粒表面涂上生物聚合物。
例如，可以使用带电聚合物通过静电相互作用，使微粒彼此之间吸附、吸收、捕获、诱捕、结合或粘着。在这种方法中可以使用诸如聚天冬氨酸和聚赖氨酸的聚合物。
可以这样使用丙烯酸酯交联：合成PLA-PEG-丙烯酸酯颗粒，在引发剂存在下用UV光使它们彼此交联。
颗粒可以通过其表面涂料彼此交联。例如，如果颗粒涂有凝胶或粘性涂料，例如藻酸盐、琼脂糖或血纤维蛋白，则可以利用凝胶性质或粘性将颗粒彼此交联，例如分别利用盐、温度或凝血因子例如因子XIIIa使藻酸盐、琼脂糖或血纤维蛋白通过胶凝作用产生附着力。
理想的情况是在间隔化合物存在下发生交联反应。间隔化合物可以是任何亲水性间隔化合物，例如葡聚糖或诸如聚乙二醇(PEG)的聚烷基二醇。所要求的间隔化合物的浓度根据所需基体孔的大小而变化。
一般根据基体的功能来选择孔的大小。可以通过颗粒大小和形状、颗粒浓度和交联的特性，例如通过改变在锚-连接物-标记物型连接中使用的连接物数量，来控制孔的大小。
在本发明第二种实施方案中，将基体接种上细胞，并使用基体作为组织再生用的骨架。
在该实施方案中，理想的孔大小为细胞直径的1～25倍，以便能够接种足够多的活细胞。可以将孔的大小从细胞直径的25倍开始向下减小，使其符合实际应用需要。有利之处在于基体是在原处形成的，减少了在接种过程中对细胞的损害，因为细胞不是像现有技术那样被物理插入基体的，而是在细胞周围形成基体。按照这种方式，更多的用于接种基体的细胞保持存活用于组织再生。
目前，应该理解本发明的基体可以用于任何组织，活的、正在坏死的或死组织，包括骨和软骨组织。可以使用接种基体的组织实例有：脊椎盘(spinal disc)再生，自体软骨细胞植入，脊髓修复，向脑递送细胞，特别是用于治疗阿尔茨海默氏病和帕金森氏症，肝再生，骨关节炎，骨腔充填，软组织增大例如在泌尿系统(urology)或乳房切除术后非强制性的乳房增大，体外受精胚胎的植入，糖尿病患者(diabetes mellitus)的胰腺再生，或者需要血管形成或血管发生的组织的再生或修复。
基体可以接种任何类型的细胞，但是特别优选供体细胞软骨细胞、来自机体其他部分或来自胚胎的干细胞，以及来自机体其他部分的重新程序化的细胞例如将脂肪细胞重新程序化以成为软骨细胞。
在使用基体来递送药物或类似物时，优选将颗粒任选地和间隔剂制成混悬液，并制备抗生物素蛋白的单独的溶液。将混悬液和抗生物素蛋白一起使用在需处理的区域，而基体就在原处形成并硬化。当混悬液和溶液被一起注射时，优选它们在靶区域彼此介入。但是，可以使用双管注射器针头使两者彼此介入。
向基体接种细胞时，可以将细胞和颗粒，以及任选的间隔剂一起混合在将要引入抗生物素蛋白的单一混悬液中。将细胞混悬液引入抗生物素蛋白的方式如上所述。
在本发明的另一方面，提供一种用于医学，包括兽医学在内的开放式多孔颗粒材料基体的形成方法，该方法包含如下步骤：制备颗粒材料的混悬液，单独制备交联剂溶液，并将颗粒混悬液在靶组织中或靶组织上原位引入到交联剂溶液。
作为选择，可以用颗粒和交联剂的混悬液，以及颗粒的单独混悬液，将这两种混悬液在靶组织中或靶组织上原位彼此引入来形成基体。
因此，本发明还提供一种用于医学，包括兽医学在内的开放式多孔颗粒材料基体的形成方法，该方法包含如下步骤：制备颗粒材料和交联剂的混悬液，制备单独的颗粒混悬液，并将悬浮的颗粒和交联剂在靶组织中或靶组织上原位引入到悬浮的颗粒中。
当想在基体上接种细胞时，可以将细胞加入到任一混悬液中或者两个混悬液中。但是，优选不要将细胞加到仅含抗生物素蛋白的混悬液中。
颗粒材料和交联剂如上所述。
混悬液和溶液可以顺序或同时彼此引入，优选快速连续依次施用，理想地，同时引入混悬液和溶液。
本发明的第四方面提供了用本发明的基体治疗人或动物体的方法。
因此，本发明提供了一种治疗动物的方法，该方法包括引入一种开放式多孔颗粒材料基体，这种基体是通过在需要治疗的动物靶组织中或靶组织上一起施用原位彼此引入的颗粒材料混悬液和交联剂混悬液而形成的。
优选基体如上所述。
可用本发明方法治疗的疾病或病症包括，但决不局限于：阿尔茨海默氏病，帕金森氏症，骨关节炎，烧伤，脊椎盘萎缩，癌症，肝萎缩和其他肝疾病，骨腔充填，骨折的再生或恢复，糖尿病，输尿管或膀胱重建，子宫膀胱的脱垂，IVF治疗，肌肉消耗(muscle wasting)病症，肾萎缩，器官重建和整容手术。
本发明的最后一方面提供用于将基体递送到靶位点的装置，该装置包含一个多管室注射器，每个管通向一个公共的(common)流出孔(discharegaperture)。任选地，在公共流出孔上附着皮下注射器针头。优选在本发明的递送本发明基体的方法中使用这种注射器。
下面将仅参照如下附图、作为例子来描述本发明的实施方案，这些附图中：
图1显示了测定抗生物素蛋白饱和的PLA-PEG-生物素纳米颗粒和生物素-PEG溶液结合的表面胞质基因组共振实验；
图2显示了不含抗生物素蛋白的PLA-PEG-生物素微粒[A]&说明聚集的缀合罗丹明的抗生物素蛋白的[B]，[C]是说明多孔性的组装骨架的SEM图像；
图3显示了在金字塔形模具中形成的基体；
图4显示了俘获的HOS细胞(含细胞跟踪器)在交联骨架内的共焦图像；
图5是显示活细胞和基体摄取Alamar蓝的图表；
图6显示了CAM培养7天后多孔骨架的原位显微照片。
实施例1
制备微粒
如Cannizzaro，S.M.等在A novel biotinylated degradable polymer forcell-interactive applications.Biotechnology and Bioengineering 1998；58：529～535所述来制备聚合物PLA-PEG-生物素。然后，制造微粒。简言之，将500mg PLA-PEG-生物素溶解在20ml二氯甲烷(DCM)中，得到25ml/ml的溶液。将PVA(250000 Mw)[88％水解的]溶解到ELGA水(0.25g溶解到250ml)，得到0.1％w/v溶液。然后用5ml Gilson吸液管将PLA-PEG-生物素溶液加到均质化的PVA溶液中。在5000rpm下再均质化该混合物10分钟，然后搅拌过夜使DCM蒸发并形成微粒。纳米颗粒是如上所述地、用9％PVA溶液在5000rpm下匀浆和5mg/ml的PLA-PEG-生物素溶液来制备的。
PVC浓度 搅拌速率 平均大小
(％，w/w) (转速/分钟) (微米)
1500 9.9
0.1 3500 5.2
5000 2.1
1500 3.2
1 3500 1.9
5000 1.7
1500 1.4
9 3500 0.6
5000 0.25
实施例2
微粒和抗生物素蛋白的交联
使用表面胞质基因组共振分析来证实微粒能够和抗生物素蛋白交联(图1)。
SPR设备(Ortho Clinical Diagnostics，Chalfont，St-Giles，UK)采用Kretschmann结构，使用780nm波长的单色激光源。玻璃载玻片一侧有50nm的银层。将每个载玻片在0.1mg/ml N-([6-生物素酰胺基-]己基-)-3’-[2’-吡啶基硫代]丙酰胺的TFE溶液中浸泡，进行生物素化。抗生物素蛋白(1.5×10-7M)，生物素-PEG(3350)-生物素(1×10-6M)样品溶液。用过量抗生物素蛋白来饱和PLA-PEG-生物素颗粒(250nm)，然后利用离心洗涤。然后在10mM磷酸钠缓冲液（pH7.4)中制备抗生物素蛋白饱和的颗粒(1.5×10-7M)。为了使基线读数稳定，首先用磷酸钠缓冲液(10mM，pH7.4)冲洗生物素-HPDP官能化的表面100s。然后用抗生物素蛋白溶液(1.5×10-7M)流经生物素化的载玻片而获得抗生物素蛋白官能化的表面。再用磷酸钠缓冲液(10mM，pH7.4)冲洗表面除去过量的链霉抗生物素。在实验的下一阶段，让生物素-PEG(3350)-生物素(1×10-6M)流经样品表面，随后用缓冲液冲洗，除去未结合的生物素-PEG(3350)-生物素。然后让抗生物素蛋白饱和的纳米颗粒(1.5×10-7M)流经表面，随后用缓冲液冲洗。至于对照实验，在注射了抗生物素蛋白和生物素-PEG-生物素之后，用非饱和的PLA-PEG-生物素纳米颗粒(1.5×10-7M，250nm)取代抗生物素蛋白饱和的纳米颗粒注射进去。另一个对照组涉及在实验时间内仅注射抗生物素蛋白。流速为0.24mL/min，结果至少重复8次。检测SPR角随时间的变化情况，单位为毫度角(mDA)，其中1mDA＝0.001°。
实施例3
微粒的聚集
将微粒水混悬液加到抗生物素蛋白溶液中。聚集导致颗粒大小的增加，并用光学显微镜记录。
参见图2，该图显示了10微米PLA-PEG-生物素微粒[A]和[B]的显微图像，其中[A]不含抗生物素蛋白，[B]含用于说明聚集的缀合罗丹明的抗生物素蛋白(abiding)，[C]说明了组装的骨架的多孔性。
实施例4
3D结构的形成
将PLA-PEG-生物素微粒和抗生物素蛋白溶液一起注射到金字塔形模具中。所得结构是独立式骨架(图3)。
实施例5
细胞-骨架复合物的形成
细胞培养实验
将HOS细胞培养在Dulbecco改性的Eagle培养基(DMEM)中，补充10％胎牛血清(FCS)，2mML-谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素B(抗生素/抗真菌剂)。将细胞培养物在37℃、富含5％CO2环境中孵育。每2～3天用0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA的PBS溶液从组织培养瓶中分出，消化细胞一次，再接种。
通过在11μlDMSO中重组物质和将该溶液加入到铺满组织培养物培养瓶的培养基中，将细胞和Cell TrackerTM绿色CMFDA(5-氯甲基荧光素二乙酸酯)荧光染料(分子探针)孵育45分钟。然后更换培养基，再培养细胞1小时。接着进行胰蛋白酶消化和再悬浮，离心细胞并再次悬浮在DMEM中。将约1百万细胞放入50％抗生物素蛋白饱和的PLA-PEG-生物素微粒混合物中，并加入25％生物素-PEG-生物素，来聚集微粒并捕获细胞。用共焦显微镜检测骨架。
参见图4，该图显示了捕获的HOS细胞(含细胞跟踪器)在交联骨架内的共焦图像(深灰色/黑色区域显示其反射系数)(细胞用浅灰色显示)。
实施例6
注射形成聚合物/细胞复合物骨架
制备0.5％浓度的琼脂糖凝胶。将使用了25％生物素-PEG-生物素、50％抗生物素蛋白饱和的PLA-PEG-生物素微粒的骨架和1×106HOS细胞注射到琼脂糖凝胶中。作为对照，将25％生物素-PEG-生物素、50％PLA-PEG-生物素微粒(不含抗生物素蛋白)和1×106HOS细胞注射到琼脂糖凝胶中。另一对照是注射使用了25％生物素-PEG-生物素、50％抗生物素蛋白饱和的PLA-PEG-生物素微粒的骨架，不注射细胞。
对捕获在骨架内的HOS细胞进行Alamar蓝分析，并证实捕获细胞是存活的。用组织培养物塑胶(plastic)和不含细胞的骨架作为空白对照：从每个样品中取出100μl样品，放入96孔板中，轻轻摇动5分钟。使用平板读数器在530Ex、590Emm、灵敏度为50的条件下进行测量(见图5)。
实施例7
尿囊绒膜(CAM)培养
将受精卵在37℃下潮湿环境中在Multihatch自动孵育器(BrinseaProducts，Sandford，UK)中孵育10～18天。第10天时，取出卵，在壳上切1cm2的方块。将骨架直接逐滴注射到10日龄鸡胚胎的CAM上，再继续孵育7天。此外，从18天鸡胚胎上切除股骨，在股骨中间造一个楔形节段性缺损，向其中注射骨架来填充缺损部位。然后将股骨/骨架外植块放到CAM上，并在37℃下，如前详细的15所述的再培养7天。然后收获外植块，斩首处死鸡胚胎。然后在组织化学分析之前，将骨架和外植块样品用95％乙醇固定，加工成石蜡，并制备5μm切片。切片用Alcian蓝/Sirius红和碱性磷酸酶染色，如下证明其蛋白聚糖、胶原蛋白和酶活性：
i)碱性磷酸酶活性：样品用Sigma碱性磷酸酶试剂盒(no.85)染色。
ii)Alcian 蓝/Sirius红：样品用Weigert苏木精，alcian蓝(1％乙酸溶液)和sirius红(饱和苦味酸溶液)染色。
如图6所见，骨架在原位保持着聚集状态，并被来自CAM的血管广泛入侵(箭头)(放大×20)。b)用alcian蓝和sirius红染色的a)石蜡切片(5μm)表明CAM向内生长且基体由CAM组织合成(放大×50)。c)是鸡股骨缺损内骨架在CAM上培养7天后的原位显微照片。可以观察到在股骨和骨架上和周围(箭头，S)来自CAM的血管侵入(与蓝纸对比)(放大×10)。骨架是用25％生物素-PEG-生物素、50％抗生物素蛋白饱和的PLA-PEG-生物素微粒产生的，并被放入股骨缺损上。将外植块-骨架构建体放在CAM中培养7天。d)将来自c)的股骨楔形缺损中骨架的石蜡切片染色，用于碱性磷酸酶活性。可以观察到CAM组织和结合在骨架上的切开的骨(B)边缘的碱性磷酸酶活性(放大×50)。